Закономерности удерживания цефалоспориновых антибиотиков в условиях высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенными фазами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

КУРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ

на правах рукописи

ОКСЕНЕНКО ОЛЬГА ИВАНОВНА

ЗАКОНОМЕРНОСТИ УДЕРЖИВАНИЯ ЦЕФАЛОСПОРИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ В УСЛОВИЯХ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ОБРАЩЕННЫМИ ФАЗАМИ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.04 - физическая химия.

Научные руководители: доктор фармацевтических наук, профессор A.A. Хабаров; кандидат химических наук, доцент А.Ю. Малыхин.

Курск - 1999

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................11

1.1. Обоснование выбора метода ВЭЖХ с обращенными фазами для анализа цефалоспориновых антибиотиков в биоматериале 11

1.2. Основы теории обращенно-фазовой хроматографии..........18

1.3. Роль ионных равновесий в сорбции цефалоспоринов.......23

1.4. Влияние концентрации органического модификатора на удерживание сорбатов................................................................28

1.5. Влияние структурных характеристик сорбатов на удерживание...............................................................................32

1.6. Прикладная ВЭЖХ цефалоспориновых антибиотиков... 36

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...........................................43

2.1. Аппаратура и колонки.........................................................43

2.2. Препараты и реактивы........................................................43

2.3. Условия хроматографирования...........................................46

2.4. Измерение коэффициентов емкости...................................47

2.5. Обработка результатов анализов.......................................47

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ............................................48

3.1. Влияние значений рН и ионной силы подвижной фазы на удерживание цефалоспориновых антибиотиков.......................48

3.2. Механизм удерживания цефалоспоринов........................56

3.3. Зависимость удерживания цефалоспориновых антибиотиков от концентрации органического модификатора в подвижной фазе..........................................................................60

3.4. Зависимость удерживания цефалоспоринов от строения.. 83

3.4.1. Связь коэффициентов емкости цефалоспориновых антибиотиков с коэффициентами распределения в системе октанол-вода.............................................................................84

3.4.2. Связь коэффициента емкости цефалоспориновых антибиотиков с упрощенным критерием гидрофобности..........89

3.5. Модели удерживания цефалоспориновых антибиотиков95

3.6. Построение математической модели удерживания цефалоспоринов методом многофакторного анализа..............110

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦЕФАЛОСПОРИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ В БИОЖИДКОСТЯХ МЕТОДОМ ВЭЖХ С ОБРАЩЕННЫМИ

ФАЗАМИ.....................................................................................115

4.1. Подготовка биопроб к анализу.........................................115

4.2. Выбор оптимальных условий хроматографирования.......117

4.3. Анализ цефалоспориновых антибиотиков в биопробах... 118

4.4. Общая схема выбора условий анализа цефалоспориновых антибиотиков............................................................................124

ВЫВОДЫ...,...................................................................................125

ЛИТЕРАТУРА................................................................................127

ПРИЛОЖЕНИЯ.............................................................................143

Список использованных в работе сокращений

и обозначений

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ПФ - подвижная фаза

АА - ацетат аммония

АБ - ацетатный буфер

МЕ - метанол

ТБАГС - гидросульфат тетрабутиламмония

КФ - фосфат калия

В - вода

ТБАФ - фосфат тетрабутиламмония

АН - ацетонитрил

ФБ - фосфатный буфер

УК - уксусная кислота

ТЭА - триэтиламин

НДДС - додекансульфонат натрия

АДГФ - дигидрофосфат аммония

Э - этанол

НФ - фосфат натрия

АК - карбонат аммония

НГПС - гептилсульфонат натрия

КХ - хлорид калия

ЦБ - цитратный буфер

ТБАБ - тетрабутиламмония бромид

ГДТАБ - гексадецилтриметиламмония бромид

НДГФ - дигидрофосфат натрия

ТМАХ - триалкиламмония хлорид

7-АЦК - 7-аминоцефалоспорановая кислота

7-АДЦК - 7-аминодеацетоксицефалоспорановая кислота

I - ионная сила

с - концентрация органического модификатора,

об%

С - концентрация органического модификатора,

моль/л

и - среднее квадратическое отклонение экспе-

риментальных значений от расчетных р' - параметр полярности подвижной фазы

г - коэффициент корреляции

Б - Б-критерий

р - уровень значимости

Р - доверительная вероятность

вг - относительное стандартное отклонение

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Цефалоспориновые антибиотики, относящиеся к группе |3-лактамных соединений, широко применяются в медицинской практике. Одной из важных задач современной химии является их количественное определение в биожидкостях с целью подбора оптимального дозирования и терапевтического мониторинга в процессе лечения. Необходимость проведения таких комплексных определений вытекает из различия фармакодинамики и фармакоки-нетики лекарственных средств у разных индивидов.

Из существующих методов анализа цефалоспориновых антибиотиков в биожидкостях (микробиологические, спектральные, электрохимические) многие исследователи отдают предпочтение высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенными фазами (приблизительно 2/3 от общего количества методов определений).

В то же время следует отметить недостаточность знаний в области физико-химических закономерностей хроматографического поведения данного класса соединений. Закономерности сорбции цефалоспориновых антибиотиков изучены лишь фрагментарно, при этом отсутствует ясность, в какой степени общетеоретические представления обращенно-фазовой хроматографии применимы к данному классу веществ. Недостаточное развитие теории имеет также отрицательные последствия. Так, выбор условий хроматографии цефалоспориновых антибиотиков осуществляется чаще всего методом проб и ошибок. Результаты такого подхода зачастую далеки от оптимальных. Поэтому на данном этапе актуальным и закономерным является развитие полуэмпирической модели для цефалоспориновых антибио-

тиков, которая позволяет приблизиться к решению основной задачи теории удерживания - развитию теоретических представлений, позволяющих рассчитывать величины удерживания исследуемых соединений, исходя из их строения и условий проведения хроматогра-фического эксперимента.

Целью данной работы явилось исследование закономерностей хроматографического поведения цефалоспориновых антибиотиков в режиме обращенно-фазовой ВЭЖХ и создание на базе этих закономерностей рациональной схемы выбора условий их анализа.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить зависимость удерживания цефалоспориновых антибиотиков от композиционных факторов подвижной фазы (количественных и качественных).

2. Исследовать корреляционные зависимости характера удерживания от структурных параметров сорбатов.

3. На основании полученных закономерностей разработать модель удерживания цефалоспориновых антибиотиков в условиях ВЭЖХ с обращенными фазами, связывающую строение исследуемых соединений, условия эксперимента и величины удерживания.

4. Разработать методики определения изученного ряда соединений в биообъектах.

Научная новизна работы. Впервые проведено систематическое исследование хроматографического поведения цефалоспориновых антибиотиков в режиме обращенно-фазовой ВЭЖХ. Показано, что на октадецильных сорбентах существует линейная зависимость логарифма коэффициента емкости сорбата от логарифмов параметров состава подвижной фазы. Установлено существование зависимости значений хроматографического удерживания цефалоспориновых антибиотиков от их строения. Предложен модифицированный крите-

рий для априорной оценки гидрофобности, достоинством которого является простота и универсальность. Получен ряд линейных уравнений регрессии, позволяющих прогнозировать хроматографическое поведение цефалоспориновых антибиотиков и определять оптимальные условия их анализа в сложных объектах биологического происхождения.

Практическая значимость работы. Предложены модели хро-матографического поведения цефалоспориновых антибиотиков в условиях ВЭЖХ с обращенными фазами на октадецильных сорбентах. Данные модели позволяют выбирать оптимальные условия хромато-графического анализа цефалоспоринов и совместно со спектральными характеристиками проводить их предварительную идентификацию.

Сформулирована общая схема выбора условий определения изученный антибиотиков в биожидкостях.

Подготовлены методические рекомендации по использованию полученных моделей , предназначенные для аналитических и клинических лабораторий.

Разработаны методики определения цефалоспориновых антибиотиков в биообъектах.

Работа является самостоятельным фрагментом комплексной научно-исследовательской тематики Курского государственного медицинского университета по проблеме "Фармация".

Внедрение результатов работы. На основании проведенных исследований совместно с кафедрой кожных и венерических болезней опубликованы и внедрены методические рекомендации по количественному определению препарата "Роцефин" (цефтриаксон) в плазме крови и моче методом ВЭЖХ с обращенными фазами .

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: - Юбилейной конференции, посвященной 60-летию КГМУ (Курск,

1995); - межобластной научной конференции "Актуальные вопросы научно-практической медицины" (Орел, 1997); - 62-й итоговой научной конференции молодых ученых и студентов КГМУ (Курск, 1997); - IV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997); - 63-й итоговой научной конференции молодых ученых и студентов КГМУ (Курск, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе:

- методические рекомендации для студентов к лабораторным работам по дисциплине "Биофарманализ";

- методические рекомендации по определению цефтриаксона в биологических жидкостях методом ВЭЖХ для исследовательских лабораторий.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, главы обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 155 источников, в том числе 121 зарубежных авторов, приложений. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 47 таблицами.

Личный вклад автора. Диссертантом выполнен весь объем экспериментальных исследований; проведены необходимые расчеты, обработка результатов и их анализ; сформулированы общие положения, выносимые на защиту, выводы и рекомендации.

На защиту выносятся следующие положения:

- - корреляция между параметрами удерживания цефалоспори-новых антибиотиков и содержанием органического модификатора в подвижной фазе;

- способ априорной оценки гидрофобности цефалоспоринов через модифицированный критерий;

- корреляционные зависимости параметров удерживания цефа-лоспориновых антибиотиков с их структурными характеристиками;

- зависимость удерживания сорбатов от рН и ионной силы подвижной фазы;

- модели удерживания цефалоспориновых антибиотиков в условиях ВЭЖХ с обращенными фазами;

- методики определения цефалоспориновых антибиотиков в биообъектах (плазма крови, моча).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Обоснование выбора метода ВЭЖХ с обращенными фазами для анализа цефалоспориновых антибиотиков в

биоматериале

В выборе метода анализа главную роль играют строение и физико-химические свойства изучаемых соединений.

К группе цефалоспоринов относится ряд природных антибиотиков и многочисленные полусинтетические препараты, полученные на основе 7-аминоцефалоспорановой (7-АЦК) и 7-аминодеадетоксицефалоспорановой (7-АДЦК) кислот [8, 20].

8

СООН

7-АЦК

Б

СООН

7-АДЦК

Структурную основу цефалоспориновых антибиотиков составляет конденсированная система, включающая дигидротиази-новый и р-лактамный циклы:

Введение различных ацильных заместителей в N1^- группу в положении 7 и разнообразных замещающих групп в положении 3 дает большой ряд полусинтетических производных, отличающихся по гидрофобно-гидрофильным свойствам. Предполагают, что высокая химическая реактивность и антибиотическая реактивность цефалоспоринов обусловлена наличием р-лактамного цикла, индуктивным эффектом ацильного заместителя и стерическим эффектом молекулы [69, 88, 118, 146].

Константа диссоциации (рКа) С4-СООН имеет значение 1,72,6 [151], свидетельствующее о достаточно сильной кислотности карбоксильной группы. Происходит это вследствие наличия соседних электроотрицательных групп. Атом азота р-лактамного кольца характеризуется слабыми основными свойствами (рКа < -5) [118]. Присутствующая в различных боковых ациламидных цепочках а-аминогруппа имеет значение рКа в ряду 7,0-7,4 [88, 57].

Характерный ультрафиолетовый спектр цефалоспориновых антибиотиков имеет максимум поглощения около 260 нм, что вызвано наличием структуры: О = С8 - N - С4 = С3 [88]. С раскрытием р-лактамного цикла поглощение исчезает. Кроме того болыиин-

3

соон

ство р-лактамных антибиотиков содержат поглощающие УФ-излучение заместители [2, 13, 27].

При выборе метода анализа возникает и вопрос об устойчивости изучаемого класса соединений в различных средах. Этот вопрос для ряда цефалоспоринов хорошо освещен в публикациях [3, 10, 17, 18, 21, 30, 31, 68, 81]. Установлено, что цефалоспорины, содержащие а-аминогруппу, обладают максимальной устойчивостью при значении рН 4-5, соответствующем изоэлектрической точке цефалоспоринов. Для других антибиотиков это наблюдается при рН 6-7. В кислых и щелочных средах наблюдается гидролиз р-лактамного кольца, причем скорости щелочного гидролиза значительно выше, чем кислотного. При рН около 1 С3-ацетокси группа гидролизуется в 8 раз быстрее, чем р-лактамное кольцо [51, 151]. В нейтральной и щелочной среде а-амино группа сильно уменьшает устойчивость цефалоспоринов (при рН = 8 в 10 раз) [151, 152].

Цефалоспориновые антибиотики, изученные в работе [151], можно представить в порядке увеличения стабильности в щелочной среде следующим образом: цефалоридин< цефалотин= цефа-логлицин= цефазолин< цефалексин= цефрадин. Для цефалогли-цина при рН 7,4 и 35° С 5 часов. Это обстоятельство следует учитывать в процессе приготовления и хранения растворов изучаемых антибиотиков.

В статье [98] изучена стабильность растворов цефалоспоринов в рабочих клинических образцах, в замороженной плазме и моче. В частности показано, что стабильность растворов цефалоспоринов зависит от рН и температуры раствора. Например, создав с помощью буфера рН = 5 и заморозив образец плазмы, содержащий цефсулодин, можно добиться стабильности образца в течение 3 месяцев. Максимально допустимое время хранения образцов (деградация не более 5%) представлено в табл. 1.

Таблица 1

Максимально допустимое время хранения образцов

Препарат Калибровочный р-р при 5° С (дней) Рабочий клинический образец Замороже проба (щ нная био-эи -20°С)

плазма (часов) моча (часов) плазма (мес.) моча (мес.)

Цефсулодин 7 4 10 1,5 >8

Цефотиам 14 5 5 >9 >9

Цефуроксим 14 >5 >5 >3 >2

Цефотаксим 14 >5 >5 >3 >3

Дезацетил-цефотаксим 14 >5 >5

Цефроксадин 21 >6 12 9 3

Цефалексин 21 >6 >6 9 3

Количественное и качественное определение цефалоспори-новых антибиотиков в биологических матрицах чаще всего проводят в биофармацевтических целях (изучение распределения антибиотиков в жидкостях и тканях организма). Вследствие низкой токсичности цефалоспоринов их терапевтический мониторинг проводят значительно реже. Исключение составляют больные с нарушениями функции почек [128]. Следует отметить, что проводимые аналитические исследования обычно не требуют максимально чувствительных методов анализа, так как вводимые дозы исследуемых антибиотиков имеют достаточно большие значения: уровень концентрации в крови часто находится в пределах 0,1 - 10 мкг/ мл.

Определение цефалоспоринов в биологических объектах сопряжено также с рядом трудностей: у них отсутствует собственная флуоресценция и поглощение света в видимой области спектра.

Флуоресцирующими свойствами обладают производные цефалоспо-ринов, полученные в результате нагревания в кислой и щелочной средах. Причем такое свойство имеют только те антибиотики, которые содержат а- аминогруппу в положении С7 (цефалексин, цефра-дин и др.) [36, 155]. Спектры поглощения в УФ-области содержат полосы, характерные также и для компонентов биологических объектов. Цефалоспорины являются термолабильными, нестойкими соединениями. Еще одной трудностью при определении антибиотиков в биообъектах является ограниченное в большинстве случаев количество биоматериала, используемого для проведения анализа. Метод анализа должен учитывать все эти обстоятельства, а в идеале должен обладать следующим набором труднодостижимых свойств [32].

1. Достаточная чувствительность.

2. Возможность работы с малыми объемами проб.

3. Большая специфичность, избирательность.

4. Быстрота выполнения анализа.

5. Простота подготовки (обработки) проб перед анализом.

6. Дешевизна и легкость обслуживания аналитического прибора.

7. Надежность и восп