Зависимость антиоксидантной активности флавоноидов от их физико-химических характеристик в различных системах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

УТКИНА ЕЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА

ЗАВИСИМОСТЬ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ФЛАВОНОИДОВ от их ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК В РАЗЛИЧНЫХ СИСТЕМАХ

02 00 10-Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2005

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор, академик РАМН

Швец Виталий Иванович

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Шишкина Людмила Николаевна

доктор биологических наук

Новиков Кирилл Николаевич

Ведущая организация:

Институт Физической химии и Электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН

Зашита диссертации состоится 27 июня в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан .2005 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук

ff £ Лютик А.И.

Актуальность работы.1 Основной причиной возникновения и развили сердечнососудистых заболеваний, смертность от которых является наиболее высокой во всем мире, и ряда других, является нерегулируемое перскисное окисление липопротеинов низкой плотности (ЛГГНП) плазмы крови и фосфолипидов биомембран.

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) в организме происходит постоянно на низком уровне, при патологии скорость ПОЛ возрастает В норме внутри клетки защиту от активных форм кислорода (АФК) осуществляют внутриклеточные ферменты - супероксиддисмугаза и каталаза. Наряду с ними процесс ПОЛ регулируют белки, содержащие БН-группу, а также низкомолекулярные вещества. Часть из них синтезируется в организме, другая часть поступает вместе с шпцей, например, токоферол, аскорбиновая кислота, флавоноиды.

В связи с тем, что флавоноиды являются существенным компонентом системы защиты организма от воздействия АФК, исследовано значительное число индивидуальных флавоноидов, выделенных из различных источников Однако отсутствие стандартной модельной системы окисления и разнообразие методов регистрации продуктов ПОЛ, образующихся на разных стадиях процесса, не дает возможности сопоставить большое количество литературных данных и сделать прогноз об эффективности антиоксидантного (АО) действия того или иного флавоноида.

В данной работе исследовали зависимость АО активности ряда флавоноидов от их физико-химических свойств на примере систем' 1) водной эмульсии фосфолипидов сои; 2) нейтральных липидов свиного жира. В первой окисление индуцировалось ионами железа (III), во второй - нагреванием до 72°С Фосфолипиды являются одним из компонентов многих мембран; нейтральные липиды входят в состав липопротеинов плазмы крови.

АО-действие флавоноидов складывается из антиокислительной и антирадикальной активностей, последняя из которых обусловлена реакцией с пероксидными радикалами. Таким образом, АО активность флавоноидов зависит от его содержания в мембране, которое регулируется коэффициентом распределения. Кроме того, флавоноиды являются многоядерными фенолами и могут ионизироваться по одной или нескольким гидроксильным группам, что также может повлиять на их способность проникать в липидный бислой.

Вклад в антиокислительную активность флавоноидов может давать, например, хелатирование ими ионов металлов переменной валентности.

В данной работе была предпринята попытка комплексного подхода к изучению зависимости антиоксидантного действия флавоноидов различной структуры от их физико-химических характеристик В настоящее время большинство работ посвящено изучению зависимости АО-активности флавоноидов от их отдельных физико-химических

В руководстве работы принимали участие к х н, доц

3 СП.

о» щГт?;

АА

характеристик, причем, как показал обзор литературы, систематические данные об этих характеристиках отсутствуют Таким образом, возникла необходимость экспериментального определения таких физико-химических характеристик флавоноидов, как константы ионизации (рКа) их гидроксильных групп, коэффициент распределения флавоноидов между липидной и водной фазами (Кр), энергия образования феноксильного радикала, способность к комплексообразованию с ионами Ре3+

В настоящее время проводятся интенсивные исследования по поиску новых природных антиоксидантов, в том числе и флавоноидов, и изучению их способности ингибироватъ ПОЛ, поэтому возможность предварительной оценки эффективности антиоксиданга представляется весьма актуальной Данная работа посвящена оценке вклада некоторых физико-химических характеристик флавоноидов в их АО-активность и созданию на основе экспериментальных данных математической базы для прогноза АО-действия соединений класса флавоноидов.

Работа выполнена на кафедре Биотехнологии МИТХТ в рамках госбюджетной темы № 1Б-5-866 «Синтез новых фармакологически активных веществ, изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, противовирусных, антипаркинсонических средств», а также гранта Минобразования России по фундаментальным исследованиям в области естественных я точных наук «Влияние природных соединений класса флавоноидов на окислительный стресс клеток, модельных и клеточных мембран», №Е02-6.0-135.

Цель работы заключалась в исследовании антиоксидантных свойств флавоноидов различной структуры в системах окисления мультиламеллярных везикул фосфолипидов сои и нейтральных липидов свиного жира; оценке вклада в антиоксидантное действие флавоноидов таких физико-химических характеристик, как константы ионизации гидроксильных групп флавоноидов, коэффициент распределения в системе липидный бислой:вода, энергия образования феноксильного радикала, способность к комплексообразованию с ионами Ре**; получении математических зависимостей, позволяющих адекватно прогнозировать АО-действие флавоноидов в системе окисления фосфолипидов сои.

Научная новизна.

Ранее исследователями предлагались различные способы оценки АО-активности флавоноидов, основанные на одном из их физико-химических свойств. В данной работе впервые использован комплексный подход к изучению зависимости АО-активности соединений этого класса от их физико-химических свойств в системе окисления мультиламеллярных везикул фосфолипидов сои.

Впервые изучена АО-активность некоторых флавоноидов в системе окисления триглицеридов животного происхождения без индуктора окисления.

Впервые были определены физико-химические свойства флавоноидов' коэффициенты распределения в системе вода:липидный бислой при рН 5.5 и 74; константы ионизации гидроксильных групп для некоторых флавоноидов, способность к комолексообразованию с ионами Ре9* при двух значениях рН.

Проанализирована зависимость АО-активности флавоноидов от их физико-химических характеристик, предложены уравнения, описывающие зависимость АО-действия флавоноидов от их физико-химических характеристик, позволяющие проводить предварительную оценку действия флавоноидов как ингибиторов ПОЛ в системе окисления мультиламеллярных везикул фосфодипидов сои.

Практическая значимость работы.

Полученные результаты позволяют упростить процедуру качественного поиска эффективных антиоксидантов среди соединений класса флавоноидов с учетом комплексного вклада в их АО-активность нескольких физико-химических параметров

В настоящее время ведутся интенсивные исследования по созданию новых эффективных нетоксичных препаратов на основе природных антиоксидантов для лечения и профилактики сердечно-сосудистых, бронхо-легочных заболеваний, сахарного диабета. Поэтому такие результаты работы, как изменение АО-активности флавоноидов при переходе из кислых к физиологическим рН, определение значений коэффициентов распределения флавоноидов в системе липид/вода, могут быть использованы в медицине и фармакологии при разработке новых препаратов и лекарственных форм. Кроме того, было установлено промоторное действие некоторых флавоноидов при кислых рН, что также необходимо учитывать при применении этих соединений в качестве лекарственных препаратов, особенно в терапевтических целях, когда у пациентов есть динамика развития ПОЛ и в организме происходит накопление продуктов окисления.

Результаты данного исследования могут иметь прикладное значение дм пищевой промышленности, где также актуально использование природных нетоксичных антиоксидантов для предотвращения порчи жиров.

Положения, выносимые на защиту.

1. Исследование антиоксидантной активности флавоноидов в системе индуцированного окисления фосфолипядов сои и в системе окисления триглицеридов животного происхождения без индуктора окисления.

2. Изучение физико-химических свойств флавоноидов и оценка их влияния на ингибирующую способность этих соединений.

3 Результаты регрессионного анализа зависимости антиоксидинтной активности флавоноидов от их физико-химических свойств

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 4 тезисов

Апробации работы. Основные результаты исследований были представлены на

международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология пищевых веществ

Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов»

(Москва, 2000г), Ш съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001 г), Ш съезде

Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002г ), Щ Молодежной научной конференции

«Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», (Москва, 2003г.) Объем и структура работы Диссертация изложена на 101 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы, содержит 15 таблиц, 29 рисунков и 184 цитируемых литературных источников

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОББСУЖДЕНИЕ I ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Модельные системы перекисного окисления липидов.

Для изучения ПОЛ используют большое число систем, в которых субстратами окисления являются эфиры жирных кислот, ЛПНП, фосфолипиды, нейтральные липиды растительных масел, лярда и т.д. АО-активность флавоноидов в последнее время изучают в основном в системах окисления эфиров жирных кислот, ЛПНП, фосфолипидов Для изучения антиоксидантного действия флавоноидов нами были выбраны следующие модельные системы.

1.1.1. Система индуцированного окисления фосфолипидов.

Фосфолипиды окисляются благодаря наличию в молекуле ненасыщенных жирнокислотных остатков молекулярным кислородом, органическими перекисями, ионами железа, всегда присутствующими в биологических системах В данной работе изучали окисление соевого фосфатидилхолина (ФХ, «Lipoid SI00", Германия Состав жирных кислот линолевая-64 6%, линоленовая-5.46%; олеиновая-11,6%; пальмипшовая-14 45%) в виде мультиламеллярных везикул, полученных механическим диспергированием липидной пленки в буферных растворах с рН 5 5 (ацетатный буфер) и 7 4 (ТРИС-НС1 буфер); индуктором окисления была система железо (Ш)/аскорбат; время инкубирования - 60 мил В этой системе ПОЛ оценивали по накоплению продуктов, определяемых по реакции с шобарбитуровой кислотой (ТБК-чувствительные продукты).

В проводимых ранее исследованиях в основном изучали окисление фосфолипидов при физиологических рН, тогда как в очагах воспаления увеличивается содержание продуктов ПОЛ, и происходит закисление среды.

Данная система была выбрана в качестве основного объекта исследования

1.1.2.Система окисления твиглинеридов.

В другой модельной системе в качестве субстрата окисления использовали нейтральные липвды животного происхождения (свиной жир) Это гомогенная гидрофобная система, содержащая 99 7% липидов (Состав жирных кислот' линолевая-9 40%, олеиновая-43%; пальмитиновая-24%, стеариновая-12,50%) и 03% воды. Окисление индуцировали надеванием до 72°С в течение часа, далее инкубировали 7 сут при температуре 4°С; определяли накопление гидропероксидов методом йодометрии.

1.2 Флавоноиды.

В данной работе использовали природные флавоноиды (табл 1)' кверцетин, дигидрокверцетин, байкалнн и байкалеин (ООО «Реликт», Россия), кемпферол, мирицетин, гесперетии и катехин (SIGMA-ALDRICH, Германия) Эти соединения широко распространены в овощах, цветах, семенах растений, орехах, коре деревьев- байкалеин и его гликозид байкалнн - в шлемнике байкальском (Scutellaria baicalensis); кемпферол, кверцетин и мирицетин - в листьях покрытосеменных; дигидропроизводные этих флавонолов, в частности, дигидрокверцетин, - в корнях деревьев, генистеин и даидоеин выделяют из бобов сои.

Выбор данных флавоноидов был обусловлен, во-первых, тем, что исследуемые флавоноиды принадлежат к разным подклассам, для которых характерны' - наличие или отсутствие двойной связи в кольце С (рис1), - положение кольца В (позиция 2 или 3), наличие или отсутствие гидроксильной группы в 3-ем положении, - наличие или отсутствие 4-кето-группы.

Каждый подкласс изучаемых нами флавоноидов представлен несколькими соединениями, отличающимися друг от друга, во-первых, количеством и расположением гидроксильных групп, наличием гликозидного остатка или метальной группы (см. табл 1), во-вторых, различием их антиоксидантного действия- были использованы соединения, проявляющие как высокую, так и низкую ингибирующую активность

Рис. 1 Структура фяавоноида Я Н, ОН или СЮ!с В каждом подклассе выбранного ряда флавоноидов присутствует препарат с известным терапевтическим действием Особый интерес представляет изофлавон генистеин который обладает широким спектром фармакологического действия, которое, как полагают

00

основано на его АО-действии В связи с этим возникла необходимость в получении препаративных количеств этого соединения и для сравнения - его гомолога даидзеина Генистеин и даидзеин были выделены нами из продукта переработки соевых бобов

Используемые в работе флавоноиды кверцетин, дигидрокверцетин, байкалин, байкалеин, кемпферол, мирицетин, гесперетин и катехин являлись коммерческими препаратами, их чистота 95-98% была подтверждена спектрофотометрически, по температуре плавления и методом ВЭЖХ (см табл 1)

1.3. Выделение и очистка изофлавонов сои. Для получения препаративных количеств изофлавоны (ИФ) генистеин и даидзеин выделяли из соевой пищевой добавки "Nova Soy" (США) по схеме, которая включала следующие стадии' 1) экстракцию смеси ИФ-гликозидов из препарата "Nova Soy", 2) получение смеси агликонов из гликозидов кислотным гидролизом; 3) разделение смеси агликонов адсорбционной хроматографией; 4) идентификацию выделенных индивидуальных соединений В этой схеме, предложенной ранее, были модифицированы стадии 1 и 2, что позволило повысить выход смеси ИФ-гликозидов до 18% от исходного препарата (стадия 1) и выход смеси агликонов до 90% от их содержания в гликозидах (стадия 2)

1.3.1. Экстракция смеси ИФ- гликозидов

Смесь гликозидов ИФ получали последовательной экстракцией препарата "Nova Soy" кислым ацетоном (рН 3.0) и 90%-ным метанолом После выделения из экстракта кристаллизацией их идентифицировали по данным ТСХ, ЯМР-спектроскопии и УФ-спектроскопии Все полученные физико-химические характеристики совпадали с литературными данными

1.3.2. Получение агликонов.

На данной стадии выделения были оптимизированы условия гидролиза смеси ИФ-гликозидов В описанных ранее методиках изофлавоны получали из смеси ИФ-гликозидов кислотным или ферментативным гидролизом В данной работе для получения агликонов использовали несколько способов гидролитического расщепления (3-гликозидной связи в молекулах ИФ-гликозидов а) ферментативным гидролизом ИФ-гликозидов под действием гликозидаз из Aspergillus heteromorphous ЗОЮ, б) кислотным гидролизом спиртового раствора гликозидов, в) кислотным гидролизом порошкообразных гликозидов

Установили, что как ферментативный гидролиз под действием смеси гликозидаз из Aspergillus heteromorphous ЗОЮ, так и кислотный гидролиз спиртового раствора и порошка ИФ-гликозидов в 1 н НС1 в течение 2 ч при 100°С проходил не полностью При проведении кислотного гидролиза порошкообразных ИФ-гликозидов в 6 н НС1 в течение 5 ч при 100° С образовывалась в основном смесь ИФ Выход реакции составил 90% от содержания в

гликозидах Это значительно превышает выход продуктов при ферментативном гидролизе и кислотном гидролизе спиртовых растворов гликозидов

Полученная смесь ИФ идентифицировалась методом ТСХ в различных системах. 'Н-ЯМР и УФ- спектры соответствовали спектрам, описанным ранее (МигрЬуР.А, 1985) По данным 6ЭЖХ, она состояла из генистеина и даидзеина, соотношение 1 8, времена удерживания соответственно 21 и 19 мин.

1.3.3. Получение и идентификация индивидуальных изофлавонов.

Смесь агликонов была разделена адсорбционной хроматографией на силикагеле в системе эфирпетролейный эфир, 7:3 на две фракции, содержащие генистеин и даидзеин соответственно Чистоту препаратов подтверждали методами ТСХ и ВЭЖХ, структура выделенных изофлавонов была подтверждена методом 'Н-ЯМР-спектрометрии,. Спектры 'Н-ЯМР генистеина и дайдзеина содержали сигналы фенольных колец (8, м д.)' 6.4 (с, Н8); 6.79-6.83 (сс, НЗ', Н5'); 7.35-7.39 (сс, Н2', Нб'), 8 38 (с, Н2), 9.6 (с, 7-ОН), а также сигналы 8.0, характерный для Н5 дайдзеина, и 12.93, характерный для 5-ОН генистеина

Полученный генистеин имел чистоту 98%, что превышает чистоту коммерческого препарата (93 7%, по данным ВЭЖХ), чистота даидзеина соответствовала чистоте коммерческого препарата (97%, по данным ВЭЖХ)

II ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ФЛАВОНОИДОВ

11.1. Исследование антиоксидантиой активности флавоноидов в системе окисления фосфолипидов.

АО-активность флавоноидов оценивали по ингибированию накопления ТБК-чувствительных продуктов Исследования проводили относительно контроля, который содержал фосфолипиды с индукторами окисления без флавоноидов АО-активность для каждого вещества рассчитывали как % ингибирования по формуле-

% ингибирования=100% - (Сбо~Со)а" х100% (С 60 - Со)контр

где Сан и Сконтр - концентрации антиоксиданта и контроля соответственно; Со и Сы - накопление ТБК- ЧП (нмоль/мл) в начальный момент и после 60 мин инкубации соответственно

Установлено, что при рН 5.5 большинство флавоноидов оказывает выраженное антиоксидантное действие. Исключением являлись кемпферол и байкалин, которые промотировали окисление (рис. 2) Причины этого будут обсуждены ниже

При рН 7.4 все флавоноиды, включая кемпферол и байкалин, проявляли антиоксид антное действие, за исключением даидзеина, который практически не ингибировал окисление.

рН 7.4

рН55

|1!!|и11.

.20 -1 23456789 10

Рис.2 Ингибирование ПОЛ мультшюмелляриых ветикуп ФХ(!х1(Г2 М) флавомоидами (1x14* Щ рН 55-02М ацетатный буфер, рН7 4 0.03 МТРИС-НС1 буфер.

1Лайхалеин, 2-байхал1т, З-мирицетин, 4~кнерцетин, 3-кемпферол, б-дигидрокверцетин, 7-гесперетин, 8-катехим, 9-геиистеин, Ю-даидзеин

Результаты эксперимента согласуются с известными литературными данными о влиянии структуры на антиоксидантное действие флавоноидов Так, увеличение числа гидроксильных групп в молекуле, наличие ОН-группы в 3-ем положении, двойная связь в кольце С способствуют увеличению АО-активности Действительно, как показал эксперимент, при обоих рН наибольший ингибирующий эффект проявили флавон-3-олы мирицетин и кверцетин, в молекулах которых присутствуют все перечисленные структурные признаки. Кроме того, высокую ингибирующую способность проявили флавон байкалин и изофлавон генисгетг они имеют три гидроксильныс группы, двойную связь в кольце С, но у этих соединений отсутствует ОН-группа в 3-ем положении Меньшую АО-активность проявили дигидрокверцетин и гесперетин, у которых отсутствует двойная связь в кольце С и ОН-группа в 3-ем положении.у гесперетина

При рН 5 5 менее интенсивно ингибировал ПОЛ катехин, в молекуле которого такое же количество ОН-групп, как у кверцетина, однако восстановлена двойная связь в кольце С и отсутствует 4-оксо-группа Активность, сопоставимую с АО-действием дагидрокверцетина и гесперетина, проявил даидзеин, у которого только две ОН-группы и отсутствует ОН-группа в 3-ем положении, но имеется двойная связь в положении Сг - С3. Эти данные позволяют сделать вывод, что наиболее важной структурной особенностью для АО-активности флавоноцдов является наличие двойной связи в кольце С, которая позволяет всей системе из трех колец перераспределять электронную плотность.

Некоторые флавоноиды проявляли различный ингибирующий эффект при изменении рН' например, активность байкалеина и даидзеина снижалась при переходе к рН 7.4, а кемпферола, байкалина и катехина - увеличивалась

Полученные данные позволяют утверждать, что ингибирующая способность флавоноидов определяется не только их структурой, но и свойствами системы окисления

11.2 Зависимость АО-активности флавоноидов от минимальной величины энергии образования феноксильного радикала.

Одним из механизмов АО-действия флавоноидов является их способность взаимодействовать с пероксидами с образованием феноксильных радикалов (рис 3)'

Fe3* + Ase + 02 Ar(OH)r. Ar(OH)A_iO' + ЬГ JIKM^mt ROM! ЛП II»

о2*

ГМ ЛИЛ JÏÏÏM

RH ROÍ*

ïïïï !î !Г П IVIf Л lit ЛЯПТЛЛО ÏÏItlflMf Л П TT

Ar(OH)n-i О" + R02*—ROOH+ Ar(OH)„-iO*

|r02"

Ar(OH)„ + ROÍ*-ЛООН + ArO* R02(Ar(0II)n.,)0

ro2* ROjArO

ok'ii^iiiï IHH^HHÏHII miií'ü'^isii nui'iiMïtii iisi/iMHua ¡ш^имшш иик'имдт

Plie. 3 ПОЛ и его ипгнбирование феноксилшыми радикалами Ase - аскорбиновая кислота; RH-mimid;

RO2 - пероксидный радикал, Аг(ОН)я флавоноид, Ar'()H)„_i(J - ионизированная форма флавоноида; ROO И -гидропероксид яипида, АЮ', Ar(OH)„.iO' - феноксильныйрадикал;

Предварительную оценку антиоксидантной способности флавоноидов можно сделать, рассчитав минимальную величину энергии образования феноксильного радикала (ДЕ„бр) из нейтральных молекул В данной работе были рассчитаны величины ДЕобр для всех исследуемых флавоноидов и сопоставлены с их АО-активностью. Расчеты проводили полу эмпирическим методом РМЗ с помощью программы HyperChem 7.01.

Феноксильный радикал образуется в результате отрыва либо атома водорода от молекулы флавоноида, либо электрона от фенолят-иона Первоначально были рассчитаны значения Е^ феноксильных радикалов при отрыве атома водорода по формуле ДЕобр = Еобр [ФЛАВ (О*)] - Еобр [ФЛАВ (ОН)] (I)

где Eaoyl'bJlABfO')] - энергия образования феноксильного радикала, Е^/ФЛАВ (ОН)] - энергия образования исходного флавоноида

Следовательно, наименьшее значение ДЕ«^, будет характерно для флавоноидов, способных наиболее легко образовывать феноксильные радикалы

Для расчета основных состояний как в случае молекул, так и в случае радикалов была выбрана волновая функция UHF (неограниченный метод Хартри-Фока) После создания молекулы или феноксильного радикала проводили процедуру оптимизации их геометрии с

учетом факторов, которые могут повлиять на энергию образования флавоноилов и их радикалов Во-первых, это возможный поворот кольца В относительно плоскости колец А и С; во-вторых, это способность флавоноидов образовывать внутримолекулярные водородные связи После введения указанных дополнительных параметров была произведена окончательная оптимизация геометрии молекул и радикалов, соответствующей глобальным минимумам их энергии При расчете использовали метод сопряженного градиента Полака-Рибьера. Значение среднеквадратичного градиента устанавливали 0 0001 ккал/А моль

Для оптимизированных структур были рассчитаны минимальные энергии образования феяоксильных радикалов (табл. 2).

Табл. 2. Величины минимальных энергий образования феноксильного радикала (АЕ0о^ флавоноидов и наиболее вероятные положения отрыва атома водорода

Ж в табл.1 Соединение Подкласс АЕ^ шл(мш ¿ЬОН-груллы

1 Байкалеин флавон 16.5740.1 6

2 Байкалин флавон 18.92±0.1 6

3 Мирнцетин флавокол 16 84±0.1 3

4 Кверцепт флавонол 1809±0 1 3

5 Кемпферол флавонол 18.41 ±0.1 3

6 Дигидрокверцетин флаванон 20.51±0.1 4'

7 Гесперепш флаваноя 2333±0 1 3'

8 Катехин флаванол 19 90±0.1 4;

9 Генисгеин изофлавон 23.53±0 1 4'

10 Дандзеин нзофлавон 23 72±0.1 А'

Как показало сопоставление структуры и величины Е^, наиболее низкие значения характерцы для флавоноидов, в молекуле которых присутствуют а) 5-ОН - 4-кето группировка, образующая водородную связь, что облегчает отрыв атома водорода от 3-го положения; б) незамещенное вторым бензольным кольцом 3-е положение; в) наличие двойной связи по положению 2-3 Отсутствие хот* бы одной структурной особенности вызывает увеличение энергии образования феноксильного радикала

По результатам эксперимента и рассчитанным значениям ДЕовр был проведен корреляционный анализ (рис 4) зависимости АО-активности от ДЕобр феноксильных радикалов и установлено, что антиоксидантное действие снижается при увеличении значения ДЕобр При проведении анализа не учитывались данные для байкалина (2), кемпферола (5) и генистеина (9) (рН 5 5); и для генистеина (9) (рН 7 4) Видно, что при рН 7 4 наблюдается несколько лучшая корреляция (1^=0,643), чем при рН 5.5 (г2=0,599)

Тем не менее, значения коэффициентов корреляции недостаточно высоки, чтобы характеризовать АО-активность флавоноидов только по величине ДЕобр Поэтому мы рассмотрели влияние на АО-активность флавоноидов и других физико-химических свойств этих соединений.

I П

Рас. 4 Зависимости % ингибирования от ДЕобр ккал/мохь I рН5.5 0,599), II-рН 7 4 (г1=0,643)

1-байкаяеин, 2-байзсалин, З-мирицетии, 4-кверцетин, 5-кемпферол, б-дигидрокверцетин, 7-гесперетин, 8-катехин, 9-жнистеин, 10-даидзеин Прямоугольниками отмечены соединения, образующие комплексы с ионами железа(1Н), кругом отмечен генистеин, не учитывавшиеся при построении корреляции.

АО-действие флавоноида зависит от его концентрации в гидрофобной области мембраны (см рис 3), которая, в свою очередь, определяется его гидрофобностью, рН среды и константой ионизации Наряду с этим важна степень погружения флавоноидов в липидпый бислой и способность к комплексообразованию с ионами металлов переменной валентности В связи с тем, что в литературе имеются лишь отдельные данные по перечисленным свойствам флавоноидов, далее провели исследование этих свойств и оценили их вклад в АО-активность флавоноидов.

III ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЛАВОНОИДОВ

1П.1 .Изучение способности флавоноидов к ионизация при изменени рН.

Значения констант ионизации (рКа) определяли методом тигриметрии в диапазоне рН от 2 0 до 13 5 Титрование контролировали рН-метрически; параллельно регистрировали спектры соединений в диапазоне длин волн 200-500 нм В таблице 3 представлены полученные экспериментально величины рКа гидроксилышх групп исследуемых флавоноидов (для первых двух значений) Значения рКа относили к определенным гидроксильным группам на основании литературных данных

Из представленных данных видно, что при рН 74 все флавоноиды находятся в ионизированной форме, тк происходит депротонирование одного или двух гидроксилов При рН 5 5 все соединения, кроме байкалипа и кемпферола, находятся в нейтральной форме По-видимому, именно это обстоятельство являлось причиной их промотирующего действия при рН 5 5 (см рис 2, стр 10) По-видимому, частичная ионизация байкалина и кемпферола ведет к увеличению их концентрации в водной фазе В свою очередь, это может привести к

Таблица 3 Константы ионизации флавоноидов

Вещество Положение ОН- группы в молекуле рКа ОН-группы Наличие депротониро ванных ОН-групп

Эксперим данные Лнт данные Расчета, данные* рН 5 5 рН 7 4

Байкалеин 7 6 7.5±0.1 124±0.1 - 808±04 14 50Ю4 0 1

Байкалин 6 5 5.510.1 10 5±0 1 - 1103104 6.4910 4 1 1

Мирицетан 7 3' 7 8±0 1 8.0Ю.1 8.12±06 8 97±0 1 0 1

Кверцеган 7 4' 6 8±01 7 9±0 6 74 9.02 8 13±0 6 126110 2 0 2

Кемпферол 7 4/ 5.8±01 6 6+01 82 8.1610,6 1000+01 1 2

Дигидрокверцегин 7 4' 6 2±0 1 7.6±01 ■ 8 39Ю6 12.22Ю2 0 2

Гесперетин 7 7.6±0 1 105±0.1 ■ 84010 6 9 60Ю.1 0 1

Катехин V 7 7.5±0 1 8 4±0 1 8 79 944 95010 1 96310 6 0 1

Генистеин 7 4' 7.1±0.1 9 8±0 1 72 10 0 8 26104 976Ю 1 0 1

Даидзеин 7 4' 7 5±0 1 10 5±0 1 - 7 5510 4 9.76±0 1 0 1

* - расчет сделан с помощью программы АСО-Ыи

взаимодействию флавоноидов с супероксидным анион-радикалом 02*", который также находится в водной фазе, с образованием пергидроксильного радикала Н02*'

АЮН + 02' -»■ Н02' +АЮ* Накопление Н02" ведет к более глубокому окислению липидов мембран и то, промотирующему действию этих соединений Р Следующим шагом бьшо определение взаимосвязи степени ионизации флавоноидов с

их АО-активностью. Для этого провели анализ количественной связи между структурой ' флавоноидов и их АО-активностью (ОБА!*), в качестве параметров использовали Еобр

феноксильных радикалов и значения рКа! и рКаг:

АО-акгивность= а* Еобр+ Р* рКа)+ с (П а) АО-активносгь= ц* Еобр+ 7* рКаг + с (П б) 15

Поскольку для всех исследуемых флавоноидов при рН 74 область их первой константы ионизации рКЭ) (кроме байкалина и кемпферола, для которых эти значения ниже), возникла необходимость рассчитать значения ДЕобр феноксильных радикалов с учетом образования их не из нейтральных молекул, а из фенолят-иона, образующегося по схеме

АгСОЩыО' -Аг(ОН)мО- (ПТ)

Энергии образования феноксильных радикалов при рН 7 4 были рассчитаны по формуле.

ДЕобр = Едбр [ФЛАВ (ОН)„.,ОТ - Еобр [ФЛАВ(0Н)„.,(0-)] (IV)

где Еое, [ФЛАВ (ОНХиО'] - энергия образования феноксильного радикала, Е0бДФЛАВ(0Н)„_1(0')] -энергия образования исходного аниона флавоноида

Оптимизация геометрии ионов и феноксильных радикалов проводилась так же, как и предыдущем случае Результаты расчета ДЕобр представлены в табл. 4.

Табл. 4. Ветчины минимальных энергий образования феноксильного радикала (АЕы>р) флавоноидов т их анионов (рН 7.4).

Л в табл.1 Соединение Подкласс ЬКлр, ккал/моль

1 Байхалеии флавон 50.68Ю.1

2 Байхалин флакон 52 63±0 1

3 Мнрицетан флавонол 54.05±0.1

4 Кверцетин флавонол 71 29±0.1

5 Кемпферол флавонол 50.00±0,1

6 Дигидрокверцегин флаванон 30.70±0 I

7 Гесаерешн флаванон 2806101

8 Катехин флавааол 27.55±0.1

9 Генистеин изофлавон 45.7310 1

10 Даддзеин изафлавон 62 7110 1

При проведении корреляционного анализа зависимости АО-активности от ДЕобр из фенолят-иона (табл 4), было определено, что коэффициент корреляции равен 1^=0,715.

Изучение взаимосвязи степени ионизации с АО-активностью флавоноидов проводили с учетом первых двух значений их рКа, так как значения последующих констант ионизации лежат за пределами исследуемого диапазона рН (данные не приводятся), а также без учета данных для генистеина, байкалина и кемпферола при рН 5.5; катехина и даидзеина при рН 7 4 Установлено, что при введении в уравнение ОБАЯ второго фактора - первой константы ионизации рКа! (уравнение II а) - наблюдается увеличение корреляции с АО-активностью исследуемых веществ (1^=0,673 при рН 5.5 и г2=0,716 при рН 7.4), а рКаг не вносит существенного вклада в их ингибирующую способность, поскольку коэффициенты

корреляции г2 (уравнение П б) практически не изменялись (1^=0,573 при рН 5 5 и 0,716 рН 7 4) Таким образом, степень ионизации (первая константа ионизации) явлется значимым параметром только при рН 5 5

Так как при ионизации молекулы существенно изменяется гидрофобность соединения, следующим этапом работы стало изучение этого свойства путем определения коэффициента распределения флавоноидов в системе липид/вода

III.2. Определение коэффициента распределения флавоноидов.

Определение коэффициента распределения флавоноидов проводили в системе липид/вода при рН 5 5 и 7.4 К мультиламеллярным везикулам из ФХ добавляли спиртовые растворы различных флавоноидов Смесь инкубировали 45 мин при 37°С и центрифугировали 30 мин при 3000 тыс об/мин Содержание флавоноидов в липидной и водной фазе определяли спектрофотометрически, снимая спектры флавоноидов в диапазоне длин волн 200-500 нм. Для определения коэффициента распределения при рН 5 5 было выбрано соотношение ФХ/ФЛАВ 10-1 и при рН 74 - 501. Коэффициент распределения Кр рассчитывали по формуле:

к„ _Çl_ = Nl/Vl = (Gl х Ai.)/(И. х [Cl] x Vw) = &xAl Р Cw Nw/Vw (S. x Aw)/Vw £» x Aw x 0.8 x [Cl]

где Ci концентрация флавоноидов в липидной фазе. M, Cw - концентрация флавоноидов в водной фазе, M, Ni и Мс - содержание веществ в липидной и водной фазах соответственно, моль: Vt и Vw - объем липидной и водной фаз соответственно, мл, [CiJ концентрация липидов, М, ц -уд молярный объем липидов, 0 8 АГ', и с. мочярные коэффициенты экстиикции соединений в тпидной и водной фазах соответственно «см'1. А' оптическое поглощение в точках максимумов

Из результатов, приведенных в табл. 5, можно сделать вывод, что все изучаемые соединения являются гидрофобными веществами, их Кр при исследуемых рН значительно больше 1.

Среди исследуемых флавоноидов выделяется байкалин, который при обоих значениях рН имеет коэффициент распределения гораздо меньше по сравнению с другими флавоноидами Это обусловлено тем, что данное соединение является гликозидом байкалеина и гидроксильные группы сахарного фрагмента придают ему меньшую гидрофобность Кроме того, байкалин и кемпферол находятся в частично ионизированной форме уже при рН 5 5, что также влияет на их коэффициент распределения и способность располагаться в липидах

Более низкиое значение коэффициента распределения, чем у генисгеина, имеет его гомолог даидзеин, хотя из сопоставления их структур следует обратное предположение' генистеин имеет на одну гидроксильную группу больше и должен бьггь менее гидрофобным

Табл. 5. Кр флавоноидов в системе липид/еода Исходные соотношения ФХ/ФЛАВ для рИ 5.5 и рИ 7 4 составляют 10'1 и 50 1 соответственно

№ Вещество Кр LogP, расчета4. Лит. данные, система октаиол :водя, рН 7.4

рН5.5 рН7.4

1 Байкалеин 66601560 450150 3.49Ю1 -

2 Байкалин 490±50 4615 2,2810 1 -

3 Мирицетин 10800±2600 41501400 2,810 1 -

4 Кверцегая 25600±2300 21001190 2,7410 1 182122

5 Кемпферол 1600±150 350130 2.69Ю.1 524136

6 Дигидрокверцегин 2300±160 140110 U210.1 56Ю6

7 Гесперепш 8500±800 4300+500 2,3010.1 -

8 Катсхин 37001350 625+48 0,45±0 1 1 210 4

9 Генисгеин 54001500 23001200 3,22Ю I -

10 Даидзеин 17601150 900190 3,6810 1 -

* - расчет сделан с помощью программы АСО-ЬаЬг

Возможно, большее значение коэффициента распределения этого соединения обусловлено влиянием водородной связи, которая образуется между водородом гидроксильной группы в 5-м положении и 4-кето группой:

Из приведенных данных (табл5) видно, что величина коэффициента распределения для большинства флавоноидов уменьшается при переходе из кислого к физиологическому рН Это обусловлено тем, что при рН 5 5 исследуемые соединения находятся в нейтральной форме (см табл 3), а при рН 7.4 имеет место частичное депротонирование одной или нескольких гидроксильных групп

Оценку взаимосвязи коэффициента распределения с АО-активностью флавоноидов (уравнение V) проводили с помощью регрессионного анализа, в качестве параметров использовали АЕобрИ коэффициент распределения Log Р:

АО-акгивность= а* Еовр+ Р* LogP+ с (V) Было установлено, что коэффициент распределения является значимым параметром при рН 5.5, так как имеет место увеличение коэффициента корреляции до значения 1^=0 894. При рН 74 коэффициент распределения, по-видимому, не влияет на АО-активность флавоноидов (1^=0,725).

3. Изучение комплексообразования флавоноидов с ионами

В настоящее время хелатирование ионов металлов переходных валентностей -индукторов окисления - флавоноидами рассматривается как один из возможных механизмов ингибирования перекисного окисления липидов В применяемой нами системе окисления

фосфолипидов в качестве индуктора окисления присутствуют ионы железа Fe . Для проверки гипотезы о хелатировании была изучена способность исследуемых флавоноидов к комплексообразованию с ионами Fe3*.

Образование комплексов регистрировали спектрофотометрически в диапазоне длин волн 200-700 нм по изменению величины поглощения (изменению коэффициента экстинкции комплексов флавоноидов с железом) и по наличию багохромного сдвига максимумов поглощения (рис.5). Исследование проводилось при эквимолярном (1:1) соотношении ФЛАВ/Fe3* для двух значений рН.

Рис. 5. Комплексообразование кверцетина при рН 7 4 1 - спектр кверцетина в отсутствие ионов железа, 2 - комплекс с ионами Ре1* Соотношение ФЛАВ/Ге" -/ I. [Сфлав]-1х1(Г4 М. [Сг,'*]-1х1(Г' М

Результаты эксперимента представлены в таблице 6 Таблица 6. Комплексообразование флавоноидов с ионами Fe?*

е

№ Соединение Величины Изменение Наличие

максимумов оптической комплекса с

поглощения, нм плотности нонами Fe"

рН 5 5 рН 7.4 рН 5.5 рН 7.4 рН 5.5 рН 7.4

1 Байкалеин +37(Х.згз) 0 есть - есть нет

2 Байкалин +20<Аэт9) 0 есть - есть нет

3 Мирице-ган +2 0 есть есть есть есть

4 Кверцетан +71(Х*7) 0 есть - есть нет

5 Кемпферол 0 +7 есть есть есть есть

6 Дигндрокверцетин +5(Х2|0) 0 есть - есть нет

7 Гесперетин 0 +37 - есть нет есть

8 Кагехин 0 0 - - нет нет

9 Генистгин 0 0 - - нет нет

10 Данюеин 0 0 - - нет нет

Из приведенных результатов видно, 410 изменения в спектрах поглощения флавоноидов при добавлении Яе3+ наблюдаются для кверцетина, дигцдрокверцетина, байкалеина и байкалина при рН 5.5, что может бьгть связано с образованием ими комплекса с

ионами Fe3+ При рН 7 4 наблюдали изменения в УФ-спектре гесперетина, кемпферола и мирицетина, спектры остальных флавоноидов оставались без изменений

Эти результаты свидетельствуют о том, что на связывание флавоноидов с ионами железа могут влиять различные факторы, например, структура соединения и/или изменение окислительно-восстановительного потенциала системы при изменении рН

Поскольку по полученным экспериментальным данным сложно сделать однозначные выводы о влиянии способности флавоноидов к комплексообразованию с ионами железа на АО-активность, был проведен эксперимент по изучению АО-активности флавоноидов в системе триглицеридов в отсутствие индукторов окисления

III.4 Изучение антиоксидантной активности флавоноидов в системе окисления триглицеридов.

Модельная жировая система подвергалась термическому автоокислению Ингибирующий эффект флавоноидов оценивали по времени накопления 4 мкмоль/г гидропероксидов (период индукции) относительно стандартного антиоксиданта ионола методом иодометрии В качестве характеристики антиоксиданого действия мы использовали относительную антиоксидантную активность s, рассчитанную по формуле

е=та.7ьт т Са Сет

где Са- концентрация исследуемого антиоксиданта, та- период индукции окисления жира в присутствии этого антиоксиданта Ссг- концентрация стандартного антиоксиданта ter- период индукции окисления жира в присутствии стандарта Дтя расчета s выбран период индукции, во время которого происходит накопление 4 мкмоль г перекисей Относительная антиоксидантная активность стандарта ионола была принята за I

Результаты эксперимента представлены в таблице 7

Таблица 7. Относительная антиоксидантная активность флавоноидов в модельной системе триглицеридов животного происхождения

Вещество Концентрация Период инд-кции Отн. а/оксид актив-сть

ФЛАВ, моль т,сутки

Ионол lxlO"4 1,45 1

Байкалеин lxlO"4 2,2 1,51

Байкалин 1x10"* 1,05 0,72

Кверцетин lxlO"1 0,85 0,58

Дигидрокверцетин 1x10"* 0,61 0,42

Генисгеин lxlO'J 5,4 0,34

Даидзеин 1x10° 4,2 0,26

>

Как видно из представленных данных, в гидрофобной системе наиболее активными являлись байкалеин, его гликозид байкалин и кверцетин, проявляя антиоксидангаое действие в концентрации 1x10"4 М Эти же соединения проявляли высокую активность и в системе окисления фосфолипидов при рН 7 4. Генистеин и даидзеии обладали АО-активностью в системе триглицеридов только в концентрации 1x10'3 М и имели наименьшую величину относительной антиоксидантной активности. В системе окисления мультиламеллярных везикул при рН 7 4 все флавоноиды, за исключением даидзеина, проявляли ингибирующий эффект Это еще раз подтверждает, что на ингибирующие свойства флавоноидов существенно влияют условия окисления.

Из приведенных данных видно, что и в отсутствие ионов железа флавоноиды эффективно ингибируют ПОЛ; по-видимому, комплексообразование с ионами железа не вносит значительного вклада в АО-активность флавоноидов Так, кверцетин, байкалеин, байкалин, генистеин и катехин не образовывали комплексов с железом при рН 7 4 (см табл 6), однако имели высокую ингибирующую способность в системе окисления ФХ Кверцетин, байкалеин и байкалин хорошо ингибировали ПОЛ в системе окисления триглицеридов, где отсутствуют индукторы окисления

Таким образом, комплексообразование не рассматривалось в дальнейшем в качестве свойства, влияющего на АО-активность флавоноидов

IV. ЗАВИСИМОСТЬ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ФЛАВОНОИДОВ ОТ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК

При рассмотрении взаимосвязи структуры и свойств флавоноидов на их АО-активность нами было отмечено, что даидзеин - единственное соединение, не образующее внутримолекулярных водородных связей - имеет наименьшую активность при рН 7.4. Таким образом, возникло предположение о влиянии внутримолекулярных водородных связей флавоноидов на их активность Тот факт, что подобное влияние имеет место, подтверждает и снижение АО-активности байкалеина при рН 74, у которого ионизация гидроксильной группы по 7-му положению может разрушать систему внутримолекулярных водородных связей, изменяя гидрофобность соединения Результаты регрессионного анализа зависимости АО-активности флавоноидов от их физико-химических характеристик представлены в таблице 8, в качестве параметров уравнения (VI) использовали значения АЕобр феноксильных радикалов, констант ионизация pKai и рКаг, коэффициента распределения LogP и наличие или отсутствие внутримолекулярной водородной связи в молекулах флавоноидов Нсв.

АО-активность=а*ДЕобр + /7*А + с (VI), 21

где А-значения рКаь рКа2, Ьо£Р, Нсв

Из полученных результатов можно сделать вывод, что наиболее значимыми факторами при рН 5 5 являются энергия образования феноксильного радикала и коэффициент распределения, а при рН 7 4 - величина Еобр, и наличие внутримолекулярной водородной связи (Нсв)

Табл. Я Коэффициенты корреляции исследуемых свойств флавоноидов с их АО-активностью

Параметры уравнения QSAR г2, рИ5.5 г", рН7.4

Еобр,*'" 0,599* 0,715 "

Е^р.рКа! 0,673 0,716

Еобр,, рКа2 0,573 0,714

Erfp,,LogP 0,894 0,725

Е„бр, наличие Н™, 0,581 0,940

* ■ использовались значения Е^ го нейтральных молекул флавоноидов (формула I) м - - использовались значения Е*^ из фенолят-ионов флавоноидов (формула III)

Исходя из этих данных, были получены уравнения QSAR, характеризующие взаимосвязь физико-химических параметров флавоноидов и их АО-активности. После нормирования параметров уравнения имеют вид.

1) Для исследуемого набора флавоноидов при рН 5.5

АО-активность=24,17*LogP -2,26* Е^ + 30,79 (VII) п=7, ¿=0,894, F=17, F-габл =14, s=0,49

2). Для исследуемого набора флавоноидов при рН 7.4:

А 0-активность=85,52*Нсв-0,04 *Еобр + 9,10 (VIII) п=8, i^^l, F=40, Ргабл =10, s=0,14

Для проверки адекватности полученных уравнений использовали АО-активность контрольных соединений' изофлавона генистеина для рН 5 5 (% ингибирования при рН 5 5 -90, см рис 2; Log Рлиши/«ма-3,73; АЕ^ из нейтральной молекулы - 23.53 кхал/моль) и флавон-3-ола робинетина для рН 7 4 (% ингибирования при рН 74 - 97.5 [Мота А., 1990]; ДЕобр из фенолят-иона-47.34 ккал/моль).

Как видно из представленных данных (рис. 6), полученные уравнения (VII, VTO) позволяют для большинства флавоноидов давать адекватную предварительную оценку их АО-активности в системе индуцированного окисления фосфолипидов при обоих значениях рН, используя лишь расчетные значения их физико-химических характеристик без экспериментальных исследований, ошибки между экспериментальными и прогнозируемыми

22

значениями АО-активности флавоноидов составили 25,5% для генистеина (рН 5 5) и 4,9% для робинетина (рН 7.4).

120

С ж 100

4 80

§ во

X 40

X X 20

* 0

-20

-40

рН 5 5

|пРМ2]

J -

I 1 1 <

. 1 I 1 С 1

1 ¡1

1 1 11||

♦ 1

рН 74

120

¡♦РЙ1

&

X

1

I, л И И Г 1

[ И !2! 11 1

>

-- •

1 1

0123456789 1011 12

Рис. 6. Экспериментальная (ряд 1) и рассчитанная по уравнениям (УЯАЯ (ряд 2) АО-активность исследуемого ряда флавоноидов в системе индуцированного окисления фосфолипидов

рН 55. 1-байкалеин, 2-байкалин, 3-мирицетил, 4-квгрцетин, 5-кемпферол, 6-дигидрокверцетин, 7-гесперетип, 8-катехин, 9-даидзеин, Ю-генистеип

рН 7 4. 1-байкалеин, 2-байкалин, З-мирицетин, 4-кверцетин, 5-кемпферол, 6-дигидрокверцетин, 7-гесперетин, 8-катехин, 9-генистеин, 10-даидзеин, 11-робинетин

ВЫВОДЫ

1. По разработанной методике из продуктов переработки сои выделены в препаративном количестве изофлавоны генистеин и даидзеин; их чистота доказана методом ВЭЖХ, а структура - методом Н'-ЯМР спектроскопии.

2. Сопоставлена АО-активность выделенных изофлавонов с флавонами других классов в различных системах: а) системе мультиламеллярных везикул фосфолипидов сои с индуктором окисления железо (Ш)-аскорбат при значениях рН 5 5 и 74, б) системе триглицеридов, не содержащей индукторов окисления Установлено, что в системе а) генистеин является таким же высокоэффективным ингибитороми ПОЛ при обоих рН, как и известные антиоксиданты кверцетин и мирицетин. Байкалин и кемпферол при рН 5.5 промотируют окисление.

3. Рассчитана энергия образования феноксильных радикалов исследуемых флавоноидов с использованием полуэмпирического метода РМЗ. Показано, что в ряду флавоноидов наименьшей энергией образования феноксильного радикала из нейтральной молекулы обладает байкалеин, из фенолят-иона - катехин

4. Изучены такие физико-химические свойства флавоноидов, как способность ионизироваться по гидроксильным группам, гидрофобностъ, способность к комплексообразованию с ионами железа (Ш) и впервые определены такие параметры как

значения констант ионизации гидроксильных групп для некоторых флавоноидов (дшидрокверцепш, байкалеин, байкалин, гесперетин, мирицетин, даидзеин), коэффициент распределения в системе липидный бислой:вода при рН 5.5 и 7.4; впервые определена способность к комплексообразованию с ионами железа (ПГ) при обоих рН.

5. Показано, что при рН 5.5 байкалин и кемпферол имеют одну депрогтонированную ОН-группу, в то время как все остальные изученные соединения находятся в неионизированной форме, при рН 7.4 все соединения частично ионизированы Найдено, что величины коэффициентов распределения флавоноидов в системе лшшд/вода при обоих рН превышают 1, причем наименьшее значение Кр имеет байкалин Определено, что при рН 5 5 наиболее способен к комплексообразованию флавон-3-ол кверцетин, а при рН 7.4 - флаванон гесперетин.

6. Проведен регрессионный анализ зависимости АО-активности флавоноидов в системе окисления фосфолипидов от их физико-химических свойств. Установлено, что наиболее значимыми параметрами при рН 5 5 являются минимальная энергия образования феноксильного радикала и коэффициент распределения флавоноидов (г2 =0.82), а при рН 7.4 -минимальная энергия образования феноксильного радикала и наличие внутримолекулярной водородной связи в молекулах исследуемых соединений (г2 =0 940).

7 По результатам эксперимента методом QSAR были получены уравнения, адекватно описывающие зависимость АО-активности большинства флавоноидов в системе окисления фосфолипидов от их физико-химических характеристик Полученные уравнения могут быть использованы для предварительной оценки АО-действия соединений этого класса без проведения экспериментальных исследований.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ

1. Уткина Е.А., Автошина C.B., Сорокоумова Г.М., Селшцева А.А, Калашникова Т Ю., Котелевцев C.B., Швец В.И. Изучение биологической активности изофлавонов сои на примере антимутагенного и антиоксидантного действия. //Труды Биотехнологического центра МГУ «Биотехнология в охране и реабилитации окружающей среды». - 2003.- № 2. -С. 222-227.

2. Уткина Е А., Автошина С.В ,. Селшцева А.А, Сорокоумова Г.М, Рогожкина Е А, Швец В И. Влияние на перекисное окисление фосфолипидов генистеина и дайдзеина, полученных кислотным гидролизом их гликозидов//Биоорганическая химия -2004. - Т. 30, №4 -С. 429-435.

3 Антошина C.B., Селищева А.А., Сорокоумова Г.М, Уткина Е.А, Дегтярев П.С., Швец В И Влияние флавоноидов различной структуры на перекисное окислете

нейтральных липидов животного происхождения//Прикладная биохимия и микробиология -2005 - №1. - С 26-31

4 Уткина Е А, Сорокоумова Г М, Селгацева А А Изофлавоны соевых бобов выделение и свойства //Тезисы международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология пищевых веществ Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов». - 2000 -Москва, Россия -С 92-93

5 Уткина Е.А, Ладин Е Г, Сорокоумова Г М, Селищева А А Флуоресценция изофлавонов сои на примере генистеина и давдзеина// Тезисы Ш съезда фотобиологов России - 2001 - Воронеж, Россия. - С. 222-223.

6 Уткина Е А , Антошина С В, Сорокоумова Г М, Селищева А.А , Швец В И Антиоксидантные свойства изофлавонов сои // Тезисы ТП съезда Биохимического общества. -2002 - Санкт-Петербург, Россия - С 360-361

7. Уткина Е А., Антошина С В, «Влияние изофлавонов сои на перекисное окисление фосфолипидов» //Тезисы Ш Молодежной научной конференции Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии -2003 - Москва, Россия -С 32-33

?

«

313 7 6*

РНБ Русский фонд

2006-4 8747

Подписано в печать^£й£(2рормат 60*84/16. Бумага писчая.

Отпечатано на ризографе Уч изд листов_.Тираж 100 экз. Заказ № 97"

Лицензия на издательскую деятельность ИД № 03507 от 15.12 2000

?

Московская государственная академия тонкой химической технологии им М В Ломоносова

Издательско-полиграфический центр 119571 Москва, пр Вернадского, 86

Список сокращений.

Введение.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Перекисное окисление липидов.

1.1.1 Общие аспекты процесса окисления. Патологии, сопровождающиеся радикальными процессами.

1.1.2 Процесс перекисного окисления липидов.

1.1.3 Системы, используемые для изучения перекисного окисления липидов.

1.1.3.1 Фосфолипидные системы.

1.1.3.2 Липидные системы, содержащие липопротеины низкой плотности.

1.1.3.3.Липидные системы без индукторов окисления на основе триглицеридов животного происхождения.

1.2. Антиоксидантный статус организма и антиоксиданты.

1.2.1 Ферментативные антиоксиданты.

1.2.2 Неферментативные антиоксиданты.

1.2.2.1 Соединения, содержащие ОН- группу.

1.2.2.2 Соединения, содержащие SH- группу.

1.2.2.3 Соединения других классов.

1.3 Флавоноиды.

1.3.1 Распространение в природе.

1.3.2 Структура и классификация флавоноидов.

1.3.3 Основные методы получения и идентификации флавоноидов.

1.4 Физико-химические свойства флавоноидов.

1.4.1 Ионизация и гидрофобность флавоноидов.

1.4.2 Способность флавоноидов к комплексообразованию с ионами металлов переходных валентностей.

1.4.3 Электронодонорные и водорододонорные свойства флавоноидов.

1.4.4 Внутримолекулярная водородная связь.

1.5 Флавоноиды как ингибиторы перекисного окисления липидов.

1.5.1 Кинетика ингибирования антиоксидантами перекисного окисления липидов.

1.5.2 Антирадикальное действие флавоноидов.

1.5.3 Антиоксидантное действие флавоноидов.

1.5.4 Прооксидантное действие флавоноидов.

1.5.5 Механизмы антиоксидантного действия флавоноидов.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1 Характеристика объектов исследования.

2.1.1 Модельные системы перекисного окисления липидов.

2.1.1.1Система индуцированного окисления фосфолипидов.

2.1.1.2.Система окисления триглицеридов.

2.1.2 Флавоноиды.

2.1.3. Выделение и очистка изофлавонов сои.

2.1.3.1.Экстракция смеси ИФ- гликозидов.

2.1.3.2. Получение агликонов.

2.1.3.3. Получение и идентификация индивидуальных изофлавонов.

2.2 Изучение антиоксидантной активности флавоноидов.

2.2.1. Исследование антиоксидантной активности флавоноидов в системе окисления фосфолипидов.

2.2.2 Зависимость АО-активности флавоноидов от минимальной величины энергии образования феноксильного радикала.

2.3 Определение физико-химических свойств флавоноидов.

2.3.1.Изучение способности флавоноидов к ионизации при изменени рН.

2.3.2. Определение коэффициента распределения флавоноидов.

2.3.3. Изучение комплексообразования флавоноидов с ионами Fe3+.

2.3.4. Изучение антиоксидантной активности флавоноидов в системе окисления триглицеридов.

2.4 Зависимость антиоксидантной активности флавоноидов от их физикохимических характеристик.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Материалы и оборудование.

3.2 Характеристика объектов исследования.

3.2.1 Подбор системы индуцированного окисления фосфолипидов.

3.2.2 Характеристика системы окисления триглицеридов животного происхождения.

3.2.3 Выделение и очистка изофлавонов сои.

3.3. Изучение антиоксидантной активности флавоноидов.

3.3.1 Изучение АО-действия флавоноидов в системе индуцированного окисления фосфолипидов.

3.3.2 Изучение АО-действия флавоноидов в системе триглицеридов животного происхождения без индукторов окисления.

3.4 Определение констант ионизации флавоноидов.

3.5. Определение коэффициента распределения (Кр) флавоноидов в системе липид/вода.

3.6 Изучение комплексообразования флавоноидов с ионами Fe3+.

3.7. Проведение регрессионного анализа (метод QSAR).

ВЫВОДЫ.

Благодарности.

Основной причиной возникновения и развития сердечно-сосудистых заболеваний, смертность от которых является наиболее высокой во всем мире, и ряда других, является нерегулируемое перекисное окисление липопротеинов низкой плотности плазмы крови и фосфолипидов биомембран. В норме окислительные процессы в клетке протекают по свободнорадикальному механизму с низкой скоростью, так как существуют специальные механизмы защиты: преобразование активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления под действием антиоксидантов и ферментов. В случаях нарушений защитных функций возникает необходимость восстановления антиоксидантного статуса организма в профилактических или терапевтических целях. Одним из возможных путей решения данной проблемы может быть поиск эффективных антиоксидантов среди природных и синтетических веществ.

Антиоксиданты - вещества, способные в малых дозах тормозить свободнорадикальное окисление. Они широко применяются в медицине для профилактики различных заболеваний, в пищевой промышленности для торможения процессов окислительной порчи жиров и в других областях. Основными требованиями к антиоксидантам являются их действие в низких концентрациях; они должны быть нетоксичными и дешевыми. В настоящее время в качестве антиоксидантов рассматриваются соединения, содержащие подвижный атом водорода с ослабленной связью с углеродом и способные образовывать радикал, обрывающий цепь окисления.

К этому типу веществ относят природные соединения - флавоноиды, которые способны ингибировать перекисное окисление липидов (ПОЛ), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и ДНК. За последние десятилетия проанализирована антиоксидантная активность большого числа как синтетических, так и природных флавоноидов в различных модельных системах, в том числе окисление ЛПНП в присутствии Си . Большое число такого рода исследований связано с тем, что терапевтический эффект ряда препаратов обусловлен их антиоксидантными свойствами.

В данной работе исследовали зависимость антиоксидантной активности ряда флавоноидов от их физико-химических свойств на примере систем, моделирующих биологические мембраны и представляющих собой мультиламеллярные везикулы фосфолипидов.

Необходимость экспериментального изучения таких физико-химических свойств флавоноидов, как способность к ионизации их гидроксильных групп, гидрофобность, энергия образования феноксильного радикала, способность к комплексообразованию с ионами Fe3+, была обусловлена, во-первых, отсутствием систематических данных об этих параметрах. Во-вторых, как показал обзор литературы, большинство работ посвящено изучению влияния лишь отдельных физико-химических свойств флавоноидов на их антиоксидантную активность. В нашей работе мы предприняли попытку комплексного исследования влияния нескольких физико-химических характеристик на способность ингибировать ПОЛ флавоноидами различной структуры.

В настоящее время проводятся интенсивные исследования по поиску и изучению антиоксидантной активности новых природных антиоксидантов, поэтому возможность предварительной оценки их эффективности с учетом выбранной модельной системы и влияния различных физико-химических факторов представляется весьма актуальной.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. По разработанной методике из продуктов переработки сои выделены в препаративном количестве изофлавоны генистеин и даидзеин; их чистота доказана методом ВЭЖХ, а структура - методом Н'-ЯМР спектроскопии.

2. Сопоставлена АО-активность выделенных изофлавонов с флавонами других классов в различных системах: а) системе мультиламеллярных везикул фосфолипидов сои с индуктором окисления железо (Ш)-аскорбат при значениях рН 5.5 и 7.4; б) системе триглицеридов, не содержащей индукторов окисления. Установлено, что в системе а) генистеин является таким же высокоэффективным ингибитороми ПОЛ при обоих рН, как и известные антиоксиданты кверцетин и мирицетин. Байкалин и кемпферол при рН 5.5 промотируют окисление.

3. Рассчитана энергия образования феноксильных радикалов исследуемых флавоноидов с использованием полуэмпирического метода РМЗ. Показано, что в ряду флавоноидов наименьшей энергией образования феноксильного радикала из нейтральной молекулы обладает байкалеин, из фенолят-иона - катехин.

4. Изучены такие физико-химические свойства флавоноидов, как способность ионизироваться по гидроксильным группам, гидрофобность, способность к комплексообразованию с ионами железа (III) и впервые определены такие параметры как значения констант ионизации гидроксильных групп для некоторых флавоноидов (дигидрокверцетин, байкалеин, байкалин, гесперетин, мирицетин, даидзеин); коэффициент распределения в системе липидный бислой:вода при рН 5.5 и 7.4; впервые определена способность к комплексообразованию с ионами железа (III) при обоих рН.

5. Показано, что при рН 5.5 байкалин и кемпферол имеют одну депротонированную ОН-группу, в то время как все остальные изученные соединения находятся в неионизированной форме; при рН 7.4 все соединения частично ионизированы.

Найдено, что величины коэффициентов распределения флавоноидов в системе липид/вода при обоих рН превышают 1, причем наименьшее значение Кр имеет байкалин.

Определено, что при рН 5.5 наиболее способен к комплексообразованию флавон-3-ол кверцетин, а при рН 7.4 - флаванон гесперетин.

6. Проведен регрессионный анализ зависимости АО-активности флавоноидов в системе окисления фосфолипидов от их физико-химических свойств. Установлено, что наиболее значимыми параметрами при рН 5.5 являются минимальная энергия образования феноксильного радикала и коэффициент распределения флавоноидов (г2 =0.82), а при рН

7.4 - минимальная энергия образования феноксильного радикала и наличие внутримолекулярной водородной связи в молекулах исследуемых соединений (г2 =0.940).

7. По результатам эксперимента методом QSAR были получены уравнения, адекватно описывающие зависимость АО-активности большинства флавоноидов в системе окисления фосфолипидов от их физико-химических характеристик. Полученные уравнения могут быть использованы для предварительной оценки АО-действия соединений этого класса без проведения экспериментальных исследований.

Благодарности

Фирме ADM (США) за любезно предоставленную для исследований пищевую добавку "Nova Soy"; ст. н. с. каф. хим. энзимологии МГУ им. М.В.Ломоносова Синицыну А.П. за любезно предоставленный препарат гликозидаз.

За существенную помощь при проведении работы и оформлении результатов сотрудникам, асприантам и студентам кафедры Биотехнологии: к.х.н., доц. Сорокоумовой Г.М и к.б.н., ст. н. с. Селищевой А.А. за участие в руководстве работы, консультации при подготовке и проведении исследований, а также за ценные замечания во время обсуждения полученных результатов. к.х.н. Рогожкиной Е.А., аспирантам Красильниковой В.В., Безрукову Д.А., Буреевой С.В., студентам Антошиной С.В., Вострикову В.В.

Заключение.

Фенолы - соединения, о свойствах и механизмах действия которых к настоящему времени накоплено значительное количество эксперимнтальных и теоретических данных. Однако интенсивное изучение флавоноидов, принадлежащих к группе фенолов, началось сравнительно недавно, после накопления и анализа сведений о широком спектре их биологической активности. Так, в последние десятилетия интенсивно изучается антиканцерогенная активность флавоноидов; установлено, что изофлавон генистеин проявляет высокую способность ингибировать рост злокачественных новообразований. В настоящее время это соединение является стандартным ингибитором тирозиновых протеинкиназ.

Наряду с этим, одним из приоритетных направлений исследований в мире является изучение антиоксидантной активности флавоноидов, в частности, ингибирования ПОЛ. Несмотря на значительное число работ в этой области, как показал обзор литературы, до сих пор не установлен точный механизм их антиоксидантной активности, ограничены сведения о некоторых их физико-химических свойствах. Как уже упоминалось, большинство исследований проводится в системе окисления ЛПНП, в то время как фосфолипиды биологических мембран также являются одними из наиболее вероятных мишеней для АФК, способных интенсивно подвергаться окислению при нарушении регуляции окислительных процессов в организме.

Таким образом, целью данной работы явилось исследование и сравнение антиоксидантных свойств ряда соединений, принадлежащих к различным подклассам класса флавоноидов в системе мультиламеллярных везикул фосфолипидов сои, моделирующих биологические мембраны; исследование влияния и оценка вклада отдельных факторов в антиоксидантное действие флавоноидов (степень ионизации, гидрофобность, энергия образования феноксильного радикала, способность к комплексообразованию с ионами Fe3+) в данной системе; получение зависимости антиоксидантной активности флавоноидов от физико-химических факторов для предварительной оценки их ингибирующей способности.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1 Характеристика объектов исследования

2.1.1 Модельные системы перекисного окисления липидов.

Для изучения ПОЛ используют большое число систем, в которых субстратами окисления являются эфиры жирных кислот, ЛПНП, фосфолипиды, нейтральные липиды растительных масел, лярда и т.д. АО-активность флавоноидов в последнее время изучают в основном в системах окисления эфиров жирных кислот, ЛПНП, фосфолипидов. Для изучения антиоксидантного действия флавоноидов нами были выбраны следующие модельные системы: система индуцированного окисления фосфолипидов; система окисления триглицеридов (система без индуктора окисления).

2.1.1.1 Система индуцированного окисления фосфолипидов.

Фосфолипиды окисляются благодаря наличию в молекуле ненасыщенных жирнокислотных остатков молекулярным кислородом, органическими перекисями, ионами железа, всегда присутствующими в биологических системах.

В данной работе окисление мультиламеллярных везикул соевого фосфатидилхолина («Lipoid SI00", Германия. Состав жирных кислот: линолевая-64.6%, линоленовая-5.46%; олеиновая-11,6%; пальмитиновая-14.45%), полученных механическим диспергированием липидной пленки в буферных растворах с рН 5.5 (ацетатный буфер) и 7.4 (ТРИС-НС1 буфер), индуцировали системой железо (Ш)-аскорбат [15]. Выбор значения рН более кислого, чем рН 7.4, был обусловлен тем, что в проводимых ранее исследованиях в основном изучали окисление фосфолипидов при физиологических рН, тогда как в очагах воспаления увеличивается содержание продуктов ПОЛ, и происходит закисление среды.

Поскольку это сложная система, скорость окисления которой зависит от многих факторов, первоначально мы провели исследования по подбору условий эксперимента.

Из литературных данных известно, что флавоноиды ингибируют ПОЛ в концентрациях Ю'Мо^М [145]. Согласно требованиям, предъявляемым к истинным антиоксидантам [62], концентрация окисляемого субстрата должна минимум на порядок превышать концентрацию антиоксиданта. Поэтому концентрация фосфолипидов не могла быть меньше Г10"2 М.

Нами было исследовано 4 системы окисления, которые различались концентрациями соевого фосфатидилхолина (сФХ) и индукторов окисления (аскорбиновой кислоты и ионов Fe ). Липидную пленку растворяли в дистиллированной воде (рН 5.9), окисление проводили посредством инкубации при 37°С и постоянном перемешивании в течение 60 мин. ПОЛ оценивали по накоплению продуктов, определяемых по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-чувствительные продукты). Из представленных в таблице 5 результатов видно, что при концентрации аскорбиновой кислоты 1 мМ и выше (системы №1-3) окисления не происходит, что, как считают [165, 166], связано с антиоксидантным действием аскорбиновой кислоты в таких концентрациях. После уменьшения содержания липидов (1.25х10"2М, 1 Омг/мл) и концентраций индукторов окисления накопление ТБК- чувствительных продуктов составило 30 нмоль/мл (система №4). Данная система была выбрана в качестве основного объекта исследования.

1. Иванов К.П Основы энергетики организма: Теоретические и практические аспекты. Том 2. Биологическое окисление и его обеспечение кислородом. СПб.: Наука. -1993.-272 с.

2. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. и др. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1991. - Т.29. - С. 1-249.

3. Aviram М. Low density lipoprotein modification by cholesterol accumulation in cells // J. Biol. Chem. 1989. -Vol. 267. - P. 218-225.

4. Esterbauer H., Wag G., Puhl H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis // Brit/ Med. Bull. 1993. -Vol. 49. - P. 566-567.

5. Rosen P., Zink S., Tschope D. Vascular damage due to oxidative stress: A pathogenetic concept for diabetic macro- and microangiopathy? // Structural and Functional Adnormalities in Subclinical Diabetic Angiopathy. Basel: Karger, 1992. - P. 23- 31.

6. Меньшикова Е.Б., Зенков H.K. Метаболическая активность гранулоцитов при хронических неспецифических заболеваниях легких //Терапевт, арх. 1991.- №11. - С. 8587.

7. Воскресенский О.Н., Бобырев В.Н. Биоантиоксиданты облигатные факторы питания // Вопр. мед. химии. - 1992. - № 4. - С. 21-26.

8. Журавлёв А.И., Пантюшенко В.Т Свободнорадикальная биология. М: Московская ветеринарная академия, 1989. - 60 с.

9. Netto L.E.S., Augusto О. Iron III binding in DNA solutions: complex formation and catalytic activity in the oxidation of hydrazine derivatives // Chem. Biol. Interact. 1991. - Vol. 79. -P. 1-14.

10. Samokyszyn V.M., Thomas C.E., Reif D.W. et al. Release of iron from ferritin and its role on oxygen radicals toxicities // Drug Metab. Rev. 1988. - Vol. 19. - P. 283-303.

11. Shi X.L., Mao Y., Knapton A.D. et al. Reaction of Cr(VI) with ascorbate and hydrogen peroxide generates hydroxyl radicals and causes DNA damage: role of a Cr(IV)-raediated Fenton-like reaction// Carcinogenesis. 1994. - Vol. 15. - P. 2475-2478.

12. Осипов A.H., Азизова О.А., Владимиров Ю.А. Активированные формы кислорода: роль в организме//Успехи биол. химии. 1990. - Т. 31. - С. 180-208.

13. Журавлёв А.И. Спонтанная биохемилюминесценция животных тканей // Биохемшпо-минесценпия. М.: Наука, 1983. - С. 3-30.

14. Bast A., Haenen G.R.M.M, Doelman С. J. A. Oxidants and antioxidants: State of the art //Amer. J. Med. -1991. Vol. 91, Suppl.3C. P. 2S-13S.

15. Пивоваренко В.Г., Туганова A.B., Осинская Л.Ф., Холодова Ю.Д. // Хим.-фарм. журнал. 1997. - В. 3. - С. 14 -18.

16. Arora A., Nair MG., Strasburg GM. Antioxidand activities of isoflavones and Their biological metabolites in a liposomal system // Arch. Biochem biophys. 1998. - Aug 15. Vol. 356(2).-P. 133-141.

17. Feng N. Ко, Chen С. C. Chun N. L., Chia С. C., Che-M. T Isoorientin-6"-0-glucoside, a water-soluble antioxidant isolated from Gentiana arisanensis // Bioch. Bioph. Acta. -1998.-Vol. 1389.-P. 81-90.

18. Toda S., Shirataki Y. Inhibitory effects of isoflavones on lipid peroxidation by reactive oxygen species //Phytother. Res. 1999. - Vol. 13(2). - P. 163-165.

19. Wei H., Cai Q., Rahn RO. Inhibition of UV light and Fenton-induced oxidative DNA damage by the soybean isoflavone genistein // Carcinogenesis. 1996. - Vol. 17(1). - P. 73-77.

20. Ward J.F., Blakely W.F., Moberly J.B. A comparison of the enzymatic repair kinetics of ionizing radiation and of hydrogen peroxide induced DNA strand breaks in V79 cells//Radiat. Res.- 1983. - Vol. 94. - P. 629-630.

21. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир. — 1991.-543с.

22. Артюхов В.Г., Наквасина М.А. Биологические мембраны. Структурная организация, функция, модификация физико-химическими агентами. // Изд-во Воронежского университета. 2000. - 243 с.

23. Суханова Г.А., Серебров В.Ю. Биохимия клетки. // Томск.: Чародей.- 2000.184 с.

24. Pinchuk I., Schnitzer Е., Lichtenberg D. Kinetic analysis of copper-induced peroxidation of LDL. // Biochimica et Biophysica Acta. 1998. - V. 1389. - P.155-172.

25. Ушкалова B.H. Кинетика и механизм окисления природных липидов. // Автореферат на соискание ученой степени кандидата химических наук. М., - 1989.

26. Эмануэль Н.М., Лясковская Ю.Н. Торможение процессов окисления жиров. М.: Пищепромиздат. -1961. С. 74.

27. Castera-Rossignol A., Bosque F. Nouvelle approche des anti-oxydants. // OCL. 1994. -Vol. 1.- N.2. -P. 131-142.

28. Wendel A. Enzymes acting against reactive oxygen // Enzymes Tools and Targets. -Basel: Karger. - 1988. - P. 161-167.

29. Sies H. Oxidative stress From basic research to clinical application // Amer. J. Med.1991. Vol. 91, Suppl. 3C. - P. S31-S38.

30. Demple В., Amabile-Cuevas C.F. Redox redux: The control of oxidative stress responses // Cell. -1991. Vol. 67. - P. 837-839.

31. Harris E.D. Regulation of antioxidant enzymes // FASEB J. 1992. - Vol. 6. - P. 26752683.

32. Storz G., Tartaglia L.A., Ames B.N. Transcription regulator of oxidative stress-inducible genes: direct activation by oxidation // Science. 1990. - Vol. 248. - P. 189-194.

33. Cutler R.G. Genetic stability and oxidative stress: Common mechanisms in aging and cancer // Free Radicals and Aging. Basel: Birkhauser Verlag, 1992. - P. 31-46.

34. Adachi Т., Ohta H., Yamada H. et al. Quantitative analysis of exlracellular-superoxide dismutase in serum and urine by ELISA with monoclonal antibody // Clin, Chim. Acta. 1992. -Vol. 212. -P. 89-102.

35. McElroy M.C., Postle A.D., Kelly FJ. Catalase, superoxide dismutase and glutathione peroxidase activities of lung and liver during human development // Biochim. et biophys. acta.1992.-Vol. 1117.-P. 153-158.

36. Биленко M.B. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. М.: Медицина, 1989.-368 с.

37. Soave М.С., Moulsma М., Chevalier P. et al. Increased superoxide dismutase activity in erythrocytes of children with pulmonary hypertension // Clin. Chim. Acta. 1992. - Vol. 209. -P. 95-101.

38. Бакалова P., Соколова Ц., Рибаров С, Каган В. Эффективность действия а -токоферола и его гомологов на люминолзависимую хемилюминесценцию // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1991. № 5. - С. 482-485.

39. Бурлакова Е.Б., Губарева А.Б., Архипова Г.В., Рогинский В.А. Модуляция перекисного окисления липидов биогенными аминами в модельных системах // Вопр. мед. химии. -1992.-№ 2.-С. 17-20.

40. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты // Успехи химии. 1985. - Т. 54. - С 1540-1558.

41. Suzuki Y., Tsuchiya М., Wassail S,R. et al. Structural and dynamic membrane properties of a-tocopherol and a-tocotrienol implication to the molecular mechanism of their antioxidant potency// Biochemistry. - 1993. - Vol. 32. - P. 10692-10699.

42. Заиков Е.Г. Почему стареют полимеры. // Соровский образовательный журнал. 2000. - Т.6. - №12.- С. 48-55.

43. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. Ленинград: Наука, 1985.

44. Beyer R.E. The participation of coenzyme Q in free radical production and antioxidation // Free Radical Biol, and Med. 1990. - Vol. 8. - P. 545-565.

45. Hodis H.N., Mack W.J., Ladree L. et al. Serial coronary angiographic evidence that antioxidant:) vitamin intake reduces progression of coronary artery atherosclerosis // JAMA. 1995. - Vol. 273.-P. 1849-1854.

46. Афанасьев Ю.И., Боронихина T.B. Витамин Е: значение и роль в организме // Успехи соврем, биологии. 1987. -Т. 104, вып. 3. -С. 400-411.

47. Burton G.M., Traber M.G. Vitamin E antioxidant activity, biokinetics, and bioavailability // Rev. Nutr. - 1990. - Vol. 10. - P. 357-382.

48. Halliwell B. Albumin an important extracellular antioxidant. // Biochem. Pharmacol. - 1988. -Vol. 37.-P. 569-571.

49. Fox R.B. Prevention of granulocyte-mediated oxidant lung injury in rats by a hydroxyl radical scavenger, dimethylthiourea //J. Clin. Invest. 1984. - Vol. 74. - P. 14561464.

50. Чеботарев E.E., Барабой В.А., Дружина H.A. и др. Окислительные процессы при гамма- нейтронном облучении организма. Киев: Наук, думка, 1986. - 216 с.

51. Sies Н. Oxidative stress From basic research to clinical application // Amer, J. Med. - 1991. -Vol. 91, Suppl. 3C.-P. S31-S38.

52. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона // Успехи соврем, биол. 1990. - Т. 110 , вып. 1.- С. 20-33.

53. Жданов Г.Г., Нечаев В.Н., Алипов П.А. Гипербарическая оксигенадия и антиоксиданты в комплексной интенсивной терапии тяжелых форм пневмоний у детей // Анестезиология и реаниматология. -1991. № 2. - С. 54-58.

54. Niki Е. Action of ascorbic acid as a scavenger of active and stable oxygen radicals // Amer. J. Klin.Nutr.-l 99t.-Vol.54.-P.SlH9-S 1124.

55. Tamba M, О'Neil P. Redox reactions of thiol free radicals with the antioxidants ascorbate and chlorpromazine: Role in radioprotection // J. Chem. Soc. Perkins Trans. 2. 1991. -Vol. 11.-P. 1681-1685.

56. Jonas S.K., Riley P.A., Willson R.L. Hydrogen peroxide cytotoxicity: Low temperature enhancement by ascorbate or reduced lipoate // Biochem. J. 1989. - Vol. 264. - P. 651-655.

57. Wang X., Liu J., Yokoi I. et al. Direct detection of circulating free radicals in the rat using electron spin resonance spectrometry // Free Radical Biol, and Med. 1992. - Vol. 12. — P. 121-126.

58. Cohen A., Schwartz E. Vitamin С and iron overload // New Engl. J. Med. 1981. -Vol.304. P. 1108.

59. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспецифической реакции организма на экстремальное воздействие (Обзор) // Вопр. мед. химии. 1988. - № 6. - С. 2-11.

60. Зенков Н.К., Панкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. М.: МАИК "Наука / Интерпериодика". -2001.-343 с.

61. BallaG., Jacob H.S., BallaJ. et al. Ferritin a cytoprotective antioxidant strategem of endoihelium//J. Biol. Chem. - 1992. - Vol. 267.-P. 18148-18153.

62. Basaga H.S. Biochemical aspects of free radicals // Biochem. and Cell Biol. 1990. -Vol. 68. -j P. 989-098.

63. Chichton R.R., Ward R.J. Iron metabolism new perspectives in view //Biochemistry. - 1992. Vol. 31.-P. 11255-11264.

64. Salonen J.T., Salonen R., Lappetelainen R. et al. Risk of cancer in relation to serum concentrations of selenium and vitamins A and E. Matched case-control analysis of prospective data//Brit. Med. J.-1985.-Vol. 290.-P. 417-420.

65. Halliwell В., VasilM., Grootveld M. The antioxidants of human extracellular fluids // Arch. Biochem. and Biophys. 1990. - Vol. 280. - P. 1-8.

66. Maples K.R., Mason R.P. Free radical metabolite of uric a?id // J. Biol. Chem. 1988. -Vol.263.-P. 1709-1712.

67. Sierra C, Pastor M.C., de Ramon M. Liquid chromatography determination of a -tocopherol in erythrocytes // Clin. Chim. Ada. 1992. - Vol. 208. - P. 119-126.

68. Марри P., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. Т. 1. - М.: Мир. - 1993.- С. 161.

69. Hollman, Р.С.Н., van Trijp, J.M.P., Buysman, M.N.C.P., van der Gaag, M.S., Mengelers, M.J.B., de Vries, J.H.M., 1997a. Relative bioavailabijity of the antioxidant quercetin from various foods in man. FEBS Letters 418, 152-156.

70. Williams J., Jordan S., Barnes S., Blair H. Tyrosine kinase inhibitor effects on avian osteoclastic acid transport.// Am J Clin Nutr 1998. Vol. 68(S). - P. 1369-1374.

71. Meng Q.H., Levis P, Wahala K., Adlercreutz H., Tikkanen M.J. Incorporation of esterified soybean isoflavones with antioxidant activity into low density lipoprotein.// Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1438. - P. 369-376.

72. Kerry N., Abbey M. The isoflavone genistein inhibits copper and peroxvl radical mediated low density lipoprotein oxidation in vitro. //Atherosclerosis. 1998. - V. 140(2). -P. 341-347.

73. Anderson J., DiwadkarVA., Bridges SR.//Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1998. -V. 218(4)-P. 376-381.

74. Li, B.Q., Fu, Т., Yan, YD., Baylor, N.W., Ruscetti, F.W., Kung, H.F. Inhibition of HIV by baicalin. // Cellular Molecular Biological Research. 1997. - Vol. 39. - P. 119-124.

75. Kim, H.J., Wood, E.R., Shin, C.G., Park, H., 1998. A new flavonol gallale ester from Acer and its inhibitory activity against HIV-1 integrace. Journal of Natural Products 61,145-148.

76. Miyazawa M, Sanako К, Nakamura S, Kosaka H Antimutagenic activity of isoflavones from soybean seeds (Glycine max merrill).//J. Agric. Food. Chem. 1999. -Vol. 47(4).-P. 1346-1349.

77. Максимова Т. Еще раз об антиоксидантной терапии // Наука и жизнь. -2001. -№2. С. 52-56.

78. Harbome, J.B. Plant polyphenols and their role in plant defence mechanisms. // INRA, Paris, 1995.-P. 19-26.

79. Koda A. Pharmacologic action of baicalin and baicalein from Scutellaris radix Taisha. //Jap. J. Allergol. -1973. Vol. 10. - N.5. - P.730-739.

80. Атлас ареалов и ресурсов лекарственных растений СССР // Под ред. П.С. Чикова. М.: Медицина. - 1976. - 340 с.

81. Литвиненко В.И., Попова Т.П. с соавт. Флавоноиды шлемников Сибири и Дальнего Востока // Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. "Новые лекарст. препараты из раст. Сибири и Дальнего Востока". 1986. - Томск. - С. 91-92.

82. Harborne JB., Williams С. A. Advances in flavonoid research since 1992 // Phytochemistry. 2000. - Vol. 55. - P. 481-504.

83. Киселева A.B., Волхонская T.A., Киселев.В.Е. Биологически активные вещества лекарственных растений Южной Сибири. 1991. - Новосибирск: Наука. Сибирское отделение. - С. 52-105.

84. Murphy Р.А Isolation of 6//-0-Acetylgenistin and 6//-0-Acetyldaidzin from Toasted Defatted Soyflakes //J.Agric. Food Chem. 1985. - Vol. 33. - P. 385-389.

85. Day AJ., DuPont MS., Ridley S., Rhodes M., Rodes MJ., Morgan MR., Williamson G. Deglycosylation of flavonoid and isoflavonoid glycosides by human small intestine and liver beta-glucosidase activity.// FEBS Lett. 1998. - Vol. 436 (1). - P. 71-75.

86. Pandjaitan N., Hettiarachchy Z.Y., Crandall P., Sneller C., Dombek D. Enrichment of Genistein in Soy Protein Concentrate with Hydrocolloids and P-glucosidase.// J. Food Science. -2000.-Vol. 65(4). P 591-595.

87. Nairn M., Gestetner В., Bondi A., Birk Y. Soybean Isoflavones. Characterisation, Determination and Antifungal Activity.//! Agric. Food Chem. 1974. - Vol. 22(5). - P .806-810.

88. Kenneth DR Setchell, L Zimmer-Nechemias, J Cai, J.E Heubi Isoflavone content of infant formulas and the metabolic fate of these phytoestrogens in early life. // Am. J Clin. Nutr. -1998. Vol. 68(S). P. 1453-1461.

89. Wu E., Loch III J., Toder B. Syntesis, Biological Activites, and Conformational Analysis of Isoflavone Derivatives and Related Compounds. // J. Med. Chem. 1992. — Vol. 35. -P. 3519-3525.

90. Cao X, Tian Y, Zhang T, Li X, Ito Y. Separation and purification of isoflavones from Pueraria lobata by high-speed counter-current chromatography. //J Chromatogr. 1999. - Vol. 10.-N 855(2). P. 709-713.

91. Esaki h., Rfwakishi S., Morimitsu Y., Osava T. New potent Antioxidative 0-Dihydroxyisoflavones in fermented Japanese soybean products. // Biosci. Biotechnol. Biochem. -1999. Vol. - 63. - P. 1637-1639.

92. Song Т., Barua K., Buseman G., Murphy P. Soy isoflavone analysis: quality control and a new internal standard // Am. J. Clin. Nutr. -1998. Vol. 68. - N6(S). - P. 1474-1479.

93. Георгиевский В.П., Комиссаренко Н.Ф., Дмитрук C.E. Биологически активные вещества лекарственных растений. Новосибирск: Наука. Сиб. Отд-ние. - 1990. - 333 с.

94. Franke А.А., Custer L.G., Tanaka Y. Isoflavones in human breast milk and other biological fluids // Am. J. Clin. Nutr. 1998. - Vol. 68 (S). -P. 1466-1473.

95. Казаков A.JI., Георгиевский В.П. Физико-химические и аналитические характеристики флавоноидных соединений. Ростов-на-Дону - 1988. - 286 с.

96. Stevens М., McCall., Lelieveld P. //Syntesis of Polyhydroxilated 2-Phenylbenzothiaoles and a Comparison of Their Cytotoxicities and Pharmacological Properties with genistein and Quercetin//J. Med. Chem. 1994. - Vol. 37. - P. 1689-1695.

97. Kohen F., gayer В., Amir-Zaltsman Y., Ben-Hur H., Thomas E., Lu LJ. A nonisotopic enzyme-based immunoassay for assessing human exposure to genistein.// Nutr. Cancer. 1999. - Vol. 35(1). - P. 96-103.

98. Aussenac Т., Lacombe S., Dayde J. Quantification of isoflavones by capillary zone electrophoresis in soybean seeds: effects of variety and environment. // Am. J. Clin. Nutr. 1998. Vol. - 68(S). - P. 1480S-1485S.

99. Харборн Дж.//Биохимия фенольных соединений// М., Мир, 1968.

100. Moridani M.Y., Pourahmad J., Bui H., Siraki A., O'Brien P.J. Dietary flavonoid iron complexes as cytoprotective superoxide radical scavengers // Free Radical Biology & Medicine. — 2003. Vol. 34.-P. 243-253.

101. Нейланд О.Я. Органическая химия M.: Высш. Шк. — 1990. - 751 с.

102. Lemanska К., Szymusiak H., Tyrakovska В., Zielinski R., Soffers A., Rietjens I. The influence of pH on fntioxidant properties and the mechanism of antioxidant action of hydroxyflavones. // Free Radical Biology & Medicine -2001. Vol. 31. - P. 869-881.

103. Zielonska J., Gebicki J.,Giynkiewicz G. Radical scavenging properties of genistein. // Free Radical Biology & Medicine 2003. - Vol. 35. - P. 958-965.

104. Areias F. M., Rego A. C., Oliveira C. R., Seabra R. M. Antioxidant effect of flavonoids after ascorbate/Fe2+-induced oxidative stress in cultured retinal cells // Biochemical Pharmacology. 2001 - Vol. 62. - P. 111-118.

105. Aruoma O.I., Halliwell В., Gajewski E., Dizdaroglu M. Copper-ion-dependent damage to the bases in DNA in the presence of hydrogen peroxide // Biochem. J. 1991. - Vol. 273.-P. 601-604.

106. Halliwell В., Gutteridge J.M.C. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease // Biochem.J.-1984.-Vol.219.-P. 1-14.

107. Jonas S.K., Riley P. A. Modification of the in vitro cytotoxicity of hydrogen peroxide by iron complexes // Free Radical Res. Cornmun.-1992. -Vol. 17. -P. 407-419.

108. Puppo A., Halliwell B. Formation of hydroxyl radicals from hydrogen peroxide in the presence of iron. Is haemoglobin a biological Fenton reagent? // Biochem. J. 1988. - Vol. 249. -P. 185-190.

109. Yoshida Y, Furuta S., Niki E. Effects of metal chelating agents on the oxidation of lipids induced by copper and iron // Biochimica a Biophysica Acta. 1993. - Vol. 1210. - P. 8188.

110. Afanas'ev I., Dorozhko A. Brodskii A., Kostyuk V., Potapovitch A. Chelating and free radical scavenging mechanisms of inhibitory action of rutin and quercetin in lipid peroxidation. // Biochemical Pharmacology, 1989.- Vol. 38. - P. 1763-1769.

111. Mira L., Fernandez M.T., Santos M., Rocha R., Florencio M.H., Jennings K.R. Interaction of flavonoids with iron and copper ions: a mechanism for their antioxidant activity // Free Radical Research. 2002. - Vol. 18. P. 1-10.

112. Cornard J.P., Merlin J.C. Comparison of the chelating power of hydroxyflavones I I Journal of Molecular Structure. 2003. - Vol. 651-653, P. 381-387.

113. Moran J., Klyucas R., Grayer R., Abian J., Becana M. Complexes of iron with phenolic compounds from soybean nodules and other legume tissues: prooxidant and antioxidant properties. // Free Radical Res. Commun.-1997. -Vol. 22. -P. 861-870.

114. Leopoldini M., Pitarch I. P., Russo N., Toseano M., Structure, Conformation, and Electronic Properties of Apigenin, Luteolin, and Taxifolin Antioxidants. A First Principle Theoretical Study // J. Phys. Chem. A. 2004. - Vol. 108. - P. 92-96.

115. Рогинский B.A. Фенольные антиоксиданты: Реакционная способность и эффективность. М.: Наука, 1988.

116. Походенко В.Д. Феноксильные радикалы. 1969. - Киев: Наук, думка. -194 с.

117. Ершов В.В., Никифоров Г.А., Володъкин А.А. Пространственно-затрудненные фенолы. 1972. - М.: Химия. - 351 с.

118. Landolt-Bornstein N.S. Magnetic properties of .free radicals. Pt C2. Organic О, P, S, Se, Si, Sn, Ge, Pb, As, Sb-centered radicals. // Springer 1979. - Vol. 9. - P. 320.

119. Sakihama Y, Cohen MF, Grace SC, Yamasaki H. Plant phenolic antioxidant and prooxidant activities: phenolics-induced oxidative damage mediated by metals in plants. // Toxicology. 2002. - Vol. 177(1) - P. 67-80.

120. Erkoc S., Erkoc F., Keskin N. Teoretical investigation of quercetin and its radical isomers // J. of Molecular Structure (Theochem). 2003. - Vol. 631. - P. 141-146.

121. Dewar M.J.S., Zoebisch E.G., Healy E.F., Stewart J.J.P. AMI: a new general purpose qantum mechanical molecular model //J. of the American Chemical Society. — 1985. — Vol. 107.-P. 3902-3909.

122. Минкин В.И., Симкин Б.Я., Миняев P.M. Теория строения молекулы. Ростов-на-Дону: Феникс. - 1997. - 560с.

123. Бурштейн К.Я., Шорыгин П.П. Квантовохимические расчеты в органической химии и молекулярной спектроскопии. М.: Наука. - 1989. -104 с.

124. Stewart J.J.P. comparison of the accuracy of semyempirical and some DFT metods for predicting heart of formation. // J. of Molecular Modeling. 2004. - Vol. 10. -P. 6-12.97

125. HyperChem release 7 for Windows //USA., F., Gainesville, Hypercube Inc., 2002.

126. CRC concise encyclopedia of mathematics. Second edition. // UK. Cambridge, the MIT press.- 1993.

127. Lien E.J, Ren. S, Bui H.H Wang R. Quantitative structure-activity relationship analysis of phenolic antioxidants // Free Radical Biology & Medicine. 1999. - No 3-4- P. 285294.

128. Vaya J., Mahmood S., Goldblum A., Aviram M., Volkova N., Shaalan A., Musa R., Tamir S. Inhibition of LDL oxidation by flavonoids in relation to their structure and calculated enthalpy // Phytochemistry. 2003. - Vol. 62. - P. 89-99.

129. Москва В.В. Водородная связь в органической химии. // Соросовский образовательный журнал. 1999. - №2. - С. 58-64.

130. Москва В.В. Понятие кислоты и основания в органической химии // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. - № 12. - С. 33-40.

131. Казаков A.JL, Хиля В.П., Межерицкий В.В., Литкин Ю. Природные и морфологические изофлавоны.- 1985-Ростов -на-Дону: 236с.

132. Cornard J.P., Merlin J.C. structural and spectroscopic investigation of 5-hydroxyflavones and its complex with aluminium // Journal of Molecular Structure. 2001. -Vol. 569.-P. 129-138.

133. Bestwick C. S., Milne L. Quercetin modifies reactive oxygen levels but exerts only partial protection against oxidative stress within HL-60 cells // Ref. Bioch. Et Biophys. Acta -2001.-Vol 1528.-P. 49-59.

134. Денисов E.T. //Докл. АН СССР. 1962. - Т. 146. - №2. - C.394-397.

135. Денисов ЕЛУ/Изв. АН СССР. 1959. - №12. - С. 2100-2111.

136. Gao Z., Huang К., Yang X., Xu Н. Free radical scavenging and antioxidant activities of flavonoids extracted from the radix of Scutellaria baicalensis Georgi. // Biochem Biophys Acta. 1999. - V.1472.-P.643-650.

137. Trieu VN., Dong Y., Zheng Y., Uckun FM. In vivo antioxidant activity of genistein in a murine model of singlet oxygen-induced cerebral stroke.// Radiat. Res. 1999. - Vol. 152. -P. 508-516.

138. Madsen I. L., Andersen Ch. M., Jorgensen L. V., Skibsted L. Radical scavenging by dietary flavonoids. A kinetic study of antioxidant efficiencies // Eur Food Res Technol. — 2000. — Vol. 211.-P. 240-246.

139. Guo Q, Rimbach G, Moini H, Weber S, Packer L. ESR and cell culture studies on free radical-scavenging and antioxidant activities of isoflavonoids. // Toxicology. 2002. Vol. 179-P. 171-180.

140. Arora A., Valcic S., Cornejo S., Nair MG., Timmermann BN., Liebler DC. Reactions of Genistein with alkylperoxyl radicals. // Chem. Res. Toxicol. 2000 - Vol. 13. - P. 638-645.

141. Wei H., Ca Q., Rahn R., Zhang X., Wang Y. Lebwohl M. DNA structural integrity and base composition affect ultraviolet light-induced oxidative DNA damage // Biochemistry. -1998 Vol. 37. - P. 6485-6490.

142. Magnani L., Gaydou E., Hubaud J.-C. Spectrophotometric measurement of antioxidant properties of flavones and flavonols against superoxide anionl. //Analytica Chimica Acta. 2000. - V.411. - P.209-216.

143. Okada Y., Okajima H. Antioxidant effect of capsaicin on lipid peroxidation in homogeneous solution, micelle dispersions and liposomal membranes. //Redox Rep. 2001. -Vol.6. -No.2. -P. 117-122.

144. Antolovich M., Prenzler P.D., Patsalides E., McDonald S., Robards K. Methods for testing antioxidant activity // Analyst. 2002. - Vol. 127. - P183-198.

145. Lotito S., Fraga C. (+)-Catehin prevent human plasma oxidation // Free Radical Biology & Medicine. 1998. -Vol. 24. - P. 435-441.

146. Miller N. J., Castelluccio C., Tijburg L., Rice-Evans C. The antioxidant properties of theaflavins and their gallate esters radical scavengers or metal chelators. // FEBS Letters. — 1996.-Vol. 392.-P. 40-44.

147. Tovar-Palacio C, Potter SM, Hafer-mann JCShay NF Intake of soy protein and soy protein extracts influences lipid metabolism and hepatic gene expression in gerbils.// J Nutr. — 1998.-Vol. 12.-P. 839-842.

148. Nogowski L, Mackowiak P, Kandulska K, Szkudelski T, Nowak KW. Genistein-ihduced changes in lipid metabolism of ovariectomized rats. //Ann. Nut. Metab. — 1998 —Vol. 42(6).-P. 360-366.

149. Rios, J.L., Manez, S., Paya, M, Alcaraz, MX, Antioxidant activity of flavonoids from Sideritis javulambrensis.il Phytochemistry. 1992. - Vol. 31. - P. 1947-1950.

150. Gabrielska, J., Oszmianski, J., Zylka, R., Komorowska, M., Antioxidant activity flavones from ScutelUxria hakalensis in lecithin liposomes. // Zeitschrift fur Naturforschung . -1997.-Vol. 52.-P. 817-823.

151. Miyase, Т., Sano, M., Nakai, H., Muraoka, M., Nakazawa, M., Suzuki, M., Yoshino, K., Nisbihara, Y., Tanai, T. Anti-oxidants from Lespedeza hamoloba. (I). // Phytochemistry. -1999.- Vol. 52.-P. 303-310.

152. Miyase. Т., Sano, M., Yoshino, K., Nonaka, K., Antioxidants from Lespedeza homoloha (II). // Phytochemistry. 1999. - Vol. 52. - P. 311-319.

153. Mitchell J. H., Gardner P.T., McPhail D.B., Morrice P.C, Collins A.R., Duthie G.G. Antioxidant Efficacy of Phytoestrogens in Chemical and Biological Model Systems //Arch. Biochem. Biophys. 1998. - Vol. 360.-No. l.-P. 142-148.

154. Arora A, Byrem TM, Nair MG, Strasburg GM. Modulation of liposomal membrane fluidity by flavonoids and isoflavonoids.// Arch. Biochem. Biophys. 2000. - Vol. 373(1). - P. 102-109.

155. Galati G, Sabzevari O, Wilson JX, O'Brien PJ. Prooxidant activity and cellular effects of the phenoxyl radicals of dietary flavonoids and other polyphenolics. // Toxicology. 2002. -Vol. 177(1).-P. 91-104.

156. Vaya J., Aviram M. Nutritional antioxidants: mechanisms of action, analyses of activities and medical applications // Free Radical Biology & Medicine. 2002. -Vol. 37. - No. 4. - P. 352-369.

157. Washko P., Rotrosen D., Levine M. Ascorbic acid in human neutrophils // Airier. J. Clin. Nutr. 1991.-Vol.54. - P.S1221-S1227.

158. May J.M., Qu Z.-C, Whitesell R.R. Ascorbic acid recycling enhances the antioxidant reserve of human erythrocytes // Biochemistry. 1995. - Vol. 34. - P. 12721-12728.

159. Wang G., Kuan SS., Francis OJ., Ware GM., Carman AS. A Simplified HPLC Method for the Determination of Phytoestrogens in Soybean and Its Processed Products.// J Agric. Food. Chem. 1990. - Vol. 38. -P. 185-190.

160. Панкин B.3., ГуревичС.М., Бурлакова Е.Б. Сб. Биоантиокислители. // Труды МОИП. 1975. - Т. 52. - М.: Наука. - С.338.

161. Журавская Н.К., Алехина JI.T., Отряшенкова JI.M. // Исследования и контроль качества мяса и мясопродуктов. 1985. - М.: Агропромиздат. - 163с.

162. Шишкина JI.H.//Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in vivo. II Ред. Бурлакова Е.Б. 1992. - М.: Наука. - С. - 26-30.

163. Бурляев В.В. Численные методы в примерах на EXCEL. // Методическое пособие по дисциплине "Применение информационных технологий в химии и химической технологии". 1999.-МИТХТ.-С.63.