Взаимодействие протимозина альфа с адаптером убиквитин-лигазы белком Keap1 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

московский государственный университет

МЕЛЬНИКОВ Сергей Викторович

взаимодействие протимозина а

с адаптером убиквитин-лигазы белком кеар1

02.00.10 - биоорганическая химия

имени М.в. Ломоносова

химический факультет

На правах рукописи

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Г

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии гена отдела химии и биохимии нуклеопротеидов НИИ физико-химической биологии им А Н Белозерского МГУ им М В Ломоносова.

Научный руководитель

доктор химических наук, профессор Вартапетян Андрей Борисович

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Карпов Вадим Львович

кандидат химических наук Птицын Леонид Романович

Ведущая организация

Центр "Биоинженерия" РАН

Защита состоится 22 апреля 2008 года в 16 часов на заседании совета Д 501 001 41 по химическим наукам при Московском государственном университете им MB Ломоносова по адресу 119991, Москва, Воробьевы горы, Институт физико-химической биологии им А H Белозерского МГУ, аудитория 501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ

Автореферат разослан 21 марта 2008 г

Ученый секретарь совета, кандидат химических наук

Смирнова И Г

ОБЩАЯ ХАКАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Многообразие белковых молекул включает в себя малоисследованную группу полипептидов, лишенных стабильных элементов вторичной и третичной структуры Эти белки, называемые несвернутыми или природно неструктурированными, играют важную роль во множестве регуляторных и адаптационных процессов, протекающих в клетке Вместе с тем, механизм их действия и регуляция их активности практически не исследованы

Одним из представителей несвернутых белков является жизненно необходимый белок позвоночных животных протимозин альфа (РгоТа) РгоТа представляет собой чрезвычайно кислый белок (pl=3 5) с молекулярной массой -12 кДа, в силу особенностей первичной структуры обладающий рядом нетривиальных физико-химических свойств В клетке РгоТа сосредоточен в ядре, однако, в силу небольшого размера, этот белок способен выходить из ядра в цитоплазму посредством пассивной диффузии Такое внутриклеточное распределение позволяет РгоТа в цитоплазме участвовать в регуляции апо птоза, а в ядре участвовать в ряде процессов транскрипции и, возможно, регулировать структуру хроматина

К настоящему времени идентифицирован ряд белков, взаимодействующих с РгоТа, вместе с тем остается неисследованным, каким образом эти взаимодействия отражаются на функциях РгоТа Ранее было установлено, что РгоТа взаимодействует с белком Keapl (Karapetian et al, 2005) Функционально Keapl описан как репрессор транскрипционного фактора Nrf2, опосредующего индукцию синтеза защитных белков при попадании в клетку токсичных ксенобиотиков и оксидантов В условиях физиологической нормы Keapl связывается с транскрипционным фактором Nrf2 и удерживает Nrf2 в неактивном состоянии за счет двух процессов Во-первых, Keapl содержит в своей структуре сигнал экспорта из ядра, поэтому связывание Nrf2 с Keapl приводит к перераспределению Nrf2 в цитозоль клетки, в результате чего Nrf2 оказывается изолированным от своих генов-мишеней Во-вторых, Keapl является адаптером убиквитин-лигазы СиШпЗ, пространственно сближает СиШпЗ и Nrf2 и опосредует

полиубиквитинирование Nrf2 Полиубиквитинирование Nrf2 влечет его деградацию 26S протеасомой, что в конечном итоге приводит к многократному снижению внутриклеточного уровня Nrf2 В условиях токсического стресса Keapl неактивен, благодаря чему становится активен Nrf2

ProTa способен усиливать транскрипцию №С-зависимых генов, но эта способность пропадает при внесении в структуру РгоТа мутаций, нарушающих его взаимодействие с Keapl In vitro было показано, что РгоТа способен вытеснять Nrf2 из комплекса с Keapl, что указывало на существование общего центра связывания для этих двух белков в структуре Keapl В связи с этим можно было предположить, что в комплексе с белком Keapl РгоТа, аналогично Nrf2, должен быть подвержен Кеар1-опосредованному экспорту из ядра, убиквитинированию и последующей деградации 26 S протеасомой

Цель работы Целью данной работы являлось изучение функциональных последствий для белка РгоТа от его взаимодействия с адаптером убиквитин-лигазы белком Keapl

Научная новизна и практическая значимость работы В работе впервые исследованы последствия взаимодействия неструктурированного белка РгоТа с адаптером убиквитин-лигазы белком Keapl Показано, что, несмотря на наличие данного взаимодействия, РгоТа остается стабильным белком, устойчивым как к деградации, так и к Keapl-зависимому убиквитинированию Также продемонстрировано, что Keapl не способен вызывать перераспределение РгоТа из ядра в цитоплазму клетки В то же время, более тонкие исследования показали, что Keapl в значительной степени усиливает экспорт РгоТа из ядра в цитозоль клетки, но, за счет имеющегося в структуре РгоТа сигнала ядерной локализации, РгоТа импортируется обратно в ядро, благодаря чему сохраняет свою ядерную локализацию

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на XII-ой и XIV-ой Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (2005 и 2007 гг) По материалам диссертации опубликованы три статьи

страницах, содержит рисунков и 2 таблицы Диссертация состоит из введения, обзора литературы на тему "Внутриклеточные функции протимозина альфа", обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Pro Та - стабильный белок, не подверженный деградации 26S протеасомой

Взаимодействие РгоТа с адаптером убиквитин-лигазы белком Keapl предполагало, что РгоТа может быть нестабильным белком вследствие направленной деградации комплексом 26S протеасомы, поэтому наши исследования мы начали с проверки стабильности РгоТа

В первую очередь было проанализировано влияние инактивации протеасомы на внутриклеточный уровень РгоТа Для этого клетки человека линий HeLa и НЕК 293 помещали в среду, содержащую ингибитор 26S протеасомы MG-132 или кластолактоцистин-(3-лактон На рисунке 1-А показано, что ингибитор протеасомы MG-132 стимулировал накопление в клетках убиквитинированных форм белков, что говорило об эффективной инактивации 26S протеасомы

Для оценки количества РгоТа в лизатах клеток мы воспользовались методом сэндвич-ИФА с использованием двух типов моноклональных антител, узнающих разные эпитопы в молекуле РгоТа Этот подход исключает возможность внесения погрешностей, связанных с потерей белка в процессе выделения и очистки

Если РгоТа подвержен деградации протеасомой, инактивация протеасомы должна повлечь за собой увеличение количества РгоТа в результате его стабилизации Результаты оценки концентрации РгоТа в лизатах клеток, обработанных MG-132, показали, что данный ингибитор протеасомы не оказывал влияния на внутриклеточный уровень РгоТа (Рисунок 1-Б)

МО-132

кДа

Антч-иь 5(1

,»7

26

Л111 и - [з

00. 442 им (1.6 г

0.4

¡О <А2 0.1

0.2 0.4 0.6 О.К 1.0 Ра тсдение клеточной» ли адта. лили

Рисувок 1. Инактивации 268 прогсасомы ингибитором МС-132 ие оказывает влиянии на внутриклеточный уровень РгоТа. Клетки НеЬа предварительно инкубировали в течение 18 часов в среде, содержащей 2 мкМ МО-132 или эквивалентное количество растворителя (ДМСО), использованного в качестве контроля. Далее клетки лизировали и анализировали аликвоты: А. Иммуноблот суммарных белков лизатов клеток НеЬа с использованием антител, специфичных к убиквитину (верхняя панель). Приведенный здесь (нижняя панель) и далее иммуноблоты лизатов с использованием антител к (5-актину указывают на одинаковое количество проб в дорожках геля. Б. Оценка количества РгоТа в клеточных лизатах методом сэндвич-ИФА.

Аналогичные результаты были получены при использовании клеточной линии НЕК 293 и при использовании кластолактоцистин р-лактона в качестве ингибитора протеасомы.

Исходя из полученных данных, можно было заключить, что РгоТа не подвержен протеолитической деградации протеасомой. Однако, учитывая большое количество РгоТа в клетке (~107 молекул на клетку), нельзя было также исключить возможности, что деградирует только малая часть РгоТа, исчезновение которой на общем фоне не видно. Чтобы проверить справедливость этого предположения, в клетках НеЬа был сверхпродуцирован белок Кеар1. Для этого клетки были трансфицированы плазмидой, в которой кДНК Кеар1 расположена под контролем вирусного промотора СМУ, а образуемый транскрипт содержит трансляционный усилитель. В результате трансфекции количество Кеар! значительно увеличилось по сравнению с

эндогенным уровнем этого белка (Рисунок 2-А) Однако это обстоятельство никак не отразилось на количестве РгоТа, выявленного в лизатах с помощью сэндвич-ИФА (Рисунок 2-Б)

В то же время, увеличение количества белка Keapl в клетке, как и ожидалось, резко снижало внутриклеточный уровень транскрипционного фактора Nrf2 (Рисунок 2-В), демонстрируя, что белок Keapl функционально активен

Суммируя полученные результаты, мы заключили, что взаимодействие РгоТа с Keapl не отражается на стабильности РгоТа и, возможно, имеет иную функцию, нежели регуляцию количества РгоТа в клетке

ш

OD 492 ям Юг

Анти-Keapl Аити-р-аклии

Контроль Сверхпроц^кция

Keapl

0 0.25 0 50 0 75 I 00 Рождение клеточного ли чата, доли

В

р ?

I

сз % a i z g z §

- Анти-ЫШ

Virra-Keapl

— - и-Р-актин

Рисунок 2. Влияние Кеар1 на внутриклеточный уровень РгоТа. За 48 часов до анализа клетки были трансфицированы Кеар1-кодирующей плазмидой или "пустым" вектором А. Иммуноблот лизатов клеток линии НеЬа с использованием антител к Кеар1 Б. Оценка количества РгоТ« методом сэндвич-ИФА В. Иммуноблот лизатов клеток линии НеЬа, трансфицированных №£2- и Кеар1-кодирующими плазмидами, либо №12-кодирующей плазмидой и вектором

2. РгоТа не подвержен убиквитинированию

Еще одним подходом к оценке стабильности белка является анализ на наличие полиубиквитинированных форм этого белка, которые узнаются и

деградируют 26Б протеасомой. Преимущество этого подхода состоит в том, что он позволяет выявить модификации убиквитином, соответствующие нестабильной доле белка, на фоне большого количества неубиквитинированного стабильного белка. К тому же известно, что, помимо мечения белков для дальнейшей деградации, убиквитинирование может изменять спектр взаимодействий белка, не оказывая влияния на его стабильность. В этом случае белок, как правило, модифицируется не полиубиквитиновой цепью, а одной молекулой убиквитина.

В первую очередь, на примере транскрипционного фактора №12 мы продемонстрировали, что наша экспериментальная система работает адекватно. Клетки линии НеЬа были трансфицированы плазмидами, кодирующими Кеар1, №0 и убиквитин, содержащий на Ы-конце 6-гистидиновый довесок [(Шз)6-иЬ].

И

МС -132 Анти-ЫгП

Анти-р-актин

^ МС>-132 - + кДа 250

|

Анти-ЫгО Щ

120

яийр

Мг12 + + Ке;\р1 + +

ны6- иь + +

Рисунок 3. Выделение убиквитннированных форм ]\г£2. Клетки НеЬа были трансфицированы плазмидами, кодирующими №£2, Кеар1 и (Шв^-ЦЬ и обработаны 1уЮ-132 или ДМСО (растворителем) в качестве контроля. А. Иммуноблот аликвоты клеточных лизатов с использованием антител, специфичных к №(2 и к р-актину (контроль). Здесь и далее значком "+", размещенным под дорожкой геля, обозначена взятая для трансфекции плазмида, кодирующая соответствующий белок. Б. Иммуноблот клеточных лизатов после их фракционирования на №-ЫТА-агарозе.

По причине быстрой деградации полиубиквитинированные белки существуют в клетке в количествах, незначительных для их непосредственного наблюдения, поэтому для стабилизации и детекции полиубиквитинированных форм №£2 трансфицированные клетки инкубировали в среде, содержащей

ингибитор протеасомы МО-132 Трансфицированные клетки лизировали, отбирали аликвоту для оценки внутриклеточного уровня Ыгй, а остальную часть фракционировали на М-ЫТА-агарозе Отобранную аликвоту и элюат связавшихся со смолой убиквитинированных (содержащих (Н1з)6-тэг) белков анализировали методом иммуноблоттинга Было показано, что в присутствии МО-132 происходила стабилизация транскрипционного фактора №£2, приводящая к появлению ожидаемого сигнала в области 120 кДа, соответствующей подвижности №£2 в ПААГ (Рисунок 3-А) Также мы наблюдали накопление в клетке полиубиквитинированных форм №12, обладающих более высокой молекулярной массой (Рисунок 3-Б) Это говорило о том, что в наших экспериментальных условиях активность системы Кеар1-опосредованного убиквитинирования была детектируемой

Для оценки убиквитинирования РгоТа клетки НеЬа трансфицировали плазмидами, кодирующими (Ню)б-иЬ, Кеар1 и РгоТа Учитывая молекулярные массы Ш (8,5 кДа) и РгоТа (12 кДа), сигнал от моноубиквитинированного РгоТа можно было ожидать в области 20 кДа, от полиубиквитинированного - в области 48 кДа и выше

Иммуноблот клеточных лизатов с использованием моноклональных антител к РгоТа показал, что в результате трансфекции клеток РгоТа-кодирующей плазмидой уровень РгоТа значительно увеличивался, но не зависел от активности протеасомы (Рисунок 4-А) В то же время, во фракции выделенных на ЫнЫТА-агарозе убиквитинированных белков сигнал РгоТа, отличный от фона, отсутствовал (Рисунок 4-Б) Обработка клеток ингибитором протеасомы также не приводила к появлению убиквитинированных форм РгоТа, Полученные результаты согласовывались с нашим предположением, что РгоТа - стабильный белок, не подверженный деградации протеасомой

Мы заключили, что, несмотря на взаимодействие с Кеар1, РгоТа избегает как поли-, так и моноубиквитинирования

0 МО -132 - ♦ к Да

20

Акт« Р«>1<' щи? щц/

Ли 111 р-актин

Вектор -

РгоТ а - +

Кещ>) 4-

ННЛ ни + + *

[Б] МО-132 - + _ + кДа

66

17

Антн ■ РгоТа 20

Вектор + +

РгоТа

Кеар!

ннЙ-иь -¡- +

Рисунок 4. РгоТа не подвержен убиквитинированию. Клетки НеЬа трансфицировали плазмидами в комбинациях, указанных под соответствующими дорожками геля. За 18 часов до лизиса клеток в среду добавляли ингибитор протеасомы МО-132 до концентрации 2 мкМ или эквивалентное количество растворителя (ДМСО). А. Иммуноблот аликвот клеточных лизатов с использованием антител, специфичных к РгоТа и к Р-актину. Б. Иммуноблот клеточных лизатов после их фракционирования на №-ЫТА-агарозе. Чтобы избежать возможности маскирования эпитопов в молекуле РгоТа убиквитином, для детекции были использованы два типа моноклональных антител, узнающих разные участки в молекуле РгоТа.

Таким образом, взаимодействие с адаптером убиквитин-лигазы белком Кеар1 не обязательно сопровождается убиквитинированием и деградацией партнеров Кеар1.

3. РгоТа устойчив к Кеар1-зависимому экспорту из ядра

Согласно современным представлениям, благодаря наличию в своей структуре сигнала экспорта из ядра, Кеар1 экспортирует транскрипционный фактор №¿2 из ядра в цитоплазму. При этом, экспорт ЬМ2 в цитоплазму является критически необходимым для последующего убиквитинирования и деградации Ыг(2.

РгоТа является стабильным молекулярным партнером белка Кеар1, поэтому мы исследовали, вызывает ли Кеар1 экспорт РгоТа из ядра в цитоплазму.

В начале мы убедились, что в нашей системе Кеар1 эффективно экспортирует из ядра транскрипционный фактор №12. Для этого клетки НеЬа

были трансфицированы либо Ыгй-кодирующей плазмидой, либо смесью №Е2- и Кеар1-кодирующих плазмид. Через сутки после трансфекции клетки фиксировали и определяли внутриклеточную локализацию белков методом иммунофлуоресцентного окрашивания. Результаты анализа внутриклеточного распределения белков К.еар1 и №€2 показали, что эктопически экспрессируемый №{2 был локализован в ядре клетки (Рисунок 5-А), тогда как при копродукции с Кеар1 №12 был локализован преимущественно в цитоплазме (Рисунок 5-Б). Таким образом, К.еар1 действительно осуществлял экспорт белка №£2 из ядра в цитоплазму.

Рнсунок 5. Оценка способности Кеар1 экспортировать транскрипционный фактор 1Чг£2 из ядра в цитоплазму. Флуоресцентные микрофотографии клеток линии НеЬа были получены окрашиванием клеток с помощью антител к Кеар1 и №¿2 и специфичных к ним вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентными красителями. Для определения положения ядер в клетках в нижней части каждой панели приведены соответствующие снимки, полученные методом фазового контраста. Клетки были трансфицированы: А. 1чИ2-кодирующей плазмидой; Б. смесью ЫЖ- и Кеар1-кодирующих плазмид.

I

В параллельном эксперименте мы оценили способность Кеар1 экспортировать из ядра белок РгоТа. Для этого клетки НеЬа были трансфицированы либо Кеар1 -кодирующей плазмидой, либо вектором, после

чего клетки фиксировали и окрашивали с использованием антител, специфичных к Pro Та и Keapl.

Результаты окрашивания показали, что сверхпродукция Keapl не оказывает влияния на практически исключительно ядерную локализацию РгоТа (Рисунок 6).

Рисунок 6. Keapl не способен перелокализовывать РгоТа из ядра в цитоплазму. Клетки линии HeLa были трансфицированы: А. вектором Б. плазмидой, кодирующей Keapl. Флуоресцентные микрофотографии были получены с помощью антител к Keapl и РгоТа. Для определения положения ядер клетки были окрашены флуоресцентным красителем ДНК Hoechst 33342.

Таким образом, мы показали, что белок РгоТа, в отличие от транскрипционного фактора Nrf2 , устойчив к опосредованной белком Keapl перелокализации из ядра в цитоплазму клетки.

4. РгоТа не оказывает влияния на степень убнквнтиннрования

Ранее было показано (Кагарейап й а1, 2005), что увеличение уровня РгоТа в клетках НеЬа приводит к усилению №12-зависимой транскрипции генов как в условиях физиологической нормы, так и при действии на клетку токсичных

транскрипционного фактора Nrf2

ксенобиотиков Этот эффект наблюдался только для РгоТа дикого типа, способного связывать Keapl, и пропадал при введении в последовательность РгоТа мутации, нарушающей взаимодействие РгоТа с белком Keapl Эти данные указывали на то, что РгоТа, связывая Keapl, может действовать как белок, высвобождающий Nrf2 из комплекса Keapl-Nrf2 т vivo Поскольку мы показали, что РгоТа устойчив к Кеар1-опосредованной деградации, можно было предположить, что после связывания с Keapl белок РгоТа ограничивает способность Keapl направлять Nrf2 на деградацию и тем самым удерживает Keapl в неактивном состоянии

Для того, чтобы проверить наше предположение, мы исследовали влияние сверхпродукции РгоТа на внутриклеточный уровень и степень убиквитинирования Nrf2 Для этого клетки HeLa были трансфицированы либо Nrf2-, Keapl-кодирующими плазмидами и "пустым" вектором, либо Nrí2-, Keapl- и РгоТа-кодирующими плазмидами Трансфицированные клетки были обработаны ингибитором протеасомы MG-132 или ДМСО (растворителем), после чего были лизированы Аликвоты клеточных лизатов использовали для оценки сверхпродукции РгоТа, основную часть лизата - для выделения поли-убиквитинированного Nrf2 методом иммунопреципитации с помощью антител к убиквитину

Можно было ожидать, что увеличение внутриклеточного уровня РгоТа повлечет за собой увеличение количества свободного Nrf2 и снизит степень его полиубиквитинирования Результат иммуноблоттинга лизатов и полученных иммунопреципитатов опроверг это предположение При значительном увеличении количества РгоТа в результате сверхпродукции внутриклеточный уровень эктопического Nrf2 (Рисунок 7-А) и степень его полиубиквитинирования (Рисунок 7-Б) в клетках, обработанных ингибитором протеасомы, заметным образом не изменялись

Ранее было показано, что комплекс белков Keapl и Nrf2 непрерывно перемещается между ядром и цитоплазмой, но при этом локализован преимущественно в цитозоле (Karapetian et al, 2005) Также известно, что

деградация Nrf2 протекает в цитозоле (Itoh et al, 2003). Pro Та сосредоточен в ядре. Полученные результаты указывают на то, что диссоциация Nrf2 от Keapl белком РгоТа происходит в ядре. В этом случае вытеснение Nrf2 не должно приводить к заметной стабилизации этого белка, поскольку в ядре Nrf2 не подвержен Кеар1-опосредованным убиквитинированию и деградации.

И 11

MG- ¡32 - + - + +

• f

v AiiTn-Nrt"2

MG-132 - + - + 1 1

AHTii-Nff2 -

Анти-Keapl —' — — ПОкДа

Анти-РгоТа — —

Вектор + + - - Вектор + + - - +

Keapl + + + + Keap! + + +- + +■

РгоТа - - + + РгоТа - - + + -

NiT2 + + + + Nrt2 + + + + -

Рисунок 7. РгоТа не оказывает влияния на внутриклеточный уровень и степень убиквитинирования транскрипционного фактора Nrf2. А. Иммуноблот суммарных лизатов клеток HeLa, содержащих нормальное и повышенное количество РгоТа. Для детекции белков Keapl и Nrf2 разделенные в ПААГ белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану, для детекции РгоТа - на мембрану Hybond N+. Б. Анализ иммунопреципитатов, полученных из лизатов клеток HeLa. Иммунопреципитация с использованием антител к убиквитину, анализ иммунопреципитатов - с помощью антител к Nrf2. Отмеченная область (120 кДа) соответствует электрофоретической подвижности неубиквитинированного Nrf2.

5. Устойчивость РгоТа к Keapl-зявисимому экспорту из ядра обусловлена сигналом ядерной локализации в структуре РгоТа

Устойчивость РгоТа в отношении опосредованного Keapl убиквитинирования может быть связана с особенностями структуры РгоТа, который, в отличие от хорошо свернутого и организованного в домены Nrf2, представляет собой статистический клубок. В то же время, причины устойчивости РгоТа в отношении его экспорта из ядра белком Keapl были не

ясны Ядерная локализация РгоТа определяется наличием в его структуре сигнала ядерной локализации (ЛЬБ), представляющего собой два блока положительно заряженных аминокислотных остатков в С-концевой части молекулы белка (Рисунок 8)

Двойная мутация,

нарушающая взаимодействие с К.еар1

^^ Ю0<

44 Ш ИбО 87Н

_м_+ м

ЁШИ (Е! № КЮ

109

1109

Предполагаемый участок связывания Кеар!

Сигнал ядерной локализации

Рисунок 8. Схематическое изображение РгоТа и его мутантов по сигналу ядерной локализации и участку связывания Кеар1 Над схемой РгоТа указаны мутации, нарушающие взаимодействие РгоТа с Кеар1 или активность его сигнала ядерной локализации Номера соответствуют позициям аминокислотных остатков в последовательности РгоТа человека

Ранее было показано, что мутации в любом из двух блоков N1^3 нарушают ядерную локализацию РгоТа В частности, замена К87Е приводит к частичному перераспределению РгоТа в цитоплазму с преобладанием локализации в ядре, а делеция С-концевых остатков 100-109 полностью инактивирует N1^ РгоТа и приводит к диффузному распределению РгоТа по клетке (ШЛйоу Й а1, 1997) Мы решили воспользоваться этими мутантами РгоТа по N1^ для выяснения возможного действия белка Кеар1 на внутриклеточную локализацию РгоТа

Для оценки внутриклеточного распределения мутантов РгоТа по N1^ клетки НеЬа были трансфицированы плазмидой, кодирующей РгоТа (К87Е) или РгоТа (1-99), либо РгоТа дикого типа в качестве контроля В трансфицированных клетках с помощью специфических антител определяли внутриклеточное распределение РгоТа Локализация эктопического РгоТа была исследована на фоне эндогенного, поэтому во всех случаях РгоТа отчетливо

детектировался и в ядре Однако, если РгоТа дикого типа был исключительно ядерным, то мутанты РгоТа по NLS, как и ожидалось, давали отчетливый сигнал в дитозоле (Рисунок 9, верхний ряд)

Оценка внутриклеточной локализации мутантов РгоТа по NSL в клетках, копродуцирующих эктопический Keapl, показала, что мутантый РгоТа, но не белок дикого типа, был локализован преимущественно в цитоплазме (Рисунок 9, средний ряд) Этот эффект был отчетливо виден даже на фоне остающегося в ядре эндогенного РгоТа, устойчивого к Keapl-опосредованной перелокализации в цитоплазму Это означало, что Keapl в значительной степени усиливает экспорт РгоТа из ядра клетки Этот результат означал, что Keapl способен экспортировать РгоТа из ядра в цитоплазму, но, благодаря сильному сигналу ядерной локализации в структуре белка дикого типа, РгоТа возвращается в ядро клетки, тем самым избегая накопления в цитоплазме Также этот результат был независимым свидетельством в пользу того, что РгоТа и Keapl взаимодействуют in vivo

Чтобы выяснить, является ли эффект перераспределения мутантов РгоТа из ядра в цитоплазму результатом прямого взаимодействия РгоТа с белком Keapl, мы сконструировали "двойные" мутанты РгоТа, содержащие ослабленный NLS и неспособные взаимодействовать с Keapl Ранее было установлено, что взаимодействие Keapl и Nrf2 опосредовано последовательностью ETGE в структуре Nrf2 Аналогичный мотив - ENGE -присутствует и в структуре РгоТа (Рисунок 8), и мутации в этой области нарушают взаимодействие Keapl с РгоТа Эксперименты по иммунофлуоресцентному окрашиванию клеток HeLa, сверхпродуцирующих мутанты РгоТа (E44G, E50G, К87Е) и РгоТа (1-99, E44G, E50G) показали, что наличие "двойных" мутаций не изменяло внутриклеточной локализации РгоТа по сравнению с локализацией РгоТа (К87Е) и РгоТа (1-99) (данные не приведены)

Копродукция мутантов РгоТа (E44G, E50G, К87Е) и РгоТа (1-99, E44G, E50G) с бел ком Keapl не приводила к перелокализации РгоТа в цитоплазму

РгоТа (дикий тип N18) РгоТа (К87Е) РгоТа(1-99)

Рисунок 9. Кеар1 экспортирует из ядра мутанты РгоТа с ослабленным сигналом ядреной локализации. Флуоресцентные микрофотографии трансфицированных клеток линии НеЬа, окрашенных с помощью моноклональных антител к РгоТа. Для трансфеции использовали смеси плазмид, указанных в верхней и левой частях рисунка. Подпись Е440, Е5(Ю в последнем ряду означает, что используемые для трансфекции РгоТа-кодирующие плазмиды содержали также замены, соответствующие мутациям Е440, Е50С в структуре РгоТа.

(Рисунок 9, нижний ряд) так, как это имело место в случае мутантов РгоТа по NLS, способных взаимодействовать с Keapl.

Полученные данные указывали на то, что для экспорта РгоТа из ядра необходимо взаимодействие РгоТа с белком Keapl так же, как и в случае экспорта транскрипционного фактора Nrf2. Продемонстрировав, что Keapl способен экспортировать из ядра РгоТа с ослабленным NLS, мы оценили способность Keapl опосредовать убиквитинирование РгоТа в этом случае. Для этого клетки HeLa были котрансфицированы смесью плазмид, кодирующих (His)e-Ub, Keapl и один из мутантов РгоТа - (К87Е) или (1-99). Аналогично экспериментам, описанным в разделе 2, клетки были обработаны ингибитором протеасомы MG-132 и лизированы, после чего очищенные на Ni-NTA-агарозе убиквитинированные белки были проанализированы методом иммуноблоттинга с использованием двух типов моноклональных антител, узнающих разные эпитопы в молекуле РгоТа. И в случае РгоТа (К87Е), и в случае РгоТа (1-99) отличный от фона сигнал отсутствовал (данные не приведены). Мы приняли во внимание, что остатки лизина являются местами присоединения убиквитина в убиквитинируемых белках. Поскольку убиквитинирования не наблюдалось для обоих мутантов РгоТа - РгоТа (К87Е) и РгоТа (1-99), в совокупности содержащих все остатки лизина, имеющиеся у РгоТа дикого типа, мы заключили, что устойчивость РгоТа к опосредованному Keapl убиквитинированию не связана с локализацией РгоТа в ядре, а обусловлена другими причинами.

V РгоТа и РгоТа (К87Е)

•гтт «« >и*™ JL, <-РгоТа (1-99)

М 1 2 3 4

Рисунок 10. Keapl ве оказывает существенного влияния на внутриклеточный уровень мутантов РгоТа с ядерно-цнтоплазматической локализацией. Частично очищенные препараты РгоТа из лизатов клеток HeLa анализировали методом электрофореза в 8% ПААГ с 7М мочевиной. Гели окрашены метиленовым синим.

Дорожки: М. Рекомбинантный РгоТа (маркер). Препараты лизатов клеток, продуцирующих: 1. РгоТа (К87Е) 2. РгоТа (К87Е) и Keapl, 3. РгоТа (1-99), 4. РгоТа (1-99) и Keap 1.

Оценка уровня сверхпродукции ProTa (К87Е) и РгоТа (1-99) при их отдельной продукции и копродукции с Keapl показала, что Keapl не вызывает видимого снижения внутриклеточного уровня мутантов ProTa по NLS (Рисунок 10) Этот результат согласовывался с заключениями о том, что локализация РгоТа в цитоплазме не является достаточным условием убиквитинирования и деградации РгоТа

Заключение

В работе проведено сравнение действия адаптера убиквитин-лигазы белка Keapl на два взаимодействующих с ним белка- ядерный белок РгоТа и транскрипционный фактор Nrf2 Полученные нами данные позволяют заключить, что несмотря на то, что транскрипционный фактор Nr£2 и РгоТа взаимодействуют с одним и тем же доменом белка Keapl, последствия этого взаимодействия для партнеров Keapl существенно отличаются Транскрипционный фактор Nrf2 в результате взаимодействия с белком Keapl перелокализуется из ядра в цитоплазму, подвергается убиквитинированию и последующей протеасомной деградации Ни одного из этих событий не наблюдается в случае с белком РгоТа

Причину устойчивости РгоТа к опосредованному белком Keapl убиквитинированию предстоит выяснить, но она не связана с локализацией РгоТа в ядре Вероятно, играют роль структурные различия между РгоТа и Nrf2, поскольку Nrf2 представляет собой хорошо свернутый белок, а РгоТа представляет смесь переходящих друг в друга конформеров статистически свернутого клубка

Как выяснено, за неспособность Keapl вызывать перелокализацию РгоТа из ядра в цитоплазму отвечает сильный сигнал ядерной локализации РгоТа Исследование мутантов с ослабленным сигналом ядерной локализации показало, что Keapl осуществляет экспорт РгоТа из ядра в цитоплазму Однако РгоТа дикого типа способен быстро возвращаться в ядро клетки, благодаря чему не происходит его накопления в цитоплазме

Ранее было показано, что РгоТа, являясь белком с небольшой молекулярной массой, может покидать ядро клетки посредством пассивной диффузии (Епкетапп е! а1, 2000) Мы продемонстрировали существование еще одного механизма выхода РгоТа из ядра клетки активного экспорта из ядра белком Кеар1 Физиологическую значимость этого явления предстоит выяснить В этой связи интересно отметить, что используемый в нашей работе мутант РгоТа (1-99) является природной формой РгоТа в условиях апоптоза В ходе апоптоза РгоТа расщепляется каспазами, утрачивая 10 С-концевых аминокислотных остатков, а с ними и функциональный сигнал ядерной локализации (Еуз1айеуа е! а1, 2000) В результате РгоТа диффузионно распределяется по клетке, а часть его экспонируется на внешнюю сторону клеточной мембраны, что может иметь отношение к дальнейшему узнаванию апоптотических клеток клетками иммунной системы (Еуз1айеуа е(. а1, 2003) Кажется вероятным, что активный экспорт РгоТа (1-99) белком Кеар1, наблюдаемый нами на примере эктопических белков, может вносить вклад в быстрый выход РгоТа (1-99) из ядра в условиях апоптоза

Наконец, полученные нами данные дают основание полагать, что роль РгоТа в усилении №12-зависимой транскрипции генов, защищающей клетку от окислительного стресса, заключается не в подавлении активности Кеар1 как адаптера убиквитин-лигазы, а, по-видимому, в усилении диссоциации протимозином а комплекса белков №12 и Кеар1 при его попадании в ядро

ВЫВОДЫ:

1 Протимозин а человека, являясь молекулярным партнером адаптера убиквитин-лигазы белка Keapl, не подвергается убиквитинированию и деградации протеасомой

2 Протимозин а сохраняет свою ядерную локализацию в клетках человека в присутствии белка Keapl.

3 Keapl способен экспортировать из ядра в цитоплазму мутанты протимозина а с ослабленным сигналом ядерной локализации Этот результат доказывает, что белки Keapl и протимозин а взаимодействуют т vivo, и что наличие сильного сигнала ядерной локализации в структуре протимозина а является причиной устойчивости протимозина а дикого типа к перераспределению белком Keapl из ядра в цитоплазму

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1 Мельников С В, Евстафьева А Г, Вартапетян А Б (2007) Взаимодействие белка протимозина альфа с белком Keapl не приводит к убиквигинированин> и деградации протимозина альфа. // Молекулярная биология, 41(5) 868-875.

2 Karapetian R N , Evstafieva A G, Abaeva I S , Chichkova N V, Filonov G S , Rubtsov Y P, Sukhacheva E A , Melnikov S V, Schneider U, Wanker E E, and Vartapetian A В (2005) Nuclear oncoprotein prothymosin a îs a partner of Keapl: Implications for expression of oxidative stress-protecting genes. // Mol

Cell Biol, 25(3) 1089-1099

3 Евстафьева A Г , Карапетян P H , Рубцов Ю П, Филонов Г С, Абаева И С, Фатеева Т В , Мельников С В , Чичкова H В , Вартапетян А Б (2005) Новые функции известного белка: участие протимозина альфа в защите клеток от апоптоза и окислительного стресса. // Молекулярная биология, 39(5) 729-745

4 Решетов Д А, Мельников С В (2007) Роль гомодимеризации белка Keapl в системе клеточного ответа на окислительный стресс. // XIV

Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», секция "Биоинформатика и биоинжерения", т I, с 44

5 Мельников С В, Филонов Г С (2005) Ядерно-цитонлазматический транспорт белков Nrf2 и Keapl в регуляции ответа клетки на окислительный стресс. // XII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», секция "Биоинформатика и биоинжерения", т II, с 48-49

6 MeFnikov S V, Filonov G S (2005) Keapl is a shuttling protein and its nuclear export contributes to negative régulation of Nrf2. // XII

Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», секция "Химия", т I, с 206

Подписано в печать 18 03 2008 Формат 60x88 1/16 Объем 1 0 п л Тираж 100 экз Заказ №707 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к А-102

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ФУНКЦИИ ПРОТИМОЗИНА а обзор литературы).

1.1. Протимозин а (РгоТа) - многофункциональный белок позвоночных животных.

1.2. Структура РгоТа.

1.2.1. Аминокислотный состав и первичная структура РгоТа.

1.2.2. Пространственная структура РгоТа.

1.2.3. Посттрансляционные модификации РгоТа.

1.3. Количество РгоТа в клетках различных тканей.

1.4. Внутриклеточная локализация РгоТа.

1.4.1. РгоТа содержит сигнал ядерной локализации.

1.4.2. РгоТа - ядерный белок, непрерывно мигрирующий между ядром и цитоплазмой.

1.4.3. В ядре клетки РгоТа сосредоточен в гранулообразных доменах

1.5. Внутриклеточные функции РгоТа.

1.5.1. РгоТа ускоряет прохождение клетки по циклу деления.

1.5.2. РгоТа является гистон-связывающим белком in vitro и в лизатах клеток и деконденсирует хроматин клеток при сверхпродукции.

1.5.3. РгоТа специфически усиливает экспрессию некоторых генов

1.5.4. РгоТа подавляет апоптотический путь клеточной смерти и расщепляется в процессе апоптоза.

1.5.5. РгоТа взаимодействует с белком Keapl.

2. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ВЗАИМОДЕЙСВТИЯ ПРОТИМОЗИНА а С БЕЛКОМ КЕАР1 (результаты и обсуждение)

2.1. РгоТа - стабильный белок, не подверженный деградации 26S протеасомой.

2.2. РгоТа не подвержен убиквитинированию.

2.3. РгоТа не оказывает влияния на степень убиквитинирования транскрипционного фактора Nrf2.

2.4. ProTa устойчив к Keapl-зависимому экспорту из ядра.

2.5. Устойчивость РгоТа к Keapl-зависимому экспорту из ядра обусловлена сигналом ядерной локализации в структуре РгоТа.

В природе, помимо свернутых в глобулы и фибриллы белков, существует малоисследованная группа полипептидов, лишенных стабильных элементов вторичной и третичной структуры. Эти белки, называемые несвернутыми (natively unfolded) или природно неупорядоченными (intrinsically disordered), существуют в клетке в виде переходящих друг в друга конформеров неупорядоченного клубка, но это не мешает им выполнять важные биологические функции как в процессах нормальной жизнедеятельности клетки, так и в процессах адаптации к различным воздействиям на клетку окружающей среды.Данная работа посвящена исследованию свойств несвернутого белка протимозина а. Этот белок обладает целым рядом уникальных свойств, необычных для большинства белковых молекул. Исследования последних лет показали, что протимозин а обладает множеством биологических функций и для некоторых из них был установлен механизм. В частности, в нашей лаборатории было показано, что протимозин а является молекулярным партнером белка Keapl, который, в свою очередь, был охарактеризован как адаптер убиквитин-лигазы, направляющий белки на деградацию. В данной работе наши усилия были направлены на выявление возможных последствий для протимозина а от его взаимодействия с белком Keapl.

1. Протимозин а человека, являясь молекулярным партнером адаптера убиквитин-лигазы белка Keapl, не подвергается убиквитинированию и деградации протеасомой.2. Протимозин а сохраняет свою ядерную локализацию в клетках человека в присутствии белка Keapl.3. Keapl способен экспортировать из ядра в цитоплазму мутанты протимозина а с ослабленным сигналом ядерной локализации. Этот результат доказывает, что белки Keapl и протимозин а взаимодействуют in vivo, и что наличие сильного сигнала ядерной локализации в структуре протимозина а является причиной устойчивости протимозина а дикого типа к перераспределению белком Keapl из ядра в цитоплазму.

1. Haritos А.А., Goodall G.J. & Horecker B.L. // Prothymosin alpha: isolation and properties of the major immunoreactive form of thymosin alpha I in rat thymus. Proc Natl Acad Sci U S A, 1984. 81(4): 1008-11.

2. Haritos A.A., Tsolas O. & Horecker B.L. // Distribution of prothymosin alpha in rat tissues. Proc Natl Acad Sci U S A , 1984. 81(5): 1391-3.

3. Clinton M., Frangou-Lazaridis M., Panneerselvam C. & Horecker B.L. // Prothymosin alpha and parathymosin: mRNA and polypeptide levels in rodent tissues. Arch Biochem Biophys, 1989. 269(1): 256-63.

4. Eschenfeldt W.H. & Berger S.L. // The human prothymosin alpha gene is polymorphic and induced upon growth stimulation: evidence using a cloned cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A , 1986. 83(24): 9403-7.

5. Pan L.X., Haritos A.A., Wideman J., Komiyama Т., Chang M., Stein S., Salvin S.B'. & Horecker B.L. // Human prothymosin alpha: amino acid sequence and immunologic properties. Arch Biochem Biophys, 1986.250(1): 197-201.

6. Panneerselvam C , Wellner D. & Horecker B.L. // The aminos acid sequence of bovine thymus prothymosin alpha. Arch Biochem Biophys, 1988. 265(2): 454-7.

7. Economou M., Seferiadis K., Frangou-Lazaridis M., Horecker B.L. & Tsolas O. // Isolation and partial characterization of prothymosin alpha from porcine tissues. FEBS Lett, 1988. 233(2): 342-6.

8. Frillingos S., Frangou-Lazaridis M., Seferiadis K., Hulmes J.D., Pan Y.C. & Tsolas O. // Isolation and partial sequence of goat spleen prothymosin alpha. Mol Cell Biochem, 1991. 108(1): 85-94.

9. Aniello F., Branno M., De Rienzo G., Ferrara D., Palmiero C. & Minucci S. // First evidence of prothymosin alpha in a non-mammalian vertebrate and its involvement in the spermatogenesis of the frog Rana esculenta. Mech Dev, 2002. 110(1-2): 213-7.

10. Donizetti A., Liccardo D., Esposito D., Del Gaudio R., Locascio A., Ferrara D., Minucci S. & Aniello F. // Differential expression of duplicated genes for prothymosin alpha during zebrafish development. Dev Dyn, 2008. 237(4): 1112-18.

11. Papamarcaki T. & Tsolas O. // Prothymosin alpha binds to histone HI in vitro. FEBS Lett, 1994. 345(1): 71-5.

12. Diaz-Jullien C , Perez-Estevez A., Covelo G. & Freire M. // Prothymosin alpha binds histones in vitro and shows activity in nucleosome assembly assay. Biochim Biophys Acta, 1996. 1296(2): 219-27.

13. Karetsou Z., Sandaltzopoulos R., Frangou-Lazaridis M., Lai C.Y., Tsolas O., Becker P.B. & Papamarcaki T. // Prothymosin alpha* modulates the interaction of histone HI with chromatin. Nucleic Acids Res, 1998. 26(13): 3111-8.

14. Gomez-Marquez J. & Rodriguez P. // Prothymosin alpha is a chromatin-remodelling protein in mammalian cells. Biochem J, 1998. 333 (Pt 1)1-3.

15. Covelo G., Sarandeses C.S., Diaz-Jullien С & Freire M. // Prothymosin alpha interacts with free core histones in the nucleus of dividing cells. J Biochem, 2006. 140(5): 627-37.

16. Cotter M.A., 2nd & Robertson E.S. // Modulation of histone acetyltransferase activity through interaction of epstein-barr nuclear antigen 3C with prothymosin alpha. Mol Cell Biol, 2000. 20(15): 5722-35.

17. Knight J.S., Lan K., Subramanian С & Robertson E.S. // Epstein-Barr. virus nuclear antigen 3C recruits histone deacetylase activity and associates-with the corepressors mSin3A and NCoR in human B-cell lines. J Virol, 2003. 77(7): 4261-72.

18. Karetsou Z., Kretsovali A., Murphy C , Tsolas O. & Papamarcaki T. // Prothymosin alpha interacts with the CREB-binding protein and potentiates transcription: EMBO Rep, 2002. 3(4): 361-6.

19. Malicet C, Giroux V., Vasseur S., Dagorn J.C., Neira J.L. & Iovanna J.L. // Regulation of apoptosis by the p8/prothymosin alpha complex. Proc Natl Acad Sci U S A , 2006. 103(8): 2671-6.

20. Karetsou Z., Martic G., Tavoulari S., Christoforidis S., Wilm M., Grass С & Papamarcaki T. // Prothymosin alpha associates with the oncoprotein SET and is involved in chromatin decondensation. FEBS 1.ett, 2004. 577(3): 496-500.

21. Kubota S., Adachi Y., Copeland T.D. & Oroszlan S. // Binding of human<prothymosin alpha to the leucine-motif/activation domains of HTLV-IRex andHIV-1 Rev. Eur J Biochem, 1995. 233(1): 48-54.

22. Pineiro A., Cordero O.J. & Nogueira M. // Fifteen years of prothymosin alpha: contradictory past and new horizons. Peptides, 2000. 21(9): 1433-46.

23. Fujita R. & Ueda H. // Prothymosin-alphal prevents necrosis and apoptosis following stroke. Cell Death Differ, 2007. 14(10): 1839-42.

24. Leone A., Krug M.S., Manrow R.E. & Berger S.L. // Mapping introns by exon excision. Anal Biochem, 1989. 183(1): 64-73.

25. Eschenfeldt W.H., Manrow R.E., Krug M.S. & Berger S.L. // Isolation and partial sequencing of the human prothymosin alpha gene family. Evidence against export of the gene products. J Biol Chem, 1989. 264(13): 7546-55.

26. Manrow R.E., Leone A., Krug M.S., Eschenfeldt W.H. & Berger S.L. // The human prothymosin alpha gene family contains several processed pseudogenes lacking deleterious lesions. Genomics, 1992. 13(2): 319-31.

27. Rubtsov Iu P. & Vartapetian A.B. // New intronless members of human prothymosin alpha genes. Mol Biol (Mosk), 1995. 29(6): 1320-5.

28. Manrow R.E. & Berger S.L. // GAG triplets as splice acceptors of last resort. An unusual form of alternative splicing in prothymosin alpha pre-mRNA. J Mol Biol, 1993. 234(2): 281-8.

29. Goodall G.J., Dominguez F. & Horecker B.L. // Molecular cloning of cDNAfor human prothymosin alpha. Proc Natl Acad Sci U S A , 1986. 83(23): 8926-8.

30. Cordero O.J., Sarandeses C.S., Lopez J.L. & Nogueira M. // On the anomalous behaviour on gel-filtration and SDS-electrophoresis of prothymosin-alpha. Biochem Int, 1992. 28(6): 1117-24.

31. Zirwes R.F., Schmidt-Zachmann M.S. & Franke W.W. // Identification of a small, very acidic constitutive nucleolar protein (N029) as a member of the nucleoplasmin family. Proc Natl Acad Sci U S A , 1997. 94(21): 11387-92.

32. Garcia-Ortega L., De los Rios V., Martinez-Ruiz A., Onaderra M., 1.acadena J., Martinez del Pozo A. & Gavilanes J.G. // Anomalous electrophoretic behavior of a very acidic protein: ribonuclease U2. Electrophoresis, 2005. 26(18): 3407-13.

33. Haritos A.A., Salvin S.B., Blacher R., Stein S. & Horecker B.L. // Parathymosin alpha: a peptide from rat tissues with structural homology to prothymosin alpha. Proc Natl Acad Sci U S A , 1985. 82(4): 1050-3.

34. Frangou-Lazaridis M., Clinton M., Goodall G.J. & Horecker B.L. // Prothymosin alpha and parathymosin: amino acid sequences deduced from the cloned rat spleen cDNAs. Arch Biochem Biophys, 1988. 263(2): 305-10.

35. Komiyama Т., Pan L.X., Haritos A.A., Wideman J.W., Pan Y.C., Chang M., Rogers I. & Horecker B.L. // The primary structure of rat parathymosin. Proc Natl Acad Sci U S A , 1986. 83(5): 1242-5.

36. Clinton M., Frangou-Lazaridis M., Panneerselvam С & Horecker B.L. // The sequence of human parathymosin deduced from a > cloned human kidney cDNA. Biochem Biophys Res Commun, 1989. 158(3): 855-62.

37. Watts J.D., Cary P.D., Sautiere P. & Crane-Robinson C. // Thymosins: both nuclear and cytoplasmic proteins. Eur J Biochem, 1990. 192(3): 643-51.

38. Gast K., Damaschun H., Eckert K., Schulze-Forster K., Maurer H.R., Muller-Frohne M., Zirwer D., Czarnecki J. & Damaschun G. // Prothymosin alpha: a biologically active protein with random coil conformation. Biochemistry, 1995. 34(40): 13211-8.

39. Gast K., Zirwer D. & Damaschun G. // Are there temperature- dependent structural transitions in the "intrinsically unstructured" protein prothymosin alpha? Eur Biophys J, 2003. 31(8): 586-94.

40. Haritos A.A., Yialouris P.P., Heimer E.P., Felix A.M., Hannappel E. & Rosemeyer M.A. // Evidence for the monomeric nature of thymosins. FEBS Lett, 1989. 244(2): 287-90.

41. Fink A.L. // Natively unfolded proteins. Curr Opin Struct Biol, 2005. 15(1): 35-41.

42. Dutta K., Alexandrov A., Huang H. & Pascal S.M. // pH-induced folding of an apoptotic coiled coil. Protein Sci, 2001. 10(12): 2531-40.

43. Goyal K., Tisi L., Basran A., Browne J., Burnell A., Zurdo J. & Tunnacliffe A. // Transition from natively unfolded to folded state induced by desiccation in an anhydrobiotic nematode protein. J Biol Chem, 2003. 278(15): 12977-84.

44. Kumar N., Shukla S., Kumar S., Suryawanshi A., Chaudhry U., Ramachandran S. & Maiti S. // Intrinsically disordered protein from a pathogenic mesophile Mycobacterium tuberculosis adopts structured conformation at high temperature. Proteins, 2007.

45. Chichkova N.V., Evstafieva A.G., Lyakhov I.G., Tsvetkov A.S., Smirnova T.A., Karapetian R.N., Karger E.M. & Vartapetian A.B. // Divalent' metal cation binding properties of human prothymosin alpha. Eur J Biochem, 2000. 267(15): 4745-52.

46. Barcia M.G., Castro J.M., Jullien CD., Gonzalez C.G. & Freire M. // Prothymosin alpha is phosphorylated by casein kinase-2. FEBS Lett, 1992.312(2-3): 152-6.

47. Barcia M.G., Castro J.M., Jullien C D . & Freire M. // Prothymosin alpha is phosphorylated in proliferating stimulated cells. J Biol Chem, 1993. 268(7): 4704-8.

48. Perez-Estevez A., Diaz-Jullien C , Covelo G., Salgueiro M.T. & Freire M. // A 180-kDa protein kinase seems to be responsible for the phosphorylation of prothymosin alpha observed in proliferating cells. J Biol Chem, 1997.272(16): 10506-13.

49. Perez-Estevez A., Freire J., Sarandeses C, Covelo G., Diaz-Jullien С & Freire M. // Properties of the protein kinase that phosphorylates prothymosin alpha. Mol Cell Biochem, 2000. 208(1-2): 111-8.

50. Sburlati A.R., De La Rosa A., Batey D.W., Kurys G.L., Manrow R.E., Pannell L.K., Martin B.M., Sheeley D.M. & Berger S.L. // Phosphorylation of human and bovine prothymosin^ alpha in vivo. Biochemistry, 1993. 32(17): 4587-96.

51. Trumbore M.W., Wang R.H., Enkemann S.A. & Berger S.L. // Prothymosin alpha in vivo contains phosphorylated glutamic acid residues. J Biol Chem, 1997. 272(42): 26394-404.

52. Wang R.H., Tao L., Trumbore M.W. & Berger S.L. // Turnover of the acyl phosphates of human and murine prothymosin alpha in vivo. J Biol Chem, 1997. 272(42): 26405-12.

53. Tao L., Wang R.H., Enkemann S.A., Trumbore M.W. & Berger S.L. // Metabolic regulation of protein-bound glutamyl phosphates: insights into the function of prothymosin alpha. J Cell Physiol, 1999. 178(2): 154-63.

54. Lukashev D.E., Chichkova N.V. & Vartapetian A.B. // Multiple tRNA attachment sites in prothymosin alpha. FEBS Lett, 1999. 451(2): 118-24.

55. Makarova Т., Grebenshikov N., Egorov C , Vartapetian A. & Bogdanov A. // Prothymosin alpha is an evolutionary conserved protein covalently linked to a small RNA. FEBS Lett, 1989. 257(2): 247-50.

56. Vartapetian A., Lukashev D., Lyakhov I., Belyaeva A., Chichkova N. & Bogdanov A. // Mammalian prothymosin alpha links to tRNA in Escherichia coli cells. Rna, 1997.3(10): 1173-81.

57. Gomez-Marquez J., Segade F., Dosil M., Pichel J.G., Bustelo X.R. & Freire M. // The expression of prothymosin alpha gene in T lymphocytes and leukemic lymphoid cells is tied to lymphocyte proliferation. J Biol Chem, 1989. 264(15): 8451-4.

58. De Rienzo G., Di Sena R., Ferrara D., Palmiero C , Chieffi Baccari G. & Minucci S. // Temporal, and, spatial localization of prothymosin alpha transcript in the Harderian gland, of the frog, Rana esculenta. J Exp Zool, 2002. 292(7): 633-9:

59. Franco F.J., Diaz G., Barcia M. & Freire M. // Thymosin, alpha 1 is a native peptide in several tissues. Biochim Biophys Acta, 1992. 1120(1): 43-8.

60. Freire M., Rey-Mendez M., Gomez-Marquez J. & Arias P. // Evidence for the synthesis of thymosin alpha 1 by calf thymocytes and the production of this peptide by natural processing. Arch Biochem Biophys, 1985. 239(2): 480-5.

61. Sburlati A.R., Manrow R.E. & Berger S.L. // Humaniprothymosin alpha: purification of a highly acidic nuclear protein by means of a phenol extraction. Protein Expr Purif, 1990. 1(2): 184-90.

62. Gomez-Marquez J. & Segade F. // Prothymosin alpha is a nuclear protein. FEBS Lett, 1988. 226(2): 217-9.

63. Clinton M., Graeve L., el-Dorry H., Rodriguez-Boulan E. & Horecker B.L. // Evidence for nuclear targeting of prothymosin and parathymosin synthesized in situ. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(15): 6608-12.

64. Manrow R.E., Sburlati A.R., Hanover J.A. & Berger S.L. // Nuclear targeting of prothymosin alpha. J Biol Chem, 1991. 266(6): 3916-24.

65. Gorlich D. & Kutay U. // Transport between the cell nucleus and the cytoplasm; Annu Rev Cell Dev Biol, 1999. 15607-60.

66. Strom A.C. & Weis K. // Importin-beta-like nuclear transport, receptors. Genome Biol, 2001. 2(6): REVIEWS3008.

67. Watts J.D., Cary P.D. & Crane-Robinson С // Prothymosin alpha is a nuclear protein. FEBS Lett, 1989. 245(1-2): 17-20.

68. Enkemann S.A., Ward R.D. & Berger S.L. // Mobility within the nucleus and neighboring cytosol is a key feature of prothymosin-alpha. J Histochem Cytochem, 2000. 48(10): 1341-55.

69. Tsitsiloni O.E., Yialouris P.P., Sekeri-Pataryas K. & Haritos A.A. // Prothymosin alpha is not a nuclear polypeptide. Experientia, 1989. 45(4): 332-4.

70. Tsitsiloni O.E., Yialouris P.P., Echner H., Voelter W. & Haritos A.A. // Evidence for the extranuclear localization of thymosins in thymus. Experientia, 1992. 48(4): 398-402.

71. Fabien N., Auger С & Monier J.C. // Immunolocalization of thymosin alpha 1, thymopoietin and thymulin in mouse thymic epithelial cells at different stages of culture: a light and electron microscopic study. Immunology, 1988. 63(4): 721-7.

72. Auger C, Stahli C , Fabien N. & Monier J.C. // Intracellular localization of thymosin alpha 1 by immunoelectron microscopy using: a monoclonal antibody. J Histochem Cytochem, 1987. 35(2): 181-7.

73. Castro J.M. & Barcia M.G. // Localization of prothymosin alpha in the nucleus. Biochem Biophys Res Commun, 1996. 224(1): 140-6.

74. Vareli K. & Frangou-Lazaridis M. // Prothymosin alpha is localized in mitotic spindle during mitosis. Biol Cell, 2004. 96(6): 421-8.

75. Bustelo X.R., Otero A., Gomez-Marquez J. & Freire M. // Expression of the rat prothymosin alpha gene during T-lymphocyte proliferation and liver regeneration. J Biol Chem, 1991. 266(3): 1443-7.

76. Zalvide J.B., Cancio E., Alvarez C.V., Regueiro В J . & Dominguez F. // Prothymosin alpha mRNA levels are invariant throughout the cell cycle. J Biol Chem, 1992. 267(12): 8692-5.

77. Gaubatz S., Meichle A. & Eilers M. // An E-box element localized in the first intron mediates regulation of the prothymosin alpha gene by c-myc. Mol Cell Biol, 1994. 14(6): 3853-62.

78. Desbarats L., Gaubatz S. & Eilers M. // Discrimination between different E-box-binding proteins at an endogenous target gene of c-myc. Genes Dev, 1996. 10(4): 447-60.

79. Walhout A.J., van der Vliet P.C. & Timmers H.T. // Sequences flanking the E-box contribute to cooperative binding by c-Myc/Max heterodimers to adjacent binding sites. Biochim Biophys Acta, 1998. 1397(2): 189-201.

80. Eilers M., Schirm S. & Bishop J.M. // The MYC protein activates transcription, of the alpha-prothymosin gene. Embo J, 1991. 10(1): 133-41.

81. Capeans C , Pineiro A., Dominguez F., Loidi L., Buceta M., Carneiro C, Garcia-Caballero T. & Sanchez-Salorio M. // A c-myc antisense oligonucleotide inhibits human retinal pigment epithelial cell proliferation. Exp Eye Res, 1998. 66(5): 581-9.

82. Mori M., Barnard G.F., Staniunas R.J., Jessup J.M., Steele G.D., Jr. & Chen L.B. // Prothymosin-alpha mRNA expression correlates with that of c-myc in human colon cancer. Oncogene, 1993. 8(10): 2821-6.

83. Moll J., Schmid P., Sansig G. & van der Putten H. // The pattern of prothymosin alpha gene expression coincides with that of myc proto-oncogenes during mouse embryogenesis. Histochem J, 1996. 28(1): 45-52.

84. Ben-Yosef Т., Yanuka O., Halle D. & Benvenisty N. // Involvement of Мус targets in c-myc and N-myc induced human tumors. Oncogene, 1998. 17(2): 165-71.

85. Kinoshita Т., Shirasawa H., Shino Y., Moriya H., Desbarats L., Eilers M. & Simizu B. // Transactivation of prothymosin alpha and c-myc promoters by human papillomavirus type 16 E6 protein. Virology, 1997. 232(1): 53-61.

86. Mol P.C., Wang R.H., Batey D.W., Lee L.A., Dang C.V. & Berger S.L. // Do products of the myc proto-oncogene play a role • in transcriptional regulation of the prothymosin alpha gene? Mol Cell Biol, 1995. 15(12): 6999-7009.

87. Dosil M., Freire M. & Gomez-Marquez J. // Tissue-specific and differential expression of prothymosin alpha gene during rat development. FEBS Lett, 1990. 269(2): 373-6.

88. Dosil M., Alvarez-Fernandez L. & Gomez-Marquez J. // Differentiation-linked expression of prothymosin alpha gene in human myeloid leukemic cells. Exp Cell Res, 1993. 204(1): 94-101.

89. Smith M.R., al-Katib A., Mohammad R., Silverman A., Szabo P., Khilnani S., Kohler W., Nath R. & Mutchnick M.G. // Prothymosin alpha gene expression correlates with proliferation, not differentiation, of HL-60 cells. Blood, 1993. 82(4): 1127-32.

90. Sburlati A.R., Manrow R.E. & Berger S.L. // Prothymosin alpha antisense oligomers inhibit myeloma cell division. Proc Natl Acad Sci U S A , 1991. 88(1): 253-7.

91. Rodriguez P., Vinuela J.E., Alvarez-Fernandez L. & Gomez-Marquez J. // Prothymosin alpha antisense oligonucleotides induce apoptosis in HL-60 cells. Cell Death Differ, 1999. 6(1): 3-5.

92. Rodriguez P., Vinuela J.E., Alvarez-Fernandez L., Buceta M., Vidal A., Dominguez F. & Gomez-Marquez J. // Overexpression of prothymosin alpha accelerates proliferation and retards differentiation in HL-60 cells. Biochem J, 1998. 331 ( Pt 3)753-61.

93. Wu C.L., Shiau A.L. & Lin C.S. // Prothymosin alpha promotes cell proliferation in NIH3T3 cells. Life Sci, 1997. 61(21): 2091-101.

94. Orre R.S., Cotter M.A., 2nd, Subramanian C. & Robertson E.S. // Prothymosin alpha functions as a cellular oncoprotein by inducing transformation of rodent fibroblasts in vitro. J Biol Chem, 2001. 276(3): 1794-9.

95. Szabo P., Ehleiter D., Whittington E. & Weksler M.E. // Prothymosin alpha expression occurs during Gl in proliferating В or T lymphocytes. Biochem Biophys Res Commun, 1992. 185(3): 953-9.

96. Alvarez C.V., Zalvide J.B., Cancio E., Dieguez C , Regueiro B.J., Vega F.V. & Dominguez F. // Regulation of prothymosin alpha mRNA levels in rat pituitary tumor cells. Neuroendocrinology, 1993. 57(6): 1048-56.

97. Trumbore M.W. & Berger S.L. // Prothymosin alpha is a nonspecific facilitator of nuclear processes: studies of run-on transcription. Protein Expr Purif, 2000. 20(3): 414-20.

98. Dutta S., Akey I.V., Dingwall C , Hartman K.L., Laue Т., Nolte R.T., Head J.F. & Akey C.W. // The crystal structure of nucleoplasmin-core: implications for histone binding and nucleosome assembly. Mol Cell, 2001. 8(4): 841-53.

99. Umehara Т., Chimura Т., Ichikawa N. & Horikoshi M. // Polyanionic stretch-deleted histone chaperone cial/Asflp is functional both in vivo and in vitro. Genes Cells, 2002. 7(1): 59-73.

100. Fujii-Nakata Т., Ishimi Y., Okuda A. & Kikuchi A. // Functional analysis of nucleosome assembly protein, NAP-1. The negatively charged COOH-terminal region is not necessary for the intrinsic assembly activity. J Biol Chem, 1992. 267(29): 20980-6.

101. Salvany L., Chiva M., Arnan C , Ausio J., Subirana J.A. & Saperas N. // Mutation of the small acidic tract Al drastically reduces nucleoplasmin activity. FEBS Lett, 2004. 576(3): 353-7.

102. Arnan C, Saperas N., Prieto C , Chiva M. & Ausio J. // Interaction of nucleoplasmin with core histones. J Biol Chem, 2003. 278(33): 31319-24.

103. Subramanian C , Knight J.S. & Robertson E.S. // The Epstein Barr nuclear antigen EBNA3C regulates transcription, cell transformation and cell migration. Front Biosci, 2002. 7d704-16.

104. Shiama N. // The рЗОО/CBP family: integrating signals with transcription factors and chromatin. Trends Cell Biol, 1997. 7(6): 230-6.

105. Bianco N.R. & Montano M.M. // Regulation,of prothymosin alpha by estrogen receptor alpha: molecular mechanisms and relevance in estrogen-mediated breast cell growth. Oncogene, 2002. 21(34): 5233-44.

106. Lai A., Kawai Т., Yang X., Mazan-Mamczarz K. & Gorospe M. // Antiapoptotic function of RNA-binding protein HuR effected through prothymosin alpha. Embo J, 2005. 24(10): 1852-62.

107. Jiang X., Kim H.E., Shu FL, Zhao Y., Zhang H., Kofron J., Donnelly J., Burns D., Ng S.C, Rosenberg S. & Wang X. // Distinctive roles of PHAP proteins and prothymosin-alpha in a death regulatory pathway. Science, 2003. 299(5604): 223-6.

108. Evstafieva A.G., Belov G.A., Kalkum M., Chichkova N.V., Bogdanov A. A., Agol V.I. & Vartapetian A.B. // Prothymosin alpha fragmentation in apoptosis. FEBS Lett, 2000. 467(2-3): 150-4.

109. Lu Z., Zhang C. & Zhai Z. // Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A , 2005. 102(8): 2778-83.

110. Itoh K., Wakabayashi N., Katoh Y., Ishii Т., Igarashi K., Engel J.D. & Yamamoto M. // Keapl represses nuclear activation of antioxidant responsive elements by Nrf2 through binding to the amino-terminal Neh2 domain. Genes Dev, 1999. 13(1): 76-86.

111. Strachan G.D., Morgan K.L., Otis L.L., Caltagarone J., Gittis A., Bowser R. & Jordan-Sciutto K.L. // Fetal Alz-50 clone 1 interacts with the human orthologue of the Kelch-like Ech-associated, protein. Biochemistry, 2004. 43(38): 12113-22.

112. Lo S.C. & Hannink M. // PGAM5, a Bcl-XL-interacting protein,.is a novel substrate for the redox-regulated Keapl-dependent ubiquitin ligase complex. J Biol Chem, 2006. 281(49): 37893-903.

113. Kang M.I., Kobayashi A., Wakabayashi N., Kim S.G. & Yamamoto M. // Scaffolding of Keapl to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes. Proc Natl Acad Sci U S A , 2004. 101(7): 2046-51.

114. Katoh Y., Itoh K., Yoshida E., Miyagishi M., Fukamizu A. & Yamamoto M. // Two domains of Nrf2 cooperatively bind СВР, a CREB binding, protein, and synergistically activate transcription. Genes Cells, 2001. 6(10): 857-68.

115. Kobayashi M. & Yamamoto M. // Molecular mechanisms activating the Nrf2-Keapl pathway of antioxidant gene regulation. Antioxid Redox Signal, 2005. 7(3-4): 385-94.

116. Sykiotis G.P. & Bohmann D. // Keapl/Nrf2 signaling regulates oxidative stress tolerance and lifespan in Drosophila. Dev Cell, 2008. 14(1): 76-85.

117. Kobayashi M., Itoh K., Suzuki Т., Osanai H., Nishikawa K.5 Katoh Y., Takagi Y. & Yamamoto M. // Identification of the interactive interface and phylogenic conservation of the Nrf2-Keapl system. Genes Cells, 2002. 7(8): 807-20.

118. Watai Y, Kobayashi A., Nagase H., Mizukami M., McEvoy J., Singer J.D., Itoh K. & Yamamoto M. // Subcellular localization and cytoplasmic complex status of endogenous Keapl. Genes Cells, 2007. 12(10): 1163-78.

119. Itoh K., Wakabayashi N., Katoh Y., Ishii Т., O'Connor T. & Yamamoto M. // Keapl regulates both cytoplasmic-nuclear shuttling and degradation of Nrf2 in response to electrophites. Genes Cells, 2003. 8(4): 379-91.

120. O'Hara K.A., Nemec A.A., Alam J., Klei L.R., Mossman B.T. & Barchowsky A. // Chromium (VI) inhibits heme oxygenase-1 expression in vivo and in arsenic-exposed human airway epithelial cells. J Cell Physiol, 2006. 209(1): 113-21.

121. He X , Chen M.G., Lin G.X. & Ma Q. // Arsenic induces NAD(P)H- quinone oxidoreductase I by disrupting the Nrf2 x Keapl x Cul3 complex and recruiting Nrf2 x Maf to the antioxidant response element enhancer. J Biol Chem, 2006. 281(33): 23620-31.

122. Theodore M., Kawai Y., Yang J., Kleshchenko Y., Reddy S.P., Villalta F. & Arinze I.J. // Multiple nuclear localization signals function in the nuclear import of the transcription factor Nrf2. J Biol Chem, 2008.

123. Jain A.K., Bloom D.A. & Jaiswal A.K. // Nuclear import and export signals in control ofNrf2. J Biol Chem, 2005. 280(32): 29158-68.

124. Sekhar K.R., Yan X.X. & Freeman M.L. // Nrf2 degradation by the ubiquitin proteasome pathway is inhibited by KIAA0132, the human homolog to INrf2. Oncogene, 2002. 21(44): 6829-34.

125. Stewart D., Killeen E., Naquin R., Alam S. & Alam J. // Degradation of transcription factor Nrf2 via the ubiquitin-proteasome pathway and stabilization by cadmium. J Biol Chem, 2003. 278(4): 2396-402.

126. Zhang D.D. & Hannink M. // Distinct cysteine residues in Keapl are required for Keapl-dependent ubiquitination of Nrf2 and for stabilization of Nrf2 by chemopreventive agents and oxidative stress. Mol Cell Biol, 2003. 23(22): 8137-51.

127. Cullinan S.B., Gordan J.D., Jin J., Harper J.W. & Diehl J.A. // The Keapl-BTB protein is an adaptor that bridges Nrf2 to a Gul3-based. E3 ligase: oxidative stress sensing by a Cul3-Keapl ligase. Mol Cell Biol, 2004. 24(19): 8477-86.

128. Zhang D.D., Lo S.C., Cross J.V., Templeton D J . & Hannink M. // Keapl is a redox-regulated substrate adaptor protein for a Cul3-dependent ubiquitin ligase complex. Mol Cell Biol, 2004. 24(24): 10941-53.

129. Furukawa M. & Xiong Y. // BTB protein Keapl targets antioxidant transcription factor Nrf2 for ubiquitination by the Cullin 3-Rocl ligase. Mol Cell Biol, 2005. 25(1): 162-71.

130. Tong K.I., Kobayashi A., Katsuoka F. & Yamamoto M. // Two-site substrate recognition model for the Keapl-Nrf2 system: a hinge and. latch mechanism. Biol Chem, 2006. 387(10-11): 1311-20.

131. Tong K.I., Katoh Y., Kusunoki H., Itoh K., Tanaka T. & Yamamoto M. // Keapl recruits Neh2 through binding to ETGE and DLG motifs: characterization of the two-site molecular recognition model. Mol Cell Biol, 2006. 26(8): 2887-900.

132. Tong K.I., Padmanabhan В., Kobayashi A., Shang C , Hirotsu Y., Yokoyama S. & Yamamoto M. // Different electrostatic potentials define ETGE and DLG motifs as hinge and latch in. oxidative stress response. Mol Cell Biol, 2007. 27(21): 7511-21.

133. Kern J.T., Hannink M. & Hess J.F. // Disruption of the Keapl- containing ubiquitination complex as an antioxidant therapy. Curr Top Med Chem, 2007. 7(10): 972-8.

134. Sun Z., Zhang S., Chan J.Y. & Zhang D.D. // Keapl controls postinduction repression of the Nrf2-mediated antioxidant response by escorting nuclear export of Nrf2. Mol Cell Biol, 2007. 27(18): 6334-49.

135. Li W., Jain M.R., Chen C , Yue X., Hebbar V., Zhou R. & Kong A.N. // Nrf2 Possesses a redox-insensitive nuclear export signal overlapping with the leucine zipper motif. J Biol Chem, 2005. 280(31): 28430-8.

136. Jain A.K. & Jaiswal A.K. // Phosphorylation of tyrosine 568 controls nuclear export ofNrf2. J Biol Chem, 2006. 281(17): 12132-42.

137. Nguyen Т., Sherratt P.J., Nioi P., Yang C.S. & Pickett C.B. // Nrf2 controls constitutive and inducible expression of ARE-driven genes through a dynamic pathway involving nucleocytoplasmic shuttling by Keapl. J Biol Chem, 2005. 280(37): 32485-92. '

138. Velichkova M. & Hasson T. // Keapl regulates the oxidation-sensitive shuttling ofNrf2 into and out of the nucleus via a Crml-dependent nuclear export mechanism. Mol Cell Biol, 2005. 25(11): 4501-13.

139. Li W., Yu S.W. & Kong A.N. // Nrf2 possesses a redox-sensitive nuclear exporting signal in the Neh5 transactivation domain. J Biol Chem, 2006. 281(37): 27251-63.

140. Lo S.C., Hannink M. // PGAM5 tethers a ternary complex containing Keapl and Nrf2 to mitochondria. Exp Cell Research, в печати.