Взаимодействие сетчатых полиэлектролитов с белками: активированный транспорт белков и коллапс геля тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

5} 1^7 химический факультет

На правах рукописи УПК 541.64:547.%

СКОБЕЛЕВА Виктория Борисовна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СЕТЧАТЫХ НОЛИЭЛЕК1РОЛИТОН С БЕЛКАМ?!: АКТИВИРОВАННЫЙ ТРАНСПОРТ БЕЛКОВ И КОЛЛАПС ГЕЛЯ.

(02.00.06. - Химия высокомолекулярных соединении»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1997г.

Работа выполнена в лаборатории полиэлектролитов и биополимеров кафедры высокомолекулярных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор химических наук

профессор А.Б. Зезин

кандидат химических наук В.Б.Рогачева

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

член-корреспондент АН А.Р.Хохлов

доктор химических наук В.В.Чупов

Ведущая организация: Научно-исследовательский физико-химический институт им. Л.Я. Карпова

Защита состоится 12 марта 1997 года в 15 час. на заседании диссертационного совета Д. 053.05.43 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд. 501,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан .февраля 1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук А.А. Миронова

Общая характеристика работы

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В последние десятилетия сформировалась новая область физико-химии полимеров, главной задачей которой является изучение интерполиэлектролнтных реакций (ИПР). Сегодня круг объектов исследований в этой области весьма разнообразен - это синтетические и природные линейные и сетчатые полиэлектролиты (ЛПЭ и СПЭ), коллоидные частицы (полимыла или золи неорганических соединений), ионогенные мицеллообразующие поверхностно-активные вещества (ПАВ) и белковые макромолекулы. Теория ИПР составляет научную основу ряда важнейших процессов, протекающих в живой природе, а также процессов, являющихся неотъемлемой частью современных технологий. Продукты ИПР - интерполиэлекгролитные комплексы (ИПК) -представляют собой широкий класс интерполимерных соединений, которые находят практическое применение для решения экологически задач, а качестве сорбентов, структуроебразователей и др. Исследование ИПК линейных синтетических полиэлектролитов с белками открыли новые возможности для использования ИПК в медицине. Созданы теоретические основы новых варианюв биохимического анализа и методов экспресс-диагностики, получения молекулярных дозирующих устройств и лекарственных препаратов пролонгированного действия с применением полиэлектролитов.

В настоящей работе впервые изучены ИПР между сетчатыми полиэлектролитами и белками - макромолекулами полиамфолитной природы. С одной стороны, явление переноса белков в химически комплементарных гелях является моделью активированного транспорта природных полиионов в биологических средах. С другой стороны, в последние годы большое внимание исследователей привлекают проблемы коллапса сеток, в том числе и при взаимодействии заряженных сеток с полиионами различной природы. И в этой связи изучение особенностей коллапса полиэлектролитных сеток при взаимодействии с белками также представляет несомненный фундаментальный интерес.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла в исследовании закономерностей взаимодействия высоконабухших слабосшитых полиэлектролитов с белками, изучении состава и свойств образующихся интерполимерных комплексов, а также факторов, обуславливающих проявление локализованного коллапса при сорбции высоконабухшими гомогенными полиэлектролитными сетками полиионов различной природы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые изучены равновесие и механизм интерполимерных реакций СПЭ с белками в водных и водно-солевых средах. Показано, что в широком интервале рН и концентрации низкомолекулярных электролитов сорбция белков из водных растворов противоположно заряженной полиэлектролитной сеткой протекает как активированный транспорт с образованием в фазе геля нового химического соединения - интерполимерного комплекса, состав которого не зависит от состава реакционной смеси и определяется величиной заряда сетки и белка (т.е. рН и ионной силой среды). Взаимодействие СПЭ с белками в водных средах осуществляется как фронтально распространяющаяся ИПР и сопровождается коллапсом сетки. Продукты незавершенных реакций представляют собой двухфазные образцы, внешняя оболочка которых представляет слабонабухший ИПК, а внутренняя часть -высоконабухший исходный гель. Впервые показано, что характер распределения белка в продуктах незавершенных реакций определяется степенью контракции сетки в результате ИПР. Установлены условия получения слоистых композиций, построенных из чередующихся слоев ИПК, включающих различные белки.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ Исследованная в работе сорбция белков СПЭ в водных и водно-солевых средах может иметь близкие аналогии с активированным транспортом белков в биологических системах. Подобные системы могут представлять интерес для иммобилизации белков в противоположно заряженных сетках и для дизайна различных структур типа "ядро-оболочка". Это позволяет получить многослойные композиции на основе слабосшитых СПЭ с различной толщиной и свойствами чередующихся слоев ИПК, включающих различные белки или ферменты. Такие композиции могут иметь важное

практическое значение, например, при конструировании полиферментных систем,

диагностических устройств й ------------------

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы были доложены на международной конференции по фундаментальным наукам "Ломоносов - 95" (Москва, 1995), на 1ой Международной конференции "Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии" (Санкт-Петербург , 1996), на международной конференции "Фундаментальные проблемы науки о полимерах" (К 90-летию академика В А. Каргина) (Москва, 1997).

ПУБЛИКАЦИИ По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( наименований). Работа изложена на

__страницах, содержит рисунков, таблицы.

Основные результаты работы.

1. ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовали гидрогели сетчатого полиакрилата натрия (СПА№) или тетраметиламмония (СПА>1(СНз)4) и сшитого бромида я о л и-><, М' -отметил-И-этиламиноэтилметакрилата (СПДМАЭМ«Е1Вг). СПЭ получали радикальной сополимеризацией мономеров с бифункциональным сшивателем М,М'-метилен-бисакриламидом (1% и 2% от веса мономера, соответственно) в 10% водном растворе. В качестве инициатора использовали персульфат аммония и метабисульфит натрия (0.2% от веса мономера).

В качестве белков использовали цитохром с сердца лошади (М=Т2400) и бычий сывороточный альбумин (М=69000) фирмы "8ц»та"(США), лизоцим куриных яиц завода "Биолар"(Олайне) и фирмы "5щта"(США) (М=Т4000), а также смесь двух протаминов состава 3:1 (по массе), полученную из гонад Аарепвег &еМи$ в форме сульфата (М=4400).

2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СЕТЧАТЫХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ С БЕЛКАМИ.

Образцы равновесно набухшего слабосшитого геля СГШ^а при погружении в нейтральные бессолевые водные растворы цитохрома с, лизоцима или протамина, а также геля СЦДМАЭМ»Е1Вг -в растворы БСА способны эффективно сорбировать белки, несущие противоположные заряды. При этом изначально высоконабухший прозрачный образец геля уменьшается в объеме и при достаточном количестве белка в окружающем растворе, в конечном счете, превращается в компактный, непрозрачный продукт, объем которого примерно в 10 раз меньше объема исходного геля.

Количество поглощенного белка определяли по убыли в равновесном растворе, концентрацию белков определяли спектрофотометрически по интенсивности поглощения при длинах волн: цитохрома с - при Я=409нм (е =110000 лхмоль^хсм"1)), лизоцима - при Х=281нм (е=31200 лхмоль"1хсм~')), протамина - при Х=230нм (е=6000 лхмоль'хсм"1)) и БСА - при /=282нм (е=36000 лхмоль'хсм"')).

Набухаемость гелей и продуктов завершенных ИПР определяли весовым методом и характеризовали величиной набухаемости : Н=(т) -Ш2 )/т2 , где Ш| -вес набухшего образца, т2 - вес сухого образца. Набухаемость, Н, геля СПАИа (рН®8) составляла 800-850 для разных образцов; геля СПДМАЭМ»Е1Вг - 600.

Существенно, что сорбция белков СПЭ наблюдается только при тех значениях рН, при которых белковые молекулы и звенья сетки несут противоположные заряды. Это отвечает значениям рНСИЭТ для систем СПАИа-цитохром с, лизоцим и протамин и рН>ЙЭТ для системы СПДМАЭМ*Е(Вг-БСА. Более того, ИПК СПА-белок, полученный в нейтральной среде и помещенный затем в водный раствор при рН«11.5>ИЭТ, разрушается в течение нескольких часов, о чем свидетельствует выделение в окружающий раствор практически всего белка, ранее включенного в ИПК. Аналогично ведет себя ИПК СПДМАЭМ'ЕЬ БСА при погружении в растворы при рНа4.5<ИЭТ. Это означает, что движущей силой сорбции белков является ИПР между сеткой и белком. Эта ИПР для системы СПАЫа - глобулярный белок представлена на схеме (1):

+ п N3 + п Г

(I)

Для простоты показаны только доминирующие положительные заряды белка и их ирогивоконы, хотя, в действительности, значительная часть положительно заряженных групп белковой молекулы может быть включена в цвиттер-ионные пары.

На Рис.1 представлены изотермы сорбции цитохрома с и лизоцима гелем СПАЫа в нейтральных бессолевых водных растворах. Изотермы представлены в координатах Р - ^ с , где Б - степень завершенности процесса сорбции (отношение количества поглощенного белка (у,) к величине максимальной сорбции белка в данных условиях (уда ), ¥=\х/\), с - концентрация белка в моль/л в расчете на моль глобул белка. Каждая точка на изотермах получена выдерживанием равновесно набухшего образца геля кубической формы массой т» 0.5 г в 10 мл водного бессолевого раствора белка, концентрацию белка варьировали в интервале 2.5х10~6 - 5х10~4 моль/л, рН раствора «7, Т-20°С. Равновесие устанавливалось в течение 10 дней.

Рис.1 Изотермы сорбции цитохрома с и лизоцима гелем

СПАИа; рН 7, Т=20°С.

0,0

-5

18 с

Из Рис.1 видно, что равновесные концентрации белка очень малы, т.е. сорбция белка гелем происходит практически до полного исчерпания белка из раствора. Крутизна изотерм свидетельствует о кооперативном характере взаимодействия белков с противоположно заряженными сетками.

Добавление №С1 к растворам приводит к сдвигу изотерм сорбции в область более высоких равновесных концентраций цитохрома с, как ввдно из Рис.2, что свидетельствует об определяющем вкладе электростатических взаимодействий в стабилизацию образующихся ИПК СПЭ-белок.

1,0-

0,8-

0,6-

.0,4-

0,2-

-7.0

-в-

С^ОМК

-А- Сжгомк

-6,5

—I—

-6,0

—I—

-5,5

-1—

-5,0

—I—

-4,5

—I

-4,0

Рис.2 Изотермы сорбции цитохрома с гелем СПА№ при различных С^аС! ; РН 7, Т=20°С.

В Табл.1 представлены составы ИПК ФипК~^ГЕЛЯ ^Б )

, где МГ£ЛЯ и

- количество молей звеньев сетки и молей белка в образце ИПК, соответственно. Значения Ирвдд определяли весовым методом, зная величину набухаемости геля. ^хЕЛЯ=тнаб/{(Н+1)*Мзв}, где тнаб, Н и Мзв - масса набухшего геля, его набухаемость и молекулярная масса звена, соответственно. Значения N5 определяли по убыли концентрации белка в окружающем растворе или весовым методом по разнице веса сухого исходного СПЭ и продукта его реакции с белком, высушенного до постоянного веса.

Таблица!.

Составы интерполимерных комплексов ЛПЭ и СПЭ с белками Фипк при различных рН и Ссоли •

ИПК / соль Ссоли ? моль/л рН ^ипк

СПА-цитохром с / ШС1 0 3.0 70

0 4.5 35

0 7.0 10

0.04 7.0 19

0.08 7.0 28

ЛПА-цитохром с / 0 7.0 9

СПА-цитохром с / Н(СН3)4Вг 0 7.0 8

0.08 7.0 9

0.15 7.0 12

СПА-лизоцим / №С1 0 7.0 10

ЛПА-лизоцим / N801 0 7.0 9

СПА-протамип / КаС1 0 7.0 20

СПДМАЭМЕьБСА / ШС1 0 7.0 55-60

Из Табл.1 видно, что в ИИК, образованных в бессолевых нейтральных растворах, в среднем на одну глобулу цитохрома с или лизоцима, включенную в ИПК, приходится 8-10 звеньев сетки СПА№ или СПАТ^СНз)^ на молекулу протамина - 20 звеньев сетки, на глобулу БСА - 55-60 звеньев сетки. Для сравнения в Табл. 1 представлены составы нерастворимых ИПК, которые образует линейный Г1А№ (ЛПАИа) (М»~300000) с цитохромом с или лизоцимом в нейтральных бессолевых средах. Видно, что составы ИПК СПЭ-белок практически совпадают с составами соответствующих нерастворимых ИПК, образованных ЛПЭ и белками.

Существенно, что состав ИПК, образованных СПЭ, не зависит от соотношения компонентов в реакционной смеси. Значения фипк Для таких систем, представленные в Таблице 1, остаются неизменными в широком интервале изменения составов реакционных смесей фсм^О^ст^а/Т^см = 3-10 для цитохрома с и лизоцима, фсм =5-20 для протамина и фсм=20-55 для БСА , и (если количества белка достаточно для полного превращения геля в ИПК) соответствуют составу нерастворимых ИПК, образованных линейными полиэлектролитами и

белками. Это существенно отличает поведение СПЭ от ЛПЭ, последние образуют ИПК, состав которых зависит от соотношения компонентов в реакционной смеси. Иными словами, добавление избыточных количеств белка не приводит к его дополнительной сорбции сеткой. Это характерно' для широкого круга сетчатых ИПК, в том числе и для ИПК, образованных противоположно заряженными СПЭ и ЛПЭ, а также СПЭ и ПАВ.

Для систем ЛПЭ-белок из литературы известны и достаточно подробно исследованы водорастворимые нестехиометричные ИПК (НИПК), включающие избыток звеньев линейного полиэлектролита. Такие НИПК получены нами для системы ЛПАКа-лизоцим. Так, при составе смеси Фсм=(^пак.Л^б)см>160 образуются водорастворимые НИПК ЛПАНа-лизоцим, в которых на одну глобулу лизоцима приходится 160 и более звеньев полианиона.

Совершенно иначе ведут себя системы белок - СПЭ. Даже при значительном дефиците молекул белка по отношению к общему количеству звеньев в геле CITANa в образце геля происходит макроскопическое фазовое разделение, в результате образуется слабонабухший наружный слой ИПК, а внутренняя часть образца представляет собой сильно набухший гель, который практически не содержит белка. Побробнее такое макроскопическое диспропорционирование в системах СПЭ-белок будет рассмотрено в разделе 3.

Очевидно, что представленные в Табл.1 составы ИПК a priori нельзя отождествить с количеством солевых связей, q, образованных единичной молекулой белка со звеньями заряженной сетки. Эти величины для систем CIIANa-белок были независимо определены при измерении количества низкомолекулярных противоионов, выделившихся в результате взаимодействия карбоксилатных групп сетки и протонированных аминогрупп белка (см.схему (2)). Поскольку химическая природа противоионов протонированных аминогрупп в исходных лизоциме и цитохроме с неизвестна, q определяли, измеряя количество Na+ противоионов сетки, выделившихся в окружающий раствор после завершения ИПР. В реакции с протамином дополнительно определяли количество выделившихся противоионов белка - сульфат-ионов. Концентрацию ионов Na+ определяли методом пламенной фотометрии, сульфат-ионов - методом ионнообменной хроматографии.

Таблица 2.

Количество солевых связей, образованных 1 молекулой белка со

звеньями сетки, (я) и значения ф* =|п+ - п_| для ИПК СПЭ-белок;

рН 7, Т=20°С.

ИПК Ч Ф*

СПА-цитохром с 7.0 10

СПА-лизоцим 7.0 7-12

СПА-протамин 12.0 19-20

Полученные данные, представленные в Табл.2, свидетельствуют, что значительная часть (около 70%) карбоксилатных групп сетки, приходящихся на одну молекулу белка в ИПК СПАЫа-белок (см.Табл.1), образуют с ней солевые

связи. В Табл.2 приведены также величины ф* =|п+ - п_|, п< число положительно заряженных и п_ - отрицательно заряженных групп в молекуле белка. п+ и п_

определяются аминокислотным составом белка. Сравнение значений ц и ф4 показывает, что большая часть заряженных групп белка образует с противоположно заряженными звеньями сетки солевые связи. Различие величин д

и ф* связано с тем, что не все ионогенные группы белков в нейтральных средах, в которых мы изучали ИПР, оказываются заряженными. И действительно, анализ дзнных потенциометрического титрования, например, цитохрома с показывает, что

глобула цитохрома с имеет в нейтральных средах заряд +7, в то время как ф*=10.

Присутствие в ИПК заряженных звеньев сетки, не участвующих в образовании солевых связей с белком, а также наличие в молекулах белков гидрофильных групп различной природы определяет более высокую набухаемость ИПК СПЭ-белок (Н«3-6 для различных ИПК) по сравнению с аналогичными ИПК СПЭ-ЛПЭ и СПЭ-ПАВ (Н«1-2).

Важно отметить, что Ф^пк и ^ систем СПЭ-белок существенно зависят от рН и ионной силы среды. На примере системы СПАЫа-цитохром с видно (см. Табл.1), что при понижении рН от 7 до 4.5 и до 3, фипк СПА-циТОхром с

возрастает от 10 до 35 и до 70 соответственно. Это обусловлено уменьшением степени диссоциации карбоксильных групп сетки. При переходе от бессолевых растворов к растворам 0.04Ы и 0.08Ы ЫаС1 фипк СПА-цитохром с измеияется от 10 до 19 и 28 соответственно. Такое изменение состава ИПК может быть связано с изменением количества и распределения цвитгер-ионных пар в глобуле белка и, соответственно, с изменением количества солевых связей, которые глобула белка образует со звеньями сетки.

ИПК, стабилизированные межцепными солевыми связями, разрушаются под действием экранирующих низкомолекулярных солей. Проведенные нами исследования показали, что ИПК СПА-цитохром с не разрушается в растворах ЫаС1 при С№а<0.Ш. Аналогично ведет себя и ИПК СПА-лизоцим. ИПК СПДМАЭМ»Е1-БСА устойчивы при СЫаа<0.20К ИПК СПА-протамин, в отличие от рассмотренных выше, разрушается только при достижении СМаС1«1.5М. Разрушение ИПК СПЭ-белок сопровождается количественным выделением белка из сетки в окружающий раствор и происходит в узком интервале изменения концентрации низкомолекулярной соли, т.е. кооперативно.

Следует отметить, что сравнительно невысокая устойчивость ИПК, образованных глобулярными белками, согласуется с поведением белков в живых системах, которые моделируются 0.14К №С1 и в которых взаимодействия белков с другими природными палиэлектролитами, а также поверхностями клеток, клеточными мембранами и др. подавлены.

3. ЯВЛЕНИЯ КОЛЛАПСА В СИСТЕМАХ СПЭ-БЕЛОК.

Выше отмечалось, что взаимодействие СПЭ с противоположно заряженными белками сопровождается ярко выраженным диспропорционированием - продукты незавершенных реакций представляют собой двухфазные системы. Одна фаза - это внешний плотный слой слабонабухшего ИПК, вторая - внутренняя часть сильно набухшего геля. Резкая граница между слоями сохраняется в течение всего процесса превращения сильнабухшего СПЭ в слабонабухающий компактный ИПК. Фактически процесс сорбции белка гелем протекает как фронтальная гетерогенная реакция. Ниже на схеме (2) в качестве

примера изображено изменение состояния гелевого образца в процессе сорбции

белка полиакрилатной сеткой в бессолевых средах:

А В

Анализ состава слоев показал, что практически весь белок, сорбированный сеткой, содержится в слое ИПК, состав которого совпадает с составом ИПК, приведенным в Табл.1; а внутренний слой геля не содержит белка. В продуктах незавершенных ИПР (А и В на схеме (2)) в таких системах контракции подвергается только внешний слой гелевого образца. Это существенно отличает локализованный коллапс от классического коллапса полимерных сеток при изменении состава растворителя и температуры, при котором контракции подвергается весь объем сетки и который происходит как резкий переход всего образца геля из набухшего в сколапсиропанное состояние.

Обнаруженное макроскопически неравномерное распределение белка в образце геля отвечает термодинамическому равновесию, поскольку длительное выдерживание гетерогенных образцов А и В в воде не приводит к смешению фаз и к размыванию межфазной границы. В то же время, добавление белка к продуктам незавершенных ИПР - гетерофазным образцам А или В приводит к приращению наружного слоя ИПК и, соответственно, уменьшению массы внутренней высоконабухающей области.

На Рис.3 представлена экспериментальная зависимость относительной массы гелевого образца (тобр/тС1ЪШа) (тобр. * масса набухшего образца при степени завершенности реакции Р, тсПАЫа - масса исходного набухшего геля СПА№) от степени завершенности сорбции Р для системы СПА№ - цитохром с. Пунктирной линией показана также теоретическая зависимость ш0бр./шсПАЫа от Р, рассчитанная в предположении, что набухаемость внешнего слоя ИПК совпадает с набухаемостыо ИПК - продукта завершенной реакции, а набухаемость

внутренней части геля равна набухаемости исходного геля СПАЫа. Экспериментальная и теоретическая зависимости в широком интервале изменения Р совпадают, что подтверждает декларированный выше механизм сорбции белка гелем. Обнаруженное нами явление макроскопического фазового разделения или локализованного коллапса характерно для ИПР с участием сильнонабухших сеток с высокой плотностью заряда. Оно было найдено ранее также для реакций слабосшитых заряженных сеток с противоположно заряженными линейными по лиэле ктролитами и ионогенными мицелл сюбразую щи ми ПАВ.

1.0

0,8-

, 0,6

1-0,4

ч

»,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Р

Рнс.З Зависимость относительной массы гелевого образца от степени завершенности сорбции для системы СПАЫа - цитохром с; тспдг>}а=0.5г, СМаС, = 0, рН 7, Т=20°С.

0,0

Существенные результаты, важные для понимания природы коллапса в таких системах получены нами при исследовании влияния простых солей на поведение смесей СПЭ-белок. Эти исследования проведены на примере взаимодействия цитохрома с с полиакрилатной сеткой. Распределение белка в продуктах таких реакций, а также движение фронта белка в фазе геля удается визуально наблюдать благодаря интенсивной красной окраске цитохрома с.

Сорбцию цитохрома с полиакрилатной сеткой проводили в нейтральных водных растворах ИаС1 или М(СНз)4С1 при концентрации солей 0-0.08 N. Использовали образцы исходного равновесно набухшего полиакрилатного геля в форме параллелепипеда с размером ребра 12-18 мм и массой 3.9 г в растворах №С1 и с размером ребра 9-12 мм и массой 1 г в растворах К(СНз)4С1. Распределение белка изучали в образцах при степени завершенности сорбции равной Р=0.2. Образцы частично превращенных гелей выдерживали в растворах заданное временя и затем делали поперечные срезы толщиной 2 мм. Полученные пластины

фотометрировали вдоль линии О-А, параллельной грани исходного образца и проходящей через его центр - точку С, как показано на схеме (3): ПАМГЙ.

(3)

На Рис.4 и 5 приведены результаты фотометрирования таких срезов в терминах зависимости относительной оптической плотности 0/0тя от расстояния г, которое отсчитывали от края среза вдоль линии О-С. Исходный равновесно набухший гель полностью прозрачен. Кривые 1-6 на Рис.4 отвечают фотометрированию продуктов незавершенных реакций между С ПАК а и питохромом с. Конец каждой кривой соответствует центру сре-;а образцов. Поскольку в оптическую плотность ИПК наряду с характеристическим поглощением цитохрома с при длине волны 409 нм вкладывает также рассеяние свега от периферийного слоя слабонабухающего ИПК, фотометрические кривые не преобразовывали в кривые распределения цитохрома с по образцу. Тем не менее кривые 1-2 на Рис.4 ясно отражают наличие двух фаз - ИПК СПЭ-белок и свободный от белка гель в продуктах незавершенных ИПР, разделенных резкой границей. Такая картина, названная локализованным коллапсом наблюдается для образцов, полученных в бессолевых средах или растворах с низкой (ниже 0.02Ы ) концентрацией ЫаС1 (образцы А и В на схеме (2)).

При увеличении концентрации соли до 0.02 N №С1 и выше (кривые 3-6 на Рис.4 ) наблюдается прокрашивание всего образца геля. При этом, в зависимости от концентрации №С1, распределение белка в образце оказывается различным. Так, в 0.02-0.06 N ЫаС1 наблюдается явно выраженный градиент концентрации белка (кривые 3-5 ), а в 0.08 N №С1 образец геля прокрашивается равномерно (кривая 6). Все кривые на Рис.4 получены после 2 недель выдерживания образцов в растворах. Увеличение времени выдерживания образцов в растворах до 3-4 недель не приводит к изменению распределения белка в гелевых образцах,

полученных в 0-0.0Ш №С1, соответствующие микрофотометрические кривые совпадают с кривыми 1,2 на Рис.4. В образцах, полученных в 0.02-0.06 N №С1 с течением времени наблюдается выравнивание концентрации цитохрома с.

И Г М1111111111МIН МIЩ111И11И1111111111111111111

\ ч

к

♦ 1 (о.оом)

• 2 (0.0ш)

А 3 (0.02ю

Т 4 «шэд

■ 5 (0.06м)

+ 6 (0.08ы)

4

г, мм

Рис.4 Кривые

фотометрирования срезов гелевых образцов

продуктов незавершенных ИПР мехщу СПАЫа и цитохромом с при различных

указанных в скобках; Р=0.2, рН 7, Т=20°С.

з

г, мм

■ 1 (О.ООЫ)

т 2 (О.ОШ)

А 3 (0.02Ы)

X 4 (0.031Я)

« 5 (0.05Ы)

X 6 (0.07Ы)

• 7 (0.08М)

О 8 (0.08М)

о о

• а

5 6

Рис.5 Кривые

фотометрирования срезов гелевых образцов

продуктов незавершенных ИПР между СПАЫ(СНз)4 и цитохромом с при различных С Ы(СНз)4Вг , указанных в скобках; Р=0.2, рН 7, Т=20°С.

Эти выводы наглядно иллюстрируют представленные на Рис.6 фотографии половинок срезов гелевых образцов продуктов незавершенных ИПР, полученных в 0, 0.04 и 0.08 N ИаС1 и выдержанных в растворах в течение 4 недель. Образцы расположены слева направо в порядке увеличения концентрации ЫаС1 в реакционной системе.

Изменение характера распределения белка в сетке от ступенчатого к равномерному наблюдается и при выдерживании в водных растворах №С1 продуктов незавершенной ИПР между СПАЫа и цитохромом с, полученных в

бессолевой среде. Равномерное прокрашивание всего объема образца геля в 0.020.06 N №С1 происходит за 4-2 недели. Отсюда следует, что перераспределение белка в образце ^процесс медленный по сравнению с процессом сорбции белка

Рис.6 Фотографии

половинок срезов гелевых образцов продуктов

незавершенных ИПР, лолучсшгах в 0. 0.04 и 0.08Ы ЫаС1 (слева направо) в системе С ПАК а- цитохрома с.

Таким образом, при сорбции цитохрома с полиакрилатным гелем как в бессолевых так ¡1 в водно-солевых средах в продуктах незавершенных ИПР имеется более или .менее резкая граница между наружным слоем И ПК и внутренней частью геля СПАКа. Однако, если в бессолевых средах резкая граница сохраняется сколь угодно долго при выдерживании образца в растворе, то в водно-солевых средах она со временем размывается, и равновесному состоянию образца отвечает равномерное распределение белка в объеме геля. Такое перераспределение белка в последнем случае не связано с разрушением ИПК СПА-цитохром с и переходом к пассивной диффузии белка в химически инертной среде. Выше было показано, что ИПК СПА-цитохром с существует и устойчив в растворах №С1 при концентрации соли вплоть до О.Ш. На Рис.2 были представлены изотермы сорбции цитохрома с полиакрилатным гелем при различных Сиась свидетельствующие о том, что вплоть до С^аС1=0.08 N сорбция белка происходит как активированный транспорт. Тем не менее характер сорбции (наличие резкого фронта или постепенное размывание границы ) существенно зависит от концентрации соли в растворе.

Можно думать, что тот или иной характер распределения белка в продуктах незавершенных реакций связан с особенностями коллапса полиэлектролитной сетки в результате взаимодействия с белком. Поэтому нами изучено влияние концентрации соли на степень контракции полиакрилатной сетки в результате

взаимодействия с цитохромом с в водно-солевых средах. На Рис.7 представлены зависимости набухаемости исходного геля СПАЫа (кривая 1) и ИПК СПА-цитохром с (кривая 3) от концентрации ЫаС1 в растворе. Как видно из Рис.7, в бессолевых водных растворах набухаемости исходных гелей и ИПК различаются более чем на два порядка. При увеличении концентрации №С1 до 0-0.02 N наблюдается резкое уменьшение набухаемости СПАЫа (НСпаш ) и в то же время увеличение набухаемости ИПК (Нипк)- Последнее связано с увеличением числа свободных карбоксилатных групп сетки, включенных в ИПК (см.Табл.1).

Рис.7 Зависимости набухаемости СПАЛа (1), СПАЩСНзИ (2) и ИПК СПА-цитохром с (3) от концентрации ЫаС1 (1,3) или >1(СНз)4Вг (2) в растворе; Т=20°С.

~г

0.04 0.06

: соли, мель / л

Непосредственной мерой степени контракции служит отношение масс исходного геля и продукта завершенной ИПР - тсгшчаМипк • Значения шспАКа/типк для различных концентраций №С1 представлены в Табл.3. При сопоставлении этих данных с характером распределения цитохрома с в продуктах незавершенных ИПР оказывается, что в бессолевых средах, в которых наблюдается макроскопическое фазовое разделение в продуктах незавершенных ИПР, взаимодействие СПАЫа с цитохромом с сопровождается сильной контракцией образца (масса образца уменьшается более чем на порядок). В солевой среде (концентрации ИаС1 > 0.02 Ы) ИПР менее набухшего в этих условиях полиакрилатного геля с белком сопровождается меньшей контракцией (в 7-4 раза). И именно в этих условиях наблюдается распределение белка по всему объему гелевого образца в продуктах незавершенных реакций.

ТаблицаЗ.

Изменение массы набухших образцов СПАМа при взаимодействии с цитохромом с в водно-солевых средах, рН 7, Т=20 °С.

СкаО 5 01 СПАЫа

моль/л т ИПК СПА-цитохром с

0.00 23.5.0

0.01 10.6

0.02 7.1

0.03 7.0

0.04 6.4

0.05 5.7

0.06 4.9

0.07 4.0

0.08 4.0

Очевидно, набухаемостъ иолиэлектролитной сепси завгси: не только от <онцентрации низкомолекулярной соли в системе, но и от её химической 1рироды. На Рис.7 (кривая 2) приведена зависимость набухземости гетраметнламмонийной соли сетчатого полиакрилата (СПАМ(С1 ¡3)4) от сонцентрации М(СНз)4Вг в растворе. Видно, что при замене №С1 на М(СНз)4Вг шбухаемость исходного нолиакрилатного геля в водно-солевых растворах :ущественно увеличивается, поскольку катион 1Ч(СНз)4+ значительно слабее :вязывается с карбоксилатными анионами сетки. Катион тетраметиламмония ¡вляегся также более слабым конкурентом в ИПР по сравнению с катионом штрш. Нами обнаружено, что ИПК СПА-цитохром с устойчив в 0.2И водных »астворах ЩСНз^Вг.

Увеличение набухаемости исходного геля при переходе от ЫаС1 к Ы(СНз)4Вг фиводит к существенному расширению интервала концентрации соли, в котором ШР в системе полиакрилатный гель - цитохром с имеет фронтальный характер. 1з Рис.5 видно, что распределение белка в продуктах незавершенных ИПР ютается ступенчатым в 0-0.07Ы 1Ч(СНз>4Вг (кривые 1-6). Только в 0.08 N ^(СНз)4Вг наблюдается размывание границы внешним слоем ИПК и внутренней

областью (кривая 7). Кривые 1-7 получены микрофотометрированием срезов гелевых образцов, предварительно ввдержаных в растворах в течение 2 недель. При дальнейшем выдерживании образцов в растворах до 3-4 недель перераспределения цитохрома с в образцах, полученных в 0-0.07К 1Ч(СНз)4Вг, не происходит (микрофотометрические кривые таких образцов совпадают с кривыми 1-6). Однако, в образце, полученном в 0.08Ы Ы(СНз)4Вг, граница между слоем ИПК СПА-цитохром с и внутренней частью непрореагировавшего СПАЫ(СНз)4 с течением времени размывается - наблюдается выравнивание концентрации цитохрома с. Микрофотометрические данные, полученные для такого образца через 4 недели, представлены на Рис.5 (кривая 8) и соответствуют более или менее равномерному прокрашиванию белком всего образца геля.

Таким образом, представленные выше данные свидетельствуют о том, что характер транспорта полиионов в противоположно заряженных сетках определяется величиной контракции сетки в результате ИПР. Чем выше контракция, тем ярче выражен фронтальный характер интерполиэлектролитной реакции, и в продуктах незавершенной ИПР наблюдается макроскопическое фазовое разделение. Фронтальный характер ИПР и, соответственно, локализованный коллапс геля непосредственно связан с энтропийной упругостью набухшей полимерной сетки. Ситуация, при которой в продукте незавершенной реакции сильной контракции подвергается только часть геля, оказывается термодинамически предпочтительной. Действительно, проигрыш конформационной энтропии системы при диспропорционировании должен быть существенно меньше, чем в случае равномерного распределения пенетранта в сетке, поскольку в последнем случае контракции должен подвергнуться весь объем образца.

Очевидно, явление локализованного коллапса при взаимодействии белков с противоположно заряженными сетками может представлять интерес для дизайна различных структур типа "ядро - оболочка". Более того, рассмотренные выше особенности транспорта белков в противоположно заряженных сетках позволяют получать многослойные композиции с различной толщиной и свойствами чередующихся слоев ИПК, включающих различные белки. Например, если гел! СПАЫа поместить сначала на некоторое время, недостаточное для превращения

¡сего образца геля в ИПК, в раствор цитохрома с, а затем в раствор лизоцима, в юлученном образце можно обнаружить окрашенное в красный цвет ядро ИПК ^ПА-цитохром с и внешнюю белую непрозрачную обролочку ИПК СПА-лизоцим. "хсма (4) такого эксперимента приведена ниже:

При обратной последовательности обработки геля конечный продукт имеет слое ядро - ИПК СПА-лизоцим и красную оболочку - ИПК СПА-цитохром с. 1одобные процессы могут быть использованы для конструирования различных юлиферментных систем, диагностических устройств и др.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что сорбция белков слабостигыми ПЭ осуществляется как активированный перенос белков в гель, движущей силой которого является ИПР с образованием в фазе геля ИПК СПЭ-белок. Такое взаимодействие происходит в средах, в которых белок и полиэлектролитная сетка противоположно заряжены. Образующиеся поликомплексы стабилизированы солевыми связями между противоположно заряженными ионсиенпыми труппами белка и сетки.

2. Составы ИПК СПЭ-белок определяются величиной заряда белка и сетки и не зависят от соотношения компонентов в реакционной смеси. При этом составы сетчатых поликомплексов совпадают с составами нерастворимых комплексов белков с линейными полиэлектролитами, полученных в тех же условиях (рН и ионная сила).

3. Впервые установлено, что характер транспорта, а также распределения белков в продуктах незавершенных реакций определяются величиной контракции сетки в результате ИПР. В бессолевых водных растворах наблюдается

локализованный коллапс гелей и, соответственно, макроскопическое фазовое разделение в продуктах незавершенных реакций. При добавлении простых солей в реакционную среду наблюдается равномерное распределение белка по всему объему геля.

4. Путем последовательных реакций полиэлектролитных гелей с разнородными белками получены двухслойные композиции, включающие слои поликомплексов СПА-цитохром с и СПА-лизоцим, разделенные резкой границей. Таким образом, сорбция белков противоположно заряженной сеткой осуществляется как фронтальная гетерогенная реакция без радиального перемешивания пенетрантов.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Карабанова В.Б., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Взаимодействие сетчатого полиакрилата натрия с белками.// Высокомолек.соед., 1995, тА37, N11, с. 1861-1867.

2. Скобелева В.Б., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Коллапс набухшей сетки и фазовое разделение при взаимодействии слабосшитого полиэлекгролитного геля с противоположно заряженными белками.// Докл. АН, 1996, т347, N2, с.207-210.

3. Скобелева В.Б., Зинченко A.B., Рогачева В.Б., Зезин А.Б. Взаимодействие слабосшитого полиамина с БСА.// Вест. Моск. Универ., 1997, в печати.

4. Скобелева В.Б., Ковригин Д.И., Рогачева В.Б., Зезин А.Б. Коллапс полиакрилатного геля при взаимодействии с противоположно заряженными белками .//Вест. Моск. Универ., 1997, в печати.

5. Карабанова В.Б., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Взаимодействие сетчатого полиакрилата натрия с белками.// Тезисы докладов международной конференции по фундаментальным наукам "Ломоносов - 95", Москва, 1995.

6. Скобелева В.Б., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Самоорганизация белков при взаимодействии с противоположно заряженными сетчатыми полиэлектролитами.// Авторефераты докладов 1ой Международной конференции "Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии", Санкт-Петербург , 1996, ч.И, с.309-311.

7. Скобелева В.Б., Зинченко A.B., Ковригин Д.И., Рогачева В.Б., Зезин А.Б. Взаимодействие слабосшитых полиэлектролитов с белками.// Тезисы докладов международной конференции "Фундаментальные проблемы науки о полимерах" (К 90-летию академика В.А.Каргина), Москва, 1997, СЗ-76.