Закономерности удерживания в обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии низкомолекулярных синтетических пептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ЛАТВИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ГРИГОРЬЕВА ВЕРА ДИОНИСЬЕВНА

ЗАКОНОМЕРНОСТИ УДЕРЖИВАНИЯ В ОБРАЩЕННО-ФАЗНОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ

02.00.04 — физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

РИГА - 1990

Работа выполнена в Институте органического синтеза Латвийской академии наук

Научный руководитель:

доктор химических наук,

старший научный сотрудник ШАТЦ В. Д.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук,

старший научный сотрудник ДАВЫДОВ В. Я.

доктор химических наук, профессор ШИМАНСКАЯ М. В.

Ведущая организация:

8 НИИ Биотехнологии Минмедпрома СССР

Защита состоится _ /5~ 199"/г. в Ю

часов на заседании специализированного совета Д 010.06.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте органического синтеза Латвийской академии наук, по адресу: 226006, Рига, ул. Айзкрауклес, 21.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института органического синтеза Латвийской академии наук.

Автореферат разослан „ 3 " фЯ-'&З-- &рЛ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета

ТУТАНЕ И. К.

I

Актуальнрсть_работы. Достижения высокоэффективной

жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и ее наиболее популярной разновидности - обращенно-фазной хроматографии (ОФХ) в течение последних десятилетий радикально изменили методологию исследований в различных областях. Благодаря развитию теории в простейших случаях удалось перейти от эмпирической разработки методов разделения к целенаправленному их созданию. Однако теоретические представления относительно ОФХ ионогенных полифункциональных соединений пока фрагментарны. Ото препятстует осознанному применению метода при синтезе и исследованиях пептидов, физико-химические закономерности сорбции которых изучены недостаточно. Подбор режимов хроматографирования осуществляется чаще всего методом проб и ошибок. Такое положение объяснимо специфическими свойствами пептидов, затрудняющими использование разработанных до сих пор теорий хроматографии. В результате этого разработка методов разделения и их оптимизация весьма трудоемки. Поэтому исследование закономерностей хроматографического поведения пептидов в условиях обращенно-фазной ВЭЖХ и создание на базе этих закономерностей рациональной схемы выбора условий анализа является актуальной задачей.

_Ц§5ью_£анной_работы явилось: - изучение зависимости удерживания на октадецилсиликагеле от строения пептидов опосредованного через параметры гидрофобности;

- изучение зависимости удерживания от состава подвижной фазы в условиях обращенно-фазной хроматографии (ОФХ) на октадецилсиликагеле и немодифицированном силикагеле;

сопоставление влияния концентрации органического растворителя, рН и ионной силы подвижной фазы на ее элюирующую силу и селективность;

- построение модели, описывающей совместное влияние состава подвижной фазы и структуры разделяемых соединений на их удерживание в условиях обращенно-фазной хроматографии на октадецилсиликагеле.

Научная__новизна. Впервые предложена модель удерживания незащищенных, частично или полностью защищенных линейных и циклических пептидов в условиях ОФХ на октадецилсиликагеле, описывающая влияние аминокислотного состава и защитных групп, а также состава подвижной фазы на величины удерживания. Разработана модифицированная система инкрементов

гидрофобности, учитывающая особенности структурных фрагментов пептидов, проявляющиеся в хроматографическом процессе.

Проведена сравнительная оценка закономерностей сорбции пептидов на октадецилсиликагеле и немодифицированном силикагеле в подвижных фазах, содержащих ацетонитрил и водный буферный раствор, и установлено, что при высоких концентрациях органического растворителя за сорбцию отвечают немодифицированные силанольные группы, а не алкильные лиганды сорбента.

Практическая „Ценность работы определяется тем, что на основании изученных закономерностей удерживания пептидов предложена рациональная схема выбора условий

хроматографирования. Предложенная модель позволяет

прогнозировать удерживание хроматографически неизученных пептидов. Она была использована при разработке режимов анализа и препаративного разделения сотен реакционных смесей и конечных продуктов. Для веществ, имеющих практическое значение, были разработаны методики анализа на уровне требований Фармакопейного комитета.

Структура___работы. Диссертация состоит из введения,

литературного обзора, экспериментальной части, глав, посвященных результатам исследования, их обсуждению, практическому применению результатов исследования, выводов, списка цитируемой литературы. В литературном обзоре даны основы теории обращение-фазной хроматографии, показана роль ионных равновесий в сорбции пептидов, влияние концентрации органического растворителя подвижной фазы на удерживание, приведены описанные в литературе методы прогнозирования удерживания пептидов в режиме градиентной хроматографии на алкилсиликагелях. В экспериментальной части содержатся сведения об используемой аппаратуре, хроматографических

материалах, исследуемых веществах, методике измерения коэффициентов емкости. В главе «Результаты и обсуждение» рассматриваются закономерности удерживания пептидов на октадецилсиликагеле в режиме обраденно-фазной ВЭЖХ. Выведены полуэмпирические модели удерживания, связывающие коэффициенты емкости сорбатов с их строением и составом подвижной фазы. Показаны возможности хроматографии незащищенных пептидов на немодифицированном силикагеле, при использовании подвижных фаз, состоящих из ацетонитрила и водного буферного раствора. В главе «Практическая ВЭЖХ пептидов» описана препаративная очистка синтетических пептидов, приведены методики контроля качества пептидных препаратов для медицины и ветеринарии.

Экспериментальная часть

Систематически исследовано поведение 31 пептида, проверка прогнозирующей способности выполнена на 39 пептидах, содержащих от.2. до 10 аминокислотных остатков. Структура наиболее характерных из них приведена в табл.1. Их величины удерживания измерены на хроматографах фирмы DuPont, модели S330 и 850. В качестве детектора использован проточный спектрофотометр фирмы DuPont А=190-360 ни.

В работе использованы колонки производства фирмы DuPont, а также заполненные в лаборатории суспензионным методом с внутренним диаметром 4, В мм, длиной 150 мм либо 250 им. Сорбенты: Zorbax ODS, Zorbax С8, Silasorb С18, Silasorb 600 имели размер частиц 5 и 7, 5 мкм. В качестве подвижных фаз применяли смеси ацетонитрила с водными буферными растворами -О, 1М фосфатным с рН 2,5; О, 1М ацетатным с рН 5,0 и О, 1М валератом аммония, рН 5,0.

При описании методик анализа и в ходе эксперимента концентрация органического растворителя выражалась в объемных процентах. В ходе исследования закономерностей сорбции были использованы логарифмы молярной концентрации органического растворителя, что позволило дать ясную физико-химическую интерпретацию параметров модели.

Таблица 1

Структура исследуемых соединений

I г-Бег-Туг-ОМе

II г-Рго-*\7а1-С1у—ОЕЪ

III г-Бег-Туг-Зег-Ме^С1и(0Вг1)-Н1з-РЬе-0КЬ

IV 2-Бег-Туг-8ег-Ме^Б1и(ОВг1)-Н1з-РЬе-Агд(N0 )-Тгр--С1у-0ЛЬ

V 2НС1. Н-Н1з-Р11е-0№э

VI н-ьуз(г)-1,уБ(г)-овг1

VII Вос-Ьуз(2)-Рго-Уа1-С1у-0Н

VIII Вос-Ьуг(Ъ)-Рго-Уа1-С1у-Ьуз(Ъ)-Ьуэ(Ъ)-ОН

IX г-Бег-Туг-Бег-Ме^СНа (0Вг1) -Н1з-РЬе-0Н

X г-Бег-Туг-5ег-Ме<:-С1и(0Вг1)-Н1з-Р11е-Агд(И0 )--Тгр-С1у—ОН

XI Ьуз-А1а-Уа1-Туг-11е-Рго-РЬе

XII Ьуз-Уа1-Туг-11е-Н1з-Рго-РЬе-Агд

XIII Ьуз-Туг-Зег-Н1з-Рго-С1и-0Н

XIV Ьуз-Рго-Рго-С1у-РЬе-С1у-Рго-РЬе-Агд

XV АБп-Агд-Уа1-Туг-11е-н1з-Рго-РЬе-Агд

XVI Азп-Агд-Уа1-Туг^а1-Н1з-Рго-РЬе

XVII Агд-Тгр-С1у-Ьуз(Вое)-Рго

XVIII Туг-С-0гп-С1у-Р11е

XIX вХу-Ьуз-Рго-Агд

Строение защищенных пептидов и их удерживание в ОФ ВЭЖХ

Коэффициенты емкости, используемые для описания удерживания, определяются константой сорбционного равновесия между неподвижной и подвижной фазами К и отношением объемов неподвижной и подвижной фаз V /V :

в т

1дк' = 1дК + 1ду /V

б т

(1)

В свою очередь, К связана со свободной энергией процесса и поэтому к4 является по существу также термодинамическим

параметром:

ДС

1дк' ---+ 1дУ /V (2)

ИТ 8 га

Из теории Хорвата вытекает вывод, о том, что влияние строения веществ на коэффициент емкости может быть опосредовано при помощи параметра гидрофобности - логарифма коэффициента распределения соединений между органическим растворителем и водой:

1дк' = а + а 1дР (3) ,

' о 1 ^ ояс/и

где ао, а1~ коэффициенты.

Величины 1дк* могут быть рассчитаны как сумма инкрементов гидрофобности , соответствующих структурных фрагментов:

^онс/* = аЛ <4>

где: а( - число однотипных структурных фрагментов в молекуле, ^ - табличное значение инкремента гидрофобности для системы октанол - вода.

Мы попытались с помощью уравнения (3) описать удерживание пептидов, имеющих не более одной свободной концевой группы. Значения 1дР находили согласно (4). Корреляция между 1дк* и 1дР была неудовлетворительной. При рассмотрении погрешностей аппроксимации для отдельных соединений было установлено, что они возрастают с удлинением пептидной цепи, а также для соединений, имеющих незащищенные концевые группы. Следовательно, можно было предположить, что гидрофобность наиболее полярных групп в обращенно-фазной системе не соответствует наблюдаемой в системе октанол-вода, поэтому требовалась оптимизация значений инкрементов Методом

наименьших квадратов нами найдены инкременты полярных фрагментов молекул, оптимизированные применительно к используемым

режимам хроматографии (табл.2). Полученные значения использовались для дальнейших расчетов гидрофобности соединений (1дР*).

Таблица 2.

Оптимизированные инкременты гидрофобности

Фрагмент ft (по Реккеру) * ч

=CH-CONH- -1,03 -о, 40

-СООН (алк. ) -0,954 -2 ,33

-NH (алк. ) -1,428 -2 ,05

Удерживание пептидов и концентрация ацетонитрила в элюенте

Для изучаемых полностью или частично защищенных пептидов на сорбенте Zorbax ODS при использовании в качестве подвижных фаз смеси ацетонитрила и О, 1М фосфатного буфера в диапазоне концентраций ацетонитрила 25-65 об. У. наблюдается характерная для ОФХ линейная зависимость логарифма коэффициента емкости от логарифма молярной концентрации ацетонитрила (С) в подвижной фаз е :

lgk* = а + blgC (5),

b в этом уравнении соответствует числу сольватирующих молекул ацетонитрила, которые высвобождаются при ассоциации анализируемых молекул с неподвижной фазой, коэффициент а характеризует сорбционную способность колонки по отношению к анализируемому веществу. В табл.3 приведены характерные параметры уравнения (5).

Сопоставление значений а и b обнаруживает, что эти параметры также линейно связаны:

а = -1,001 - 1,168Ь (г=0,992) (6)

Корреляция между параметрами а и b в уравнениях (5) -компенсационная закономерность - уже отмечалась в литературе для других классов веществ. Ее наличие свидетельствует о том, что доминирующий механизм сорбции органического модификатора и пептидов рассматриваемого множества одинаков. Поскольку

Параметры уравнений (5)

Таблица 3

(инение 1дР* а Ь г п сг

I 1, ,41 3, ,02 -3,51 0, ,995 3 0, ,038

II 2, ,87 3, ,35 -3,48 0, ,997 5 0, ,032

II 5, ,59 9, ,03 -8, 65 0, ,992 4 0, , 054

IV 4, ,70 8, ,06 -7,82 0, ,999 4 о, ,010

V 2, ,33 2, ,83 -3,31 0, ,999 4 0, ,014

VI 4, , 62 6, ,89 -5, 55 0, ,998 6 о, , 031

VII 2, , 15 5, ,50 -5, 65 0, ,997 5 0, , 030

VIII 5, ,56 9, ,34 -8,81 0, ,991 3 0, , 040

IX 2, ,21 6, ,52 -б, 69 0, ,995 5 0, , 046

X 1, , 32 7, ,05 -7,24 0, ,994 4 0, , 054

ацетонитрил сорбируется алкилсиликагелем по гидрофобному механизму, следует вывод, что в диапазоне 25-65% органического растворителя в подвижной фазе механизм сорбции данного множества объектов также преимущественно гидрофобный.

Модель удерживания пептидов

Обнаружено, что с увеличением 1дР значения а и Ь (табл.3) по абсолютной величине возрастают. Коэффициенты корреляции в этом случае невелики:

а = ао + а^дР* (г=0,75) (7),

Ь = Ьо + Ъ^дР* (г=0,68) (8),

однако статистический анализ показал, что с вероятностью О,99

* *

можно утверждать, что связь между а и 1дР , Ь и 1дР существует. Значит, можно представить удерживание пептидов как функцию их гидрофобности и концентрации органического растворителя в элюенте.

Подставив выражения (7) и (8) в уравнение (5), получаем:

1дк' = х + у1дР*+ г1дС + и1дР*1дС (9)

Найдено, что х=2,337; у=0,568; г=-2,826; и и--0,400 (г-0,93; п»33; а=0,15). Уравнение (9) является полуэмпирической моделью сорбции рассматриваемого класса

веществ. Ее прогнозирующая способность оценена путем сопоставления расчетных и экспериментальных значений lgk' для 29 пептидов, не использованных При определении коэффициентов уравнения (9). Среднеквадратичное отклонение расчетных значений lgk* от экспериментальных составляет 0, 13. Расчетные и экспериментально наблюдаемые значения lgk1 связаны соотношением:

1дкЛ « 0,006 + 1,0591дкЛ (10) (г=0, 96; п=29; (7=0,13)

Близость свободного члена к нулю, а углового коэффициента к единице свидетельствует о том, что предлагаемая модель при априорном расчете параметров удерживания не дает существенных систематических ошибок. Достигнутая точность прогнозирования удерживания пептидов достаточна для решения практически важного вопроса - расчетного выбора содержания ацетонитрила в элюенте на основании строения анализируемого соединения. Во многих случаях оптимальным значением можно считать k,=3, 1дк'= 0,477. Поскольку отклонения расчетных значений к* от экспериментальных, превышающие 2ст крайне редки,

экспериментально наблюдаемое удерживание практически всегда будет удовлетворять условию 1, 5<^дКСП <6- Оба предельных значения легко наблюдать экспериментально в изократическом режиме хроматографии, они в большинстве случаев приемлемы для аналитической практики. Примеры сопоставления расчётных и экспериментальных хроматограмм пептидов даны на рис.1.

Другая сфера применения модели (9) - предварительный качественный анализ смесей пептидов. Поскольку значительные расхождения расчетного и экспериментального удерживания крайне маловероятны, неожиданное расположение пика на хроматограмме служит признаком того, что строение пептида отличается от предполагаемого.

При использовании уравнения- (9) для прогнозирования удерживания свободных линейных и циклических пептидов на сорбенте Zorbax ODS в подвижных фазах, содержащих S-30 об. '/• ацетонитрила, было замечено, что набор параметров, обеспечивающих удовлетворительную точность прогнозирования для

Вос-А^(Ы02)-А^(Ы02)-Рго-Уа1-Ьу5(2)-Уа1-Туг-Рго-ОВг1

Вое

:-НБ(ОВ21)-РЬе-ОН

II

Рис. 1. Сопоставление экспериментально полученных хроматограмм с результатами прогнозирования (пунктирная линия). Элюент: ацетонитрил - О,1М фосфатный буфер, рН2,5 (50:50).

защищенных хотя бы по одному из концов молекул пептидов, приводит к завышенным результатам для свободных пептидов. Появление в молекулах линейных пептидов двух незащищенных концевых групп приводит к неаддитивному снижению гидрофобности. Эффект снижения гидрофобности наблюдается и в случае циклических пептидов. Для его учета введены поправки:

** , *

1дР = 1дР - 3 ** *

1дР - 1дР - 4

(линейные) (11) (циклические) (12)

Величины 1дР коррелируют с 1дк\ причем для линейных и

циклических пептидов наблюдается единая зависимость (рис.2).

Это дало возможность распространить уравнение (9) и для

анализа незащищенных пептидов. Отношение коэффициентов емкости

/ кД„„„ для 13 исследованных соединений было в пределах расч. эксп.

О, 7- 1, 33.

lgk'

lgP

Рис.2. Зависимость lgkx от гидрофобности для незащищенных линейных и циклических пептидов.

Из рис.2 следует также существенный вывод о сфере применимости октил- и октадецилсиликагелей. Величины удерживания на сорбенте с меньшей длиной цепи алкильного радикала менее чувствительны к структуре разделяемых соединений. Такие сорбенты предпочтительны при анализе сложных смесей пептидов, сильно различающихся по строению, в то время как большая длина цепи способствует лучшему разделению близких по строению веществ.

Модели удерживания на Zorbax ODS и Silasorb С18

Алкилсиликагели различных марок, аналогичные по методу химического связывания лигандов и их структуре, могут заметно различаться по свойствам. В связи с этим мы провели сравнение параметров уравнений, описывающих закономерности сорбции защищенных пептидов, для Zorbax ODS й Silasorb С18 (табл.4).

Таблица 4

Сопоставление параметров моделей сорбции пептидов. Подвижная фаза: ацетонитрил - О, 1 М фосфатный буфер, рН2, 5

Уравнение Сорбент Параметры уравнения r n CT

(3) Z lgk'=-0,595+0,2311gP* 0, ,962 12 0, ,13

S lgk'=-0,552+0,24llgP 0, ,877 10 0, ,24

(5) Z lgk'=5,5-5,651gC 0, 997 5 0, 03

S lgk'=5,4-5,55Ige 0, ,996 5 0, ,05

(7) Z a=-l,001-1,168b 0, ,992 21 0, ,27

S a=-0,835-1,127b 0, ,982 21 0, ,45

(8) Z a=3,33+0,8001gP* 0, ,75 21 1, , 39

S a=3,58+0,8521gP 0, ,72 21 1, ,73

(9) Z b=-3,90-0,62 01gP* 0, ,68 21 1, ,31

S b=-4,19-0,657lgP 0, ,63 21 1, ,67

(10) Z lgk'=2,34+0,571 lgPj 0 ,932 33 0, , 165

-2,831gC-0,4 lgClgP

S lgk'=2,47+0,751 lgP-* 0, ,923 35 o, , 169

-3,OlgC-O,561 lgClgP

Z - Zorbax ODS (4,бх250)мм, S - Silasorb С18 (4,6х150)мм.

Видно, что обсуждаемые закономерности соблюдаются с близкой точностью на обоих сорбентах. Значения коэффициентов близки для двух материалов. Таким образом, влияние основных структурных и композиционных факторов в данных системах одинаково. Параметры уравнений близки по величине. Наблюдается также линейная зависимость между величинами lgk* на двух сорбентах:

lgk' =0, 036 + 1, llgk' (г - О, 99 а = О, 07) ( 13),

где: к' и к' - коэффициенты емкости соединения на Silasorb С18 и Zorbax ODS в одинаковых подвижных фазах.

Следовательно, сорбционные свойства этих двух материалов близки, и в аналитической практике их можно считать взаимозаменяемыми.

Сорбция незащищенных пептидов на алкилсиликагеле в широком

диапазоне концентрации ацетонитрила

Обнаружено, что для изученных свободных линейных и циклических пептидов, зависимость (5) соблюдается лишь при небольших концентрациях ацетонитрила в подвижной фазе. В широком диапазоне концентрации ацетонитрила для данных соединений характерна необычная в ОФХ параболическая зависимость 1дк' от 1дС (рис.3).

1дГ 1.5 -

0.5

-0.5

-1

0.8 1дС

Рис.3. Зависимость 1дк'-1дС циклических пептидов.

для незащищенных линеиных

Это свидетельствует о том, что при высоких концентрациях ацетонитрила гидрофобный механизм уже не является доминирующим. Можно показать, что в системах, где возможны два механизма сорбции, результирующая зависимость 1дк* от 1дС при определенных условиях может быть близка к параболической. Пусть для двух механизмов справедливы следующие выражения:

1дк* - а + Ь^дС (14), 1дк' - а2+ Ь21дС (15),

где а , а2, Ь^, Ъ2~ коэффициенты уравнений, причем Ь1<0, а

Ь >0.

2

Неоднородная поверхность октадецилсиликагеля может сольватироваться компонентами подвижной фазы. При этом на полярных центрах сорбируются преимущественно молекулы воды (или компоненты буфера), на неполярных - органического модификатора. Относительная степень сольватации центров двух типов зависит от состава подвижной фазы и определяет вклад двух механизмов, ^ и £ + ^ = 1) . Если вклад механизма

меняется от некоторого максимального до минимального аналогично величинам удерживания:

*г - + а19с (16)"

то из (14) - (16) получаем:

1дк* = шо + т1 1дС + ¡п 1д С

( 17) ,

где: т , т , т2 " коэффициенты уравнения.

Полученные данные удовлетворительно (табл.5) описываются уравнением (17).

Параметры параболического

уравнения

Таблица 5 ( 17)

гогЬах ОББ, подвижная фаза: ацетонитрил - О, 1М фосфатный (Ф), рН 2,5 или О, 1 М ацетатный (А), рН 5,0 буферные .растворы

Соединение т 0 Ф А Ф т 1 А т 2 Ф А г Ф А

XI 8,8 7,1 -20 ,4 "13, ,6 11,1 6,3 0,99 0,99

XII 9,1 9,3 -22 ,0 -19, ,4 12,5 10, 3 0,99 0,96

XIII 3,4 2,8 -10 ,6 " 8, ,4 6,9 5,5 0,97 0,97

XIV 9,6 9,2 -21 ,3 -19, ,2 11,6 10, 5 0,99 0,99

XV 7,3 6,4 -20 ,5 -15, ,3 12,9 9,2 0, 98 0,96

XVI 7 , 2 6,1 -18 ,5 -14, ,8 11,0 8,8 0,98 0,99

XVII 9,3 : 6,4 -21 ,2 -14, ,6 11,5 8,3 0,99 0,95

XVIII 1,7 , 1,1 -б ,8 -4,? ! 4,7 4,3 0,97 0, 97

Аналогичная зависимость 1дк* - 1дС наблюдалась нами при замене О, 1М ацетатного буфера, рН 5, 0 на О, 1М валерат аммония, рН5,0 (рис.4). Удерживание пептидов со свободными аминогруппами в подвижных фазах, содержащих валерат аммония, несколько сильнее, чем в подвижных фазах, содержащих ацетат аммония, что свидетельствует о небольшом ион-парном взаимодействии. Координата 1дСп вершины параболы не зависит от типа применяемого буферного раствора, координата увеличивается с ростом гидрофобности аниона буфера в ряду фосфат - ацетат - валерат. Концентрация ацетонитрила в подвижной фазе в точке перегиба (С^) перемещается в область больших концентраций по мере увеличения гидрофобности пептидов.

1.5

0.5

-0.5

lg г

Acetate

Phosphate

0.4

0.(5

0.6 1дС

1.2

Рис.4. Влияние используемого буферного раствора на зависимость 1дкл-1дС для соединения (XVI).

Для выяснения механизма сорбции пептидов при высоких концентрациях ацетонитрила было изучено хроматографическое поведение ряда модельных соединений: фенилуксусной кислоты,

резорцина, бензиламина, анилина, фенилаланина. Оказалось, что для фенилуксусной кислоты и резорцина во всем диапазоне концентрации ацетонитрила наблюдается характерная для обращенно-фазной ВЭЖХ линейная зависимость 1дк' от 1дС, при высоких концентрациях ацетонитрила эти вещества не удерживались, несмотря на высокую полярность. Параболическая зависимость наблюдалась только для веществ, имеющих положительно заряженные группы - бензиламина и фенилаланина. Следовательно, взаимодействие пептидов с октадецилсиликагелями в подвижных фазах, характеризующихся высокими концентрациями органического растворителя и рН 2-7, объясняется процессами ионного обмена, а не молекулярной адсорбцией на силанольных группах.

Роль рН и ионной силы подвижной фазы

Удерживание свободных пептидов как ионогенных соединений в режиме обращенно-фазной ВЭЖХ определяется не только концентрацией органического растворителя, но также рН и ионной силой подвижной фазы, однако до сих пор не было ясности, какой из этих факторов более важен при оценке элюирующей способности, а какие следует рассматривать как второстепенные. Нами изучено влияние рН подвижной фазы в интервале 2-7 и концентрации буфера в интервале 0,001М-0,1М на удерживание модельных пептидов, имеющих в своем составе нейтральные, основные и кислые аминокислоты.

В диапазоне концентраций буферного раствора 0, 1-0,01М удерживание пептидов изменяется относительно слабо, но дальнейшее разбавление буфера ведет к резкому усилению сорбции, сопровождаемому ухудшением формы пика (табл.6).

Видно, что варьирование молярности буфера по-разному влияет на к1 различных пептидов. Это влияние сказывается также в первую очередь на селективности разделения. Изменение концентрации буфера даже на два порядка сопоставимо с тем влиянием на- удерживание, которое оказывает изменение концентрации ацетонитрила всего на 10-20%.

Таблица 6

Влияние концентрации буферного раствора на удерживание Zorbax ODS (4, 6х250)мм, ацетонитрил - фосфатный буфер, рН2, 5

Коэффициенты емкости Соединение Концентрация Концентрация ацетонитрила

буфера, моль/л 25'/. 50% 70 7.

Фенилаланин 0, ,1 0,25 0,32 0,65

0, ,0 0,32 0,30 0, 65

0, ,0 0,62 0,50 1,0

Циклобрадикинин 0, ,1 3,9 0, 77 2,9

0, ,0 5,0 1,3 3,5

0, ,0 30 >30 >30

Ангиотензинамид о, ,1 0,7 0,4 2,5

0, ,0 1,2 0,6 4,8

0. .0 9,4 >30 >30

Для характерных представителей пептидов, обладающих различным балансом кислых и основных групп, установлено, что варьирование рН во всем диапазоне, допустимом для октадецилсиликагеля, приводит к изменению к* не более чем в 5 раз, хотя и может заметно влиять на селективность разделения (рис. 5).

Следовательно, при выборе состава подвижной фазы для элюирования пептидов, в первую очередь необходимо найти концентрацию органического растворителя. Выбор рН и концентрации буфера имеет относительно второстепенный характер.

Сорбция пептидов на немодифицированном силикагеле

Участие немодифицированных силанольных групп сорбента в процессах сорбции привело к мысли о возможности практического применения систем с силикагелем и подвижными фазами, характерными для ОФХ. Сопоставление удерживания пептидов на немодифицированном силикагеле и Zorbax ODS показало, что при

к'

16 12 -

2 3 4 5 6 ' 7

PH

—- ValProArgLysAsp — Oxytocin -в- BocAlaTrpMetAsp

Рис.5. Влияние pH буферного раствора на коэффициенты емкости.

Igk'

1.2

0.8 0.4

О

0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

IgC

Рис.6. Сопоставление зависимостей lgk'-lgC для соединения (XIV) на сорбентах Zorbax ODS и Silasorb 600.

высоких концентрациях ацетонитрила в подвижной фазе поведение пептидов на этих двух принципиально различных сорбентах почти идентично (рис.6).

Для немодифицированного силикагеля параболическая зависимость lgk* от 1дС в целом сохраняется (таблица 7), однако при малых С удерживание на силикагеле слабее, чем в аналогичных условиях на Zorbax ODS. Селективность при этом может отличаться.

Таблица 7

Параметры параболического уравнения (17)

(Silasorb 600, элюенты: ацетонитрил -О, 1М ацетатный буфер, рН5,О)

Соединение m 0 m i m 2 n Г

XI 0, ,65 -з, ,71 2, ,86 10 0,94

XIII 0, ,46 "2, ,01 1, ,87 9 0,86

XIV 1, ,12 -2, , 66 2, ,10 9 0,98

XV 0, ,77 "2, ,77 2, ,70 9 0,91

XVI 0, ,48 "2, , 60 2, ,43 9 0,93

XVII 0, ,50 -1, ,80 1, ,57 9 0,80

XIX 0, ,31 -1, ,97 2 J ,59 9 0,97

Эффективность разделения большинства пептидов на немодифи-цированном силикагеле не уступала эффективности обращенно-фазного разделения. Пики были достаточно симметричны, благодаря чему данный подход оказался применим в практической хроматографии пептидов.

Общая схема выбора условий анализа синтетических пептидов

На основании полученных результатов нами сформулирована рациональная схема выбора условий разделения синтетических пептидов (при анализе пептидов в биообъектах порядок действий может быть другим), включающая:

1) оценку гидрофобности пептида;

2) выбор с помощью модели (9) или ее графического отражения концентрации ацетонитрила, необходимой для элюирования с коэффициентом емкости около 3;

3) эксперимент с подвижной фазой, содержащей выбранное количество ацетонитрила и буферный раствор. Обычно используется О, 1М фосфатный буфер, рН2, 5 или О, 1М ацетат аммония, рН 5,0;

4) оценку " полученной хроматограммы. При необходимости изменения селективности следует использовать буферный раствор, имеющий другие рН или концентрацию, для окончательной оптимизации элюирующей силы следует изменить концентрацию ацетонитрила.

Анализ высокополярных пептидов, не сорбирующихся на алкилсиликагелях в подвижных фазах, содержащих 0-5% ацетонитрила, следует проводить на модифицированном или немодифицированном силикагеле при концентрации ацетонитрила 60-80%.

Если компоненты изучаемых смесей близки по строению, для анализа желательно использовать октадецилсиликагели, в противном случае разделение удобнее проводить на октилсиликагеле.

Практическая ВЭЖХ пептидов

В рамках исследований по синтезу окситоцина,

дезаминоокситоцина, пентагастрина, аргинин-вазопрессина и его аналогов, аналогов брадикинина и полистескинина, аналогов энкефалина, циклических и линейных аналогов С-концевых фрагментов нейротензина, аналогов вещества Р, бомбезина и других синтетических пептидов разработаны режимы анализа около 1000 реакционных смесей и полупродуктов синтеза пептидов.

Для конечных продуктов, имеющих практическое значение, контроль качества должен осуществляться на уровне требований Фармакопейного комитета. При этом чаще всего оценивают показатели чистоты лекарственного вещества и содержание действующего начала в лекарственных формах. Для этих задач разработаны типовые методики.

Основные параметры режимов хроматографического анализа, внесенных в нормативно-техническую документацию на пептидные препараты, приведены в таблице 8.

Таблица

Режимы ВЭЖХ анализа пептидных препаратов

8

Препарат

Объект анализа

Задача

Режим

Пентагастрин Субстанция

Аргинин-вазопрессин

Ангиотензин-амид

Окситоцин

Дезамино-окситоцин

«Четырехзаме-щенный» вазо-прессин

Субстанция, лиофилизи-рованная форма

Лиофилизи-

рованная

форма

Субстанция, лиофилизи-рованная форма

Субстанция, раствор для ветеринарии

Субстанция

Определение хроматографи-ческой однородности

Определение хроматографи-ческой однородности

Определение содержания посторонних примесей

Определение содержания действующего начала

Определение хроматографи-ческой однородности

Определение хроматографи-ческой однородности

Б11азогЬ С18, СН СЛ:0,1М АсОНН ,

3 ' 4'

рН5,0 (35:65), к * =3; ¿=220 нм

БНаэогЬ С18,

СН СИ:О,1И АсОНН , 3 4'

рН5,0 (14:86) к,=4; Х=230 НМ

311азогЬ С18, СН СИ:0,1М Асога ,

3 4'

рН5,0 (13:87) к,=5,5; Х=220 ни

Б11азогЬ С18,

СН СЛ:0,2М АсОНН . 3 4'

рН5,0 (18:82) к'=3,5; Х:=2 3 0 нм

гогЬах С8, СН СЫ:0,1М АсОШ ,

4

рН5,0 (20:80); к»=3; \=230 нм

БаДаБогЬ С18, СН СИ:0,2М АсОЫНа, рН5,0 (22:78); к'=5,5; А—230 НМ

Выводы

1. Показано наличие линейной связи между гидрофобностыо пептидов и их коэффициентами емкости на алкилсиликагелях. Разработана модифицированная система инкрементов гидрофоб-ности, учитывающая особенности поведения структурных фрагментов пептидов в обращенно-фазной ВЭЖХ. Чувствительность констант сорбционного равновесия к гидрофобности сорбатов выше в случае CIS-модифицированных силикагелей по сравнению с С8-си-ликагелем, поэтому сорбенты первой группы следует предпочитать при разделении близкородственных веществ, а второй - при анализе пептидов, значительно различающихся по строению.

2. В диапазоне концентрации ацетонитрила 5-30% между логарифмами коэффициентов емкости Igk* и логарифмами молярной концентрации ацетонитрила 1дС соблюдается линейная зависимость. Уравнения lgk'-lgC для различных пептидов следуют компенсационной закономерности, что указывает на единый, гидрофобный механизм сорбции в данных условиях.

3. Параметры уравнений lgk1 - lgC для различных пептидов связаны с гидрофобностью, на основании чего предложена модель, описывающая удерживание пептидов как функцию их строения и концентрации органического растворителя в подвижной фазе. Характерные погрешности прогнозирования lgkx ранее не изученных пептидов не превышают О, 13. Модель применима для априорного выбора условий хроматографии и качественного анализа продуктов пептидного синтеза.

4. Использованный подход к моделированию пригоден для систем с различными алкилсиликагелями. Числовые значения параметров модели удерживания для сорбентов Silasorb С18 и Zorbax ODS близки между собой.

5. При увеличении концентрации ацетонитрила в элюенте от 40 до 80% для свободных пептидов наблюдается аномальное увеличение удерживания. Зависимость между коэффициентами емкости и содержанием ацетонитрила в диапазоне 0-8ОУ. близка к параболе и описывается уравнением второй степени. Значения коэффициентов емкости, приемлемые для аналитической хроматографии, могут быть получены при разных концентрациях

ацетонитрила, соответствующих левой и правой ветвям параболы. При высоких концентрациях ацетонитрила в подвижной фазе алкильные лиганды сорбента в сорбции участия не принимают, удерживание определяется ионообменным взаимодействием с немодифицированными силанольными группами.

»

6. Показана возможность хроматографирования пептидов на немодифицированном силикагеле в подвижных фазах, традиционно используемых в обращенно-фазной хроматографии на алкилсиликагелях. В этом режиме также наблюдается параболическая связь между lg):x и 1дС. Использование силикагеля в качестве неподвижной фазы позволило расширить возможности ВЭЖХ применительно к аналитической и препаративной хроматографии пептидов.

7. рН и ионная сила буферного раствора, используемого для приготовления подвижных фаз, которые часто определяют форму пика и селективность, влияют на удерживание в значительно меньшей степени, чем концентрация органического растворителя. Их оптимизация должна производиться лишь после выбора необходимой концентрации органического растворителя.

8. На основании анализа исследованных закономерностей удерживания пептидов предложена общая схема выбора режимов разделения продуктов пептидного синтеза, разработаны методики анализа ряда пептидных препаратов, включенные в нормативно-техническую документацию.

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в следующих статьях и тезисах докладов:

1. Григорьева В. Д., Шатц В. Д. , Бривкалне Л. А. , Чмпенс Г. И. Высокоэффективная жидкостная хроматография пептидных биорегуляторов, их фрагментов и производных. 1. Сорбция фрагментов кортикотропина на Зорбакс ОДС. // Биоорган, химия. 1983. - Т. 9, К. 7. - С. 869 - 877.

2. Grigoryeva V.D., Shatz V.D. Sorbtion of corticotropin and its fragments on Silasorb C18 (LC) and Zorbax ODS. // 4th Danube Symposium on Chromatography. Abstract Volume II. / Bratislava, 1983. - P.C13.

3. Григорьева В. Д. , Шатц В. Д. Хроматографическое поведение циклических пептидов в сравнении с линейными аналогами. // Хроматография в биологии и медицине. Тезисы докладов 1 Всесоюзной конференции. - Н. , - 1983. - С. 9.

4. Григорьева В. Д., Бривкалне Л. А. , Шатц В. Д. Обращенно-фазовая хроматография пептидов в широком диапазоне концентрации органического модификатора подвижной фазы. // VI Всесоюзный симпозиум по химии белков и пептидов. Тезисы докладов. / Рига, 1983. - С. 397.

5. Mutulis F. , Mutule I., Chipens G. , Grigoryeva V., Breslav M. Application of modern methods in the synthesis of cyclic analogues of bradykinin // Chemistry of Peptides and Proteins. / Berlin, New York: Walter de Gruyter & Co, 1984. Vol.2. - P.41 - 46.

6. Григорьева В. Д. , Бривкалне JI. А. Удерживание пептидов на неполярном сорбенте и силикагеле в системах, содержащих фосфатный буфер и ацетонитрил. // Синтез и исследование биологически активных соединений. Тезисы докладов 8-ой конференции молодых ученых. / Рига, 1984. - С. 115.

7. Shatz V.D., Grigoryeva V.D., Brivkalne L. A. HPLC of peptides on ODS-silica and unmodified silica. // Advances in Liquid Chromatography. Abstracts of Presentations of the 4th Annual American - Eastern European Symposium on Liquid Chromatography. / Szeged, Hungary, 1984. - P.77-78.

8. Шатц В. Д. , Григорьева В. Д. , Бривкалне Л. А. ВЭЖХ пептидов и некоторых модельных веществ в водно-органических элюентах. // 111 Всесоюзный симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии. Тезисы докладов. / Рига, 1984.

С. 60.

9. Григорьева В. Д. , Бривкалне Л. А. , Шатц В. Д. Высокоэффективная жидкостная хроматография пептидных биорегуляторов, их фрагментов и производных. II. Сорбция пептидов из водно-органических элюентов октадецилсиликагелем и немодифицир'ованным силикагелем. // Биоорган, химия. - 1985.

Т. 11, N. 4. - С. 447 - 453.

10. Shatz V.D., Grigoryeva V.D., Brivkalne L.A. HPLC of peptides on octadecylsilica and unmodified silica. // Chromatography'84. / Eds. H.Kalasz and L.S.Ettre. - Budapest Akademiai Kiado, 1986. - P.499 - 511.

11. Григорьева В.Д., Шатц В.Д. Высокоэффективная жидкостная хроматография пептидных биорегуляторов, их фрагментов и производных. // Биоорган, химия. - 1989. -т. 15, N. 8. -С. 1013 -1017.

12. Григорьева В. Д. , Шатц В. Д. Высокоэффективная жидкостная хроматография пептидных биорегуляторов, их фрагментов и производных. IV. Хроматографическое поведение и очистка окситоцина. // Биоорган, химия. - 1989. -Т. 15, N. 9. -С. 1157 -1160.

13. Григорьева В. Д. , Шатц В. Д. Роль pH и ионной силы подвижной фазы в обращенно-фазной ВЭЖХ пептидов. // V Всесоюзный симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии. Тезисы докладов. / Рига, 1990.

С. 167.

Подписано в печать 8.11.90. Формат 60x84/16. Тираж 125 экз. Бесплатно. Зак. № 336. Отпечатано на Экспериментальном заводе Института органического синтеза Латвийской академии наук; 226065 Рига, ул. Крустпилс, 53