Ациклические аналоги нуклеозидов и их амфифильные производные

Шамшин, Дмитрий Викторович

Ациклические аналоги нуклеозидов и их амфифильные производные тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Шамшин, Дмитрий Викторович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2006 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Ациклические аналоги нуклеозидов и их амфифильные производные»

Автореферат диссертации на тему "Ациклические аналоги нуклеозидов и их амфифильные производные"

На правах рукописи

Шамшин Дмитрий Викторович

АЦИКЛИЧЕСКИЕ АНАЛОГИ НУКЛЕОЗИДОВ И ИХ АМФИФИЛЬНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ

02.00.10 - Биоорганическая химия.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва, 2006

Работа выполнена ла кафедре Биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор Василенко Иван Александрович

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Юркевич Александр Морисович

доктор химических наук

Балакин Константин Валерьевич

Ведущая организация: ЦХЛС - ВНИХФИ

Защита диссертации состоится ¿К * 2006 г. в часов на заседа-

нии Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова (119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. В настоящее время в биохимии и медицине идет интенсивный поиск новых биологически активных веществ, обладающих антивирусной активностью. Среди потенциальных веществ подобного рода большое внимание уделяется аналогам нуклеозидов, в том числе, ациклическим аналогам нуклеозидов и их фосфорсодержащим и амфифильным производным. На их основе созданы и внедрены в практику такие препараты, как ацикловир, ганцикловир и др. (Erik De Clercq and Hugh J Field П Review. Antiviral prodrugs - the development of successful prodrug strategies for antiviral chemotherapy. / British Journal of Pharmacology. 2006. 147. P. 1-11. published online 14 November 2005.).

Поиск эффективных противовирусных препаратов предполагает модификацию структуры нуклеозида. При выборе направлений химических модификаций необходимо исходить из следующих соображений: 1) поиск вещества, обладающего наибольшей активностью по отношению к молекулярной мишени; 2) модификация структуры нуклеозида, обеспечивающая перенос вещества во внутрь клетки. Такой подход связан с тем, что вещества проявляющие высокую активность по отношению к молекулярной мишени не проявляют активность на клеточном уровне всвязи с затрудненным транспортом через мембрану. Как правило, в процессе транспорта аналогов нуклеозидов через биологические мембраны лимитирующей стадией является их включение в мембрану. Для оценки способности аналогов нуклеозидов преодолевать биологические мембраны, необходим доступный метод изучения взаимодействия амфифильных аналогов нуклеозидов с мембранами, позволяющий оценить солюбилизирующую способность аналогов нуклеозидов.

В автореферате использованы следующие сокращения:

ДФХ — додецилфосфохолин; ККМ — критическая концентрация мицеллообразованмя; КССВ — константа спин-спинового взаимодействия; AZT — З'-азидо-З'-дезокситимццин; BSA — МО-бис(тримегилснлид)адст-амид; d4T — (2',3 '-дидсзокси-г'.З'-дидсгидроЭ-тимйдин; DMAP — дйметиламинопиридин; DMF — диме-тилформамид; DMSO — димегилсульфоксвд; HIV — вирус иммунодефицита человека; Thp—тетрагидро-пнранильная группа.

аналогов нуклеозидов, облегчающих их встраивание в мембрану; разработка метода изучения взаимодействия амфифильных аналогов нуклеозидов с модельными мембранами, позволяющего сделать сравнительную оценку солюбилизирующей способности модифицированных аналогов нуклеозидов по отношению к мембранам, для сравнения эффективности дальнейшей модификации аналогов нуклеозидов липофильными фрагментами.

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре Биотехнологии МИТХТ им. М. В, Ломоносова в рамках госбюджетной темы „Синтез новых аналогов нуклеозидов - потенциальных агентов против ретровирусных инфекций и препаратов пролонгированного действия" 1Б-21-866 (1994-1997гг).

Целями работы явились: I) синтез новых ациклических аналогов нуклеозидов, обладающих противовирусной активностью и содержащих кратные связи в алкильном фрагменте; 2) установление связи „структура - биологическая активность" синтезированных соединений; 3) для сравнения эффективности дальнейшей модификации аналогов нуклеозидов липофильными фрагментами - разработка метода изучения взаимодействия дейтерий меченых амфифильных аналогов нуклеозидов с мембранами методом !Н и "Р ЯМР-спсктроскопии и 4) с целью отработки этого метода - синтез дейтерий меченого и немеченого амфифильпого аналога нуклеозида.

Научная новизна. В настоящей работе предложены эффективные методы получения тринадцати новых ациклических аналогов нуклеозидов с кратными связями в алкильной части молекулы. По результатам тестирования полученных аналогов нуклеозидов установлена зависимость анти-ВИЧ-активности от их строения. Синтезированы новые амфифильные аналоги нуклеозидов, в том числе и с дейтериевой меткой. Для сравнения эффективности дальнейшей модификации аналогов нуклеозидов липофильными фрагментами, отработана методика изучения взаимодействия дейтерий меченых аналогов нуклеозидов с модельными мембранами посредством ЯМР-спектроскопии, позволяющая изучать кинетику процесса встраивания амфифильных аналогов нуклеозидов в мембрану и получать сравнительную оценку солюбилизирующей способности аналогов нуклеозидов.

Практическая ценность. Синтезированы новые аналоги нуклеозидов, проявляющие противовирусную активность. Некоторые из синтезированных пами аналогов нуклеозидов проявили хорошую активность (сравнимую с активностью азидотимиди-на) против ВИЧ на культуре лимфобластоидных клеток. Синтезирован дейтерий меченый и немеченый конъюгат дидезоксидидегидротимидина с додеканолом, с использованием которого разработана методика, позволяющая изучать взаимодействие амфи-

фильных аналогов нуклеозидов с модельными мембранами и оценивать их солюбили-зируюшую способность, на основании чего можно оце1Швать способность аналогов нуклеозидов преодолевать клеточные мембраны.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Синтез алкильных синтонов состава Cj: 5-ацетокси-1-бром-2-транс-пентена, 5-ацетокси-1,1 -диметоксипент-2-ена.

2. Использование последних для получения новых ациклических аналогов нуклеозидов, содержащих в качестве алкильного фрагмента 5-гидроксипентеновый и 5-гидрокси-1-метоксипентеновый остатки с природными и модифицированными азотистми основаниями.

3. Корреляция активности со структурой синтезированных аналогов нуклеозидов на основе сравнительной оценки их анти-ВИЧ-активности.

4. Синтез немеченого и дейтерий меченого конъюгата З-О-додецил-1-0-фосфо-5'-(2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидро)-тимидина и 3-(?-(а-2Н2)-додецил-1-0-фосфо-5'-(2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидро)-тимидина.

5. Разработка методики исследования взаимодействия амфифильных аналогов нуклеозидов с модельной мембраной и сравнительной оценки солюбилизи-ругощей способности амфифильных аналогов нуклеозидов па примере синтезированных конъюгатов методом 2Н и 31Р ЯМР-спектроскопии. На основании сравнительной оценки солюбилизирующей способности аналогов нуклеозидов можно оценивать способность этих аналогов нуклеозидов преодолевать биологические мембраны.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три статьи и тезисы четырех докладов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы частично изложены на конференциях: Abstr.l4th International Symposium on Heterocyclic Chem. Antwerp August 1-6, P01-65, (1993r.); Abstr. 13th International Symposium on Medicinal Chemistry, Paris, P201, (1994г.); Юбилейная научная сессия, посвященная 100-летию со дня рождения проф. Н. А. Преображенского, Россия, Москва, октябрь, 21-25, с. 145-146, 1996; Конференция „Наукоемкие технологии", Россия, Москва, октябрь 25-29, с.179-180, 1999.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах, содержит 7 схем, ^ таблиц, рисунков. Она состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной час-

ти, выводов и списка цитируемой литературы ссылок на литературные источники).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Несмотря на большое количество синтезированных аналогов нуклеозидов, обладающих потенциальной биологической активностью, интерес исследователей к новым ациклическим производным известных противовирусных препаратов не ослабевает. Какой должна быть структура нуклеозида для проявления им противовирусной, в частности, анти-ВИЧ активности, до сих пор не выяснено.

Очевидно, что целый ряд структурных параметров одновременно может обуславливать наличие или отсутствие биологической активности. Ранее высказано предположение, что одним из определяющих факторов для узнавания трифосфата нуклеозида ДНК-полимеразами является присутствие в молекуле „жесткого фрагмента" с сохранением расстояния между N-1 (или N-9) атомом гетероцикла и 5'-ОН группой углеводного или ациклического фрагмента, имитирующее переходное состояние субстрата в компетентном для реакции комплексе ДНК-полимераз. Подтверждением этого предположения служит обнаружение у трифосфатов (2^-гидроксипентеновых аналогов аденозина, тимидина и цитидина, синтезированных в нашей лаборатории ранее (1) (рис. 1), способности ингибировать синтез ДНК, катализируемый различными ДНК-полимеразами, в том числе ДНК-полимеразой ВИЧ. Основываясь на этом предположении нами осуществлен синтез новых аналогов нуклеозидов с ациклическим фрагментом С5 (2-5).

Синтез гуанидинового аналога (2а), которое по аналогии с ацикловиром, может оказаться также и противогерпесным препаратом, является логичным продолжением

В = Аёе, С}!, ТЬу но'

В = а) Суг, Ь) ТЬу

НО

В = а) лае, Ь) С>1, с) ТЬу

х у г

a) ОН Ш2 N

b) МН2 Н СН

c) ОН КН2 СН

В = а) Су% Ь) ТЬу

серии синтезов нуклеозидов типа (1). 7-Деаза-аналоги пуриновых нуклеозидов выбраны нами ввиду того, что дидезоксинуклеозиды, содержащие такие модифицированные основания, показали умеренную анти-ВИЧ активность in vitro. (i^-Производные синтезированы с целью проверки гипотезы о влиянии расстояния от 5'-гидрокси-группы до атома азота гетероцикла на антивирусную активность аналогов нуклеозидов. Расстояния между атомом кислорода 5'ОН-группы и атомом азота гетороциклов (N-1 или N-9), рассчитанные по программе Hyperchem 6.01, для fZ^-изомеров близки к расстояниям в природных нуклеозидах, а для (Ej-изомеров отличаются в большую сторону на 1,5-2 А. Метокси-соединения (4 и 5) выбраны нами исходя из предположения, что в процессе распознавания нуклеозидов при синтезе ДНК атом кислорода метокси-группы может имитировать кислород рибозного цикла природных нуклеозидов.

1. Синтез ациклических аналогов нуклеозидов.

1.1. Синтез аналогов нуклеозидов, содержащих цис-пентеновый фрагмент. 1.1.1. Получение исходного синтона для синтеза цис-пентеновых аналогов нуклеозидов.

В качестве ациклического фрагмента для синтеза производных (2а-с) был выбран (%)-5-ацетокси-1-бромпент-2-ен (6) использовавшийся ранее для получения производных (1). Для получения бромида (6) применяли разработанную ранее методику с использованием легко доступных пропаргилового спирта и оксиэтилена (схема 1). Для защиты НО- группы в молекуле пропаргилового спирта использовали тетрагидропи-ранильную группу (Thp), устойчивую в условиях металлоорганического синтеза. Размыкание оксиэтилена проводили комплексом эфирата трехфтористого бора с Незащищённым пропаргилидом лития (получен с применением н-бутиллития) с образо-

ванием соединения (7), использованного далее как исходное для получения всей серии синтонов С5. Выход продукта составил 75%. Далее для получения бромида (6): ацети-лировали хлористым ацетилом в пиридине в присутствии диметиламинопиридина (выход продукта (8) 92%), затем снимали ТЬр-защитную группу в метаноле с применением Ооууех-5С^ (выход продукта (9) 70%), после чего гидрировали на катализаторе Линдлара в смеси гексана и этилацтата (выход продукта (10) 98%), бромировали в хлористом метилене тетрабромметаном в присутствии трифенилфосфина (выход продукта (6) 66%).

1.1.2. Синтез аналогов нуклеозидов, содержащих цис-пентеновый фрагмент.

Нами проведено сравнение эффективности применения различных методов конденсации на примере синтеза производного гуанина (2а). При введении в реакцию конденсации с (6) триметилсилильного производного N -лауроилгуанина не удалось добиться удовлетворительных результатов ввиду низкой эффективности реакции (выход продуктов конденсации не превышал 10%) и большого числа побочных продуктов.

Другие использованные нами методы конденсации предусматривали предварительное получение соли 2-амино-б-хлорпурина (11) обработкой гидридом натрия (метод А) или КОН в присутствии 18-краун-б (метод Б). Затем натриевую (или калиевую) соль гетероциклического основания выдерживали с бромидом (6) в ОМГ или ацето-

Синтез (23-гидроксипентеновых производных гуанина, 7-деазагуашша и 7-деазааденина.

2с

Схема 2.

Таблица 1

Синтез (%)-гидроксипентеновых производных гуанина, 7-деазагуанина и 7-деазааденина.

Ациклический синтон Гетероцикл Метод синтеза Продукт Выход основног продукта,%

(6) (11) А (2а) 52

(6) (11) Б (2а) 13

(6) (22) А (2Ь) 15

(6) (22) Б (2Ь) 56

(б) (23) А (2с) <10

(6) (23) Б (2с) 42

Таблица 2.

Физико-химические характеристики ацетокси- и гидроксипентеновых производных гуа-

нина, 7-дезазагуанина и 7-дезазааденина.

Соединение УФ-спектр* Т. пл., °С

'Каях, им 6, М"'см"'

24 250 9580 202-204

310 8800

25 230 13100 171-179

271 10100

26 235 8380 160-162

316 2040

2а 252 12400 220-222

274 8250

2Ь 274 9300 196-198

2с 261 10980 248-250

284 6790

* В метаноле 24, 25, 26; в воде 2а-с.

Таблица 3.

Параметры 'Н-ЯМР-спектров ^-гидроксипентеновых аналогов нуклеозидов (5, м.д, КССВ, Гц).

Соединение Протоны ациклического t ¡Пигмента

H-1'д (J 6.5) Н-2'+Н-3', м Н-4',дг H-5'т СНз, с (АсО) Прочие протоны

(12)« 4,56, 5,52 2,58 (J 7.8, 6.5) 4,14 (J 7.8) 2,05 6,95 (с, NH,, 2Н), 8,39 (с, 11-8, 1Н)

(25)- 4,92 5,63 2,55 (J 7.8.6,5) 4,14 (J 7,8) 2,09 7,23 (д, I 4,6, Н-6, 1Н), 7,57 (д, J 4,5,11-5, 1Н). 8.65 (с. Н-2, 1Н)

(26)* 4,53 5,58 2,55 (J 7,8,6.5) 4,14 (J 7,8) 2,09 5,06 (с, NH2,2Н), 5,38 (д. J 4,0, Н-5, 1Н), 7,13 (д, J 4.0, Н-б, 1Н)

(24)» 4,96 5,64 2,58 (J 7,8,6,5) 4,16 (J 7,8) 2,04 6,88,6,92 (2д, J 4,0, Н-5 и Н-5", 2Н) 7,64 (д , J 4,0, Н-6, 1Н), 8,13 (д, J 3,7, Н-6", 111), 8.87, 8,81 (2с. Н-2 и Н-2". 2Н)

(2а)*" 4,59 5,61 2,34 (16,7, 6,5) 3,34 (I 6,7) - 6,49 (с, NH2, 211), 8,64 (о, Н-8, 1Н) 9,82 (шс NH, 1Н)

(2Ь)" 4,86 5,65 .2,34 (J 6,7, 6,5) Под пиком воды - 6,54 (д, J 3,5, Н-5,1Н), 6,98 (с, NH:, 2Н), 7,27 (д, J 3,5, Н-6, 1-Н) 8,04 (с, Н-2, 1Н)

(2с)** 4,45 5,70 2,42 (J 6,7,6.5) 3,38 Ü 6,7) - 6,20 (с, NH2, 211), 6,25 (д, J 3,6, Н-5, Ш), 6.79 (д. J 3,6. Н-6.1Н) 10.12 (vo, NH. ]Н)

* растворитель - CDCb

** растворитель - DMSO-rfs

нитриле соответственно. Условия проведения реакции, и выход целевого продукта приведены в табл. 1. Оба метода нуклеозидной конденсации селективны: практически не наблюдалось образование других региоизомеров, кроме 9-замещенного 2-амино-б-хлорпурина. Наиболее эффективным оказался метод А (гидридный), позволивший получить замещенное (%)-гидроксипентеновое производное гуанина (12) (схема 2) с выходом 52%. Удаление 5'-ацетокси-группы и замену С1 на ОН в гетероцикле проводили в одну стадию обработкой 0,1 N раствором №ОН, при этом выход 9-(5-гидрокси-2-пентен-1-ил)гуанина (2а) составил 66%. Структуру продукта конденсации (6) и (¿)-гидроксипентенового производного гуанина (2а) подтверждали методами УФ- и 'н-ЯМР-спектроскопии (табл. 2, 3).

В качестве гетероциклических компонентов для синтеза 7-деазааналогов нук-леозидов (2Ь, с) нами были выбраны 4-хлорпирроло[2,3-с1]пиримидин (22) и 2-амино-4-хлорпирроло[2,3-с1]пиримидин (23). Оба гетероцикла были получены из общего предшественника - этилового эфира 4,4-диэтокси-2-цианомасляной кислоты (16) по схеме, представляющей собой комбинацию методов, известных из литературы (схема

3).

Конденсация (16) с гуанидином или тиомочевиной в щелочных условиях привела к замешенным аминопиримидинам, соответственно (17) (выход 82%) и (18) (выход 64%). Циклизацией производного (17) в кислой среде был получен 2-амино-4-гидроксипирроло[2,3-с!]пиримидин (19) с выходом 88%. В случае вещества (18), циклизации предшествовало десульфирование (выход 75%), затем полученное соединение (20), в кислой среде, превращалось в 4-гидроксипирроло[2,3-с1]пиримидина (21) (выход 86%). Обработка (19) и (21) хлорокисью фосфора привела к целевым гетероциклическим фрагментам (23) (выход 79%) и (22) (выход 58%) в форме, удобной для нуклеозидной конденсации, с суммарным выходом 42 и 33% на соединение (15) соответственно. Физико-химические параметры и спектральные характеристики (22) и (23) совпадают с приведенными в литературе.

Для алкилирования пирроло[2,3-<1]пиримидинов (22) и (23) ациклическим бромидом (6) (схема 2) были опробованы два метода - А и Б. Эти методы применялись для синтеза различных углеводных производных 7-деазагуанина и 7-деазааденина, причем метод А давал наиболее высокие выходы конечных продуктов. В нашем случае (табл. 1), наиболее эффективным оказался метод Б (с использованием межфазного катализатора), который позволил получить ацилированные ациклические аналоги нук-леозидов (25) и (26) с выходом 42 и 56% соответственно.

,ОЕ1 К2СОз,К1 ЕИ ЕЮ'

79%

РОС1з 3

)

НгИ—

.О ОЕ1

82%

н2м-<р=ш №12

Г | ла нк

с®

88%

о.2хна

ин

58%

РОСЬ

Схема 3.

Получение гетероциклов для синтеза соединений 2Ь и с.

Структура продуктов конденсации (25) и (26) подтверждена методами УФ- и 'Н-ЯМР-спекгроскопии (табл.2,3). УФ-Спектры соединений (25) и (26) соответствуют спектрам 7-замещенных пирроло[2,3-ё]пиримидинов, в спектрах 'Н-ЯМР сигналы от Н-5' и Н-6' протонов присутствуют в виде двух дублетов, что также соответствует спектрам 7-замещенных пирроло[2,3-с1]пиримидинов. Кроме того, положение сигналов от Н-2' иН-3 '-протонов в спектрах !Н-ЛМР соединений (25) и (26) с характерной константой спин-спинового взаимодействия ^.з1 — 11 Гц близко к таковому в бромвде (6),

что свидетельствует о сохранении цис-конфигурации двойной связи ациклического фрагмента при конденсации.

При синтезе соединения (25) наряду с целевым продуктом конденсации получено небольшое количество (8%) ди-замещенного пирроло[2,3-с1]пиримидина (24), структура которого подтверждена данными УФ-, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. В спектре 'Н-ЯМР соединения (24) сигналы протонов Н-5 и Ы-6 присутствуют в виде двух пар дублетов, в спектре 13С-ЯМР - два набора сигналов атомов углерода гетероцикла, один из которых соответствует сигналам гетероцикла в (24) (табл. 3). Возможное образование побочных продуктов с аналогичной структурой отмечено в публикациях при синтезе рибозидов пирроло[2,3-<3]пиримидинов.

После деблокирования 5'-гидроксильной группы и замещения атома хлора в положении С-4 гетероцикла были получены целевые аналоги 7-деазааденозина (2Ь) и 7-деазагуанозина (2с) с выходом 85 и 56%, соответственно. Соединение (25) обрабатывали насыщенным раствором аммиака в метаноле в автоклаве при 100°С 36 ч, соединение (26) обрабатывали ОД N раствором КаОН при кипении в течение 40 мин.

Структуру целевых соединений (2Ь, с) подтверждали методами УФ- и ^-ЯМР-спекгроскопии (табл. 2,3). УФ-Спектры аналогов нуклеозидов (2Ь, с) соответствуют спектрам 9-замещенных производных 7-деазааденина и 7-деазагуанина; в спектрах !Н-ЯМР присутствуют все ожидаемые сигналы гетероциклов и ациклического фрагмента (табл. 3).

Данные тестирования биологической активности соединений (2а-с) приведены в таблице 5.

1.2. Синтез аналогов нуклеозидов, содержащих транс-пентеновый фрагмент и оксиметильную группу в положении 1' цис- и транс- пентенового фрагмента.

1.2.1. Синтез ациклических фрагментов для получения аналогов нуклеозидов, содержащих транс-пентеновый фрагмент и оксиметильную группу в положении 1' цис- и транс- пентенового фрагмента.

В качестве ациклических реагентов для получения аналогов нуклеозидов типа (3), (4) и (5) использовали соответствующий ациклический бромид (27) и ацеталь (28), синтез которых приведен на схеме 4. Для получения (2^)-5-ацетокси-1-бром-пент-2-ена (27) исходный 1-тетрагидропиранилоксипенг-2-ин-1-ол (7) гидрировали в присутствии литийалюмогидрида (выход 50,5%), ацетилировали (выход 97,9%), удаляли тетрагид-ропиранильную защитную группу в присутствии Бот^ЕХ 50 (Н') (выход 70%) и бро-

3, В=: а) Ас1с

b)Су1

c) ТЬу

4, В=: а) Су1 Ь) ТЬу

5, В=: а) Су1 Ь) ТЬу

НО^^^ОТИр

ЫА1Н4

но

АсО

АсО^,

Бои'ех 50 (Н+)

70%

ОН АсО.

65%

\Dowex 50 (Н+) ✓ 10

8 \ /Н]/Р(3/СаСОз

62% ч '

89%

62% АсО

АсО'

АсО.

53% ОН

сндамеьдавдоз

66% .О

АсО

.ОСН3

^ОСНз

.ОСН3 "ОСН3

Схема 4.

Синтез (Е)-5-ацетокси-1-бром-пент-2-ена и (Е+2)-5-ацетоксипент-2-ен-1-аля.

мировали тетрабромметаном в присутствии трифенилфосфина (выход 65%). Структура соединений (27), (29), (31) подтверждена с помощью ИК- и 'Н-ЯМР спектроскопии. В спектрах этих соединений сигнал от протонов при атомах С-2 и С-3 присутствует в виде дублета триплетов с константой спин-спинового взаимодействия 15 Гц, что, при сравнении с описанными ^-аналогами (около 11 Гц), соответствует (Е)-конфигурации двойной связи.

Диметилацеталь (28) (схема 4) получали окислением 5-ацетоксипент-2-ен-1-ола (10) диоксидом марганца (выход 89%) с последующей ацетализацией тримети-лортоформиатом (выход 66%). Уже на стадии окисления спирта (10) в альдегид (32) происходит изомеризация двойной связи, что приводит к образованию смеси (2+Е')-■ 5-ацетоксипент-2-ен-1-алей в эквимолярном количестве (по данным 'Н-ЯМР спектроскопии). (Разделение (7.)- и (2^-изомеров проводили после получения аналогов нуклеозидов. До этой стадии реакции проводили со смесью изомеров.) Так в спектре реакционной смеси (рис. 2) соединению (10) соотвегвуют два набора сигналов от протонов при атомах С-2' и С-3': дублет триплетов при 6,35 м.д. и неразрешившийся сигнал, вероятно тоже дублет триплетов, 6,18 м.д. с константой спин-спинового взаимодействия 11,1 Гц (2-двойная связь) и дублеты триплетов при 7,01 и 6,80 м.д. константой спин-спинового взаимодействия 15,7 Гц (Е-двойная связь). Интегральная интенсивность сигналов этих двух групп протонов одинакова и соответствует одному протону, что свидетельствует об эквимолярном соотношении (¿)- и (Е)- изоме-

Рисунок 2. 'Н-ЯМР-спектр протонов С2 и СЗ соединения (10) из реакционной смеси окисления спирта (10) в альдегид (32).

ров. Структура соединений (28) и (32) подтверждена данными ИК- и 'Н-ЯМР-спектроскопии.

1.2.2. Получение аналогов нуклеозидов, содержащих транс-пентеновый фрагмент и оксиметильную группу в положении 1' цис- и транс- пентенового фрагмента.

Синтез аналогов нуклеозидов проводили для соединений (3) по ранее отработанной нами методике (схема 5). Для этого в конденсацию с бромидом (27) вводили триметилсилильные производные пиримидиновых оснований (33) и (34) и натриевую соль аденина (35). После деблокирования соединения (36) насыщенным аммиаком в метаноле целевые ^-пщроксипентеновые производные тимина (Зс), цитозина

№

1) Мез5!.\гН.$1Мез, МезЗЮ 27

36, В=: а) Ас1е

b) Су1

c) ТЬу

КГНз/МеОН

3, В=: а) Аёе

b)С>1

c) ТЬу

№

1) МезБ^М^Мсз, .\ie3SiCl

лю.^^----

- ^-осн»

37, В=: а) Су1

Ь) ТЬу мНз/МеОН + --

ОАс 37, В=: с) С^ а) ТЬу

5, В=: а) Суг

Ь) ТЬу +

ОН 4, В=; а) Су! Ь) ТЬу

Схема 5.

Синтез аналогов нуклеозидов (3) и (4).

(ЗЬ) и аденина (За) получены с выходами на исходный бромид (27) 67, 69 и 73 %, соответственно. Строение аналогов нуклеозидов (3) подтверждено данными УФ- и 'Н-ЯМР-спектроскопии (табл. 4).

Конденсацию тимина (33) и цитозина (34) со смесью (7.)- и (Е)- ацеталей (28) (схема 5) проводили при комнатной температуре в ацетонитриле в присутствии че-тыреххлористого олова по методике, предложенной для конденсации азотистых оснований с ацеталями в работах Флорентьева и соавт. (2)- и (^-Изомеры ациклических аналогов нуклеозидов (37а-с1) после стадии деблокирования гидроксильной группы разделяли методом тонкослойной препаративной хроматографии (выделение оптических изомеров по 1'С-атому пентенового фрагмента не производили). Деблокирование ацетилзащищенной гидроксильной группы в тех же условиях, что и для соединений (3) привело к соединениям (4) и (5). Суммарные выходы (в расчете на смесь (¿) и (2^-изомеров) составили: для производных тимина (4Ь) и (5Ь) 54 % и для

Таблица 4.

Спектры 'Н-ЯМР и Л..ОТС УФ-спекгров ациклических аналогов нуклеозидов.

№ Сигналы пентенового фрагмента: 6 (м.д.), мультиплетность Другие сигналы: 6 (м.д.), мультиплетность УФ-спектр ^мпкс, нм

1'-СН„ 2-СН З'-СН 4'-СН2 5-СНз

За 4.78, Д(4.7) 5.82, 15.4) т(4.7) 5.73, 15.4) т(5.01 2.27, т(6.7) д(5.0) 3.57, т(6.7) Гетероцикл 1-СН 2 8.18, с; 1-СН 8 8.22, с -

ЗЬ 4.45, Д(3.6) 5.75, 15.0) тП 5.81, 15.0) тС5 7) 2.30, Д(5.2) тГ6 0) 3.69, т(б.0) Гетероцикл: 1-СН 7.30; 6-СН 5.75 270

Зс 4.27, Д(5.6) 5.65, 15.2) т(5.6) 5.79, 15.2) т(6.0) 2.25, Д(6.0) т(6.2) 3.68, т(6.2) Гетероцикл: 1-СН 6.9; 7-СН3 1.8 265

5а 6.65, 12.0) 4.94, 12.0) д(8.4) 5.12, Д(8.4) т(6.9) 1.93, Д(6.9) т(6.8) 3.49, т(6.8) СНз (ОМе) 3.58, с; гетероцикл: 1-СН 7.43, д(7.3), 6-СН 5.82 д(7.3) 277

5Ь 7.05, 14.0) 5.02, 14.0) д(8.4) 5.15, Д(8.4) т(8.2) 2.19, Д(82) т(б.б) 4.08, т<6.6) СНз (ОМе) 3.47, с; гетероцикл: 1-СН 7.77, к(1.2), 7-СНз 1.88 д(1.2) 269

4а 6.07, д(4.8) 5.50, 15.6) Д(4.8) 5.85, 15.6) т(б.2) 2.28, Д(6.2) т(6.0) 3.58, т(6.0) СНз (ОМе) 3.98, с; гетероцикл: 1-СН 7.37, д(7.3), 6-СН 5.86 д(7.3) 273

4Ь 6.08, Д(5.3) 5.21, 15.5) Д(5.3) 5.74, 15.5) т(5.8) 2.31, т(6.9) Д(5.8) 3.91, т(6.90 СНз (ОМе) 3.57, с; гетероцикл: 1-СН 7.79, к(1.2), 7-СНз 1,87 д(1.2) 266

производных цитозина (4а) и (5а) 63 %. Структуру целевых соединений (4) и (5) подтверждали с помощью данных УФ- и 'Н-ЯМР-спектроскопии (табл. 4), а также данных элементного анализа.

1.3. Результаты биологического тестирования ациклических аналогов нуклеозидов.

Биологическое тестирование аналогов нуклеозидов (1-4) проводилось в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН группой сотрудников под руководством д. б. н. Г. Г. Миллер. Результаты тестирования приведены в таблице 5.

Предположение о зависимости биологической активности от расстояния между атомом кислорода 5'-ОН группы и атомом азота (N-1 или N-9) гетероцикла подтверждается результатами тестирования биологической активности: (^-аналоги (1а-с, 2а) проявили большую активность, чем ^-аналоги (За-с). Замена N-7 атома азота в гетероциклах на атом углерода не привела к повышению биологической аютвно-

Таблица. 5

Результаты тестирования на анти-ВИЧ активность на культуре клеток МТ4, инфицированны

НТШУ27

№ Соединение Акги-ВИЧ-активность ЕОп' \ м кг/м л % кнгибиции (среднее значение д вух методов тестирования) Острая цитоток-сичиость СС504. мкг/мл

1а ®-9-(5-гидроксипент-2-ен-1-ил)адешш 0.5 100 >100

1Ь ®-1-(5-ги1роксипснт-2-ен-1-ил)цитозин 25 72,4 >100

2а (г>9-(5-гидроксипент-2-ен-1-ил)гуанин 2,5 86,1 >100

1с (2>1-(5-гядроксипент-2-ен-1-ил)тишш 25 32,2 >100

2Ь ®-7-деаза-9-(5-гидроксипенг-2-ен-1- нл)адешш 50 33,1 >100

2с ^-7-деаза-9Ч5-гидроксипент-2-ен-1-ил)гуанин 50 65,4 >100

За (Е/)-9-(5-гидроксипонг-2-ен-1-ил)аденин 25 29,3 >100

ЗЬ да-1-(5-гидроксипснт-2-сн-1-ил)цнгозин 50 27,4 >100

Зс (2^-1-(5-пщрокс1шенг-2-ен-1-ил)тимин 25 78,6 >100

5а (2,>-1-(5-гидрокдипент-2-ен-1-мегокси- 1-ИЛ)цИТОЗИН 2,5 76,4 >100

5Ь ^-1-(5-гяцроксипент-2-ен-1-метокси-1-ил)тимин 2,5 100 >100

4а (Е) • 1 -(5-гидроксипент-2 -ен-1-мегокси-1-ил)цитозин 2,5 65,2 >100

4Ь £Ь>1-(5-гидроксипет--2-ен-1-метокси-1-илУгамин 25 24,1 >100

— А2Т 0,1 100 >100

ц ЕО50 — средние суммарные значения 50% эффективной дозы, подавляющей продукцию ан-

тигенов ВИЧ от двухкратных повторностей в двух тестах. г) СС50 — 50% цитотоксическая концентрация нуклеозидов, подсчитанная через 24 часа после инфекции клеток.

сти аналогов нуклеозидов с ациклическим фрагментом (ZJ-Cs. Это следует из результатов тестирования для 7-деазасоединений (2Ь и 2с) и аналогов нуклеозидов с . ^модифицированными гегероциклами (1а и 2а). Введение метокси-группы в положении 1' (соединения (4 и 5)), как и предполагалось, повысило активность аналогов нуклеозидов относительно соответствующих аналогов нуклеозидов без метокси-группы (соединения (lb, с и ЗЬ, с)). Таким образом, установлена связь биологической активности: а) с удаленностью 5'ОН-группы от атома азота гетероцикла (N-1 -для пиримидиновых и N-9 - для пуриновых аналогов нуклеозидов), б) с наличием 1 '-метокси-группы, атом кислорода которой, вероятно, имитирует атом кислорода ри-бозного цикла.

2. Синтез амфифильных аналогов нуклеозидов и изучение их взаимодействия с модельной мембраной.

Поиск новых противовирусных препаратов включает синтез новых соединений с последующим биологическим скринингом. Однако не все новые соединения оказываются активными как на молекулярном, так и на клеточном уровне. Это может быть связано с трудностью образования монофосфатов аналогов нуклеозидов в клетке, а также с трудностью преодоления аналогами нуклеозидов клеточных мембран. Липофильные фрагменты, присоединенные к действующим на молекулярном уровне веществам, способны облегчить их транспорт через мембрану. Логичным продолжением работы в направлении получения новых противовирусных препаратов является синтез конъюгатов фосфатов аналогов нуклеозидов с липофильными фрагментами. В этом направлении определенную сложность представляет выбор липофильного фрагмента для конъюгата.

Предварительно оценить липофильность вещества можно с помощью расчета коэффициента распределения в системе октанол/вода - Log я. Так, например, для 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимвдина значение Log к составляет -0,49, а для З-О-додецил-1-0-фосфо-5'-(2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидро)-тимидина 5,7 (рассчитано при помощи программы DayLight). Однако значение Log я не всегда линейно соотносится со способностью веществ проникать через мембрану. Более близким к этой способности по природе взаимодействия может оказаться способность встраивания веществ в модельную мембрану. Для сравнения влияния липофильных фрагментов на солюбилизирующие свойства конъюгатов нами разработан метод изучения взаимодействия амфифильных аналогов нуклеозидов с модельной мембраной. Из всех

возможных методов исследования мембранных массо-обменных процессов наиболее информативным нам представляется метод ЯМР спектрометрии на ядрах дейтерия и фосфора. Известно, что дейтериевые метки не изменяют химических свойств препаратов и не влияют на их солюбилизирующие свойства. С целью демонстрации возможностей метода анализа взаимодействия амфифильных аналогов нуклеозидов с модельной мембраной с использованием ЯМР спектрометрии на ядрах 2Н и 31Р нами были получены 3-0-додецил-1-0-фосфо-5'-(2',3,-дидезокси-2',3|-дидегидро)-тимидин (46а) (конъюгат с!4Т) и его дейтерий-меченый аналог (46Ь) (рис. 3). Для сравнения солюбилизирующей способности конъюгата использовался ДФХ.

2.1. Синтез 3-0-додецил-1-0-фосфо-5'-(2',3'-дидезокси-2',3'-дндсгидро)-тимидина (46а, Ь).

Для демонстрации возможностей предлагаемой методики исследования 2Н ЯМР спектроскопии в изучении взаимодействия амфифильных молекул с мембранами, был выбран дейтерий-меченый конъюгат проявляющего антивирусную активность 2',3 '-дидсзокси-2',3 '-дидегидро-тимидина (<14Т) с додеканолом. Для получения конъюгатов с!4Т с додеканолом и а-2Н:-додеканолом использовали фосфитный три-эфирный метод (схема 6). Фосфитилирующий агент - 2-цианоэтилтетраизопропилфосфородиамидит (38) получали в две стадии. На первой стадии получали дихлорцианоэтилфосфит (39) из треххлористого фосфора и циано-этанола. На второй стадии к дихлорцианоэтилфосфиту (39) прибавляли диизопропи-ламин. Дейтерий-меченый додеканол (40Ь) получали изотопным обменом, восстанавливая метиллаурат литийалюмодейтеридом 1лА12Н4. Далее синтез дейтерий-меченого и немеченого конъюгатов вели по общей методике. На первой стадии получали 3-0-додецил-1-(ЛУ/-диизопропиламидо)-цианоэтилфосфит (42а) и 3-0-а-2Н2-додецил-1-(ЛУ/-диизопропиламидо)-цианоэтилфосфит (42Ь), взаимодействием 2-цианозтилтетраизопропилфосфоро-диамидита (38) соответственно с додеканолом и а-2Нг-додеканолом в присутствии диизопропиламмонийтетразолида (41).

Затем, на второй стадии, полученные З-О-додецил-1-(/*/,//-диизопропиламидо)-цианоэтилфос-фиты (42а, Ь) вводились в реакцию с с14Т (43). Таким образом, были получены дейтерий-меченый и немеченый 5 '-0-(0-додецилцианоэтилфосфит)-2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидин (44а, Ь), которые,

9"Ка*

СпН.СК^О-^ 46а,Ь

Рисунок 3. Конъюгат с14Т, К=а) 'Н, Ь) 2Н.

без выделения, окисляли третя-бугилгидроперекисью до 5'-0-(0-додецилцианоэтилфосфо)-2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидина (45а, Ь). Далее продукт (45а, Ь) обрабатывали последовательно триэтиламином и натриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты. Так получали целевые З-О-додецил-1-0-

2 Ш(1-Рг)2

" >"\ 38

^днс V I алии) /\

\ и-и СпНгэСЯзО , <С N .. Г=м

■-" >"4 „~тС11Н2зСКг0Р01^

\/ 39 79% V

У (л^ стадии)

СцНиСЯгОН 40а,Ь

44а,Ь

42а,Ь 43

(СНз)зСООН О^^ 2Жа+ЕОТА 9"На

— СцН^О-^ — ^'^ТЪ1

45а,Ь (четыре стадии) 46а,Ь

Схема б.

Синтез амфифильных аналогов нуклеозидов.

фосфо-5'-(2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидро)-тимидин (46а) и 3-0-о.-2Н2-додецил-1 -О-фосфо-5'-(2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидро)-тимидин (46Ь). Структура соединений (4ба, Ь) подтверждена данными 'Н- (табл. 6), 2Н- и (табл. 7) 13С-ЯМР-спектроскопии.

2.2. Синтез додецил-(у-2Нз)фосфорилхолина.

Додецилфосфорилхолин (ДФХ) был выбран как потенциальный детергент биологических мембран в качестве сильно липофильного вещесва, способного встраиваться в мембрану. В настоящее время ДФХ находит применение, в частности, при изучении мембранных белков. Поскольку концентрации меченых соединений весьма низки (не более 5-7 мг на образец), необходимо было использовать дей-териевую метку с возможно большей интенсивностью пика ЯМР-сигнала. Этому требованию отвечает метка в у-положении холина (дейтерий введён в К—СНз-группу).

Таблица 6.

'Н .ЯМР-спектры додеканолов, d4T и конъюгатов.

№ Растворитель Химические сдвиги, 5 (м. д.), вид сигнала

Сигналы додсканола Сигналы с!4Т дидезоксидидегидрорибозного фрагмента тимина

-€Н3 9(-СНгО а-СН2- (НШг- 5'-СН2- 4'-СН- З'-СН- 2'-СН- Г-СН- -СНз -сн- №/ж

40а А 0.74, т 1.93, м 3.41, т 1.38, м —/4.17, с

46а С 0.88, т 1.27, м 3.89, м 1.63,м 4.13,м 5.01, м 6.43, м 5.89, м 7.00, м 1.91, с 7.55, с —/—

40Ь А 0.79, т 1.18, м 3.50* 1.45, м —/—

46Ь 0 0.81, т 1.19, м 3.75* 1.51,м 4.05, м 4.89, м 6.43, м 5.83, м 6.87, м 1.77, с 7.39, с 11.19, с/-

43 В — — — — 3.59, м 5.05, м 6.3$», м 5.91, м 6.82, м 1.72, с 7.66, с 11.30, ы-

* — слабый сигнал остаточного 'Н-водорода.

Таблица 7.

"С ЯМР-спектры додеканолов, (14Т и конъюгатов

Растворитель Химические сдвиги, 8 (м. д.), вид сигнала

Сигналы додеканола Сигн Дидезоксидидегидрорибозного фрагмента алы (14Т тимина

СН3 10(-СНг) о-СНЬ- 5,-СНг- 4-СН- ЗЧН- 2ЧН- 1ЧН- 6-С 5-С 4-С=0 2-С=0 СНз

40а А 13.84 2265,2559,2937,2956, 29.72, ЗШ, 3267 62.28

46а С 13.49 2Щ 24X1,285), 28.81, 29.43,2954,3107 61.33 65.82 88.80 133.21 126.39 84.47 135.61 109.56 163.68 150.55 11.57

40Ь А 13.87 2161,25.78^29.34,2953, 296^31.90,3237

46Ь О 13.55 2189,2Ш,28.53,2884, 29.47,2961,31.12 65.86 88.84 133.22 126.42 84.51 135.65 109.61 163.70 150.57 11.58

43 В — — — 62.91 90.68 135.27 125.80 88.03 136.66 111.13 166.84 152.62 11.61

Где А — СГНСЬ, В — еН3(УН, С — СТ1С13 + СНзО'Н + Ч120, V» — СНС13 + (СТЦ^О.

1. росьлгаэ

С12Н25ОН -

2. НОСН2СН2М*(а1а)2С2Нз»СНз-

803'™Е13

С,2Н250^0(СН2)2Ыт(СНЗ)2С2НЗ 40а ^=/ 0 47

Схема 7.

Додецил-(у-2Нз)фосфорилхолин (47) синтезировали фосфорилированием до-децилового спирта (40а) по Брокерхоффу с использованием л-толуолсульфоната холина, селективно меченого дейтерием по одной из И-метильных групп (Схема 7.). В отличие от классической методики Брокерхоффа, разработанной для получения холиновых фосфодиэфиров с сильно гидрофобными компонентами (диглицериды, холестерин), выделение продукта методом экстракции оказалось в нашем случае неэффективно. При экстракции, выраженные детергентные свойства додецил-Оу-2Нз)-фосфорилхол1ша проявлялись в образовании стойких эмульсий и в значительной потере вещества за счет растворения в водной фазе. Экстракция нами была заменена дополнительной хроматографической очисткой в обращеннофазовых условиях (силикагель/метанол-вода 4:1), позволяющей выделить смесь производных, содержащих алифатическую цепь. Далее полученную смесь разделяли прямофазной хроматографией на силикагеле. Полученный додецил-(у-2Нз)-фосфорилхолин охарактеризован данными 'Н- и 2Н-ЯМР-спекгров.

2.3. Исследования взаимодействия с мембраной ДФХ и конъюгата Й4Т.

В спектрах 3!Р ЯМР в водной фазе конъюгат с14Т (46) дает узкий изотропный сигнал ~ 0 м.д. (рис. 4а), подтверждающий, что в водных дисперсиях в данных условиях сформированы мицеллы, в которых молекулы алкилфосфонуклеозида совершают быстрое изотропное движение. В спектрах 31Р ЯМР липосом яичного фосфатидилхолина, размер которых более 10000 А, наблюдается анизотропный сигнал (рис. 46), свидетельствующий об анизотропном характере движения молекул фосфатидилхолина. При инкубации дисперсии липосом с водной дисперсией конъюгата <34Т (46), образующего мицеллы, в спектре 31Р Рисунок 4. 31Р и 2Н-ЯМР-исследования вза- наблюдается сигнал, предсгав-

имодействия коньюгата <14Т с мембраной. ляющий суперпозицию изотропного и

анизотропного сигналов (рис 4в). Соотношение площадей изотропного и анизотропного сигналов отражает мольное соотношение конъюгата (46), встроившегося в мембрану и находящегося в водной фазе.

Нами были исследованы водные растворы со следующими мольными соотношениями конъюгат (46)/лецитин: 1/4, 1/8, 1/17. Растворы готовились двумя способами: 1. смешением раздельно приготовленных водных дисперсий лецитина и конъюгата (46) (нами впервые предложен такой способ подготовки образца); 2. совместным диспергированием конъюгата (46) и лецитина (контрольный эксперимент при мольном соотношении 1/17). Кинетику разрушения бислоя наблюдали с помощью Э1Р ЯМР спектроскопии. Установили, что наиболее стабильное состояние бислоя наблюдается при соотношении конъюгат (46)/лецитин 1/17. При таком соотношении, влияние температуры и времени на фазовое распределение конъюгата оказалось мало (табл. 8).

В спектрах 2Н ЯМР водной дисперсии конъюгата Й4Т (4бЬ) наблюдается узкий изотропный сигнал (рис 4е), подтверждающий формирование мицелл. При совместном формировании липосом фосфатидилхолина и конъюгата (46Ъ) проявляется широкий сигнал с характерным квадрупольным расщеплением (рис 4д), свидетельствующий, что молекулы в составе липосом претерпевают анизотропное движение. При совместной инкубации мицелл конъюгата ¿4Т (46Ь) с липосомами фосфатидилхолина в спектрах 2Н ЯМР наблюдается сигнал, представляющий суперпозицию трех сигналов (рис 4г): двух узких изотропных сигналов воды 2Н'НО и конъюгата ■ с!4Т (461)) в составе мицелл, и анизотропного сигнала с квадрупольным расщеплением, что свидетельствует о прошедшем массообмене между липосомами и мицеллами. Соотношение площадей одного изотропного (за вычетом сигнала 2Н'НО) и анизотропного сигнала дает значение коэффициента распределения молекул алкилфос-фонуклеозида между мицеллами и липосомами.

При сравнении действия мицелл конъюгата с14Т (4бЬ) и ДФХ на липосомы яичного фосфатидилхолина начальные стадии солюбилизации наблюдаются: для конъюгата <14Т (46Ь) при мольном соотношении 1/17 и для ДФХ при соотношении 1/67. Это подтверждает, что ДФХ, по отношению к мембранам, обладает более активным солюбилизирующим действием, чем алкилфосфонуклеозид. Таким образом, предложенным методом можно проводить сравнение солюбилизирущего действия амфифильных конъюгатов аналогов нуклеозидов и других амфифильных веществ, а также исследовать кинетику процесса встраивания веществ в мембрану, при условии : проведения ЯМР-экспериментов через выбранные промежутки времени после при-

Таблица 8.

Соотношения интенсивносгей изотропных и анизотропных сигналов в спектрах 31Р ЯМР.

Соотношение конъюгат лецитин При 30°С При 60°С

Через 1 час Через 24 часа

1/4 1/1,50 1/1,20 1/1,05

1/8 1/1,80 1/1,58 1/1,06

1/17 1/2,30 1/2,00 1/1,47

1/17 (контрольн.) 1/2,09 1/1,96 1/1,33

готовления образцов. На основании данных о солюбилизирующей способности можно делать предположения о способности исследованных соединений преодолевать биологические мембраны.

ВЫВОДЫ

1) Синтезированы алкильные синтоны для получения аналогов нуклеозидов состава С5: (Е)-5-ацетокси-1-бромпент-2-ен, (Т) + (Е)-5-ацетокси-1,1-диметокси-пент-2-ен.

2) На основе полученных синтонов состава С5 синтезировано десять новых ациклических аналогов нуклеозидов (2а-с), (За-с), (4а, Ь), (5а, Ь).

3) Произведено биологическое тестирование синтезированых соединений на анти-ВИЧ-активность, установлена связь биологической активности: а) с удаленностью 5'ОН-группы от атома азота гетероцикла (N-1 - для пиримидиновых и N-9 - для пу-риновых аналогов нуклеозидов), б) с наличием Г-метокси-группы, атом кислорода которой, вероятно, имитирует атом кислорода рибозного цикла, в) со структурой гетероцикла (модификация пуриновых гетероциклов). Следует отметить, что все соединения проявили заметную активность и не проявляли токсичности при концентрациях до 100 мкг/мл.

4) Для отработки методики изучения взаимодействия амфифильных аналогов нуклеозидов с мембранами синтезированы амфифильные дейтерий меченый и немеченый аналоги дидезоксидидегидротимидина.

5) На основе синтезированных амфифильных аналогов нуклеозидов отработана методика изучения кинетики встраивания и распределения амфифильных молекул в системе вода — модельные мембраны методом 2Н, 31Р ЯМР -спектроскопии. Данные,

полученные по этой методике, позволяют оценить способность амфифильных аналогов нуклеозидов преодолевать биологические мембраны.

Основное содержание диссертации изложены в следующих работах:

1. Цытович А.В., Шамшин Д.В., Бурковский В.Б., Швец В И. // Ациклические аналоги нуклеозидов П. Ациклические аналоги гуанозина, 7-дезазагуанозина и 7-дезазааденозина, содержащие цис-гидроксипентеновый фрагмент. / Биоорганическая химия. - 1995. - Т. 21, № 11. - С. 874-880.

2. Василенко И.А., Шамшин Д.В., Цытович А.В., Кан А.Н., Алексеева С.Г., Швец В.И. // Ациклические аналоги нуклеозидов III. Синтез новых ациклических аналогов 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидронуклеозидов. / Биоорганическая химия. - 2004. - Т. 30, №6.-С. 607-612.

3. Василенко И.А., Шамшин Д.В., Маликова Н.Н., Алексеева С.Г., Швец В.И. // Синтез амфифильных аналогов нуклеозидов и изучение их взаимодействия с модельными мембранами. / Биологические мембраны. - 2005. - Т. 22, Ла 4. - С. 356360.

4. Tsytovith AV., Philippov D.V., Shamshin D.V.. / Acyclic anallogs of didieoxynucleosides containing modified heterocycles // Abstr. 14th Intemat. Symp. on Heterocyclic Chem. 1993. - Antwerp. - P. 01-65.

5. Tsytovith A.V., Shamshin D.V., Burkovsky V.B.. / Acyclic didioxydidehydronucleoside analogs - potential antiretroviral agents (structure-activity relationship). // Abstr. 13th Internat. Congr on Medicinal Chemistry, - 1994. - Paris. - P. 201.

6. Цытович А. В., Шамшин Д.В., Коваленко A.B., Покидышева Л. Н., Титова И. В., Миллер Г. Г.. / Новые ациклические аналоги нуклеозидов, содержащие гидрокси-пентеновый фрагмент (тезисы) // Юбилейная научная сессия, посвященная 100-летию со дня рождения проф. H. А. Преображенского. - 1996. - Россия, Москва. - С. 145-146.

7. Василенко И.А., Коваленко A.H, Шамшин Д.В. / Разработка методов введения дейтерий-меченных липофильных фрагментов в различные биологическиактивные соединения, (тезисы) // 6-ая международная конференция „Наукоемкие технологии". - Россия, Москва, 1999. - С.179-180.

к исполнению 11/09/2006 Исполнено 12/09/2006

Заказ № 609 Тираж: 100 эк'л.

Формат 60x90/16 Объем 1.5 усл.тт.л. ООО «11-й ФОРМАТ.» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56

wwvv.auloreferat.ni

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Шамшин, Дмитрий Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Введение.

1. Аналоги нуклеозидов.

1.1. Аналоги ацикловира.

1.2. Аналоги ганцикловира.

1.3. Фиксированные модификации аналогов ганцикловира.

1.4. Аналоги ганцикловира с заменой атома кислорода на атом серы.

1.5. Аналоги нуклеозидов „разомкнутые " по С2'-СЗ'-связи.

1.6. Ациклические аналоги нуклеозидов, содержащие атом кислорода в положении Гили 3'.

1.7. Ациклические аналоги нуклеозидов, содержащие метокси-группу при С-1' атоме.

1.8. Другие ациклические аналоги.

1.9. Аналоги нуклеозидов с циклической структурой.

2. амфифильные аналоги нуклеозидов. 3 о

2.1. Эфиры нуклеозидмонофосфатов аналогов нуклеозидов.

2.1.1. Алкильные и арилъные эфиры аналогов нуклеозидов.

2.1.2. Циклофосфаты аналогов нуклеозидов.

2.2. Динуклеозидмонофосфаты.

2.3. Фосфолипидные и стероидные производные нуклеозидов.

2.4. Эфиры Н-фосфанатов нуклеозидов.

3. фосфонаты аналогов нуклеозидов.

Резюме.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Синтез ациклических аналогов нуклеозидов.

1.1. Синтез аналогов нуклеозидов, содержащих цис-пентеновый фрагмент.

1.1.1. Синтез цис-пентенового фрагмента.

1.1.2. Синтез аналогов нуклеозидов, содержащих цис-пентеновый фрагмент.

1.2. Синтез аналогов нуклеозидов, содержащих транс-пентеновый фрагмент и оксиметилъную группу в положении Г цис- и транс- пентенового фрагмента.

1.2.1. Синтез ациклических фрагментов для получения аналогов нуклеозидов, содержащих трапс-пептеновый фрагмент и оксиметилъную группу в положении

1'цис- и транс- пентенового фрагмента.

1.2.2. Получение аналогов нуклеозидов, содержащих транс-пентеновый фрагмент и оксиметилъную группу в положении 1'цис- и транс- пентенового фрагмента. 55 1.3. Результаты биологического тестирования ациклических аналогов нуклеозидов.

2. Синтез амфифильных аналогов нуклеозидов и изучение их взаимодействия с модельной мембраной.

2.1. Синтез 3-0-додецил-1-0-фосфо-5 '-(2', 3 '-дидезокси-23 '-дидегидро)-тимидина (46а, Ъ).

2.2. Синтез додецил-(у-2Нз)фосфорилхолина.

2.3. Исследования взаимодействия с мембраной ДФХ и конъюгата с14Т.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Материалы и методы.

2. Биологическое тестирование синтезированных аналогов нуклеозидов.

3. Синтез пентеновых синтонов для ациклических аналогов нуклеозидов.

3.1. Синтез (Е)-5-0-Ацетил-1-бромпент-2-ена (27).

3.2. Синтез (Е+2)-5-0-Ацетил-1,1-диметоксипент-2-ена (28).

4. Синтез ациклических аналогов гуанозина, 7-деазагуанозина и 7-деаза-аденозина, содержащие цис-гидроксипентеновый фрагмент.

5. Синтез ацетилзащищенных метоксипентнновых аналогов нуклеозидов.

6. Синтез ацетилзащищенных Е-пентеновых аналогов нуклеозидов.

7. Общая методика деблокирования гидроксильной группы аналогов нуклеозидов (2,3,4,5).;.

8. Синтез амфифильных аналогов нуклеозидов.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертация по химии, на тему "Ациклические аналоги нуклеозидов и их амфифильные производные"

В настоящее время в биохимии и медицине идет интенсивный поиск новых биологически активных веществ обладающих антивирусными и противоопухолевыми свойствами. Среди потенциальных веществ подобного рода большое внимание уделяется аналогам нуклеозидов, их фосфорным и амфифильным производным. На их основе созданы и внедрены в практику такие препараты, как ацикло-вир, ганцикловир, азидотимидин и др. При включении таких нуклеозидов в цепь ДНК предполагается прекращение дальнейшей элонгации цепи праймера.

Таким образом, актуальными представляются следующие направления работы: синтез новых аналогов нуклеозидов модифицированной структуры с целью поиска наиболее эффективного субстрата вирусных ДНК-полимераз; модификация структуры аналогов нуклеозидов, облегчающих их встраивание в мембрану; разработка метода изучения взаимодействия амфифильных аналогов нуклеозидов с модельными мембранами, позволяющего сделать сравнительную оценку солюби-лизирующей способности модифицированных аналогов нуклеозидов по отношению к мембранам, для сравнения эффективности дальнейшей модификации аналогов нуклеозидов липофильными фрагментами.

В этой работе описаны: синтез новых ациклических аналогов нуклеозидов, модифицированных как по гетероциклическому основанию, так и по углеводному фрагменту и результаты их биологического тестирования; синтез амфифильных аналогов нуклеозидов, методика изучения их взаимодействия с модельной мембраной с помощью метода ЯМР-спектроскопии.

Аналоги нуклеозидов, модифицированные по гетероциклическому фрагменту, могут обладать более низкой цитотоксичностью и более высокой активностью, чем их предшественники. Среди аналогов нуклеозидов, модифицированных по углеводному фрагменту, особое внимание привлекают ациклические аналоги, не имеющие гидрокси-групп в 2'- и в 3'- положении: при включении 5'-трифосфатов таких нуклеозидов в цепь ДНК предполагается прекращение дальнейшей элонгации цепи праймера.

Полярность аналогов нуклеозидов затрудняет их проникновение через клеточные мембраны. Для решения проблемы транспорта таких соединений внутрь клетки были получены конъюгаты аналогов нуклеозидов с липофильным фрагментом. Разработанная методика предназначена для изучения взаимодействия дейтерий меченных конъюгатов с модельной мембраной и позволяет оценить способность амфифильных аналогов нуклеозидов встраиваться в мембрану. При допущении, что лимитирующей стадией процесса транспорта амфифильных аналогов нуклеозидов является их встраивание в мембрану, предлагаемая методика может стать удобным инструментом более точной оценки возможностей новых амфи-фильных нуклеозидов преодолевать биологические мембраны, чем, применяемый в настоящее время, расчет коэффициента распределения log п.

Целями работы явились: 1) синтез новых ациклических аналогов нуклеозидов, обладающих противовирусной активностью и содержащих кратные связи в алкильном фрагменте; 2) установление связи „структура - биологическая активность" синтезированных соединений; 3) для сравнения эффективности дальнейшей модификации аналогов нуклеозидов липофильными фрагментами - разработка метода изучения взаимодействия дейтерий меченых амфифильных аналогов нуклеозидов с мембранами методом 2Н и 31Р ЯМР-спектроскопии и 4) с целью отработки этого метода - синтез дейтерий меченого и немеченого амфифильного аналога нуклеозида.

Литературный обзор

Синтез аналогов нуклеозидов. Структура - антивирусная активность.

Введение.

После открытия в 1959 году первого ациклического аналога нуклеозида - 5-йодо-2'-дезоксиуридина, а затем ацикловира (рис. 1), обладающих противоретро-вирусной активностью, в направлении синтеза новых противовирусных агентов в течение многих десятилетий десятилетия доминировали ациклические аналоги нуклеозидов [1]. Выявление среди аналогов нуклеозидов эффективных противовирусных препаратов [2] (ацикловир, ганцикловир, пенцикловир (рис. 1) и др.), обусловило расширение исследований, направленных на поиск более активных соединений этого класса. Противовирусное действие аналогов нуклеозидов заключается в следующем: их трифосфаты при включении в цепь ДНК прекращают дальнейшую элонгацию цепи праймера (например, из-за отсутствия в молекуле термина-торного субстрата З'-гидроксильной группы). Поэтому новые аналоги нуклеозидов должны обладать с одной стороны достаточно схожей с природными нуклеозида-ми структурой и правильно распознаваться при синтезе вирусной ДНК, с другой стороны их структура должна достаточно отличаться от природных нуклеозидов, чтобы при синтезе ДНК человека их распознавание было бы затруднено. В связи с этим, при биологическом тестировании на культуре клеток определяются

ГШ

Я=Н Ацикловир К=1^-С|Н€(0)— Валацикловир СН(СН3)2 ш ко-1 ол

11=Н Ганцикловир 11= Н21Ч-С|Н€(0)— Валганцикловир СН(СН3)2

11=Н, Х=ОН Пенцикловир 11= СН3СО, Х= Н Фамцикловир

ГШ2 о^гг

НО' ^

НО'

Цидофовир

0, ко

11=Н Тенофовир К=(СНз)2СН0С(0)0СН2-Тенофовир дисопроксил

11=Н Адефовир

К=(СНз)зСС(0)0СН2-Адефовир дипивоксил две характеристики: ингибирование вирусной ДНК характеризуется эффективной дозой (ED50 - концентрация 50-процентного ингибирования воспроизводства ДНК вируса) и цитотоксичность (IC50 - концентрация, приводящая к гибели 50% клеточной культуры).

Первые аналоги нуклеозидов обладали высокой цитотоксичностью и, поэтому, применение их было ограничено. Значительным шагом в области синтеза новых нуклеозидных противовирусных препаратов был синтез в 1977 году ацик-ловира: 9-(2-гидроксиэтоксиметил)гуанина [3]. В последствии ацикловир стал ре-ференс препаратом для новых нуклеозидов, обладающих антивирусным действием в отношении вирусов герпеса типа 1 и 2 и вируса опоясывающего лишая ветряной оспы. Следом за ацикловиром были синтезированы ганцикловир [4] и пенцикловир (1987) [5] (рис. 1). Эти аналоги нуклеозидов обладают эффективными подавляющими концентрациями против вируса герпеса менее 1 мкМ.

Применение вышеперечисленных аналогов нуклеозидов ограничено их малой растворимостью в воде. С целью увеличить растворимость препаратов в воде были синтезированы их сложноэфирные производные: валацикловир [6], валган-цикловир и фамцикловир [7,8]. Эти соединения, обладая хорошей растворимостью в воде, оказались более удобными для создания противовирусных препаратов. Они лучше усваивались, легко гидролизовались в организме с образованием соответствующих аналогов нуклеозидов, которые прекращали дальнейшее развитие ДНК вирусов.

Существует еще одно осложнение применения аналогов нуклеозидов в противовирусной терапии - их фосфорилирование в клетке затруднено и протекает медленно. Быстрое появление резистентных штаммов вирусов к препаратам на основе этих нуклеозидов в значительной степени тоже связано с трудностью и высокой избирательностью процесса первичного фосфорилирования нуклеозидов в клетке. Фосфаты нуклеозидов гидролизуются в процессе метаболизма клеток. Эти обстоятельства послужили причиной синтеза фосфонатов аналогов нуклеозидов: цидофовира [9], адефовира [10], тенофовира [11]. Цидофовир стал первым фосфо-натом ациклического нуклеозида, применяемым при терапии цитомегаловируса и СПИДа. Адефовир и тенофовир также применялись в терапии СПИДа. Однако все фосфонатные аналоги нуклеозидов медленно проникали в клетки по причине их высокой полярности и низкой липофильности.

Дальнейшее развитие противовирусных препаратов привело к синтезу сложных эфиров фосфонатов ациклических нуклеозидов, обладающих более высокой способностью проникать через клеточные мембраны. Первым в ряду этих соединений был адефовир дипивоксил [12], применявшийся при терапии СПИДа. Однако высокая токсичность принуждала сокращать дозировку препарата. В настоящее время это соединение используется при лечении герпеса при дозировке около 10 мгв день [13,14]. Позже был синтезирован тенофовир дисопроксил [15].

Противовирусная химеотерапия постепенно преодолела консервативное сопротивление, основанное на предпосылке, что химические препараты должны неизбежно быть токсичны для организма в целом. Значительно способствовало преодолению этого предубеждения открытие таких противовирусных агентов, как ацикловир и ганцикловир. В настоящее время кроме препаратов, содержащих одно противовирусное соединение, разрабатываются и применяются препараты, являющиеся комбинацией различных противовирусных агентов. При разработке новых противовирусных лекарственных препаратов поиск новых пролекарств -ациклических аналогов нуклеозидов остается актуальной задачей.

Синтез новых аналогов нуклеозидов авторы публикаций обосновывали схожестью пространственного расположения функциональных групп либо с природными нуклеозидами, либо с уже известными аналогами нуклеозидов, обладающих биологической активностью. В структуру, новых аналогов нуклеозидов вносились следующие изменения: модификация гетероциклических оснований, ациклических фрагментов, имитирующих сахарный остаток, или комбинирование модифицированных составляющих. По структуре ациклического фрагмента можно выделить следующие направления поиска новых биологически активных ациклических аналогов нуклеозидов: аналоги ацикловира, аналоги ганцикловира, аналоги ганцикловира с фиксированной структурой, аналоги нуклеозидов с заменой в ациклическом фрагменте атома кислорода на атом серы, аналоги нуклеозидов с атомом кислорода в положении 1' или 3', аналоги природных нуклеозидов, разомкнутых по 2'С-З'С связи; аналоги нуклеозидов с 1'-метокси группой и другие модификации. По таким группам систематизирован материал в обзоре.

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

ВЫВОДЫ

1) Синтезированы алкильные синтоны для получения аналогов нуклеози-дов состава С5: (Е)-5-ацетокси-1-бромпент-2-ен, + (Е)-5-ацетокси-1,1 -диметокси-пент-2-ен.

3) Произведено биологическое тестирование синтезированных соединений на анти-ШУ-активность, установлена связь биологической активности: а) с удаленностью 5'ОН-группы от атома азота гетероцикла (N1 - для пиримидиновых и N9 - для пуриновых аналогов нуклеозидов), б) с наличием Г-метокси-группы, атом кислорода которой вероятно имитирует атом кислорода рибозного цикла, в) со структурой гетероцикла (модификация пуриновых гетероциклов). Следует отметить, что все соединения проявили заметную активность и не проявляли токсичности при концентрациях до 100 мкг/мл.

4) Для отработки методики изучения взаимодействия амфифильных аналогов нуклеозидов с мембранами, синтезированы амфифильные дейтерий меченый и немеченый аналоги дидезоксидидегидротимидина.

5) На основе синтезированных амфифильных аналогов нуклеозидов отработана методика изучения кинетики встраивания и распределения амфифильных молекул в системе вода - модельные мембраны методом 2Н, 31Р ЯМР-спектроскопии. Данные, полученные по этой методике, позволяют оценить способность амфифильных аналогов нуклеозидов преодолевать биологические мембраны.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Шамшин, Дмитрий Викторович, Москва

1. De Clercq Е. and Field H. J. / Review. Antiviral prodrugs the development of successful prodrug strategies for antiviral chemotherapy. // British Journal of Pharmacology. 2006. 147. P. 1-11., published online 14 November 2005.

2. Harnden M. R., Baley S., Boyd M. R. / Synthesis of Novel Series of Acyclic Nucleoside Analogues. // Top. Med. Chem. Proc. 4th SCI-RSC Med. Chem. Symp. Cambridge, 6th-9th. Sept. 1988. London. P. 213-244.

3. Elion G. В., Furman P. A., Fyfe J. A., De Miranda P., Beauchamp L. & SchaefFer H. J. / Selectivity of action of an antiherpetic agent, 9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977.74. P. 5716-5720.

4. Crumpacker C. S. / Ganciclovir. // N. Engl. J. Med. 1996. 335. P. 721-729.

5. Boyd M. R., Bacon Т. H., Sutton D. & Cole M. / Antiherpesvirus activity of 9-(4-hydroxy-3-hydroxymethylbut-l-yl)guanine (BRL39123) in cell culture. // Antimicrob. Agents Chemother. 1987. 31. P. 1238-1242.

6. Crooks R. J. / Valaciclovir a review of its potential in the management of genital herpes. // Antiviral Chem. Chemother. 1995. 6 (Suppl. 1). P. 39-44.

7. Vere Hodge R. A., Sutton D., Boyd M. R., Harnden M. R. & Jarvest R. L. / Selection of an oral prodrug (BRL 42810; famciclovir) for the antiherpesvinis ágent BRL 39123 9-(4-hydroxy-3-hydroxymethylbut-l-yl)guanine; penciclovir., // Antimicrob. Agents

8. Chemother. 1989. 33. P. 1765-1773.

9. De Clercq E., Sakuma T., Baba M., Pauwels R., Balzarini J., Rosenberg I. & A. / Antiviral activity of phosphonylmethoxyalkyl derivatives of purine and pyrimidines. // Antiviral Res. 1987. 8. P. 261-272.

10. De Clercq E., Holy A., Rosenberg I., Sakuma T., Balzarini J. & Maudgal P. C. / A novel selective broad-spectrum anti-DNA virus agent. // Nature. 1986. 323. P. 464-467.

11. Keppeler K., Kiefer G. and De Clercq E. / Synthesis and Antiviral Activity of Acyclic Derivatives of 5-Etyl-2'-Deoxyuridine// Arch. Pharm. 1986. 319. P. 360-365.

12. GoudgaonN. М. and Schinazi R. F. / Activity of Acyclic 6-(Phenilselenil)pyrimidine Nucleosides against Human Immunodeficietncy Viruses in Primary Lymphocytes // J. Med. Chem. 1991. 34. P. 3305-3309.

13. Tanaka H. et. al. / A New Class of HIV-1-Specific 6-Substituted Acyclouridine Derivatives: Synthesis and Anti-HIV-l Activity of l-(2-Hydroxyetoxy)metyl.-6-(phenylthio)thymine (HEPT)//J. Med. Chem. 1991. 34. P. 349-357.

14. Robins M. J., Hatfield P. W., Balzarini J., and De Clercq E. / Nucleic Acid Related Compounds. 47: Synthesis and Biological Activities of Pyrimidine and Purine "Acyclic" Nucleoside Analogues. //J. Med. Chem. 1984. 27. P. 1486-1492.

15. Hasan A. and Srivastava P. C. / Synthesis and Biological Studies of Unsaturated Acyclonucleoside Analogues of S-Adenosil-L-homocysteine Hydrolase Inhibitors. // J. Med. Chem. 1992. 35. P. 1435-1439.

16. Kumar R., Sharma N., Nath M., Holly A. SafFran, and Lome J. D., Tyrrell. / Synthesis and Antiviral Activity of Novel Acyclic Nucleoside Analogues of 5-(l-Azido-2-haloethyl)uracils. //J. Med. Chem. 2001. 44(24). P. 4225-4229.

17. Ogilvie K. K. et. al. / Synthesis of a purine acyclonucleoside series having pronounced antiviral activity. The glyceropurines. // Can. J. Chem. 1984. V. 62. P. 241-252.

18. Ogilvie K. K. et. al. / N-Substituted acyclopurinenucleosides with antiviral activity. //Nucleosides & Nucleotides. 1985.4(4). P. 507-513.

19. Ogilvie K. K. and Proba Zb. A. / Synthesis of purine and pyrimidine trihydroxyaacy-clonukleosides. // Nucleosides & Nucleotides. 1984. 3(5). P. 537-547.

20. Lazrek H. B., Taourirte M., Barascut J.-L. and Imbach J.-L. / Novel Acyclic Analogues of 3'-Azido-3'-Deoxythymidine l-Hydroxy-3-Azido-2-propoxymethyl Derivatives.//Nucleosides & Nucleotides. 1989. 8(5&6). P. 1093-1095.

21. Hsu L.-Y., Wise D. S., Kucera L. S., Drach J. C., and Towensend L. B. / Synthesis of Anti-Restricted Pyrimidine Acyclic Nucleosides. // J. Med. Chem. 1992. 57. P. 3354— 3358.

22. Kumar A. and Walker R. T. / The Chemistry of 2',3'-Seconucleosides IV. Synthesis and Reactions of 3'-Azido-2',3'-Dideoxy-2',3'-Secothymidine and Related Analogues. // Tetrahidron. 1990. Vol. 46. №9. P. 3101-3110.

23. Harnden M. R., Jennings L. J., and Parkin A. / Synthesis of 1-(Hydroxyalkoxy)pyrimidines, a Novel Series of Acyclic Nucleoside Analogues. // J. Chem. Soc. Trans. 1990.1. №8. P. 2175-2183.

24. Holy A., Rosenberg I., Dvorakova H., and De Clercq E. / Synthesis and Evaluation of Acyclic Nucleotide Analogs. //Nucleosides & Nucleotides. 1988. 7(5&6). P. 667670.

25. Bailey S., Harnden M. R. / Novel Acyclic Analogues of Purine Nucleosides: 2,3-Dihydroxy-l-Metoxypropil and 3-Hydroxy-1-Metoxypropil Derivatives. //Nucleosides & Nucleotides. 1987. 6(1&2). P. 391-392.

26. Tippie M. A., Martin J. C., Smee D. F., Matthews T. R., and Verheyden P. H. / Antiherpes Simplex Virus Activity of 9-4-Hydroxy-3 -(Hydroxymethyl)-1 -Butyl.guanine. //Nucleosides & Nucleotides. 1984. 3(5). P. 525-535.

27. Martin J. C., Smee D. F., Verheyden P. H. / Synthesis of 9-(4-Hydroxy-2-oxybutyl)guanine, and Related Acyclic Nycleoside Analogues. // J. Org. Chem. 1985. 50. №6. P. 755-759.

28. Vemishetti P., Saibaba R., Panzica R. P., and Abushanab E. / The Preparation of 2'-Deoxy-2'-fluoro-l',2'-seconucleosides as Potencial Antiviral Agents. // J. Med. Chem. 1990. 33. P. 681-686.

29. Hayashi S., Phadtare S., Zemlicka J., Matsukura M., Mitsuya H., Border S. / Synthesis of 1 -(4-hidroxy-1,2-butadien-1 -il)cytosine. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. № 16. P. 6127-6131.

30. Цытович А. В., Кочеткова M. В., Кузнецова Е. В., Мицнер Б. И., Швец В. И. /

31. Ациклические Аналоги Нуклеозидов. I. Исследование Способа Синтеза Аллено-вых Производных Нуклеозидов. //Биоорг. Химия. 1991. Т. 17. № 8. С. 1086-1093.

32. Lee Young Rang, Park Ju-Hyun, Jeon Raok, Jeong Lak Shin, Chun Moon Woo, Kim Hee-Doo / Design and synthesis of novel fluorocyclopropanoid nucleosides. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 2001 20(4-7) 677-679.

33. JeannotF., Mathe C., Gosselin G. / Synthesis and antiviral evaluation of3-C-trifluoromethyl nucleoside derivatives bearing adenine as the base. //Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2001. 20(4-7), 755-758.

34. Yoo Su Jeong, Kim Hea Ok, Lim Yoongho, Kim Jeongmin, Jeong Lak Shin /

35. Synthesis of novel (2R,4R)- and (2S,4S)-iso dideoxynucleosides with exocyclic methylene as potential antiviral agents. // Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2002. V. 10(1). P. 215-226.

36. Gumina G., Schinazi R. F., Chu Chung K. / Synthesis and Potent Anti-HIV Activity of L-3'-Fluoro-2',3 -Unsaturated Cytidine. // Organic Letters. 2001. V. 3(26). P. 41774180.

37. Jones B. C., McGuigan C., Riley P. A. / Synthesis and biological evaluation of some phosphate triester derivatives of the anti-cancer drug araC. //Nucleic Acids Res. 1989. V. 17(18). P. 7195-7201.

38. McGuigan C., Tollerfield S. M., Riley P. A. / Synthesis and biological evaluation of some phosphate triester derivatives of the anti-viral drug AraA. //Nucleic Acids Res. 1989. V. 17(15) P. 6065-6075.

39. McGuigan С., O'Connor Т. J., Swords В., Kinchington D. / Simple phospholipids have selective anti-HIV activity. // AIDS. 1991. V. 5(12). P. 1536-1537.

40. Devine K. G., McGuigan C., O'Connor T. J., Nicholls S. R., Kinchington D. / Novel phosphate derivatives of zidovudine as anti-HIV compounds. // AIDS. 1990. V. 4(4). P. 371-373.

41. Herdewijn P., Balzarini J., De Clercq E., Pauwels R., Baba M., Broder S., Vanderhaeghe H. / 3'-substituted 2',3-dideoxynucleoside analogues as potential anti-HIV (HTLV-III/LAV) agents. // J Med Chem. 1987. V. 30(8). P. 1270-1278.

42. McGuigan C., Davies M., Pathirana R., Mahmood N., Hay A. J. / Synthesis and anti-HIV activity of some novel diaryl phosphate derivatives of AZT. // Antiviral Res. 1994. V. 24(1). P. 69-77.

43. Арзуманов А., Дяткина H. / Модифицированные фосфаты нуклеозидов -предшественники противоопухлевых и противовирусных препаратов в клетке. // Биоорганическая Химия. 1996. Т.22. N 10-11. С. 777-794.

44. Tener G. М., Gilham Р. Т., Razzell W. Е., Turner A. F., Khorana Н. G. / Studies onthe chemical synthesis and enzymatic degradation of desoxyribo-oligonucleotides. // Ann N Y Acad Sci. 1959. 81. P 757-775.

45. Walker R. T., Slater M. J., Jones A. S., Balzarini J., De Clercq E. / The synthesis and biological properties of some 5-substituted-2'-deoxyuridines. // Nucleic Acids Symp Ser. 1985. V. 16 P. 291-294.

46. Hunston R. N. Jones A. S., McGuigan C., Walker R. T., Balzarini J., De Clercq E. / Synthesis and biological properties of some cyclic phosphotriesters derived from 2-deoxy-5-fluorouridine. //JMed Chem. 1984. V. 27(4). P.440-444.

47. Puech F., Gosselin G., Lefebvre I., Pompon A., Aubertin A. M., Kirn A., Imbach J. L. / Intracellular delivery of nucleoside monophosphates through a reductase-mediated activation process. // Antiviral Res. 1993. 22(2-3). P. 155-174.

48. Busso M., Mian A. M., Hahn E. F., Resnick L. / Nucleotide dimers suppress HIV expression in vitro. // AIDS Res Hum Retroviruses. 1988. V. 4(6). P. 449-455.

49. Henin Y., Gouyette C., Schwartz 0., Debouzy J. C., Neumann J. M., Huynh-Dinh T. / Lipophilic glycosyl phosphotriester derivatives of AZT: synthesis, NMR transmembrane transport study, and antiviral activity. // J Med Chem. 1991. V. 34(6). P. 1830-1837.

50. Henin Y., Gouyette C., Schwartz 0., Debouzy J. C., Neumann J. M., Huynh-Dinh T. / Lipophilic glycosyl phosphotriester derivatives of AZT: synthesis, NMR transmembrane transport study, and antiviral activity. // J Med Chem. 1991. V. 34(6). P. 1830-1837.

51. Namane A., Gouyette C., Fillion M. P., Fillion G., Huynh-Dinh T. / Improved brain delivery of AZT using a glycosyl phosphotriester prodrug. // J Med Chem. 1992. V. 35(16). P. 3039-3044.

52. MacCross M., Robins M. / The Chemistry of Antitumor Agents. // N. Y.: Acad. Press, 1990. P. 261-298.

53. McGuigan C., Bellevergue P., Sheeka H., Mahmood N., Hay A. J. / Certain phosphoramidate derivatives of dideoxy uridine (ddU) are active against HIV and successfully by-pass thymidine kinase. // FEBS Lett. 1994. V. 351(1). P. 11-14.

54. Holy A., Votruba I., Masojidkova M., Graciela A., Snoeck R., Naesens L., De Clercq E. and Balzarini J. / 6-2-(Phosphonomethoxy)alkoxy.pyrimidines with antiviral activity. // J Med Chem. 2002.45(9). P. 1918-1929.

55. Zidek Z, Potmesil P, Kmoniekova E, Holy A. / Immunobiological activity of N-2-(phosphonomethoxy)alkyl. derivatives of N6-substituted adenines, and 2,6-diaminopurines. //Eur J Pharmacol. 2003. 475(1-3). P. 149-159.

56. Мицнер Б. И., Кочеткова М. В., Филиппов Д. В., Цитович А. В., Дяткина Н. Б. /

57. Синтез аналогов нуклеозидов, содержащих г/ис-2-пентеновый фрагмент, и их три-фосфатов.//Молекулярная биология. 1993. Т27. Вып. 1. С. 174-184.

58. Krayevsky A. A., Victorova L. S., Mozzherin D. Ju., Kukhanova M. K. / New modified substrates for discriminating between human DNA polymerases alpha and epsilon. //Nucleosides and Nucleotides. 1993. V. 12. N 1. P. 83-94.

59. Davoll J., Johnson A. M. / Quinazoline analogues of folic acid. // J. Chem. Soc. 1970. V. 8. P. 997-1002.

60. Seela F, Roling A. / 7-Deazapurine containing DNA: efficiency of c7GdTP, c7AdTP and c7IdTP incorporation during PCR-amplification and protection from endodeoxyribonuclease hydrolysis. //Nucleic Acids Res. 1992. 20(1). P. 55-61.

61. Seela F, Hansske F, Watanabe K, Cramer F. / Introduction of antigenic determining 2,4-dinitrophenyl residues into 4-thiouridine, N3-(3-L-amino-3-carboxypropyl) uridine and tRNA-Phe from E. coli. // Nucleic Acids Res. 1977 Mar;4(3):711-22.

62. Михайлов С. H. //Биоорган, химия. 1992. Т. 18. N 8. С. 1033-1066.

63. Флорентьев В. JL, Яворский А. Э., Кочеткова С. В., Смирнов И. П., Щавельева И. Л., Цылевич Т. Л., Готтих Б. П. / Биоорган. Химия. Т. 13. № 7. 1987. С. 10001001.

64. Флорентьев В. Л., Яворский А. Э., Решотько JI. Н. / Химико-фармацевтический журнал. 1988. Т. 22. №7. С. 833-836.

65. Флорентьев В. Л., Цылевич Т. Л., Кочеткова С. В. / Биоорган. Химия. 1987. Т. 13. №9. С. 1240-1244.

66. Okhanov V. V., Dubovskii P. V., Miroshnikov A. I. / Structure-functional studies of polymyxins. (l)-NMR analysis of polymyxin В and M conformation. // Bioorg Khim. 1991. V. 17(12) P. 1689- 1693.

67. Sergheraert C., Pierlot C., Tartar A., Henin Y., Lemaitre M. / Synthesis and anti-HIV evaluation of D4T and D4T 5'-monophosphate prodrugs. // J Med Chem. 1993. V. 36(7) P. 826-830. ;

68. Tirri L. J., Ayengar N. K., Lipton L. C., Chatteijie N., Brockerhoff H. / Studies on the hydrogen belts of membranes: III. Glycerol permeability of dihydrosphingomyelin-cholesterol membranes. //Lipids. 1978. V. 13(4). P. 267-269.

69. Чудинов M. Б., Аникин M. Б., Аникин А. Б., Брагина H. А., Чупин В. В., Серебренникова Г. А. / Биоорган. Химия. 1993. Т. 19. №2. С. 250-261.

70. Цытович А. В., Кочеткова М. В., Кузнецова Е. В., Мицнер Б. И., Швец В. И. / Ациклические аналоги нуклеозидов I. Исследование способа синтеза алленовых производных нуклеозидов. //Биоорган. Химия. 1991. т. 17. № 8. С. 1086-1093.

71. Miyoshi I., Kubonishi I., Yoshimoto S., Akagi Т., Ohtsuki Y., Shiraishi Y., Nagata

72. К., Hinuma Y„ / Type С virus particles in a cord T-cell line derived by co-cultivating normal human cord leukocytes and human leukaemic T cells. //Nature. 1981.294(5843). P. 770-771.

73. Миллер Г. Г., Быковский А. П., Покидышева JI. Н., Титова И. В. / Патент РФ № 2067116 31.01.1994 г.