Анализ структурной организации кальмодулинактивируемой Ca2+, Mg3+ - АТФазы эритроцитов человека с помощью моноклональных антител тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ МИ 1Ш.М.М. ШИШКИНА

на правах рукописи

ФЕЩЕНКО Марина Станиславовна

АНАЛИЗ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ 1СДЛЫгЮДУЛ1Я1ЛЗГ11Б:ЕРУЕ?.Ю11 Сз^.Мс^-АТФазы ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ НОНОКЛОНАЛЫШ АНТИТЕЛ •

специальность 02,00.10 - Биоорганическая екня, химия природных соединений ц физиологически актантах Ееществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата нплгсеских наук

Москва, 1991

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте биооргаиической химии им- М. М. Шемякина АН СССР

.Научный руководитель - доктор химических наук Н.Н.Модянов Официальные оппоненты: доктор химических наук Н.Г.Абдулзев;

Ведущая организация: Всесоюзный кардиологический научный центр

на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР

кандидат химических наук Г.А,Габибов.

АШ СССР

Защита состоится " " 1991 г. в часов

автореферат разослан ¿¿с?с ¿Жл 1991 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат химических наук

В.А.Несмеянов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование транспортах систем, с помощью которых потенциалобразукцке ионы преодолевает нембранние барьеры клетки, обеспечивая ее ионный гсиеостаз. является актуальной проблемой совреиежой физико-химической биологии. С точки зрения жизнеобеспечения клетки важное значение ткет транспорт конов универсальны* регуляторов внутрнклстз^гпсс процессов. 3 основе регуяяторкого действия леяит сбалансированное изменение концентрации катиона в клетке, .являющееся результатом фушсциони-рованкя слокной сети кекбрэштх Са ' -транспортнрувзщх систем. Одна из таких систем - Са^+-АТФаза плазматических иекбран, найдена практически во всех клетка; зукаркот. Используя энергии гидролиза АТФ," этот фермент осуществляет транскеыбранны» перенос иоков Са2+ иротав более чек тысячекратного, градиента их концентрации. Работа

о

Са -насоса находится под контролем болывго числа природных регуляторов: кальиодулина, !скслых фосфолигадев, цАМФ-зашюиыой протеинкиназц, протеинкиназн с, калытаина и других.

К настоящему времени накоплена значительная информация о строении к функции Са^+-АТФазы плазматических мембран: определена полная аминокислотная последовательность белковой цепи, локализованы основные функциональные к рагуляторные области фериента. Дальнейшее развитие предстаагапгй о принципах функционирования и регуляции Са^+-насоса на юлекулярном уровне не возможно без детального анализа пространственной организации фермента. Однако трудности технического характера в настоящее гремя не позволяют- исследоьать трехмернур структуру молекулы АТФази путей рэнтгекоструктурного анализа. Применение таких

традиционных методов как гидрофобное мечение и ограниченный протеолиз в составе нативного липопротеинового комплекса затруднено из-за незначительного содержания белка в мембране. В связи с этим представляется перспективным иммунохимический подход к изучение топографии Са^+~АТФазы в мембране, в частности, использование метоклональных антител, являюцихся селективным»: .зондами на конкретные участки фермента. С помощью моноклональных антител - также каазт быть получена информация о локализации функциональных доменов белка и его полиморфизма.

Цель ргбога, Настоящая работа является частая проводимых в

Институте биоорганической зишни струэтурно-функцкональкьк

исследований Са -АТФаза эритроцитов человека. Цель работа

заключалась в создании представительной коллеюцш моноклональных р. ■

антител к Са -АТФазе и исследовании с юс поиощьв структурно-функцконалк-шк свойств фермента, в первуп очередь его пространственной организации в плазматической неибране.

Научная новизна и практическая ценность работа, Получена коллекция гибридом, продуцирующих моноклоналыше антитела к Са^-АТФазз эритроцитов человека. Проведена ■ характеристика этих антител: определены константы аффинности, класс и подкласс полученных антител. Определена ориентация эпитопов - мииеней антител, относительно плаз1атической мембраны.

Разработан подход к локализации антигенных детерминант белка, стимулировавших образование моноклональных антител. С помощьв этого подхода впервые идентифицирован экстрацеллвлярный фрагмент 130-142 полипептидной цепи, что позволило предлоапъ

экспериментально обоснованнуг модель трансмембранной организации н-концевой области молекулы созданной коллекции

выявлены коноклональные антитела к. по-крайней мере, двум различным изофоршм Са^+-АТФазы. Это могет стать основой метода разделения изотерм фермента с целью изучения их функциональных особенностей, а такте распределения изоформ в различных органах и тканях илекопитавцих.

Объем работа.. Диссертация содеркгг страниц мгшнописного

текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, вызодов и списка цитируемой литературы С ссылок).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Получение донокдожишьа; атхипел к Со?+-££Фазе зращюцшоб человека и их яаратерислпша.

Выделение фермента проводили в две стадии: получение фракции плазматических мембран эритроцитов С теней) и очистка Са2+-АТФазы с помощь» аффинной хроматографии. На первой стадии выход мембранных белков из одного литра зритроцитарной кассы составлял обычно 3-4 г. На стадии аффинной хроматографии получали 0,5-0,7 кг Са<2+-АТФазы т I г мембранных белков. Освоение и оптимизация процесса. выделения фермента явилось отправной точкой структурно-функциональных исследований Са2+-АТФази.

С целыз создания наиболее представительной коллекции

ыоноклональных антител СмкАТ) к Са^+-АТФазе эритроцитов человека при иммунизации копользовали четыре различных препарата антигена: С а) - нитроцеллюлозные реплики белковой полосы 138 кДа, полученные путем электропереноса кз полиакриламидного геля; (в) - нативный солюбилизированжй фермент; С с) - денатурированную Са^+-АТФазу в растворе; (о) - кальмодулин-связываюший фрагмент 53 кДа, полученный путей ограниченного гидролиза ке;.сбрано-сзязанной Са2+ -АТФазы трипсином с последующей хроматографией на кальнодулин-сефарсзе. Для препаратов А и в использовали 36-дневную схему иммунизации. В случае нативного фермента в к денатурированной Са^+-АТФазы в растворе с наиболее эффективной оказалась двухнедельная схеаа иммунизации.

Гибридизацию спленоцитов иммунных мышей с миеломной линией Хб3-Ад8.б53. проводили по методу Келера и. Цильштейна в модификации Фазекаса.

Для обнаружения положительных клонов, тс есть синтезирующих антитела к Са~+-АТФазе, использовали иммуноферментный анализ (ИФА). В результате было отобрано 16 устойчивых гибридных ¡слонов. Они были дважды клонированы методом лимитирующих разведений и от каждого первичного клона в конечном итоге было взято в дальнейшую работу по одному наиболее активному (табл.1). Класс я подкласс моноклональных шггител определяли итгуно^ерментньаг методом, используя коммерческие моноспеци^ические антисыворотки (табл.I).. Гибридизация а, проведенная после иммунизации животного антигеном, иммобилизованным на нитроцеллюлозе, дала антитела только класса 1дм. Все антитела, полученные после гибридизаций в, с и X), принадлежат к иммуноглобулинам класса с.

Степень сродства ыкАТ к нативной и денатурированной Са -

АТФазе определяли методом ИФА. Антитела, отобранные в результате гибридизаций А и. с, обнаруживали более высокое сродство к денатурированной Лорке фермента. Антитела, получению после гибридизации з, одинаково связывались с нативной и денатурированной АТФазой. Антитела к фрагменту 53 кДа (гибридизация с) взаимодействовали только с иативным ферментом. Аффинность мококлональншс антител определяли по методу Бзати. Расчктанные Каф приведены в табл. I. Наиболее высокоаффишше аниггела были получены в случае тшункзацш; антигеном, ншлобг-тизоваиньи: на китроцеллклсзе, что. вероятно, объясняется ад'ьпвантквкиьш свойствами носителя.

Для доказательства специфичности мокожональнкх антител изучали их взаимодействие с суммарной фракцией белков зритроци-тарной мембраны. На рис. I представлены результаты ккмуноблоттинга препаратов •«енбрашшх белков зртггроцитов человека и очищенной Са~+-АТФазы с использованием антитела 208. В обоих препаратах антитело 2В8 выявляет осковнуп белковуи полосу около 140 кДа, что соответствует молекулярной массе фермента. Аналогичная картина была получена и при ккмунодетекции фермента с помошьв других антител из нашей коллекции, игаагочая антитела к фрагменту 53 кДя.

Последние, как отмечалось р.ше, не взаимодействовали с р.

денатурированной Са -АТФазой. Высокая специфичность консгло-нальнык антител была подтверждена также в ходе экспериментов по выявлении перекрестного взаимодействия антител с Нг+,к+-АТФазой почек свиньи и н+-АТФазой митохондрий сердца быка в кнмуно-ферментном анализе. Лиеь одно антитело С 2п10) взаимодействовало с

На+,к+-АТФазой, но с более низким сродством, чем с Сас,+-насосок

7 7 -Т

С!'аф = 1.25*10 н 8,10*10 , И . соответственно ). С протонной

АТФазой антитела не связывались. Полученные данные свидетельствует

Таблица I. Характеристика моноклональных антител.

СП

ПРОТОКОЛ ИММУНИЗАЦИИ мнАТ Класс и подкласс АТ Каф, М"1 Взз1М0действие Сохранение эпитопов после исчерпывающего гидролиза Картирсеа-ние эпито -пов мнАТна

с цитатными эритроцитами с инвертированными везикулгми

тригю+юм химо-трипсином триттмес-ких фраг-ментах.нДа

А. Фермент иммобилизованный на нитроцеллюлозе (36 дней) 1Е4 608 102 ЗС6 1дМ 1оМ 1дМ 2.60-Ю9 1,31 • 109 3,1 -ю9 8,33-10° <• • ♦ ♦ 35-33,5 35-33,5 35-33,5

В. Нативная АТФаза 114 дней) 5Е6 208 2й10 1д01 1дб1 1д®1 6,71 • 10? 5,13-107 8,10 • 107 - <■ - 90-48 90-33,5 90-48

С. Денатурированная АТФаза ПА дней) 7С8 704" 8В8 6В6 8Е2 2С7 5Рб 1961 1д<И 1дб1 № 3,20-198 1,80 • Ю7 3,80 • 10б 1,25 • Ю7 7,7о • !07 6,19 - Ю7 549- 107 / - * + + - + -V 90-48 90-48 90-48 90-48 35-33,5 90-48 90-48

Д. Фрагмент 53 кДа (36 дней) Р5 09 !дСч Г, 90-106 4 65- 106 не исследовалось не исследовалось -

Рис.I. Взаимодействие моноклонального антитела 208 с препаратом зретрощтгарннх мембран и очищенной Са^+-АТРазой. с- белки-маркеры • молекулярной массы, 1,3-. препарат белков эритроцитарной мембраны, окрашенный соответственно амидо черным и при помощи антитела 208, 2,4- очищенный фермент, окрашенный соответственно, амидо черным и при помощи антитела 208

в пользу того, что ашттопы всех коноклональных антител, за исключением одного, принадлежат участкам структуры, характерным для Сас+-АТФазы.

ГЬсле определения основных характеристик ыкАТ представлялось целесообразным выяснить возможность их использования для идентификации Са2+-насоса в различных тканях млекопитающих, что является большой проблемой из-за незначительного содеркания

фермента в мембране. Эксперимент проводили ка зрительных клетках, р>+

где ранее Са" -АТФаза не бала идентифицирована. Антитело 2Д8,

наиболее интенсивно выявлявшее Са^+-АТФазу в суммарной фракции белков мембран эритроцитов, использовали для иммунотестирования препаратов плазматической мембраны и мембран дисков наружных сегментов палочек сетчатки быка. С белками мембран дисков антитела на взаимодействовала. В препарате плазматической мамбраны антитела выявляли только две белковые полосы М. и. 140 и 124 кДа. представляющих собой соответственно интактный фермент .и продукт его протеолнтичесхой деградации. Таким образом, Са^+-АТФаза впервые была иденп-йицировака в зрительных клетках млекопитающих.

2. Влияние лоноклаюхъшс антител на функциональные свойства ферлеюпа.

Моноклоналышэ антитела также когут быть использованы для изучения функциональных свойств ферыента, взаимного расположения к взаимодействия его функционально-важных участков. С цель» выявле-кия антител, влияхада на активность Са^-насоса, проводили измерения базальной и кальмодулин-зависииой АТФ-гадролазной активности Са -АТФазы на очищенном солюбилизированнои препарате фермента после предварительной инкубации со специфическими антителаыи и нормальными иммуноглобулинами мыши (последние использовались в качестве контроля). Было показано, что в результате взаимодействия с антителом Е5, полученным против кальмодулин-связывающего фрагмента 53 кДа, происходит уменьшение чувствительности Са -АТФазы к активирующему действию кальмодулина. Это антитело использовали для сравнительного кммунохиыического исследования ряда других кальмодулин-зависимых белков: протеинкинады ii, киназы фосфорилазы и фосфодиэстеразы. Антитело г 5 обнаружило кросс-реактивность по

отношению ко всем исследованным ферментам, что свидетельствует о существовании сходных участков структуры в регутшторных областях этих белков. При этом ингибиторный эффект антител проявляется только в процессе взаимодействия с Са~+-АТФазса и гтротеинкиназой xi. Результаты эксперимента приводятся в табл. 2. Однако, несмотря ка эти интересные данные, не представлялось возможным локализовать эпитоп - шшень моноклонального антитела Р5, вследствие о'гсутствкя связывания антитела с денатурированной Са^+-АТФазой. Очевидно, что - з гштоп - мишень данного антитела является конфоркационным.

Таблица 2. Влияние моноклонального антитела Г5 на калькодулкн-зависикые ферменты.

Фермент

Актгзностъ С ерш)

Базальная

F5

4- F5

В присутствии кальмодулина

- F5

+ F5

Са2+-АТФаза протеинкиназа ii фосфодиэстераза киназа фосфзрилззьг

8400 2800 1800 4850

9100 2750 1820 5100

56230 10050

48S00 3210

3I8I0 27100

15330 12750

ЬЬноклональное антитело- 7са, полученное после иммунизации денатурированным ферментом в растворе (протокол с), вызывало увеличение базального и кальмодуяин-зависнмого компонентов активности фермента соответственно в 2,5 и 1,3 раза. После точной

локализации эпитета, распознаваемого антителом 7С8 возможно его использование в функциональных исследованиях Са^+-АТФазы. Остальные антитела не оказывали влияния на АТФ-гидролаз ную активность фермента.

3. Анализ распределения эпьтопов в полипептвной цепи белка.

Картирование зпитопов в полипептидной цепи белка проводили на

Oj.

продуктах ограниченного гидролиза Са -АТФазы трипсином. Выбор триптического расщепления для решения поставленной задачи объясняется тем, что ранее была изучена кинетика образования триптических фрагментов и определены их N-и С-концевые координаты. Ограниченный протею лиз Са^+-АТФазы трипсином приводит к образование целого ряда высокомолекулярных фрагментов- 00, 85, 81, 76, 48 кДа к более низкомолекулярных- 35 и. 33,5 кДа. Высокомолекулярные фрагменты фермента образуются в результате последовательной деградации полипептида 90 кДа, расположенного в границах 3I5-II6I. Фрагменты 35 и 33,5 кДа, происходящие из N-концевой области молекулы не имеют участков перекрывания с полипептидом 90 кДа. В эксперименте по картированию элитопов были подобраны условия получения гидролизата, содержащего возмогло более полный набор фрагментов .АТФазы, затем проводилось электрофоретическое разделение полипептидов в полиакрилакиднем геле с последующим переносом на нитроцеллюлоз ную бумагу. Нитроцеллюлозние реплики, содержащие набор фрагментов фермента, инкубировали с различными моноклональными антителами. Такое картирование позволило выделить три группы антител: I. Антитела, связывающиеся с высокомолекулярными фрагментами

ю

от 90 до 48 кДа.

II. Антитела, взаимодействующие с фрагментам 35 и 33,5 кДа. (к этой группе относится ионоклональное антитело 1Е4, участок связывания которого, как было показано, ориентирован в межклеточное пространство.)

III. Антитело 2D8, связывающееся как с полипептидами 35 и 33,5 кДа, так и с высокомолекулярными фрагментами.

Даннис по картированию эпитопов приведены в табл.1.

4. Изучение яранслелбранной организации СО2 -ЛФазы.

Определение полной аминокислотной последовательности •

ЛТФазы эритроцитов человека открыло путь к исследованию транс-иембранной организации этого фермента. На основе, расчетов профиля гидрсфсбносги белка было предложено несколько гипотетических моделей укладки полипептидной «епи молекулы Сз2+-АТФазьг в мембране, отличавшихся количествам и расположением трансмембранных тяхей В этой связи особое значение приобретает экспериментальные данные топографических исследований фермента. Одеты из инструментов такого рода исследований могут служить моноклинальные антитела.

4.1 Определение ориентации эпитопов Са^*-АТФазы относительно плазматической мембраны.

На начальном этапе топогра&гческих кссагздованиД необходимо бьшо выяснить с какими участками гягегрального белка-внеклеточными, цитоплазыатическими или внутримембранными-связавается каждое конкретное антитело. С этой цель» изучали взаимодействие нококлональных антител с интактныш эритроцитами

человека и инвертированными эритроцитарными везикулами. Образование иммунных комплексов детектировали с помощью радиоактивно меченных 1251 вторичных антител. 9 из 14 антител связывались с инвертированными везикулами и лишь одно антитело IE4 взаимодействовало с интактными эритроцитам! (табл.1,). Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что эпитоп, распознаваемый антителом IE4, расположен на внешней поверхности клетки, а участки связывания девяти других антител ориентированы в цитоплазму. Вопрос о локализации эпитопов - мишеней четырех ккАТ, не связывавшихся в эксперименте ни с интактными эритроцитами, ни с вывернутыми везикулами, остается открытым. Отсутствие взаимодействия может объясняться, с одной стороны, экранированием эпитопов близлежащими белками или фрагментами самой Са^+-АТ$азы, с другой стороны, тем, что эпитопы находятся во внутримекбранных сегментах полипептидной цепи белка.

4.2. Локализация эпотопа в наружной облаете молекулы фермента.

Поскольку было показано, что в созданной коллекции моноклональных антител имеется единственное антитело (1Е4), взаимодействующее с Са -АТФазой с внешней стороны клетки, то представлялось целесообразным как можно более точно локализовать эпитоп - мишень данного антитела, и тем самым получить первые экспериментальные данные о структуре внеклеточной -области молекулы фермента.

Прежде всего взаимодействие антитела 1Е4 с интактными эритроцитами было изучено более подробно. В качестве отрицательного контроля использовали 1дм мыши С sigma) и

я

моноклональное антитело 1G2 С . характеристика данного антитела

приводится в табл. I). Эритроцитарную суспензию инкубировали с

различными концентрациями антител.- Связывание антител с клетками

1

детектировали с помощью х меченых иммуноглобулинов овцы против

igM мыши. Полученный результат представлен на рис.2. В случае

антитела 1Е4 была получена типичная кривая насыщения, тогда как

для антитела 1G2 наблюдалось лишь незначительное увеличение

связывания при повышении его концентрации. Эти данные

свидетельствуют о специфичности взаимодействия антитела 1Е4 с

интактными эритроцитами. Для ~с;;азатеиъства того, что контрольное

антитело 1G2 способно связываться со своим эгаггопом так ss

эффективно как антитело lEi, был проведен эксперимент аналогичный

вышеописанному, но на эритроцитарных мембранах. Как показано на

Р+

рис. 3, взаимодействие обоих антител с Са -АТФазой в данном случае иог.ет быть описано кривыми насыщения.

В экспериментах по картированию элитопов на фрагментах ограниченного гидролиза Са2+-АТФазы трипсином было показано, что антитело 1Е4 взаимодействует только с полипептидами 35 и 33,5 кДа. Ранее было установлено, что N-концевой аминокислотой фрагмента является GjLu ¡19), а с-конец, вероятнее всего, имеет координату -312. Такта образом с самого начала область локализации эпитопа -мишени 1Е4 могла бить ограничена координатами 19 - 312.

Для более тонкой локализации эпитопа проводили исчерпывающий гидролиз очищенной Са2+-АТФазы стафилококковой протеазой V8, йодозобензойной кислотой и химотрипсином. Так как после каждого расщепления ожидалось получение мелких полипептидов, то смесь фрагментов разделяли электрофоретически в Tricine-SDS-системе и переносили методом электроблоттинга либо на нитроцеллюлозные фильтры (для иммунотестирования), либо на pvDF-мембраны (для

в

а. и

30000

20000-

10000

; [1дМ], рд/т!

Рис. 2. Взаимодействие коноклональных антител с интактнши эритроцитами.

Е а

40000

50000-

20000

100С0"

1ЕД Ю2

I I

0 20 40 60 80 100 120

Рис.3. Взаимодействие моноклональных антител с тенями эритроцитов.

структурного анализа). В случае протеазы чъ ни один из фрагментов, перенесенных на нитроцеллюлозу, не взаимодействовал с антитело«. Обработка АТФазы йодозобензойной кислотой дала только один фрагмент С У. и. 16 кДа), взаимодействующий с антителом 1Е-5, н-концевув последовательность этого фрагмента после электроблот-тинга на РУОР-иембрану определить не удалось, вероятнее всего по

ч

причине того, что л-конец фрагмента блокирован. Химотрюттическзй гидролизат содержал несколько фрагментов, выявлявшихся при иммуно-тестировакии с помотъя гигоггела 1е4. Два низкоиолекулярных фрагмента (М.м. 13,5 и 8,8 кДа) были подвергнуты деградации по Эдману после переноса на рупг-кембрану. Их Ы-концевые последовательности совпадали и соответствовали участку Иу (81) -ьуз (89) -ьрмса 4 изоформы Са^+-эритроцитов человека.

Дальнейшее уточнение эпитспа, распознаваемого антителом 1Е4, проводили с помощью синтетических пептидов. Так как эгоггоп был локализован в пределах фрагмента 8,8 кДа, синтезировали следующие три пептида, моделирующие предсказанные внемембранные участки молекулы Са2+-АТФазы: I) в1у(31)-с1и<99), 2) А1а(136)-С1и<152!, 3) рье(121)~С1и(152). Последовательности пептидов соответствуют ьрмса 4 изоформе фермента (рис.4). Способность каадого из пептидоз связываться с антителом 1Е4 исследовали с помощью стандартного иммуноферментного метода и конкурентного анализа. Пэптид 3 взаимодействовал с антителон, поэтому на основе его аминокислотной последовательности были синтезированы два более коротких пептида: 4) рье(121!-Уа1(135) и 5) С1ц(130)-С1и(142). Так ге было изучено взаимодействие антитела 1Е4 с пептидом туг (127) -Ии (156), синтезированным на основе структуры ЪРМСА 1Ь изоформы Са^+-АТФазы, и гомологичным участку рье(121)-с1и(152) ьрмса 4

УГСННУГРРККРКТГЬЕЬУНЕАЬ0О\ГГЫХЬЕ1АА112ЬУЬ Б ЬРМСА«

А

110

|| ^И!

ГХКРАОЕЕИЕЬССО'^ЛТТРЕ13ЕМЕАСА2Н1ЕСйДХ1<2'2У11 ЬРМСА! 130 НО 15о 160

2

130 140 150 160

Рис. 4. Синтетические пептиды, использованные для локализации

?+

наружного зпитопа Са -АТФазы эритроцитов.

изофорщ. Результаты конкурентного анализа представлены на рис. 5. Пептид 2 взаимодействовал с антителом с низкой аффинностью, тогда как пептиды I, 4 и 6 не проявляли способности к связыванию (кривая, полученная для пептида 4, » не приводится, чтобы не перегружать рисунок). Слабое взаимодействие , антитела 1Е4 с пептидом 2 может объясняться тем, что последний содержит частично разрушенный зпитоп - мишень данного антитела. Пептиды 3 и 5 связывались с антителом 1Е4 с "высоким сродством, что дало возможность локализовать соответствующий зпитоп в пределах последовательности из 13 аминокислот: 01и(130)-01и(142) и таким образом зафиксировать положение первой наружной петли молекулы

120

Ьотраипп апЯдгг», рМ

Ряс.5. Конкурентный ананлиз взакмодействия синтетических пэатадоз с монокленаяьншл антителом 1Е-4.

Са^+-АТФазы (ряс. 6). Важнее значение также имеет факт отсутствия взаимодействия антитела 1Е4 с пептидом 6. Это указывает па то, что данное антитело является изо&>рмспецис£агчным.

5. Получение изофорлепеиифичньа: антител и их характеристика.

В настоящее время известии две изоформы Са^+-АТФазн эритроцитов человека: I) Ьрмса 4 изоформа, которая является преобладающей и состоит иэ 1205 аминокислотных остатков; 2) ЬР.мса 1Ь минорная изоформа, содержащая 1220 остатков. Последняя отличается тем, что включает в себя участок фэсфорилирования

№ОкШ65Ю/81кО

?+

Рис.6. Схема пространственной организации Са -АТФазы в мембране.

цАЫФ-зависикой протеинкиназой. Создание изоформспецкфичных антител представляет собой весьма сложную задачу. В данном случае наиболее продуктивной является иммунизация чсинтетическими пептидами, соответствующими уникальным участкам структуры белка. Поэтому для получения антител к минорной изоформе Са -АТФазы в качестве антигена использовали синтетический пептид, моделирующий участок , фэсфорилирования (фермента цАМФ-зависимой протеинкиназой С аминокислотные остатки 1153-1180). '

Поскольку антипептидныэ антитела часто обнаруживают кросс-решстквность по отношению . к различным белкам, то было изучено их взаимодействие с препаратами очищенных на+,к+-АТФазы из

почек свиньи, н+-АТФазы датохондрий сердца быка. родопсина зрительных клеток, а также с пептидами, синтезированными на основе структуры этих белков. Лишь несколько' гибридных клонов продуцировали антитела, не обнаруживающие перекрестных реакций с другими белками. После двукратного клонирования этих гибридом ¡методом лимитирующих разведений был выбран единственный клон юн, имеющий одинаково высокую аффинность как по отношению к петтяу-антигену так и к денатурированной Са2+-АТФазе (К д = 3,0»10®,

Таким образом: в нашей коллекции яйсвтсл ышоклональные антитела к обеим изоформам фзриента. Это ккАТ юн, полученное после иммунизации синтетическим пептидом, соответствующим участку фюсфорнлирования, и ккАТ 1Е4, спеш»445ЧНОЭ к Ьрмса 4 изоформэ. Д«я оценки возможности детектирования изсфори Са^+-АТФазы с помощью полученных антител препарат очищенного солюбилизировэн.*!гго фермента подвергали электорофорезу в полиакриланиднон гсл», затеи переносили методом электроблоттинга на нитроцеллюлозные фильтры. •Нитроцеллюлозные полосы, содержащие иммобилизованный фермент, инкубировали с различными ыонеклональныыи антителами: звз, 1Е4, 1g11. Образование иммунных комплексов детектировали по стандартной методике имиуноблотгинга. Результаты эксперимента ггредстазлени hi рис.7. Как видно из рисунка, антитела 1Е4 и ЮН связываются с белковыми полосами имеющими различную электрофоретическуз подвижность. Антитело 8BS, взятое в качестве контроля, окрашивает значительно более широкую область, чем кагдое из изоформспецифнчных антител. Это дает возможность предположить, что антитело 8В8 взаимодействует с обеими изофорыами фермента. Таким образом была показана возможность детекции изоформ с помощью монокпональных антител. Предполагается

использование этих антител для разделения изофзрм фермента методом аффинной хроматографии, "с целью изучения их функциональных особенностей.

«До

200- r-Ti :' S

ы

115 - 1

97 - i 1

65 - •

43 - ■ i -

1 2 ! 3 1 . • 4

Рис.7. Взаимодействие коноклоналыпи антител с препаратом очкце-ной Са2+-АТФазы. I- препарат АТФазы, окрашенный адгздо черным, 2, 3. 4- препарат АТёазы, окрашенный соответственно при помовд: антител 888, 1Е4, 1011.

выводы

1. Создана коллекция ионоклонаяъных антител к Са2+-АТФазе эритроцитов человека, и проведена характеристика этих антител.

2. Исследовано влияние моноклональных антител на функциональную активность фермента.

3. Разработан подход к определению ориентации зпитопоз антител относительно плягп'лтггг&ской мембраны, выявлено 9 антител к

.цитоплазматическии доменам молекулы фермента и одно (1Е4) - к наружному участку Са^-АТФазы.

4. С покопаю антитела 1Е4 участок 130-142 полипептидной цепи локализован на внешней стороне, плазматической мембраны , и предложена модель трансиембранной организации я-концезой области молекулы Са2+~АТФазы.

5. Предложена методика детекции и разделения изоформ основанная на использовании изофоркспецифичных антител.

6. С помощь» антител идентифицирована Са2+-АТФаза в плазматических мембранах наружных сегментов палочек сетчатки быка.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях.

1. Северин С.Е., Луценко С. В.. Фещенко М.С. Связывание синапсина I из мозга человека с калъмодулиноы и тубулином. - vii Всесоюзный симпозиум по химии белков и пептидов, Таллинн, 1987, стр.100.

2. Фещенко М. С., Зварич Е. И.Шахпаронов Ы. И. Исследование стру1сгурно-функциональных свойств Са^+,Ид^+-АТФазы эритроцитоз человека с помощью моноклональных антител. - vxr Всесоюзный симпозиум по химии- белков и пептидов, Таллинн, 1887, стр.126

3. E.I. Svaritch, M.S. Fescher.kc, M.I. Siiakhparonov. Arrangment of functional doaairi3 in the polypeptide chain of human erythrocyte membrane Ca" -ATPase. - First Spanish-soviet congress of physical chsiuical biology, Granada, 1987, p.22.

I. Зварич E. К , Фещенко U. С., Шахпаронов Ы. И., Шдянов Н» Н. ifcc-

Р-ь 2+

ледование стругстурно-шункциональкой организации Са ,Ug - АТФазы мембран эритроцитов человека. - Тезисы докладов хи Всесоюзного соБеданм по транспортным АТФазам, Иркутск, 1087, стр. II

5. Луценко С. В. , Зварич Е. И., Фещенко IL С., Шахпаронов Ы. И. йдгунологические свойства кальмодулкн-зависимой протеинкиназы IX (киназы II) из мозга крысы. Тезисы докладов XII Всесоюзного совещания по транспортным АТФазам, Иркутск, 1987, стр. 26.

6. Shakhparonov M.I., Zvaritch E.I., Feschenko M.S. , Modyanov N.N.

2+

Huaan erythrocyte membrane Ca -ATPaae. Immunochemical study of the molecular organization. International symposiua on molecular basis of biowembrane transport, Rosa Marina, Italy, 1988, p.82.

7. v.yu. Alakhov, H.N. Modyanov, M.I. Shakhparonov, E.I. Zvarith, M.S. Feschenko , and S.V. Lutzenko. Elucidation of conservative elements of calnodulin-dependent enayraes with the use of

monoclonal antibodies. - Biotechnology and Applied Biochemistry, 1988, v.10, p.319-325.

8. Зварич E. И., Фещенко 11 С., Шахпаронов li. И. , Модянов Н. Н. Са^+-АТФаза мембран эритроцитов человека. Исследование молекулярной организации. - Тезисы докладов V Советско- Швейцарского симпозиума "Биологические иэбраны: структура и функции", Рига, I9S3, стр.71.

9. Feschenko M.S., Zvaritch E.I., Klinenko A.S. Immunochemical studies of human erythrocyte Ca ,i-5g -АТ£азе. - Intrnaticnal syraposiura "Molecular organization of Molcgical structures", Moscow, 19ЯЭ, p.4.

10. M. Fesclienko, E. Zvaritch. Production of. s-cnoclcna.v antJbo&i*;-« and epitope mapping of the hruaan eryc'irc-syta Ca*4'-ЛТРз-ге. SovenXh international conference cf young ecieailcto c.i t-r-jauic and biological che!ei3try, Varna, Bulgaria, 1290, p.70-72,

11. Фещенко У. С., Зварзгч Е.И., Шахлароиов H.1L Нсолэдсзание молекулярной организации Са~+-АТФазы эритроцитов. Ижуиолсгяческий подход. - Всесоюзный симпозиум "Хюди белков", Тбилиси, ISOO, стр. 159.

12. Фешенко 1LC. , Зварич Е.И., Шахпаронов li.lt, Модяксв Н,К.

рл.

Антигенные свойства Са -АТФазы эритроцитов человека. Биологические мембраны, 1991. т. 8, N 12, стр. 1237-1247.

13. M.S.Feschenko, Е.X.Zvaritch, F.Hofraann, M.I.Shakhparonov, N.N.

Modyanov, T.Vorherr, E.Carafoli. A monoclonal antibody recognizes

an epitope in the first extracellular loop of the plasina membrane 2+

Ca -pump (submitted).