Структурно-функциональная организация Са-АТФазы плазматических мембран человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

п

а

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ УДК 577.152.361

Пестов Николай Борисович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Са-АТФазы ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН ЧЕЛОВЕКА

Специальность 02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и

физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ кандидат химических наук Шахпаронов М.И.

Москва — 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Введение 1

ГЛАЗА 1. Са-АТФазэ плазматических мембран (Обзор литературы) 2

1.1. Очистка и реконструкция 2

1.2. Общая функциональная характеристика 3

1.3. Топология молекулы 8

1.4. Регуляция активности аутоингибиторным доменом 12

1.5. Другие механизмы модуляции активности 18

1.6. Разнообразие изоформ, альтернативный сплайсинг, 28 тканеспецифичность и регуляция экспрессии ¡n vivo

1.7. Системы клеточной экспрессии и сайт-направленный мутагенез 39

1.8. Медицинские аспекты 42 ГЛАВА 2. Исследование структурно-функциональной организации Са-АТФазы 47 плазматических мембран при помощи фагового дисплея, иммунохимических, белкозоинженерных методов

(Результаты и их обсуждение)

2.1. Получение и свойства фрагментов РМСА 47

2.3. Тонкое картирование эпитопов моноклональных 50 антител к РМСА

2.4. Структурно-функциональные соответствия РМСА 58

2.5. Общий эпитоп РМСА и АРР 5S

2.6. Применение С-концевого фрагмента РМСА .для продукции и аффинной 62 очистки химерных белков

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 67

3.1. Материалы 67

3.2. Методы исследования 68 Выводы 77 Благодарности 78 Список сокращений 79 Список литературы 80

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В регуляции многих процессов жизнедеятельности клетки ключевая роль принадлежит ионам Са. В основе регуляторного действия ионов Са лежит изменение внутриклеточной концентрации "мессенджера", которая внутри клетки приблизительно в 10000 меньше, чем снаружи. Первостепенную роль в поддержании такого градиента концентрации иона играет Са-АТФаза плазматических мембран (РМСА) — система активного транспорта, использующая энергию АТФ для удаления избыточных количеств кальция. Нарушение внутриклеточного гомеостаза иона вызывает необратимые метаболические сдвиги, губительные для клетки, а на уровне всего организма является причиной развития многих тяжелых заболеваний. Поэтому изучение механизмов гомеостаза кальция, а в том числе механизма функционирования РМСА, относится к числу фундаментальных проблем физиологии, медицины и физико-химической биологии.

Цель работы. Основной задачей данной работы явилась характеризация моноклональных антител к Са-АТФазе плазматических мембран человека (ИРМСА) с использованием различных методов, в том числе картирование эпитопов при помощи фагового дисплея. Зная расположение эпитопов моноклональных антител в первичной последовательности РМСА, предполагалось проведение исследований структуры РМСА — трансмембранной топологии.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе выполнения данной работы помимо достижения первоначальных задач (картирования эпитопов моноклональных антител) удалось получить неожиданные интересные результаты. Прежде всего нужно отметить теоретическое предсказание и экспериментальное подтверждение существования общего эпитопа четвертой изоформы Са-АТФазы плазматических мембран человека (ИРМСА4) и предшественника р-амилоида. Кроме того, показана практическая возможность использования С-концевого домена РМСА для биотехнологических целей — аффинной очистки рекомбинантных белков.

ГЛАВА 1

Са-АТФаза плазматических мембран {Обзор литературы)

Са-АТФаза плазматических мембран (РМСА, кальциевый насос) — интегральный мембранный белок, обнаруженный з клетках эукариот: животных и растений. Ее функция — поддержание внутриклеточного кальциевого гомеостаза — исключительно важна для нормальной жизнедеятельности. Используя энергию АТФ, РМСА переносит ионы Са за пределы клетки против 10000-кратного градиента концентрации.

После обнаружения Са-зависимой АТФазной активности в мембранах эритроцитов [1] и ее связи с транспортом Са [2], наиболее важными, ключевыми этапами в исследованиях РМСА можно назвать:

1. Открытие активирующего эффекта кальмодулина на РМСА [3,4]

2. Разработка процедуры очистки РМСА на иммобилизованном кальмодулине

[5].

3. Определение нукпеотидной последовательности «ДНК РМСА — дедукция аминокислотной последовательности с немедленным открытием существования нескольких изофоом фермента [6-8]

4. Локализация кальмодулин-связывающего домена РМСА [9].

Опубликовано немало обзороа, посвященных РМСА [10-25], з данной работе

сделана попытка разностороннего охвата всей научной литературы, связанной с исследованиями этого интересного фермента.

1.1. Очистка и реконструкция РМСА.

Попытки выделить РМСА такими методами, как ионобменная хроматография и гель-фильтрация оказались неудовлетворительными для получения высокоочищенного активного препарата [26]. РМСА может быть получена з довольно чистом виде из мембран эритроцитов при помощи солюбилизации ее в неионном детергенте и аффинной хроматографии на иммобилизованном кальмодулине с элюцией ЭДТА. Впервые это удалось сделать з Швейцарии Ниггли. используя тритон Х-100 [5], а позднее — и с использованием дезоксихолата [27]. Авторами был получен белок с электрофоретической подвижностью 125 кДа и примесью 205 кДа (наиболее вероятно — димер РМСА, его количество возрастает при длительном хранении). Выход общей активности составил 19.5% с обогащением в 500 раз. [5]. Позднее

процедуру удалось существенно улучшить за счет добавления фосфатидилхолина и глицерина [28] в буферы для очистки, повысив удельную активность з 2 раза и выход общей активности до 49% [29]. Позднее метод был также адаптирован и для небольших объемов эритроцитов [30].

Эритроциты представляют собой наиболее удобный источник для выделения РМСА, поскольку они содержат, по всей видимости, только один тип мембран — плазматические. Очистка РМСА из других тканей осложняется присутствием большого количества других мембран и ассоциированных белков, в том числе кальмодулин-связывающих. Все же удалось выделить РМСА из обогащенной фракции плазматических мембран из сердца [31-37], скелетной мышцы [38], гладкой мышцы [39]) и из синапса [39,40], из ацинарных клеток [41] и из проростков рэдьки [42]. Проблематичным оказалось выделение РМСА из печени, поскольку РМСА этого органа не связывает кальмодулин. Это удалось сделать лишь с использованием аффинной хроматографии на монокпональном антителе, но белок был выделен в неактивной форме, поскольку элюция с сорбента осуществлялась 4М мочевиной [43].

Очищенная РМСА была успешно реконструирована в азолектиновые (из фосфолипидов сои) пузырьки, приготовленные при помощи ультразвуковой обработки. Детергент можно удалять двумя способами: дезоксихолат — диализом, а тритон Х-100 — абсорбцией на полимере БМ-2 [44]. Первый способ дает более плотно-замкнутые липосомы и позволяет наблюдать транспорт Са (внедрение 45Са) и стимуляцию Са-АТФазной активности Са-инофором А23187 (за счет устранения градиента Са). Реконструированный насос является подходящим объектом для изучения стехиометрии ионного транспорта.

1.2. Общая функциональная характеристика РМСА.

РМСА принадлежит к АТФазам Р-типа, т.е. образует фосфорилированный интермедиат (ацилфосфат) по остатку аспарагиновой кислоты во время рабочего цикла (для таких АТФаз характерно наличие абсолютно консервативного мотива ОКТСТ(Ц1)(Т,1), а также ингибирование ванадатом).

Прежде всего нужно отметить существование нескольких систем активного транспорта Са в клетке помимо РМСА: Са-АТФазы сарко-эндоплазматического ретикулума (БЕЯСА), а также присущего плазматическим мембранам Ыа/Са-обменника. Чтобы отличить при биохимических экспериментах активности этих трех систем, используют несколько приемов. Транспорт Са, опосредованный Са-АТФазами и обменником, можно различить с использованием безнатриевых сред и ингибированием АТФаз ванадатом, лантаном или кадмием [45]. Для отличия активности РМСА от БЕЯСА применяют либо кальмодулин, специфически

активирующий РМСА, либо тапсигаргин, селективный ингибитор вЕРЮА [46]. Этот ингибитор теперь широко применяется, его использование более удобно, чем измерение кальмодулин-активируемой активности, поскольку последняя может зависеть от уровня эндогенного кальмодулина, степени протеолического расщепления РМСА и других факторов. Также очень важно отметить, что, в отличие от других АТФаз, фосфорилирование РМСА увеличивается в присутствии солей !_а3+ [47].

Считается, что РМСА состоит из одной пслипептидной цепи, включающей б себя около 1200 аминокислотных остатков. В высокоочищенных препаратах РМСА при электрофоретическом анализе наблюдается только одна полоса, поэтому вполне обоснованно считается, что РМСА имеет только одну субъединицу. Скорее всего, РМСА в норме негликозилирована, однако это нельзя строго исключить. Сообщалось также, что очищенная РМСА сердца крысы ингибируется на 20% при обработке нейраминидазой [34].

Нужно также упомянуть об интересном открытии, пока неподтвержденном в работах других авторов — очищенная из эритроцитов РМСА, содержит поли(3-гидроксибутират) и полифосфат [48]. Эти вещества присутствуют з мембранах многих клеток, в частности, в бактериях они образуют потенциал-зависимые Са-каналы, благодаря им же происходит трансмембранный перенос ДНК при трансформации. Б той же работе показано, что РМСА функционирует и как полифосфаткиназа. Если данное открытие — не артефакт, то возможно, что эти вещества ассоциировано! с РМСА в один комплекс и/или важны для ее работы. В таком случае уникальна ли РМСА среди других АТФаз?

Итак, располагаясь в цитоплазматической мембране, РМСА связывает ионы Сг и переносит их за пределы клетки, используя энергию АТФ. Общая схема рабочего цикла РМСА аналогична всем АТФазам Р-типа и особенно БЕРСА (Рис. ). Фермент активируется связыванием Са (кажущаяся К<* по внутренней флуоресценции очищенной РМСА — около 1 10'7 [49]). В Са-связанной форме РМСА фосфорилируется Мд-АТФ. Затем от фосфорилированного фермента отщепляется Са на другой стороне мембраны (что соответствует состоянию с низкой аффинностью к Са — Ка около 2-10' 3). Скорость-лимитирующей стадией реакционного цикла считается отщепление фосфата, т.е. гидролиз фосфофермента. Для процесса также необходимо присутствие магния, который катализирует его с Ко.5 около 26 мкМ [50]. По всей видимости, магний необходим для перехода Е-,—>Е2. Здесь нужно отметить, что РМСА ранее называлась Са2*Мд2"-АТФазой.

Удельная АТФ-азная активность очищенной РМСА — 3.8 мкмоль субстрата / мг белка в мин [5]. При соблюдении максимальных мер предосторожности во время выделения удавалось достичь активности до 6 мкмоль/мг мин [28]. Однако степень фосфорилирования очищенной РМСА достигает лишь уровня 0.83 нмольУмг белка (а

теоретически должно состазлять около 7) при полумаксимальной концентрации 8.2 мкМ АТР [28].

РМСА способна гидролизовать !ТР, СТР, GTP, UTP примерно с 75%-ной эффективностью от АТФазной активности, но только последняя может быть сопряжена с транспортом Са [34,51].

Измеренные кинетические константы в разных работах несколько отличаются друг от друга. Получены K^.ca — 14 мкМ (в присутствии кальмодулина — 0.9 мкМ) для очищенной РМСА эритроцитов человека [52]; Кт. Са — 20 мкМ ( в присутствии кальмодулина — 0.3 мкМ) и Кт. АТо — 30 мкМ для РМСА сарколеммы сердца собаки [31], но для сарколеммы сердца свиньи: Km. Са — 0.88 мкМ и Кт. АТф — 0.45 мМ для РМСА [53]. Оптимальная концентрация Са для измерения АТФазной активности РМСА

— 10"4 М для препаратов мембран и Ю'МО"® М .для очищенной РМСА и комплекса кальмодулин-РМСА [28]. Концентрации Са выше 10 мМ ингибируют РМСА [28,541. Один оборот фермента — примерно 1 сек [28] при 4 мкМ АТФ и достигает 0.25 сек при 720 мкМ АТФ [55].

Кс.5 ванадата для РМСА нативных мембран эритроцитов человека — 0.5 мкМ [55](SERCA на порядок менее чувствительна), а эритроцитов свиньи — 1.6 мкМ [56]. По крайней мере для РМСА сарколеммы сердца [57] ингибирование ванадатом сильно зависит от ионной силы. В среде, содержащей только сахарозу, ванадат ингибирует РМСА в 100 раз менее эффективно.

При рассмотрении других реакций, катализируемых РМСА, прежде всего надо отметить способность фермента катализировать циклическую реакцию обмена фосфата, что характерно для всех АТФаз:

АТФ + Ф* АТФ* + Ф

Для этой реакции предпочтительна высокая концентрация Са, при 10 мМ Са скорости циклической и АТФазной реакций равны [28]. Обнаружено, что в нативных пузырьках мембран проксимальных канальцев почки Са-ионофор А23187 ингибирует циклическую реакцию, катализируемую РМСА [54]. На этом основании авторами был сделан вывод, что для способности катализировать обмен фосфата необходима доступность Са с внеклеточной стороны фермента.

Как и другие АТФазы Р-типа, РМСА в конформации Е2 обладает фосфатазной активностью (измеряемой по гидролизу л-нитрофенипфосфата) [57]. Эта активность стимулируется в 20 раз DMSO и ингибируется Са.

В принципе РМСА, как и SERCA, способна катализировать и обратную реакцию

— синтез АТФ как в присутствии, так и в отсутствии градиента Са [58,59]. Фосфорилирование РМСА неорганическим фосфатом удается достичь при помощи инкубации в присутствии Mg/EGTA/30% DMSO. Необходимо образование комплекса Ег-магний-фосфат, причем DMSO совершенно необходим, по-аидимому для

понижения активности воды з каталитическом центре фермента (для снижения скорости гидролиза ацилфосфата). После удаления ОМБО и добавления Са фосфофермент способен фосфорилировать АДФ.

Фосфат в концентрации 10 мМ активирует кальмодулиновую стимуляцию транспорта Са РМСА инвертированных пузырьков эритроцитарных мембран з 4 раза, а АТФазную активность — в 2.5 раза [60]. Причем в инвертированных пузырьках идет сотранспорт фосфата и кальция в соотношении 1:1 з случае кальмодулин-активируемого транспорта (собственно перенос анионов происходит по анионному каналу). Подобный, но на порядок более слабый эффект имели хлорид и сульфат [61,62]. Но эти анионы в большей степени стимулировали АТФазную активность, а не транспорт Са. Для изучения этих эффектов использовали сравнение с глюконатом — анионом, не проникающим сквозь мембраны. Хотя эффективность транспорта Са РМСА зависит также от анионного состава среды, все же надо заметить, что в живой клетке доступны самые различные анионы, поэтому вряд ли такая зависимость имеет физиологическое значение.

Реконструированная РМСА способна транспортировать 31 нмоль Са/мг мин [31]. Оценку способности РМСА транспортировать Са в живой клетке проводили на модельном объекте — захлопнувшихся тенях эритроцитов. РМСА активируется при повышении внутриклеточного Са з диапазоне 1-10 мкМ и максимальная скорость работы РМСА достигает 1.3 мкМ Са/мин [631. При экспериментах с такими же тенями но при помощи более тонких методов (микрофотолиз арестованного АТФ з единственной тени) получены следующие значения: Утах 1 мкМ/мин и Кт,Са 4 мМ [55]. Поскольку объем тени составляет около 65 фл, то содержащаяся в одном эритроците РМСА способна эвакуировать 39000 ионов Са в сек [55]. Содержание РМСА в общем белке мембран эритроцитов — примерно 0.1% [64], т.е. каждый эритроцит имеет около 400-7200 молекул РМСА [64]. Таким образом, согласно микроизмерениям способность молекулы РМСА в нативной мембране эритроцита транспортировать Са находится в пределах от 5 до 100 ионов в секунду [55], а согласно макроскопическим экспериментам — около 50 [47,65].

С точки зрения физиологи/ клетки выведение кальция за пределы клетки осуществляется РМСА и Ыа.Са-обменником. Последний берет на себя основную нагрузку в сердечной мышце [13]., тогда как в эритроцитах, ацинарных клетках поджелудочной железы [66], гигантских клетках глии [67], синапсах фоторецепторных клеток [68,69] и клетках эндотелия [70] почти все выведение Са производится РМСА. Для сократимых клеток считается, что РМСА в сравнении с обменником — высокоаффинный, но низкопоточный путь, однако все же выдвинуто несколько предположений, что РМСА может быть важна и для формирования осцилляций Са [71731

3 работе [62] выдвинуто предположение, что РМСА переносит Са электрогенно. Но уже давно известно, что транспорт Са БЕЯСА стимулируется протонофорами. Также оказалось, что при работе в липосомах РМСА не накапливает тетрафенилборат, проницаемый анион, а начальная скорость РМСА не стимулируется запиномицином (что должно бы происходить, если бы РМСА транспортировала Са электрогенно) [44]. В стационарном же состоянии транспорт Са активируется и валиномицином, и протонофором СССР в 1.5 раза. Наблюдалось также прямое заксисление среды вокруг липосом, стимулируемое А23187. Поэтому был сделан вывод, что РМСА транспортирует и протон в ст�