Аффинная модификация эндонуклеаз рестрикции и ДНК-метилтрансфераз аналогами субстратов как метод исследования этих ферментов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ТРУДОВОГО КРАСНОГО Р Г Б ОД ЗНАМЕНИ И ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ

г > „„ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

1 3 Ц-'.Ь г'

им. МЛ. Ломоносова

Химический факультет

На правах рукописи УДК 577. ¡13.4.

ШЕФЛЯН ГАЛИНА ЯКОВЛЕВНА

АФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ И ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ АНАЛОГАМИ СУБСТРАТОВ КАК МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

ЭТИХ ФЕРМЕНТОВ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА 1М5

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Научные руководители:

доктор химических наук профессор Шабарова З.А.

доктор химических наук профессор Громова Е.С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук профессор Матвиенко H.H.

кандидат химических наук Вейко H.H.

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологин им. Энгельгардта РАН

Защита состоится "28" февраля 1995 гола в 16 часов на засел: Специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Москов< государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва. ГСП-! 234, Ленинские горы, МГУ, лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан "26" января 19<$года.

\

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат химических наук' ' /. _ . - И.Г. Смирнова

" {

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Метод аффинной модификации белков активированными нуклеиновыми кислотами (НК) достаточно широко применяется в биохимии и молекулярной биологии, но в качестве объектов в основном используются белки с низкой степенью специфичности по отношению к НК - гистоны, рибосомные белки и т.д. Важным классом белков, специфически взаимодействующих с ДНК, являются широко используемые в молекулярной биологии ферменты рестрикции-модификации П-го типа. Эти ферменты узнают короткие нуклеотидные последовательности и расщепляют или модифицируют их по обеим цепям. Применение метода аффинной модификации белков аналогами ДНК открывает широкие возможности для анализа структуры и функционирования этих ферментов. Однако, подходы к созданию реагентов для ковалентного присоединения к ферментам рестрикции-модификации П-го типа малочисленны и не разработаны до конца.

Объектом наших исследований явились ферменты рестрикции-модификации £roRII, Mval, 5íoII и эндонуклеаза рестрикции ВяШ, которые узнают последовательность или CCNGG (SjoII; N - А или Т, G или С). Ферменты модификации £coRII (M-ícoRII) и Mval (М-Mr al) метилируют последовательность C*C^/pJ3G (или C*CNGG -M-SjoII) по 5-ому положению (M-üctfRIl, M-SjoII) или по N-4 положению (M-A/val) внутреннего остатка цитозина (показано звездочкой). Эндонуклеазы рестрикции EcoKll (R-EcoRll), Mval (R-A/val), SmII (R-SjoII) и SirNI (R-BjíNI) гидролизуют участки узнавания как показано стрелками:

5' iCCUT/AGG У 5' ¿CCNGG 3'

4- - R-EcoRII, U - R-BííNI, R-Aível 4- - R-5joII

Эти ферменты нуждаются в кофакторах для функционирования - З-аденозил-Ь-метионине (SAM) для ферментов модификации и нонах

Mg2+ для эндонуклеаз рестрикции. На кафедре химии природных соединений благодаря использованию синтетических субстратов установлены группы атомов в ДНК, взаимодействующие с этими ферментами, исследован кинетический механизм реакции, получены негидролизуемые аналоги субстратов. Однако ничего не известно о том, какие домены белковой молекулы взаимодействуют с субстратом и о конформационном состоянии белка в комплексе с субстратом. Одним из подходов к решению этой проблемы является ковалентное присоединение белков к модифицированному олигонуклеотиду с последующим протеолизом белкового компонента и анализом полученного пептида. Зависимость степени аффинной

модификации белков реагентами от внешних условий может дать информацию о механизм ферментативного катализа.

Целью настоящей работы является разработка методов ковалентного присоединени ферментов рестрикции-модификации к активированным субстратам, оптимизация у слови аффинной модификации белков, исследование механизма функционирования ферментов пр: помощи данного метода и определение оптимальной схемы выделени олигонуклеотидопептндов - продуктов трипгического гидролиза конъюгатов ферментов олигонуклеотидом.

К реагентам для ковалентного присоединения к ферментам рестрикции-модификаци] предъявлялись следующие требования: наличие активных групп, специфичность действие .(наличие участка узнавания ферментов, минимальное искажение структуры, "точечные модификации в участке узнавания).

Научная новизна и практическая ценность работы. Сконструированы реагенты, содержании участок узнавания ферментов, лля аффинной модификации ферментов рестрикции модификации П-го типа. ДНК-дуплексы, содержащие остаток были направлены н;

зондирование центров в белке, контактирующих с гетероциклическими основаниями учасгкг узнавания. ДНК-дуплексы с монозамещенной пирофосфатной связью вместо расщепляемо? эндонуклеазамн рестрикции фосфодиэфирной связи использовались для исследования каталитических центров ферментов. ДНК-дуплексы с монозамещенной пирофосфатнои межнуклеотидной связью, не совпадающей с местом разрезания эндонуклеазамн рестрикции позволяли изучать аминокислотные остатки, взаимодействующие с углеводофосфатньш остовом субстратов. Обнаружено, что дуплекс с монозамещенной пирофосфатной связью в центре участка узнавания образует комплексы с эндонуклеазамн рестрикции ¿соЯП, Л/уа1, и Дг/Ш н расщепляется ими, причем £соШ1 расщепляет такой дуплекс по двум фосфодиэфирным связям: канонической и соседней с ней с З'-конца. Показано образование конъюгатов ферментов рестрикции-модификации с дуплексами, содержащими монозамещенную пирофосфатную межвукпеотидную связь и ферментов рестрикции А/ул1, йтгШ и с субстратом, содержащим остаток Ьг^ёи. На основе анализа зависимости степени аффинной модификации эндонуклеаз рестрикции дуплексом с монозамещенной пирофосфатной межнуклеотидной связью от концентрация ионов

предполагается

следующее: 1) гонформационные перестройки в комплексе Я'ЛА>а1 с субстратом при последовательном включении двух ионов конформационная перестройка комплекса

К-ЕсоШ1 с субстратом, сопровождающаяся изменением аминокислотного окружения ДНК,

при увеличении концентрации кофактора. Показано, что эндонуклеаза рестрикции 55<?И взаимодействует с ДНК-дуплексом, содержащим или не содержащим участок узнавания, почти с одинаковой эффективностью в отсутствие ионов Mg2+, т.е. специфическое узнавание субстрата происходит в присутствии кофактора на стадии катализа. Предложена и отработана схема выделения олигонуклеотидопептидов, которые образуются после трипсинолиза продукта ковалентного присоединения эндонуклеазы рестрикции SjoII к ДНК-дуплексу, содержащему монозамешенную пирофосфатную связь.

Полученные результаты важны как для понимания механизма функционирования ферментов рестрикции-модификации П-го типа, так и для дальнейшего использования метода аффинной модификации белков аналогами субстратов для исследования высокоспецифического белково-нуклеинового узнавания.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на IV-ом симпозиуме New England Biolabs "Эндонуклеазы рестрикции и метилтрансферазы: Структуры и механизмы" (Вермонт, США, 1993), на конференции New England Biolabs по биологической модификации ДНК (Вильнюс, Литва, 1994), I Всероссийской планово-отчетной конференции по направлению "Белковая инженерия" Государственной научно-технической программы России "Новейшие методы биоинженерии" (Москва, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы (15В ссылок), содержит 26 рисунков и 12-таолиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. В работе использованы препараты ферментов рестрикции-модификации EcoR.Il (Завод химреактивов, Латвия), A/val (НПО "Фермент", Литва) и эндонуклеазы рестрикции BstN1 (ИБФМ, Пущино). Препараты ферментов рестрикции-модификации Ssoll были любезно предоставлены Карягиной А.С. и Никольской И.И. (Институт медицинской биохимии АМН России). Синтез, очистка и подтверждение первичной структуры олигонуклеотидов были проведены сотрудниками лаборатории химии нуклеиновых кислот химического факультета МГУ Орецкой Т.С., Романовой Е.А., Волковым Е.М., Ташлицким В.Н. Большую помощь при планировании и организации эксперимента оказала Кубарева Е.А.

Реакции проводили в соответствующих буферных растворах, состав которых указан в подписи к табл. 2, при 37°С в течение 0,5-18 часов. В реакциях использовали эндонуклеазы

рестрикции в количестве 4,5 ед.агг7мкл, 37,5 нг/шсл £ceRII; 30 ед.актЛаэт, 6,9 нг/мкл Aiva. .60 нг/мкл Ssoll; 6 ед.акт./мкл £«N1 и ферменты модификации в количестве 0,5 ед.акт./ми 10 нг/мкл £coRU; 0,2 ед.акт./мкл Aíval; 0,2 ед.акт./мкл £roII. За нековалентным связывание! дуплексов с ферментами следили методом торможения в 4,5%-ном ПААГ. Продукт! гидролиза субстратов эндонуклеазами рестрикции аналшировали электрофорезом в 20%-hoi ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Продукты ковалентного присоединения активировании ДНК к ферментам рестрикции-модификации аналшировали электрофорезом по Лэмли 12V»-hom ПААГ, содержащем додецилсульфат натрия. Cjj - концентрация ДНК-душхексоf Tris - три«гидрокснметнл)аминометан. Melm - N-метилнмидазол, SAM - З-аденозил-L метионин.

1. Ковалентное присоединение Ферментов рестрикции-модификации к ДНК-дуплексам, содержащим монозамещенную пирофосфатную межнукяеотидную связь 1.1. Конструирование субстратов и их свойства Для аффинной модификации ферментов рестрикции-модификации использовали 32р меченные ДНК-дуплексы I и II. содержащие участок узнавания этих ферментов, причем 32] находился в дизамешенной фосфатной группе пирофосфатной группировки.

а-аепь 5' ACCTACC-o-^-o-{m>-TGGTGGT 3'

СЛ? ?

■р-о-р-о-1

О О

6-депь 3' TGGATGG-АССАССА 5'

СЛР ?"

а-цепь 5* GTCACT-o-{lo-¿-o-CCTGGATCCG 3'

О О

б-аепь 3' САСТСА-ССАССТАСССА 5'

Эта группа участвует в образовании ковалентной связи с нуклеофильными агентам] (схема 1).

О О ч- „ О О

II II. II . 1

Я-О-Р-О-Р-О-Я—Я-О-Р-О + Ыи-Р-О-Я

II. II.

С1Н5О о с2нр о

МиН - нуклеофнльный агент, ЯО- н К'О- - фрагменты олигодезоксирибонуклеотидов * - расположение 32р.метси Схема 1

В качестве нуглеофильных агентов могут выступать группы белка, которые результате нуклеофильной атаки присоединяются к олнгонуклеотиду ТСКЗТСКЗТ и дуплекса I или олнгонуклеотиду ССТСЮАТССО из дуплекса II.

Методом торможения в геле было показано, что дуплекс I образует нековалентные комплексы с эндонуклеазами рестрикции £coRII, SjoII, Mval и &:NI. Таким образом, введение. объемной группировки в ДНК-дуплекс не вызывает серьезных структурных искажений, препятствующих ДНК-белковым контактам.

Показано (табл. 1), что введение монозамешенной пирофосфатной межнуклеотидной связи в центр участка не препятствует образованию комплексов в отсутствие Mg-+ с ферментами EcoRll, Ssoll, Mval и BstNl и гидролизу активированного

дуплекса эндонуклеазами рестрикции Mval по интактной цепи, SjoII - по обеим цепям, и £coR!I по модифицированной цепи с изменением "специфичности" разрезания. Дуплекс с монозамешенной пирофосфатной межнуклеотидной связью на границе участка узнавания и фланкирующей последовательности гидролизуется эндонуклеазой рестрикции Mval по обеим цепям, iSjoII - по интактной цепи и не гидролизуется ícoRII.

Таблица 1.

Расщепление эндонуклеазами рестрикции Mval, ifcoRII и SjoII ДНК-дуплексов с монозамешенной пирофосфатной межнуклеотидной связью в участке узнавания.

ДНК-дуплекс Цепь Степень гидролиза, "/'о*)

R-Aíval R-£coRII R-SioII

I а -•*> 71,6 канонический i неканонический гидролиз, 18 часов 29

б 8 0 34

II а 9 за 1 час 51 за 18 часов

б 84 - 51

*) приведены данные лщролиза в течение 1 часа при 37°С, если не оговорено особо

**) степень гидролиза не определена из-за совпадения места разрезания и места введения

модификации

1.2. Ковалентное присоединение ферментов рестрикиии-модификации EcoRII. Mval. SíoII и &/NI к ДНК-дуплексам 1 и II. Влияние состава буфера Ковалентное присоединение ферментов рестрикцни-моднфгпеащт к ДНК-дуплексам I и II проводили при 37°С в течение 16-18 часов в соответствующих буферных растворах, указанных в подписи к табл. 2.. Параллельно проводили два

анализа реакционной смесп гель-электрофорезом по Лэшш с предварительной обработкой реакционной смеси SDS при 95°С,что исключает образование нековалентных комплексов. Один гель прокрашивали нитратом серебра или кумасся G-250 для обнаружения зон белка; одновременно проводили автораднографню второго геля (рис. 1). Совпадение зон, содержащих бедок, с радиоактивномеченными зонами подтверждало образование коваленгного конъюгата исследуемого фермента и ДНК-дуплексов I и II.

Для поиска оптимальных условий аффинной модификации белков ДНК-дуплексами I

и II изменяли два параметра в составе растворов: 1) нуклеофильность буферного раствора,

заменяя Tris на Melm, являющийся более активным нуклеофильным агентом; 2)

концентрации соответствующих кофакторов (Mg^+ для экдонуклеаз рестрикции и SAM для

ДНК-метилтрансфераз). Результаты представлены в таблицах 2 и 3. ■) в)

Рис. 1. Анализ методом электрофореза по Лэмли коваленгного присоединения R-£eoRIl к ДНК-дуплексу i в Ме1т-буфере (а) радиоавтограф геля: 1 - дуплекс 1,2- реакционная смесь с ферментом; (б) гель, прокрашенный Кумасси G-250: 1 - фермент, 2 - реакционная смесь дуплекса I с ферментом, 3 -смесь реперкых белков. Справа указаны массы реперных белков. Буфер А (см. в подписи к табл. 2).

R-£"coRII. Как следует из таблицы 2, увеличение нуклеофщшюсти буфера для реакции коваленгного присоединения дуплекса I к R-£coRII привело к резкому увеличению степени аффинной модификации белка. Причиной этого, вероятно, является катализ Melm при взаимодействии £coRII с ДНК-субсгратом I. При использовании Melm для аффинной модификации R-£coRII ДНК-дуплексом II не наблюдалось увеличения эффективности процесса по сравнению с использованием Tris (табл. 2).

Как видно из таблицы 2, введение ионов Mg2+ ингибирует процесс ковалентного присоединения эндонуклеазы рестрикции £coRII к ДНК-дуплексам I и II. Ингибирование . - ковалентного.. присоединения не может быть связано с гидролизом ДНК-дуплексов при добавлении ионов Mg2+, так как Е.А. Кубаревой было показано, что гидролиз субстратов

б

R-£coRII начинается только при концентрации Mg2+, равной МО'^М, в то время как ингибирование ковалентного присоединения происходит уже при 1> Активная связь

в дуплексе II замешает расщепляемую ферментом фосфодиэфиряую связь, поэтому гидролиз модифицированной цепи блокирован и в данном случае не является причиной ингибирования ковалентного присоединения. Резкое уменьшение степени аффинной модификации R-£coRII, вероятно, объясняется изменением аминокислотного окружения модифицированных межнуклеотидных связей дуплексов I и II в фермент-субстратных комплексах в присутствии ионов

R-Sroll. Добавление Melm не приводит к повышению степени аффинной модификации R-iSjoII дуплексами I и II (табл. 2). Незначительное уменьшение эффективности аффинной модификации R-SíoII ДНК-дуплексом I, вероятно, не является следствием влияния Melm на взаимодействие фермента с субстратом, так как нами было показано, что ферментативный гидролиз в Tris- и Ме1т-буферах происходит с одинаковой эффективностью.

Таблица 2.

Степень аффинной модификации R-£coRII, R-SíoII, R'&rNl и R-Aívol ДНК-дуплексами I и II в зависимости от состава буферного раствора при 37°С в течение 18 часов, %.

Буфер [Mg2+1, R-£coRII R-SJOII R-BííNI R-AYval

М дуплекс дуплекс дуплекс дуплекс

I II I II I I II

Melm- 0 11,8 0,3 18,5 5 - 0,3 -

буфер*) 3,75-10-5 10,6 0,8 . _ - 0,8 -

1,5-10"4 4,4 1,9 17,1 _ - 0,9 -

1.5-10"2 1,2 0 2,5 5,4 0 -

Tris- 0 0,9 1,6 22 1,4 0,42 0,5 0.5

буфер**) 3,75- Ю-5 - 1,8 _ _ - 6 1

1,5-10-4 - 1,1 19,8 _ 2,9 1,8

1,5-10-2 - 0,8 5 5,9 - 0,5 0

*) буферные растворы: А - 40 мМ Melm, рН 7,6, 50 мМ NaCl, 7 мМ дитиотреит (R-£coRII); В - 10 ыМ Melm, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 0,1 мМ дитиотреит (R-SioII); С - 10 мМ Melm, рН 8,5, 150 ыМ NaCl, 1 мМ дитиотреит, 100 мкг/мл альбумин (R-Aíval).

**) буферные растворы: D - 40 мМ Tris, рН 7,6, 50 мМ NaCl, 7 мМ дитиотреит (R\EcoRII); Е - 10 мМ Tris, рН 7,5, 50 иМ NaCl, 0,1 М днтиотрегт(R-Ssoll и R\8irNI); F-10иМ Tris, рН 8,5, 150 иМ NaCl, 1 мМ дитнотреитол, 100 uxrhui альбумин (R-A/val).

Г

Введение ионов приводит к ингиоированию коваленгного присоединение

•R-SjoII к дуплексу I. Поскольку нами было показано, что эндонуклеаза рестрикции SjoI] гидролизует ДНК уже при концентрации Mg2+, равной 1-

снижение выхода продукт;

аффинной модификации R-ÍjoII соответствует гидролизу ДНК-дуплекса ферментом. I случае, когда модифицированная межнуклеотидная связь и место разрезания дуплекса I] R-AvjH совпадают, гидролиз модифицированной цепи отсутствует (таблица 1). Вероятно поэтому добавление ионов не влияет на значения степени аффинной модификацт

R-SíoII дуплексом II в пределах ошибки эксперимента.

R-À/val. Из таблицы 2 видно, что дуплекс I практически не образует ковалентного аддукта ( R-Aíval в отсутствие ионов При концентрации ионов Mg'+, равной 1,5- Ю-4 М, г

также при оптимальной для ферментативного гидролиза с участием

R-Aíval (1,5-10"2 M

выход ковалентного белково-нуклеинового комплекса не превышал 1%. Была подобран: такая концентрация Mg2+ (3,75-10"-' M), при которой ковалентное присоединение R-A/vaí t дуплексу II происходит со значительно более высоким выходом - 6% (таблица 2).

Замена Tris-буфера на Melm-буфер не привела к увеличению эффективное^ коваленгного присоединения R-A/val к дуплексу I. Напротив, выход снижался приблизительно в б раз при любой взятой концентрации ионов Mg2+.

Выход продукта "пришивки" R-A/voI к дуплексу II не превышает 2%. В этом случа< образование ковалентно-связанного аддукта происходит с примерно одинаковой эффективностью как в присутствии ионов Mg2+ (до концентрации

1,5-10"4 М),

так и в га

отсутствие. Результаты ковалентного присоединения R-Mval к дуплексу II позволяют предположить, что в процессе взаимодействия с субстратом одна из нуклеофильных групп ï R-A/val сближается с фосфатной группой, примыкающей к CCTGG-последовательности с 5'-•конца.

Оптимальные условия для образования конъюгатов M-A/val с дуплексом

I - буферный раствор, содержащий Tris, и отсутствие кофактора - SAM (табл. 3). Кал показано в случае M-Mval, добавление SAM снижает эффективность аффинное модификации в 2 раза, а введение в реакционную смесь Melm - приблизительно в 6 раз. Конъюгат M-Mval с дуплексом II также образуется в Tris-буфере, но с меньшее эффективностью. Аффинной модификации M-Ssall дуплексом I в рассмотренных условиях н< наблюдалось (табл. 3). Вероятно, полная противоположность в результатах аффинное модификации M-À/val и М-5го11 дуплексом I является отражением различных типо! взаимодействия С-5 я N-4 меггшггрансфераз с углеводофосфатным остовом субстратов.

S

Таблица 3.

Степень аффнной модификации M-ícoRII, М-A/val и M-SjoII ДНК-дуплексами I и II в зависимости от состава буферного раствора при 37°С в течение 18 часов, %.

Буфер [SAM], M-£coRII M-A/val M-SjoII

мМ дуплекс I дуплекс I дуплекс II дуплекс 1

Melm-буфер о*) _ 0,8 0

rris-буфер 0**) - 5,4 2,3 0

I—) 0,46 2,8 - 0

") буферы: G - 50 и M Tris-40 мМ Melm, рН 9,0, 20 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреит, 0,1 мг/мл альбумин M-Aível)и H -5 мМ Tris-40 мМ Melm, рН 7,6, 50 мМ NaCl, 10 мМ HDTA, 1 м M дитиотреит, 1 мМ 2-(еркаптоэтанол (M-SjoII).

") буферы: I - 50 мМ Tris, рН 9,0, 20 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреит, 0,1 мгУмл альбумин (M-Aíval) и J - 50 [M Tris, рН 7,6,50 мМ NaQ, 10 мМ EDTA, 1 M дитиотреит, 1 мМ 2-меркаптоэтанол (M-SjoII). **) буферы: К - 40 мМ Tris, рН 7,9, 5 M дитиотреит, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ SAM (M-.EcoR.II), L - 50 мМ "ris, рН 9,0, 20 мМ NaQ, 1 ыМ дитиотреит, 0,1 мг/мл альбумин, 1 мМ SAM и M - 50 мМ Tris, рН 7,6, 50 [M NaCl, 10 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 1 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ SAM для M-Mval и M-S.roII оответсгвенно.

1.3. Кинетика коеалентного присоединения ■ На примере аффинной модификации R-£coRII ДНК-дуплексом I (рис. 2) изучали инетику данной реакции.

40

30

20

10

10 15 20 Время, ч

A a j t!

26

зс. 2. Зависимость степени аффинной модификации R-£coRlI дуплексом 1 от времени инкубации в гфере А (1) и зависимость степени гидролиза немодифицнрованного ДНК-дуплекса III от времени )еяшсубации фермент-субстратного комплекса в отсутствие ионов Mg^+, после инициирования акции добавлением кофактора, в буфере D (2), 37°С. Концентрация ДНК-дуплекса I - 1,8-10"7, илегса П1 - 3,5-Ю'7. Концентрация R-£eoRll 8,5-10"7 М.

Коваленгное присоединение эндонуклеазы рестрикции EcoRII к дуплексу I в Ме1т-буфере (рис. 2) так же, как и разрушение монозаыещенной пирофосфатной межнукпеотндной связи ДНК-дуплекса I (данные не приводятся) имеют одинаковое время полуреакшш

(приблизительно 4 часа) и время насыщения (8 часов).

5* ACCTACCTGGTGGT 3'

............................П1

3' TGGATGGACCACCA 5*

Совпадение кинетических параметров ковалентного присоединения белка к дуплексу I и гидролиза активной группировки в ДНК, который активируется в присутствии Melm, позволяет предположить, что именно активация монозамещенной пирофосфатной связи Melm является лимитирующей стадией процесса. В то же время, из рис. 2 видно, что время инактивации R-£coRII при гидролизе дуплекса III с каноническим участком узнавания R-jEсоRII составляет примерно 10 часов, и ковалеетное присоединение происходит только в условиях сохранения активности ферментом.

1.4. Зависимость степени аффинной модификации R-£coRII дуплексом I от кониентраиии

феумента

Была исследована зависимость выхода реакции ковалентного присоединения дуплекса I к R-£coRII от концентрации фермента. Увеличение содержания фермента до определенного количества (до 560 нг для препарата с концентрацией 90 мкг/мл и до 1,25 мкг для препарата с концентрацией 250 мкг/мл) позитивно влияет на ход реакции, поскольку это увеличивает концентрацию фермент-субстратного комплекса (рис. 3).

Количество фермента, мкг

Рве. 3. Зависимость степени аффинной модификации Я'ЕсоЯП дуплексом II от концентрация фермента для двух препаратов белка с ■сходной концентраций - 90 мкгАсл (а) и 250 мктУмл (б), 37°С, 18 часов, буфер А (см. подпись к табл. 2).

При этом не наблюдается максимума эффективности аффинной модификации К-ЕсоШ1 дуплексом I при каком-то определенном сгехиометрическом соотношении ДНК н белка. Однако при количествах белка выше 560 нг для разбавленного и 1,25 мкг для концентрированного препарата начинается ингибирование^ ковалентного присоединения. Этот процесс непосредственно не связан с увеличением содержания белка, так как происходит одинаково для двух препаратов с разной концентрацией, а

коррелирует с содержанием глицерина, присутствующего в препарате фермента. Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что для увеличения выхода аффинной модификации лучше использовать препараты белка с максимальной концентрацией основного вещества и низким содержанием глицерина.

1.5. Изучение специфичности ковалентного присоединения ДНК-дуплексов I и II к ферментам

рестрикции-модификации Для исследования специфичности ковалентного присоединения ДНК-дуплексов I и II использовали два подхода; 1) проверяли возможность ингибировання аффинной модификации ферментов ДНК-дуплексами, не содержащими активированной группировки и обладающими (IV) или не обладающими (V) участком узнавания исследуемых эндонуклеаз рестрикции и ДНК-метилтрансфераз; 2) проверяли возможность ковалентного присоединения белков к активированному ДНК-дуплексу VI, не содержащему участок узнавания ферментов.

5* СССААССТСССТСТ 3' 3' СССГГССАСССАСА У 5" ССГССТСССТССАС 3'

IV

3' ССАССАСССАССТС 5*

С2«5? ? 5' ТСССС-о-р-о-р-о-СТССТТТТ

VI

О О

ТСЛСССЯ?-САССААААТС 5'

Из рис. 4 видно, что ковалентвое присоединение дуплекса I к Л-ЛсоМ! ингибируется избытком субстрата IV. В присутствии дуплекса V не наблюдается тенденции к снижению выхода ковалентного продукта. Ковалентного присоединения к модифицированному ДНК-дуплексу VI не происходит. Полученные данные подтверждают высокую специфичность ковалентного присоединения дуплекса I к К-£со1И1.

3

Огадиндба|4ши

Рис. 4. Зависимость относительной степени аффинной модификации Я-£со!Ш дуплексом 1 от соотношения дуплексов IV или V и дуплекса I. Ср дуплекса I - 1,8-10"' М. Концентрация К.-£соЮ1 -8,5-10"' М. Степень модификации R-.Ec0R.II дуплексом I в отсутствие дуплексов IV и V принята за 100%. Буфер А (см. подпись к табл. 2).

Соотношение ингибитор/реагент

Рис. 5. Зависимость относительной степени аффинной модификации дуплексами I или II от

соотношения дуплексов IV или V и дуплексов I или И. Ср дуплексов 1 и II - 1,8-Ю"? М. Концентрация R•S.к>II - 1,1-Ю"6 М. Степень аффинной модификации дуплексами I или II в отсутствие

дуплексов IV в V принята за 100%. Буфер Е (см. подпись к табл. 2).

7ми-кратный избыток конкурентного субстрата IV полностью ингибирует ковалентное присоединение к дуплексу I, но в присутствии дуплекса V тоже

наблюдается тенденция к снижению выхода ковалентного продукта, хотя и в меньшей степени (рис. 5). Показана возможность ковалентного присоединения к ДНК-

дуплексу VI (10,8 % - степень aффWнoй модификации дуплексом I и 11,3% - дуплексом VI в одном эксперименте). Таким образом, ингибирование "пришивки" субстратом Я-5то11 позволяет считать аффинную модификацию Я-ЛоИ дуплексом I специфичной реакцией, но

ингнбироваяие дуплексом V, а также присоединение к дуплексу VI без участка узнавания фермента показывает, что ДНК-дуплексы, не являющиеся субстратами данного фермента, тем не менее тоже могут связываться с активным центром белка, хотя и с несколько меньшей эффективностью. >

Из рис. 5 видно, что ковалентное присоединение R-5íoII к дуплексу II также ингибируется добавлением субстрата IV, что подтверждает специфическую природу образовавшегося аддукта.

Конкурентное ингибирование ковалентного присоединения R-A/val к дуплексу I добавлением различных количеств дуплекса IV также подтвердило специфический характер этой реакции.

2. Ковалентное присоединение R-£g>RII. R-SjoII. R-Mval и R-jRttNI к

br5dU -содержащему

субстрату под действием УФ-света

ДНК-дуплекс VII, содержащий остаток

br5dU в центре участка узнавания ферментов рестрикции, активируется УФ-светом и присоединяется к ближайшим группам белка, способным акцептировать радикалы. Образование ДНК-белковых конъюгатов говорит о тесном контакте определенного фрагмента белка с модифицированным гетероциклическим основанием, но отсутствие "пришивки" не может быть однозначным доказательством того,

что фермент не образует дискриминационных контактов с данным основанием в ДНК.

5* СС—AGGAGCTCCbr5UGGAATT 3'

............................vn

3' TTAAGGbr^UCCTCGAGG—АСС S1

Для образования специфических комплексов дуплекса VII с ферментами рестрикции белки инкубировали совместно с ДНК-дуплексом VII при 37°С 30 минут в соответствующем буфере, не содержащем ионы

Затем проводили облучение УФ-светом с длиной волны 280-320 нм в течение 20 минут в 100 мкл реакционной смеси. После облучения комплексов из реакционных смесей отбирали аликвоту и анализировали методом электрофореза по Лэмли. Наличие фермента в зоне, соответствующей комплексу

32Р

-меченного субстрата с

эндонуклеазой рестрикции, подтверждали прокрашиванием гелей нитратом серебра. Параллельно аналогичный гель сушили и проводили авторадиографию (рис. 6). Совпадение зоны

32Р

-меченного субстрата в предполагаемом комплексе с зоной белка является доказательством образования ковалентных конъюгатов R-SsoII, R-BstNI и R-Mral с ДНК-дуплексом VII в результате УФ-облучения. При этом в контрольных экспериментах было показано, что не происходит "сшивок" типа ДНК-ДНК и не образуются продукты ковалентного присоединения ДНК к компонентам раствора; ДНК, не содержащая остатка br^dU,

не присоединяется к изучаемым белкам, отсутствие зон, соответствующих ДНК-белковым конъюгатам, в случае, если не проводилось облучения фермент-субстратных комплексов, является дополнительным доказательством ковалентной связи в конъюгатах.

1 2 3 4

Рис. 6. Радиоавтограф гель-элепрофореза (8%-ный ПААГ, метод Лэмли) продуктов ковалентного присоединения под действием УФчзета R-SjoI1'(2), R-firrNI (3) в буфере Е и R-Aíval в буфере F (4) (см. подпись к табл. 2) к субстрату VII; 1-исходный дуплекс VII. Время облучения-20 мин, 20°С.

Были получены ковалентные комплексы R-SjoII, R-Mval и R-fivrNI с 18-звенным конкатемерным дуплексом VII с выходами 6,05%, 0,80%, 0,89% соответственно. 3. Приложение метода ковалентного присоединения éepMeHTQB-рестрикции-модификации второго типа к активированным ДНК для зондирования механизма их взаимодействия с

субстратами.

На основании результатов аффинной модификации R-iicoRH ДНК-дуплексами I и II мы предполагаем, что в составе фермент-субстратного комплекса в отсутствие ионов R-EcoRII не экранирует углеводофосфатный остов молекулы ДНК в центре участка узнавания от окружающей среды. В присутствии Mg2+ молекулы субстрата оказываются полностью закрытыми от внешней среды белком в районе участка узнавания. Исходя из этого предполагается, что в составе фермент-субстратного комплекса ионы Mg-+ участвуют в сборке каталитически активного комплекса и координации молекул в нем. При этом изменяется аминокислотное окружение молекулы субстрата.

Ингибирование реакции присоединения R-SjoII к дуплексу I субстратом IV доказывает, что ковалентная связь образуется в каталитической полости фермента. ДНК-дуплекс V, не являющийся субстратом R-SíoII, также способен ингибировать ее ковалентное присоединение к дуплексу I, но в большей концентрации. Соотношение ингибитор/реагент при полуингибировании ковалентного присоединения (Rj/2) равно для субстрата IV ~2,2, а для дуплекса V -5,7. Мы предполагаем, что взаимодействие R-SjoII и с субстратом, и с ДНК, не содержащей участка узнавания фермента происходит в одном и том же домене.белка и даже без существенного изменения пространственной структуры белка, по крайней мере в

\k

отсутствие ионов Mg2+, что доказывает ковалентное присоединение к дуплексу VI. При этом R-SíoII имеет все же большее сродство к субстратам, хотя и соотношение Кассспеа/КасснеспеЦ имеет невысокое значение и, вероятно, близко по значению к (К,/2>ду1шекс У/(К1/2)цуплекс IV. Возможной причиной сла^о выраженной дискриминации ДНК, содержащих и не содержащих участок узнавания, R-ЛоН является то, что как предполагается Кубаревой и соавт (1992), гидролиз ДНК ферментом происходит, когда ДНК находится в 'открытой форме". Вероятно, узнавание субстратов R-SioII осуществляется при локальном разворачивании спирали. Поскольку неспецифичное связывание R-SíoII ДНК оыло определено в отсутствие а в присутствии кофактора фермент гидролизует

субстраты с высокой специфичностью, можно предположить, что Mg~+ необходим для образования "открытой" формы ДНК и узнавания субстрата.

Необходимость присутствия ионов

Mg2+ в низкой концентрации для ковалентного присоединения R-A/val к дуплексу I, вероятно, свидетельствует о следующих особенностях взаимодействия этого фермента с ДНК

1) В отсутствие ионов Mg2+ не оказывается ни одного аминокислотного остатка нуклеофильной природы, сближенного с гидролизуемой связью (модифицированной в дуплексе I).

2) Введение ионов Mg2"*" в фермент-субстратный комплекс приводит к такой конформационной перестройке белка, в результате которой нуклеофильная группа белка подходит к расщепляемому узлу; это демонстрируется увеличением степени аффинной модификации R-A/val дуплексом I в данных условиях.

3) Однако концентрация ионов

равная как нами было показано,

оказывается недостаточной для эффективного гидролиза субстрата, несмотря на то, что при помощи ковалентного присоединения мы доказали включение кофактора в комплекс. Следовательно, для полного каталитического акта необходимо присутствие более, чем одного иона

4) При дальнейшем увеличении количества ионов Mg2+ достраивается каталитически активный комплекс и гндролизуется субстрат R-A/val. Снижение выхода конъюгата эндонуклеазы R-A/val с дуплексом I при концентрации равной или превышающей 1,5-10"'* М, может объясняться диссоциацией ДНК-белкового комплекса в результате гидролиза этого субстрата.

Отсутствие влияния ионов Mg2+ на выход продукта ковалентного присоединения R-A/val к дуплексу II, содержащему активную группу на границе между участком узнавания

и фланкирующей последовательностью, показывает, что конформационная перестройка

белка имеет локальный характер и происходит только в районе пшролизуемой связи. За

образование ковапентного адцукта К-Л/у£г1 с . дуплексом II, вероятно, ответственна

аминокислота, образующая контакты с фосфатой группой.

Исходя из полученных данных можно предложить следующую схему ферментативной

реакции и параллельно идущего процесса ковалентного присоединения: А В С

Ц кз 1<5 кд

Е + Б—[Ед + Мд2*— [ЕЗ- Мд2*] + Мд2^-[Е&(Мд2*)2] — Е + Р к2 к4

[Е-Б]

а. Схема 2

где - ковалентно-связанный комплекс К-Муа1 и дуплекса I, Е- фермент, 5 -

обобщенный субстрат или дуплекс I в случае ковалентного присоединения.

На основании схемы 2 была рассчитана зависимость степени аффинной модификации

фермента, как функция от концентрации которая имеет вид

__

где q - коэффициент эффективности образования конъюгата, отражающий особенности аминокислотного окружения активированной группы ДНК (1, т, п, р - суммы произведений кинетических констант).

Обнаруженное нами сходство в количестве ионов необходимом для

функционирования эндонуклеаз рестрикции МуА и ЕсоИV (Випонд и соавт., 1994) позволяет предположить сходство в структуре активных центров белков, координирующих ионы кофактора.

4. Разработка методов выделения пептидов, ковалентко связанных с о ли го н укл еоп там и

Для выделения олигонуклеотидопептидов - продуктов трипсинолиза конъюгатов к-ЯсоЯП и К-5го11 с олигонуклеотидом ТСЮТСЮТ - были опробованы описанные в литературе методы НРЬС и ИРЬС, которые не привели к полной очистке целевого вещества от продуктов автопротеолиза трипсина. Был разработан новый подход к очистке олигонуклеотидопептидов о^ белкового материала. Его основой является использование большого отрицательного заряда, который появляется у пептидов при присоединении олигонуклеотидного компонента. Это приводит к их более высокой электрофоретической

подвижности в концентрированных полнакриламидных гелях (20%) с 7М мочевиной по

сравнению с ^модифицированными пептидами (рис. 7). Отсутствие белковых зон, не

содержащих ^^Р-метту, доказывает, что пептиды, ковалентно не связанные с

олигонуклеотидом ТСЮТСЮТ, отделились от целевых соединений при электрофорезе. В

результате электрофоретического разделения были обнаружены 2 основные зоны,

содержащие пептидный и олигонуклеотидный материал.

ж) 6)

12 12

0ЛНГ0ЯуКЛЕ07НЛ0П«7ТНД

олигонутасотндопептнд

олкгонуклсотид

«щ «й-а

сангонуклеотидопептад сангонухлеотндопеттнд

олнгонуклеоткя

Рис. 7. Анализ продуктов протеолиза конъюгата Я-ЛоП с олигонуклеотидом ТООТООТ электрофорезом в 20%-ном ПААГ; а) радиоавтограф гели: б) гель, прокрашенный нитратом серебра. 1 -контрольная смесь, содержащая дуплекс I и трипсин; 2 - реакционна* смесь после протеолиза. Все смеси инкубировали в 200 мш буфера для протеолиза при 37°С в течение 5 часов.

0,039

о ю :о зо

В}«М1ф*р«а, ми

Рис. 8. Анализ чистоты пептидного материала продуктов трипсинолиза конъюгата К.-£»о11 с олигонуклеотидом после выделения электрофорезом в 20%-ном ПААГ и доочистки при помощи НРЬС методом капиллярного элегтрофореза в 20 мМ цнтратном буфере.

После выделения триптических фрагментов конъюгата с олигонуклеотидом

потребовалась их дополнительная двойная очистка при помощи НРЬС, которая проводилась Барзтовой Л .А. и Вирясовьш М.Б. В результате были получены четыре основные хроматографические фракции, две из которых не содержали пептидного материала, и две содержали пептиды, как было установлено методом капиллярного элегтрофореза в

Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина И.В. Назимовым (рис. 8). Оказалось, что обе пептидные фракции содержат вещества с идентичным соотношением заряда к массе. Это позволяет предположить идентичность пептидов в первой и второй зонах первичного элекгрофоретического разделения (рис. 7). Различие в подвижности в этом случае, вероятно, объясняется частичным разрушением "пришитого" олигонуклеотида или влиянием конформационных особенностей олигонуклеотидопептида на элекгрофоретическую подвижность. Анализ методом капиллярного электрофореза подтвердил высокую чистоту препаратов. Остальные хроматографические фракции, по-видимому, относятся к низкомолекулярным загрязнениям, возникающим в процессе выделения веществ из геля и их обработки. Таким образом, предложенный подход для отделения пептида R-SíoII, ковалентно связанного с олигонуклеотидом, приводит к получению высокочистого препарата интересующего нас пептида.

ВЫВОДЫ

1. Сконструированы реагенты для ковалентного присоединения к ферментам рестрикции-модификации firoRII, BííNI, A/val и 5joII: получены олигонуклеотидные дуплексы с монозамещенной пирофосфатной межнуклеотидной связью в участке узнавания ферментов и ДНК-дуплекс конкатемерного типа, содержащий два участка узнавания этих ферментов, в каждом из которых остаток dT заменен на br5dU.

2. Показано, что введение монозамещенной пирофосфатной межнуклеотидной связи в центр участка узнавания не препятствует образованию комплексов в отсутствие Mg2+ с ферментами рестрикции EcoRII, SioII, Mval и &íNI. Эндонуклеазы рестрикции SjoII и Kíval расщепляют ДНК-дуплексы с монозамещенной пирофосфатной связью, по крайней мере по немодифицированной цепи, a £coRII расщепляет дуплекс с монозамещенной пирофосфатной связью в центре участка узнавания по модифицированной цепи с изменением "специфичности" разрезания. Дуплекс, содержащий остаток гидролизуется эндонуклеазой рестрикции R-BííNI с высокой эффективностью.

3. Проведена аффинная модификация ферментов R-£coRII, R-&rNI, R-SíoII, R-A/val, M-£coRII и M-A/val ДНК-дуплексом с монозамещенной пирофосфатной межнуклеотидной связью, оптимизированы условия реакции (время инкубации, нуклеофильность буфера, концентрация кофактора, положение монозамещенной пирофосфатной межнуклеотидной связи). Получены специфические конъюгаты R-SjoII, R-firrNI и R-A/vel с ДНК-дуплексами, содержащими

br^dU.

4. На основе зависимости степени аффинной модификации эндонуклеаз рестрикции дуплексами с монозампленной пирофосфатной связью в участке узнавания от концентрации Mg2+ показана роль кофактора в конформапионной динамике фермент-субстратных комплексов. у

а) Показано снижение степени аффинной модификации R-jEcoRII дуплексом с монозамещенной пирофосфатной межнуклеотидной связью в центре участка узнавания при увеличении концентрации Mg2+. Предполагается информационная перестройка комплекса R-EcoRII с субстратом при добавлении ионов

б) Зависимость выхода ковалентного присоединения R-A/val к ДНК-дуплексу с монозамещенной пирофосфатной связью от концентрации ионов Mg2+ имеет максимум при 3,75-10"3 М. Предполагается конформационная перестройка фермент-субстратного комплекса при включении двух ионов Mg-+ в каталитический комплекс R-A/val с субстратом.

в) В отсутствие Mg2+ R-5ioII ковалентно присоединяется как к дуплексу с монозамещенной пирофосфатной связью, содержащему участок узнавания фермента, так н к активированному дуплексу без участка узнавания, т.е. специфическое узнавание субстрата происходит в присутствии кофактора на стадии катализа.

5. Предложена оптимальная схема выделения олигонуклеотидопептида - продукта фрагментирования белково-нуклеинэвого конъюгата трипсином.

Основное содержание диссертации отражен* в следующих публикациях:

1. E.S. Gromova, G.Ya. Sheflyan, O.V Petrauskene, E-A. Kubareva, Z.A. Shabarova - The use of synthetic substrates for study of restriction endonucleases - new developments. - New England Biolabs Workshop "Restriction Endonucleases and Methyltransferases Structures and Mechanisms", Vermont (USA), July 3-S, 1993 p.71.

2. E.A Kubareva. G.Ya. Sheflyan, M.G. Brevnov, A.S. Karyagina. E.S. Gromova - Interaction of

and £coRII restriction endonucleases with syntheac DNA duplexes containing structural anomalies into the recognition sequence. Change of endonucleases cleavage specificity. - New England Biolabs Workshop "Restriction Endonucleases and Methyltransferases Structures and Mechanisms", Vermont (USA*, July 3-8, 1993 p.80.

3. Г-Я. Шефлян, B.H. Ташлипгнй, E.A. Kyfiaptsa - Взаимодействие эндонуклеазы рестрикции Mval с синтетическими ДНК-дуплексами: температурный оптимум и энергия активации ферментативной реакции, эффективные константы скорости и энергия активации процесса термоинахтивацин фермента. - Вестник МГУ. Серия 2. Химия, 1993, 34(5), 516-520.

4. ГЛ. Шефлян, Е.А. Кубарева, Е.С. Громова, З.А. Шабарова - Исследование гидролиза ДНК-дуплексов, содержащих 5-фтордезоксицитидин, эндонуклеазами рестрикции". 'Биохимия, 1993, 58(11), 180S-1811.

5. З.А. Шабарова, ГЛ. Шефлян, С.А. Кузнецова, Е.А. Кубарева, О.Н. Сысоев, М.Г. Ивановская, Е.С. Громова - Аффинная модификация эндонуклеазы рестрикции ДНК-дуплексом, содержащим монозамещенную пирофосфатную межнуклеотидную связь. -Биоорганическая химия, 1994, 20 (4), 413-419.

6. A.C. Карягина. Е.А Кубарева, ИЛ. Левченко, К.Н. Дегтяренко, В.Г. Лунин, ГЛ. Шефлян, С.А. Кузнецова, Е.А. Романова, Е.М. Волков, Т.С. Орецкая, З.А. Шабарова, И.И. Никольская, Е.С. Громова - Инженерия ферментов системы рестрикции-модификации SsoII из штамма Shigella sonnei 47. - Тезисы докладов I Всероссийской планово-отчетной конференции по направлению "Белковая инженерия" Государственной научно-технической программы России "Новейшие методы биоинженерии", Москва, 1994, с. 71.

7. G.Ya. Sheflyan, Е.А. Kubareva, Е.М. Volkov, T.S. Oretskaya, E.S. Gromova, Z.A. Shabarova -Chemical cross-linking of DNA duplexes with monosubstituted pyrophosphate group to restriction endonucleases Mval and EcoRII. - New England Biolabs Workshop on Biological DNA Modification, Vilnius (Lithuania), May 22-28, 1994, p. 98.

8. G.Ya. Sheflyan, E.A. Kubareva, E.M. Volkov, T.S. Oretskaya, E.S. Gromova, Z.A. Shabarova -Chemical cross-linking of Mval and EcoRII enzymes to DNA duplexes containing monosubstituted pyrophosphate internucleotide bond. - Gene, 1995, in press.