Эффективная и селективная модификация ДНК в присутствии эффекторов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.113 (4 + 7)

ПОДЫМИНОГИН Михаил Александрович

ЭФФЕКТИВНАЯ И СЕЛЕКТИВНАЯ

МОДИФИКАЦИЯ ДНК В ПРИСУТСТВИИ ЭФФЕКТОРОВ

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссергации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск — 1992

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической хим.СО РАН.

Чау'.'ный руководитель - доктор химических наук

Зарытова В.Ф.

Официальные оппоненты: кандидат химических наук

Халимская Л.М. доктор химических наук Петренко В.А.

Ведуща. организация.- Институт цитологии и генетики СО РАН

(г. Новосибирск)

Защита отстоится " т-сн# 1992 г. в 9 часов на заседании С)1т;и,1!м;1аировашиго совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Ноьосяоирск-ЭО, пр. Лаврентьева, 6.

С диссертацией можно ознакомиться б библиотеке Новосибирско го института биоорганической химии.

Автореферат разослан " 20* д^^мЯН-.

1992 г.

Учёный секретарь Спиш'алигированного

совета, кандидат химических наук О.С. Федорова

Актуальность проблемы. В основу метода адресованной модификации нуклеиновых кислот (НК) положена внутрикомплексная реакция полинуклеотида и комплементарного определенному его участку реакционноспособного производного адресующего олиго-нуклеотида. Применение данного подхода открывает широкие возможности для направленного мутагенеза, химического фраг-ментирования НК, а также избирательного воздействия на их функциональную активность в живых клетках. Успешное решение данных задач возможно лишь на базе высокоэффективных и селективных олигонуклеотидных реагентов. Трудоемкость синтеза препаративных количеств протяженных олигонуклеотидов, сложности, связанные с выделением и очисткой их реакционноспо-собных производных, с одной стороны, а также высокая частота встречаемости сайтов узнавания коротких олигонуклеотидов и низкая стабильность их комплексов с КК-мишенью с другой, делают весьма актуальной разработку методов повышения эффективности и селективности действия реагентов с коротким оли-гонуклеогидным адресом. Примером может служить предложенный нами ранее подход, основанный на использовании эффекторов реакции модификации - н-(2-оксиэтил)феназиниевых (рьп) производных олигонуклеотидов, образующих прочный комплекс с НК-мишенью в непосредственной близости от участка связывания реагента.

Цель работы. Цель настоящей работы заключалась в изучении особенностей и преимуществ эффекгорного варианта комплементарно адресованной модификации, а также в попытке создания на его базе универсального метода направленного химического фрагментировавия однонитевых НК.

Научная новизна. В настоящей работе впервые проведена высокоселективная модификация одкоцепочечного фрагмента ДНК алкилирущими производными три-, тетрануклеотидов в присутствии рьп-производных олигонуклеотидов в качестве эффекторов. Предлагаемый в работе подход, основанный на использовании пары з•,5•-ди-РЬп-производных тетрануклеотидов, фланкирующих тетрануклеотидный реагент при образовании комплекса с мишенью, позволяет осуществлять направленную химическую "рестрикцию" достаточно протяженных однонитевых ДНК практически по любому заранее выбранному остатку гуанозина с выхс-

-з-

дом до 39».

Практическая ценность. Предложенный и экспериментально апробированный вариант метода комплементарно адресованной модификации НК может быть успешно■использован для повышения эффективности и селективности действия реакционноспособных производных олигонуклеотидов с коротким адресом (вплоть до три-, тетрануклеотидов). Он оказался продуктивным не только при модификации фрагмента ДНК с маловыраженной вторичной структурой, но и в случае высокомолекулярных РНК, таких как 16а рРНК б. соИ, обладающих слоеной пространственной организацией (Зенкова М.А. и др., 1991).

Продемонстрированный в работе факт достаточно эффективной сайт-специфической модификации фрагмента ДНК при помощи реагента и эффекторов на основе тетрануклеотидов открывает реальную возможность создания универсального метода направленного химического фрагментирования однонитевых нуклеиновых кислот.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на международном симпозиуме "Перспективы терапевтического и диагностического применения олигонуклеотидных производных" (Новосибирск, 1988), XV Всесоюзном совещании "Органическая химия ДНК-дуплексов" (Киев, 1989), VII Симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (Чехословакия, 1990),

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 106 страницах машинописного текста, состоит из 3 глав, введения, выводов, примечаний, списка цитируемой литературы из 135 наименований и содержит 5 таблиц и 6 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Олигонуклеотидные реагенты с короткой адресующей частью, наряду с такими достоинствами, как доступность исходных олигонуклеотидов и простота синтеза и очистки конечного продукта, обладают двумя серьезными недостатками. Во-первых, это сравнительно низкая константа ассоциации олигонуклеотодного адреса с комплементарной последовательностью НК-мпшени, а во-вторых, высокая частота встречаемости сайтов полного комплементарного связывания с протяженными полинуклеотидами.

-4-

Известно, что короткие олигонуклеотиды, способные образовывать с комплементарной матрицей комплекс с одноцепочечным разрывом (т.е. располагаться встык голова к хвосту), вступают в кооперативное взаимодействие, во многом определяющее термическую устойчивость полученной дуплексной структуры

(КЬогапа II. б . еЬ а1. , 1968).

Можно было предположить, что олигонуклеотид, образующий прочную дуплексную структуру в непосредственной близости от комплементарного комплекса реагента на НК-мшени, будет способствовать его стабилизации, тем самым повышая степень модификации мишени. Иначе говоря, будет служить эффектором реакции комплементарно адресованной модификации. Лучших эффек-торных свойств следовало ожидать от олигонуклеотидных производных, обладающих повышенным сродством к НК, например от олигонуклеотидов с коваленгно присоединеными остатками ин-теркалирующих красителей.

Для проверки данного предположения нами было проведено исследование (Зарытова В.Ф. и др., 1988) сайт-направленного алкилирования 302-членного одноцепочечного фрагмента ДНК 5 * —с( псНдМН—производным гексануклеотида (I) в присутствии октануклеотидных эффекторов (п)-(уи) (см. схему I). В качестве эффекторов были испытаны немодифицированные октанук-леотиды (и) и (V), а также их в'-моно- (III), (VI) и з',?'-ди-рьп-производные (IV) и (VII). Из схемы I видно, что поли-нуклеотидная мишень имеет два сайта полного комплементарного связывания реагента (I), один из которых вовлечен в образование шпилечной структуры (участок Б).

При последовательном введении в реакционную смесь, содержащую фрагмент ДНК и реагент (I), олигонуклеотидных эффекторов в стандартных условиях были получены результаты, представленные на рис. I. Добавление в реакционную смесь ок-тануклеотидов (и) или (V), образующих комплекс с мишенью в непосредственной близости от сайтов связывания реагента (I) соответственно в участке А или Б, не приводило к появлению продуктов адресованной модификации фрагмента. Ситуация менялась при использовании в качестве эффектора 5*-рьп-производ-ного октануклеотида (III) или (VI), причем эффектор (III) способствовал алкилированию только в участке А (схема I),

-5-

Схема I

ТАСССАССТССАСаТССТС

(XV) Ит-рСТСССАСГр-РЬп

Участок А

Т-А' т-а а-т гео-Св с-с

Т-А Т в

АйОААТТСат,,

сс,

I ,саатсАГ,а-с_ с т

, 26° г АоватлАаттсс,

(I) С1ЯСН2НН-рТТСССгД

(\'ш) С1 г?сн2йн-рттсссА

(IX) С1 !<СН2?Ш-рТСССА

(х) а (?сн2пн-рссол

(XI) С1ПСН2НН-рССЛ

рТТСААСОС (II)

РЬт-рТТСАлаас (111)

РЬп-рТТСЛАСОСр-РЬп (IV)

РЬп-рТТСАр-РЬп (XII)

РЬп-рТТСА (XIII)

РЬг.-рАСаСр-РЬп (XIV) 100

Участок Б

. ТТСаССААТССАТТСАСАСАСОССТ

стсстсссооасс

АСАаллааатстссаАССсАС0тлс,\аатсотС„САСГАОА !!; ! ; \ 120

(I) С1ПСН2«Н-рТТСССгА

(VIII) С1ПСН2КН-рТТСССА

(IX) С1 ГгСН2НН-рТСССА

(х) С1 ггсн2пн-рсссА

(XI) С1РСН2МН-рССА

рОАСССТСО (V )

РЬп-рОАСССТСа (VI)

РЬп-рОАОССТСар-РЬп (VII)

в о

СССааААААСАаТССАСССААССТТССССССаСССТСАСТаОСАСАСССТССАСА

100

тсааАстсаттсаассаасссааосссооАсатссАастасстАа

40 20

5 '

160

-ЙНСН2СН2НН,

РЬп-

сн,сн,он

I

n.

С1 я-

а

У?

СН2СН2С1

сн3

где он образует комплекс с фрагментом ДНК, а эффектор (VI) -соответственно только в участке Б (максимальное алкилирова-ние мишени протекало по основаниям агь7 и а 50 соответственно, см.рис. I). Введение дополнительно РЬп-остатка на з'-ко-

- 6-

нец 5 ■-рьп-производных <ш) и (VI), приводящее к повышению стабильности их комплементарных комплексов с НК-мишенью, вызывало увеличение выхода адресованного алкилирования фраг-

А

12 345678а Рис Л. Результата электрофоре ти-

оооооОС^^С? Р ческого анализа ( 8% денатурирующий ПААГ) 32р-меченных продуктов модификации 302-членного фрагмента ДНК алкилирушим реагентом (I) (дорожки 2-8). Реакции алкилирования во всех случаях проводили в 0.16м нас1, о,1гом ебта, 0.02м иа,нроч (рн 7.4) при 37°с в течение 18 ч. Перед проведением электрофореза препараты ДНК обрабатывали ю% водным пиперидином ( 30 мин, 95°с). Реакционные смеси сот держали дополнительно: на дорожках 2 и 6 - соответственно октав нуклеотиды (ii) и (v); 3 и 7 -5 1-рьп-производные (iii) и (vi); ; -—в-267 4 И 8 - 3 ' , 5 • -ди-рьп-производные

Ч»? * А

д (iv) и (vii). ДНК-фрагмент исход-

ив но присутствовал в концентрации 1•ю вм; реагент, октануклеотиды и их РЬп-производные - в концентрации 1.7*1о-5м. а+с - статистическое расщепление по пуринам.

а

о ' а

чс

мента реагентом (I) в их присутствии. В результате этого, после алкилирования ДНК-фрагмента гексануклеотидным реагентом в присутствии эффекторов (iv) или (vii) в условиях близких к физиологическим, и последующего расщепления мишени по остаткам алкилировэнных пуринов при обработке водным пиперидином, выход реакции направленной химической "рестрикции" по основаниям с267 и в150 составил соответственно 14 и 5%.

I. Модификация НК-мишени реагентами убывающей длины.

Как и ранее, в качестве НК-мишени использовали 302-член-ный одноцепочечный фрагмент ДНК. Его нуклеотидная последовательность может образовывать несколько шпилечных структур, две из которых приведены на схеме I.

Модификацию ДНК-фрагмента осуществляли 5'-с 1псн2?;н-производными гекса-, пента-, тетра- и тринуклеотидов (VIII)-(XI), имеющих одинаковую з'-концевую нуклеотидную последовательность, в течение 25 ч при 25°с. Результаты анализа продуктов направленного химического фрагментирования 302-мера после расщепления по остаткам пуринов, алкилированных указанными реагентами в присутствии октануклеотидного эффектора (IV) или (VII), представлены на рис. 2.

12 34*56789

150-

Рис. 2. Радиоавтограф 8% денатурирующего ПААГ после разделения продуктов расщепления ДНК-фрагмента, алкилированно-го реагентами (VIII)-(Х1)(дорожи 1-4 и 5-8 соответственно) в присутствии эффекторов (IV)(дорожки 1-4) и (VII)(дорожки 5-8). На дорояске 9 -представлены продукты модификации фрагмента ДНК гексанук-леотидным реагентом (VIII) в отсутствие эффекторов. Реакционные смеси исходно содержали 302-мер в концентрации 1<Г°м, реагенты (уш)-(Х1) -в концентрации Ю~5м, окта-нуклеотидные эффекторы (IV) и (VII)-в концентрации 2-ю~*м. Реакцию алкилирования проводили при 25°с, 25 ч.

сэ

6Э

о

т в

сэ

4Е&»

Как и следовало ожидать, из четырех исследованых реакци-онноспособных производных олигонуклеотидов наиболее эффективно алкилирует ДНК-фрагмент в присутствии того или иного эффектора гексануклеотидный реагент (VIII). Уровень направленной химической "рестрикции" для этого соединения по основаниям участка А (схема I) достигает 38х, тогда как для реагентов (IX), (х) и (XI) аналогичная величина составляет соответственно 23, 6 и 8% (адресованной считали модификацию по основаниям с,2Ъ2-аг67 участка А или о1<5-о150 участка Б). Второй сайт комплементарного связывания (участок Б), общий для всех четырех реагентов, вовлечен в образование прочной шпилечной структуры. Этот факт может являться основной причиной снижения эффективности действия реагентов на фрагмент ДНК в этом районе. Так например, уровень расщепления мишени по основаниям участка Б для гексануклеотидного реагента почти в 2 раза ниже аналогичной величины, полученной при модификации участка А, и составляет 20%. Отчетливо регистрируются продукты адресованной деструкции НК-мишени по основаниям си5_ 015о и в СЛучае использования более коротких олигонук-леотидных реагентов (IX)-(XI), однако эффективность их действия не превышает 5%. Полученные значения эффективности адресованной "рестрикции" в участках А и Б в основном коррелируют с ожидаемыми комплексообразуицими свойствами реагентов.

Важно отметить, что фрагмент ДНК подвергается хотя и. не очень эффективной, но тем не менее отчетливо регистрируемой (рис. 2, дорожки 4, 8) адресованной модификации в случае самого короткого из исследованных, тршуыеотидного реагента (XI). Направленное алкилирование мишени этим соединением обнаруживается не только в одноцепочечном участке А (8%), но и в двуцепочечном участке Б (5%) в присутствии соответствующего октануклеогидного эффектора (VII).

Эти результаты достаточно ярко демонстрируют возможности предложенного варианта адресованной модификации НК, позволяющего повышать эффективность действия реагентов с коротким олигонуклеотидным адресом, так как в отсутствии эффекторов в выбранных условиях реакции направленное алкилирование фрагмента ДНК невозможно не только тринуклеотидным, но даже бо-

-9-

лее длинным гексануклеотидным реагентом (рис. 2, дорожка 9).

По мере уменьшения длины олигонуклеотидного адреса в реагентах (viii>-(х1) закономерно меняется позиционная направленность алкшотрования мишени. Наиболее детально это прослеживается на примере модификации в участке А (рис. 2, дорокки 1-4). Так. гексануклеотидный реагент (viii) преимущественно алкилирует основание о267 в присутствии эффектора (iv) (дорожка 1), то есть ближайшее от его 5'-конца неспаренное основание НК-мишени. В случае реагентов (хх),(х) и (xi) в аналогичных условиях максимум модификации приходится соответственно на основания б263, в262 и а264 (дорожки 2-4). Стоит отметить, что реакционноспособные производные пента- и тетрануклеотида предпочитают модифицировать гуакозиновые остатки мииени, вовлеченные в образование комплементарного комплекса с их олигонуклеотидным адресом (преимущественно третье от «'-конца), поскольку ближа&шши неспаренными ос-

^ 266 265

нованиями фрагмента оказываются а и а соответственно (схема I), а наиболее подверженными действию - алкилирувщих агентов центрами в НК являются остатки гуааозинов.

Важным следствием использования эффекторного варианта при комплементарно адресованной модификации одноцепочечных НК является возможность повышения не только эффективности, но и селективности действия реагентов с коротким олигонуклеотидным адресом. Из представленных на рис. 2 данных видно, что применение соответствующего эффектора позволяет направлять реагенты (уш)-(хЦ в определенный район полинуклеотидной мишени даже при наличии нескольких сайтов их полного комплементарного связывания. Если для гекса-, пента- и тетранукле-отидных реагентов на фрагменте ИНК имеется лишь два полностью комплементарных сайта (участки А и В, схема I), то в случае тринуклеотидного реагента таких участков оказывается уже девять. Тем не менее, присутствие в реакционной смеси соответствующего эффектора позволяет устранить поливариантность связывания данного реагента с НК-мишенью.

К сожалению в выбранных условиях модификации несколько нарушена селективность действия реагента (viii) в присутствии эффектора (vii). В этом случае наряду с адресованной модификацией оснований мишени в участке Б обнаруживается по-

-10-

бочная модификация в участке А (рис. 2, дорожа 5). Тем не менее, снижение на порядок концентрации эффектора (vu) в реакционной смеси, а также повышение температуры проведения реакции, восстанавливает абсолютную селективность действия гексануклеотидного реагента (рис. I, дорожа 8).

2. Зависимость эффективности модификации от длины и комбинации эффекторов.

Стабильность комплекса с одноцепочечным разрывом, образуемого реагентом и эффектором с соответствующим участком по-линуклеотида, а следовательно, и эффективность воздействия на мишень, во многом определяется комплексообразушими свойствами эффектора. Из данных, представленных на рис. I, видно, что эф&екторнне свойства олигонуклзстилов зависят от наличия в их структуре ковалентно связанных остатков Phn, стабилизирующих НК-дуплексы.

Сродство эффектора к НК-мишени определяется также длиной адресующей части молекулы. Так, замена октануклеотидного эффектора (iv) на тетрануклеотидный эффектор (хи) (схема I) при прочих рав1шх условиях приводит к снижению степени модификации мишени гексануклеогидиым реагентом (vin) в участке А с 38 до 8%.

Ее,ли же один октаиухлеотидный эффектор (iv) заменить на два тетрануклеотидных эффектора (xiii) и (xiv), формирующих единый дуплексный блок (схема I ) при образовании комплекса с мишенью, то эффективность адресованной модификации в участке А лишь незначительно уменьшается и составляет 35%.

Ео всех приведенных выше примерах: эффекторы образовывали комплекс с мишенью со стороны з'-конца реагента (схема I). Можно било ожидать проявления эффекторных сеойств и от Phn-производных олигонуклеотидов, имеющих сайт комплементарного связывания, расположенный со стороны 5'-конца реагента. Действительно, введение в реакционную смесь, содержащую ДНК-фрагмент, реагент (viii) и эффектор (iv), еще одного эффектора (xv) приводит к практически количественной адресованной модификации полинуклеотидной мишени (рис. 8, дорохска 4), и суммарный уровень направленной химической деструкции 302-мера по основаниям «гв2-огь7достигает 89%.

- 11-

а-ю 12 3 4

т

о

2«4-а-А А а л а ■в/ в

Рис.3. Результаты электрофоретическо-го анализа (8% денатурирующий ПААГ) 32р-меченных продуктов модификации 302-мера алкилируицими производными три-, тетра-, пента- и гексануклеоти-да (схема I) (дорожки 1-4 соответственно). Реакционные смеси содержали помимо фрагмента ДНК и реагентов дополнительно октануклеотидные эффекторы (iv) и (xv) в концентрации 2-ю~4м. Концентрация мишени исходно составляла ю"вм, реагентов - ю"5и. Реакцию алкилирования проводили при 25°с, в течение 25 ч.

270

Тот факт, что з',5'-ди-рьп-производное октануклеотида (xv) образует комплементарный комплекс вплотную к дуплексу, образованному гексануклеотидным реагентом (viii) на мишени, оказывается весьма существенным для реализации эффекторных свойств соединения (xv). Появление хотя бы одного неспарен-ного основания ДНК-мишени между дуплексными структурами реагента и эффектора значительно снижает влияние последнего на степень модификации НК. Так, при замене гексануклеотидного реагента (viii) на пента-, тетра- и тринуклеотидный реагент (1х)-(х1) (схема I) уровень адресованной "рестрикции" составил 25, 9 и 7% соответственно (рис. 3). А это практически не

-12-

отличается от соответствующих величин (23, 6 и 8%, рис. 2), полученных для этих реакционноспособных производных в присутствии лишь одного эффектора (iv).

Другим важным следствием использования эффекторов, контактирующих с 5'-концевой частью реагента при образовании комплементарного комплекса с НК-мишеныо, наряду со значительным повышением эффективности модификации, является изменение позиционной направленности алкилирования. Эффектор (xv) полностью блокирует модификацию оснований фрагмента ДНК, входящих в структуру сайта его комплементарного связывания (ср. дорожку 1, рис. 2 и дорожку 4, рис. 3). В результате этого ажилированию подвергаются лишь основания фрагмента ДНК, вовлеченные в образование комплекса с адресующей частью реагента (VIII).

3. Высокоселективная модификация фрагмента ДНК тетрануклео-тидшм реагентом в присутствии тетрануклеотидних эффекторов.

Несмотря на бурное развитие в последние десятилетия методов генной инженерии, проблема направленной химической "рестрикции" нуклеиновых кислот не теряет своей актуальности в связи с тем, что в природе пока не обнаружены так называемые крупно-шепящие рестриктазы, необходимые для установления первичной структуры высокополимерных НК. Решение проблемы направленного фрагментирования одноцепочечных НК возможно химическими методами, например при помощи ытенагл-производ-ных олигонуклеотидов (viassov v.v. et al., 1986). Однако достаточно широкая позиционная направленность действия указанных реагентов значительно снижает выход целевого продукта рестрикции и требует его выделения из сложной смеси близких по длине фрагментов.

Проблема алкилирования мишени в' -ci ксн2№1-производными олигонуклеотидов преимущественно по одному, заранее определенному основанию, мотет бить решена в рамках эффекторного варианта комплементарно адресованной модификации. Из представленных выше результатом следует, что введение' в реакционную смесь эффектора, контактирующего е '¡' -концевой частью реагента на мишени, препятствует ялкилированию оснований, входящих в сайт его комплементарного связывания. Это значи-

-13-

тыыю ограничиваэт число оснований мишени, подвергающихся модификации, причем алкилируются лишь те основания, которые участвуют в связывании адресующей части реагента.

Учитывая то, что в сайте узнавания реагента s •-ci ксн2ш-остаток способен наиболее эффективно алкилировать третье от него пуривовое основание мишени, можно представить структуру 6'-концевой части реагентов, которые в случае использования пары фланкирующих эффекторов приводили бы к алкилированию одноцепочечной ДНК преимущественно по одному основанию: ciRCHjW-pPupPupPypPu... Все это учитывалось при выборе сайта модификации, а также при синтезе 5'-с1исн2нн-содержащего тетрануклеотидкого реагента и серии phn-содержащих тетранук-леотидннх эффекторов, для исследования возможности направленной химической "рестрикции" модельного фрагмента ДНК при помощи коротких олигонуклеотидных производных (схема 2).

Схема 2.

хххх хххх

I I I I I I I I

XVII) pCTTAp рССАСр (XVIII) (XIX) pGTCCp pCTGTp (XXI • i i i ; i i i i í i ! i [ i; э: . .— AAGGAATTCGTGGTGTGC --GTACAGGTCGTGACACTA

24 0 M:: 23C 130 i i:j120

Cl RCH2NH-pAGCÁ (XVI) Cl RCH2NH-pAGCA (XVI)

r--mi-

I 4 ? i i ; 30

^-gtgggactcgttgggggg

(XXI) pCCTGp pACCCp (XXII) I II I

--X XX X

X- = Phn- 5¡..-'

Как видно из данных, представленных на рис. 4-, введение в реакционную смесь, содержащую ДНК-фрагмент и реагент (xvi), дополнительно двух тетрануклеотидных эффекторов (xvii) и (XVIII) приводит к алкилированию, а после обработки пиперидином, к расщеплению мишени по основанию g234 с выходом 39% (дорожка 3). Продукты химической "рестрикции" полинуклеотида по остаткам g123 и g37, входящим в структуру двух других сайтов модификации, были получены с выходом 26 и 21% соответственно ггри введении в реакционную смесь попарно эффекго-роЕ (XIX) и (хх), (XXI) и (XXII) (рис. 4, дорожки 2 и i соответственно ).

а+в 12 3 4 гэсэсэ

- ^ сгэ

сз Рис.4. Результаты электрофоретичес-

кого анализа 32р-меченных продуктов с—---' направленной химической "рестрикции"

5» одноиепочечного фрагмента ДНК после

□ алкилирования тетра1!уклеотидным ре-

агентом (XVI) в присутствии различных пар фланкирующих эффекторов: дорожка 1 - в присутствии эффекторов (XXI) и (ххи); дорожка 2 - эффекторов (XIX) И (XX); дорожка 3 -эффекторов (XVII) и (XVIII); дорожка 4 - в отсутствие эффекторов. Реакционные смеси исходно содержали фрагмент ДНК в концентрации ю~вм, реагент (XVI) и эффекторы (XVII) -(ххи) - в концентрациях 5Ю~6м, Реакцию алкилирования мишени проводили при 25°с в течение 25 ч.

■т

пз

На основании представленных на рис. 4 данных можно говорить о строгой селективности химической "рестрикции" фрагмента ДНК тетрануклеотидным реагентом (XVI) в присутствии тетрануклеотидинх эффекторов. Каждая пара эффекторов способствует алкилированию мишени только в одном из трех возможных сайтов модификации реагентом (XVI). При этом какие-либо продукты алкилирования мишени по двум другим сайтам не регистрируются.

выводы.

1. Изучена реакция комплементарно адресованного алкилирования одноцепочечного фрагмента ДНК 5*-о-фосфорил-[4-(н-метил-н-2-хлорэтиламино)бензил]амидными (5 '-С1КСН2КН-) производными коротких олигодезоксирибонуклеотидов в присутствии эффекторов н-(2-оксиэтил)феназиниевых (рип-) производных олигодезоксирибонуклеотидов, Показано, что:

а) Селективная модификация модельного ДНК-фрагмента может быть осуществлена алкилирундим производным тринуклеотида по одному из девяти имеющихся сайтов связывания при использовании в качестве эффектора з' , в'-ди-РЬп-производного октанук-леотида, образующего комплекс в непосредственной близости от выбранного сайта модификации.

б) Эффективность алкилирования НК-мишени зависит от длины адресующей части реагента и закономерно возрастает в ряду от три- до гексануклеотида (с 8 до 38%). В отсутствие эффектора используемые реагенты не модифицируют мишень в выбранных условиях реакции.

в) Использование з' ,5'-да-рьп-производного окгануклеотида в качестве эффектора позволяет проводить сайт-специфическую модификацию НК-мишени реагентами на основе коротких олигонуклеотидов (вплоть до тринуклеотида) не только в одноцепо-чечных, но и в таких труднодоступных участках, как шпилечные структуры.

г) Замена октануклеотидного эффектора на тандемный блок, состоящий из двух тетрануклеотидних эффекторов соответствующей структуры, лишь незначительно снижает эффективность модификации фрагмента ДНК 5'-с((гсн2ш-производным гексануклеотида (с 38 до 35%).

2. Эффективность действия 5 • -а ю^ин-производного гексануклеотида может быть повышена более чем вдвое за счет использования пары з*,б•-ди-рьп-производных октануклеотидов, фланкирующих реагент при образовании комплекса с мишенью, по сравнению со случаем, когда используется только один эффектор. Бри этом эффектор, образующий комплекс со стороны 5'-конца реагента, блокирует модификацию оснований мишени, входящих в сайт его комплементарного связывания, что позво-

-16-

ляет ограничить число подвергающихся модификации остатков 1-3 нуклеотидами, участвующими в связывании реагента.

Появл'-.ше хотя бы одного неспаренного основания между сайгами узнавания реагента и эффектора, образующего комплекс с мишенью сс стороны s'-конца реагента, устраняет влияние последнего на эффективность модификации НК-мишени. з. Проведено сайт-специфическое расщепление одноцепочечного фрагмента ДНК по остаткам гуанозина в сайтах ...pTpGpCpT... с выходом 21-39% s ' -ci Gov«-про из водным тетрануклеотида d(pApGpcpA) в присутствии з',s'-ди-РЬп-производных тетра-ir/клеотидов в качестве эффекторов. Показано, что применением соответствующей пары тетрануклеотидов-эффекторов, фланкирующих реагент при образовании комплекса с НК-мишенью, он может быть направлен избирательно только в один из трех имеющихся сайтов связывания. На этом примере впервые продемонстрирована принципиальная возможность унификации процесса направленного химического фрагментирования одноцепочечных НК путем создания банка тетрануклеотидных реагентов и всевозможных по составу тетрануклеотидов-эффекторов.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих сообщениях :

1. Kutyavin I.V., Podyminogin M.A., Bazhina Yu.N., Fedorova O.S., Knorre D.G., Levina A.S., Maraayev S.V., Zarytova V.F. N-(2-hydroxyethyl)phenazinium derivatives of oligonucleotides as effectors of sequence-specific modification of nucleic acids with reactive oligonucleotide derivatives.// FEBS Lett. 1988. V. 238. N 1. P. 35-38.

2. Зарытова В.Ф., Кутявин И.В., Мамаев C.B., Подыминогин М.А. Эффективная и селективная модификация одноцепочечного фрагмента ДНК алкилирующими производными коротких олиго-дезоксирибонуклеотидов в присутствии эффекторов реакции .ч-(2-гидроксиэтил)феназиниевых производных олигодезокси-рибонуклеотидов.// Биоорган.химия, 1990. Т. 16. N 12. С.1653-1660,

3. Zarytova V.F. , Kutyavin Ï.V. and Podyminogin M.A., N-(2-hydroxyethylJpbenazinium derivatives of oligonucleotides

-17-

as effectors for effective and selective modification of a single-stranded DNA.// Collect. Czechosl. Cheia. Communs. 1990. V. 55. N 1. P. 245-248.

4. Зарытова В.Ф., Кутявин И.В., Мамаев C.B., Подыминогин М.А. Сайт-направленная химическая рестрикция одноцепочечного фрагмента ДНК алкилирушим производным тетрануклеотида d(pApGpCpA) в присутствии тетрануклеотидных эффекторов.// Биоорган, химия. 1992, Т.18. N 7. С.