Экстрактивные вещества Primula Macrocalyx BGE. Химические трансформации риккардина C тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Косенкова Юлия Сергеевна

ЭКСТРАКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВАРЫШЬА МАОЮСМУХЪСЕ. ХИМИЧЕСКИЕ ТРАНСФОРМАЦИИ РИККАРДИНА С

02.00.10 — биоорганическая химия

■П

ии34027 Ю

Автореферат диссертации на соисканне ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск — 2009

003482710

Работа выполнена в Новосибирском институте органической химии им. Н. Н. Ворожцова СО РАН

Научный руководитель: д.х.н. Салахутдинов Нариман Фаридович

Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор Бабкин Василий Анатольевич к.х.н. Черняк Елена Ильинична

Ведущая организация:

Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН

Защита состоится «12» ноября 2009 г. в 1400 на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан «12» октября 2009 г.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Изучение химического состава лекарственных растений, выделение мажорных вторичных метаболитов, изучение их биологической активности, а так же проведение химической модификации природных соединений с целью получения новых фармакологических препаратов - важная и актуальная задача химии растительного сырья и органического синтеза. Одна из таких важных задач - это выделение веществ, отвечающих за ингибирование NO-синтаз (NOS) и создание новых препаратов соответствующего действия, так как накопление избыточного количества оксида азота (И) N0 в организме приводит к целому ряду патологических состояний, к которым относятся септический шок, нейродегенеративные заболевания, острые и хронические воспалительные процессы.

Поиск селективных ингибиторов ¡NOS ведется не только среди синтетических агентов, но и среди природных соединений. Объектом нашего исследования является Primula macrocalyx Bge. (Первоцвет крупночашечковый) рода Primula семейства Primulaceae (Первоцветные). Это растение широко используется народной медициной при бронхолегочных заболеваниях, в компрессах при ссадинах, переломах и укусах насекомых. В тибетской медицине считается, что оно способно подавлять развитие опухолей, ускорять заживление ран и излечивать заболевания крови. Кроме того, благодаря довольно высокому (до 2 %) содержанию витамина С, листья Первоцвета употребляют в пищу. Несмотря на все эти свойства, химический состав P. macrocalyx практически не изучен.

Целью данной работы является исследование химического состава надземной и подземной частей лекарственного растения Р. macrocalyx, выделение вторичных метаболитов из экстрактов растения, тестирование доступных метаболитов на биологическую активность и последующая их химическая модификация с целью повышения биологической активности.

Научная новизна. В настоящей работе впервые было проведено исследование качественного и компонентного состава малополярных

экстрактов Р. macrocalyx. В ходе исследования нами были получены следующие результаты:

1. Из исследованных экстрактов выделено и установлено строение для 11 индивидуальных соединений, из которых бисбибензилы риккардин С (10) и перроттетин Е (11) ранее из высших растений не выделялись.

2. Впервые для надземной части растения определен количествешшй и качественный жирнокислотный состав.

3. Разработана эффективная и оригинальная методика выделения риккардина С (10), проявляющего свойства ингибитора NO-сингазы, из надземной и подземной частей растения.

4. Проведено изучение сезонной динамики накопления риккардина С в надземной части Р. macrocalyx в условиях интродукции. Количественно показано, что содержание риккардина С в растеши меняется в зависимости от стадии вегетации и достигает максимума в период плодоношения.

5. Впервые получены простые и сложные эфиры риккардина С -новые ингибиторы NO-синтазы. Проведены испытания на NOS-ингибирующую активность.

Практическая значимость работы состоит в разработке эффективного подхода выделения из Р. macrocalyx мажорного метаболита риккардина С (10), обладающего свойствами ингибитора NO-синтазы, и получения на его основе простых и сложных эфиров, обладающих, судя по данным биоиспытаний, еще более высокой NOS-ингибирующей активностью.

Апробация работы. Основные результаты обсуждались на семинарах Отдела природных и биологически активных веществ, молодежных конкурсах научных работ НИОХ СО РАН. Отдельные части работы были доложены на IV и V Всероссийских конференциях «Химия и технология растительного сырья» (г. Сыктывкар, 2006; г. Уфа, 2008), VI Всероссийском научном семинаре «Химия и медицина. Молодежная научная школа" (г. Уфа, 2007), Всероссийской научной конференции «Современные проблемы органической химии» (г. Новосибирск, 2007), а также на Международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений»

4

(Алматы, 2007), VII Международной научно-практической конференции «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии» (г. Барнаул, 2008), X Международном симпозиуме "Эколого-популяционный анализ полезных растений: интродукция, воспроизводство, использование" (г. Сыктывкар, 2008), Международной конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, 2009) и на VII Всероссийской конференции «Химия и медицина, 0рхимед-2009» (г. Уфа, 2009).

Публикации По материалам диссертации в рецензируемых журналах опубликовано 4 работы, имеется 1 патент.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, вьюодов и списка цитируемой литературы (129 наименований). Работа содержит 41 рисунок, 5 схем,22 таблицы и 4 протокола биоиспытаний.

Основное содержание работы

Выбор темы диссертации обусловлен недостаточной изученностью лекарственной флоры Западной Сибири и необходимостью исследования химического состава растений, находящих применение в народной медицине для создания новых медицинских препаратов природного происхождения.

Во введении к диссертации (первая глава) обоснована актуальность представленной работы, показана ее научная новизна и практическая ценность проведенных исследований.

В ходе фитохимического исследования Р. macrocalyx Bge. нами было показано, что мажорным компонентом малополярных экстрактов растения является риккардин С - соединение, проявляющее свойства ингибитора NO-синтазы. Изучение свойств риккардина С и получение его производных - потенциальных ингибиторов NO-синтазы, сделало для нас актуальным написание литературного обзора (вторая глава), посвященного анализу исследований 2003-2009 гг. в области соединений, проявляющих свойства ингибиторов NO-синтазы, их происхождению, а так же взаимосвязи «химический остов - NOS-ингибирующая активность». Так огромный массив соединений,

5

протестированных на ингибирование Ж)-синтазы и описанных в обзоре, условно можно поделить па три группы:

1) ингибиторы ЫО-синтазы природного происхождения, в частности,

соединения, полученные экстракцией растительного сырья;

2) соединения, полученные на базе природных соединений путем их

химической трансформации с целью повышения биологической активности;

3) синтетические агенты.

На основании анализа литературных источников есть основания полагать, что наиболее перспективными и селективными ингибиторами ЫО-синтазы являются соединения, полученные на базе природных соединений и синтетические агенты.

Третья глава диссертации посвящена выделению и идентификации вторичных метаболитов из надземной и подземной частей Р. тасгоса1ух жирным кислотам, метоксифлавонам, с алии платам, гликозидам и бисбибензилам.

Качественный и количественный состав жирных кислот в надземной части Р. тасгоса1ух

При последовательной экстракции надземной части растеши гексаном (рис. 1) и диэтиловым эфиром (рис. 2) было показано, что оба экстракта в значительном количестве содержат жирные кислоты.

52 АС 9 8 | 1 2 }« 13 11 1 1 1 Г? " 1В 1» й л»1,4^ 27 » к

плит .1 . т 1 • ^ -" 1Я —г+н-т^ч

ИОптЬ.. ?80яп ^ . ::........т±:-- г~{" ¡-У» ..........Р.........Г! Г^ж —эд-м

32ПЛВ1Ь., ЭбОотГ ..................г-г ' 'А* ЭТ1—

1 1 3 4 3 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 МШ

Рис. 1 Хроматограмма экстракта надземной часта (гексан-кипячение)

Рис. 2 Хроматограмма экстракта надземной части (диэтиловый эфир-настаивание)

В связи с этим, для анализа жирнокислотного состава надземной части, была проведена экстракция растительного сырья смесью гексана и диэтилового эфира. Для определения содержания свободных жирных кислот (СЖК) часть полученного экстракта предварительно хроматографировали на колонке с целью отделения красящих пигментов. Другую часть экстракта подвергли гидролизу - для определения общего содержания жирных кислот (ОСЖК). Затем провели обработку полученных образцов диазометаном с получением метиловых эфиров карбоновых кислот. Жирные кислоты идентифицировали в виде метиловых эфиров с помощью методов ГХ и ГХ/МС (Табл. 1). Содержание метиловых эфиров СЖК в соответствующем образце составило 20.6%, а ОСЖК в гидролизованном образце - 63.4%. В соответствии с данными таблицы 1, в исследуемом растении присутствуют все монокарбоновые кислоты нормального строения с числом атомов углерода от б до 30 и незначительное количество дикарбоновых кислот. Доминирующими кислотами надземной части Р. тасгоса1ух являются пальмитиновая (С16:0, отн. содержание 12%), октадекатетраеновая (С18:4Д6-9'12,15, отн. содержание 10.7%), линолевая (С18:2А9,12, отн. содержание 14.8%) и а-линоленовая (С18:ЗД9,12,15, отн. содержание 6.6%) кислоты. Содержание остальных кислот находится в интервале 0.2-4.8%, некоторые кислоты (С8:0, С11:0 и др.) присутствуют в следовых количествах. Следует отметить, что надземная часть Р. тасгосЫух содержит наряду с неразветвленными насыщенными жирными кислотами их изомерные формы (как изо-, так и антеизокислоты).

Доля ненасыщенных кислот составляет 38.8% от общего их содержания. Наличие в исследуемом растении у-линоленовой (С18:ЗД6,9'12, отн. содержание 4.8%) в сочетании со значительным количеством октадекатетраеновой (C18:4A6,9,12,15) кислот является хемотаксономическим маркером рода Primula. Общее содержание кислот в надземной части составляет 2.2%, доля СЖК - 0.37% от массы сухого растительного сырья.

Сравнение жирнокислотного состава гидролизованного и негидролизованного экстрактов показывает, что в свободном виде в растении присутствуют практически все монокарбоновые кислоты, а дикарбоновые кислоты присутствуют в растении только в связанном состоянии. Все мажорные кислоты находятся большей частью в этерифицировашюм состоянии, причём соотношение свободная/этерифицированная форма для них различно. Особо следует отметить различное соотношение форм С18:1Д9 и С18:ЗД9,12,15 в свободном и связанном состоянии, причём С18:1А9 в свободном виде является одной из основных кислот, тогда как в суммарной фракции преобладает кислота С18:ЗД9'12,15. Следует отметить различное содержание свободной/этерифицировашюй формы и для жирной кислоты С28:0, которой в свободном состоянии больше, чем в связанном. Кроме того, в анализируемых образцах методом ГХ/МС были обнаружены а-токоферол, фитол и фитостеролы.

Табл. 1 Времена выхода и относительное содержание (масс.%) метиловых эфиров жирных кислот в экстракте надземной части P. macrocalyx по данным ГХ/МС и ГХ

Время выхода по ГХ/МС, мин Время выхода по ГХ, мин Идентифицированные кислоты (в виде метиловых эфиров) Свободные кислоты (масс. %) Общее содержание кислот (масс. %)

6.13 5.86 С6:0 - 0.3

7.75 7.42 С7:0 - 0.3

7.87 7.63 янтарная кислота - 0.2

9.30 8.92 С8:0 - <0.1

10.79 10.06 С9:0 0.9 0.6

12.19 11.72 С10:0 <0.1 0.1

13.51 13.10 С11:0 <0,1 <0.1

13.78 13.57 окгадикарбоновая кислота - <0.1

14.57 14.03 С12:0-изо - <0.1

14.69 14.08 С12:0-антеизо <0.1 <0.1

14.77 14.17 С12:0 0.13 1.3

15.50 14.89 С13:0-изо - <0.1

15.94 14.97 С13:0 <0.1 0.2

16.23 15.82 декандикарбоновая ислота - 0.3

16.88 16.13 С14:0-изо - 0.2

16.92 16.25 С14:0-антеизо - <0.1

17.09 16.38 С14:0 0.1 2.7

17.32 17.03 ундекандикарбоновая кислота - 0.1

17.75 17.14 С15:0-изо 0.2 <0.1

17.83 17.40 С15:0-антеизо - 0.2

18.14 17.50 С15:0 0.7 0.3

18.97 18.19 С16:0-изо 0.1 0.4

19.03 18.23 С16:0-аитеизо 0.2 0.1

19.22 18.42 С16:0 2.8 12.0

19.79 18.98 С17:0-изо <0.1 <0.1

19.87 19.00 С17:0-аитеизо <0.1 <0.1

20.14 19.32 С17:0 0.2 0.2

20.66 19.89 С18:ЗД6'9'12 0.8 4.8

20.76 19.99 С18:4Д6'9'12'15 1.8 10.7

20.86 20.06 С18:2Д9,12 4.3 14.8

20.87 20.10* С18:1Д9 3.4 0.7

20.92 20.15* С18:ЗД9,12'15 1.8 6.6

21.10 20.23 С18:0 0.6 1.9

20.64 21.09 С19:0-изо - 0.1

21.96 21.24 С19:0 0.4 0.5

22.62 21.92 С20:1ДИ - 1.2

22.83 22.15 С20:0 0.1 <0.1

23.65 22.90 С21:0 - 0.2

24.44 23.65 С22:0 0.3 1.0

25.20 24.43 С23:0 <0.1 0.1

26.03 25.14 С24:0 0.3 0.6

26.61 25.87 С25:0-изо - <0.1

26.68 25.89 С25:0-антеизо - <0.1

26.98 25.93 С25:0 <0.1 0.1

28.10 26.70 С26:0 0.4 0.1

28.90 27.31 С27:0-изо - <0.1

29.07 27.35 С27:0-антеизо - <0.1

29.43 27.44 С27-.0 - 0.1

31.05 28.37 С28:0 1.4 0.4

32.30 28.72 С29:0-изо - <0.1

33.11 28.88 С29:0 - 0.2

35.60 30.02 С30:0 <0.1 <0.1

Всего: 20.6 63.4

"Олеиновая и линоленовая кислоты вышли в одном газохроматографическом пике. Их суммарное содержание определено по ГЖХ, а соотношение оценено по масс-спектрометрическим данным.

Выделение вторичных метаболитов из надземной и подземной частей Р. тасгоса1ух

Из различных экстрактов, полученных из надземной и подземной частей Р. тасгоса1ух, были выделены: салицилаты (1, 2), гликозид (3), метоксифлавоны (4-9) и бисбибензилы (10, 11, рис. 3). Все выделенные нами соединения, судя по данным ВЭЖХ экстрактов, полученных из воздушно-сухого сырья, содержатся как в надземной, так и в подземной части растения. Однако подбором условий экстракции нам удалось получить экстракты, в которых те или иные вторичные метаболиты являются мажорными компонентами.

Рис.3

Выделение салииилатов и примверина

Соединения (1) и (2) - метил- 4-метоксисшшцилат и пеонол (2-гидрокси-4-метоксиацетофенон) первоначально выделялись нами из экстракта подземной части P. macrocalyx четыреххлористым углеродом. Пеонол (2), по литературным данным, ранее выделяли как из Р. veris L., так и из P. auricula L. На приведенной хроматограмме ВЭЖХ (рис. 4) метил- 4-метоксисалицилату и пеонолу соответствуют пики 9 и 11. Соединения (1) и (2) выделялись нами также и из надземной части, но их выделению предшествовала дополнительная обработка экстракта, удаляющая основную часть липофильных веществ и красящих пигментов.

Рис. 4 Хроматограмма экстракта подземной части четыреххлористым

углеродом

Из ацетонового экстракта подземной части растения при помощи колоночной хроматографии на силикагеле нами был выделен примверин (2,4-диметоксибензойной кислоты -(Р-О-ппокопиранозил)-р-Б-глюкозид) - один из основных полярных метаболитов рода РптиЬ (3, рис. 5).

Рис. 5 Хроматограмма ацетонового экстракта подземной части (пик 8 -

примверин)

Выделение метоксифлаеонов

В результате последовательного настаивания падземной части Р. тасгоса1ух в гексане и ацетоне был получен довольно простой по составу ацетоновый экстракт (рис. 7). Из этого экстракта было выделено пять минорных компонентов - метоксифлавоны (4-8). Для улучшения их выделения, экстракт специальным образом обрабатывали с целью удаления липофильных веществ. Остаток хроматографировали и рехроматографировали на колонках с силикагелем. В результате хроматографии были выделены, в порядке элгоирования, следующие соединения: 2',5'-диметоксифлавон (4), 3'-метокси-4',5'-метилендиоксифлавои (5), 3',4'-диметоксифлавон (6), затем метил-4-метоксисалицилат (1), пеонол (2), 5,6,2',3',6'-

12

пентаметоксифлавон (7) и 5,6,2',3',5',6'-гексаметоксифлавоп (8). Метоксифлавон (9) — 3',4',5'-триметоксифлавон — был выделен нами из ацетонового экстракта интродуцированного сырья в фазе бутонизации.

Рис. 6 Хроматограммы метоксифлавонов. Сверху вниз: ВЭЖХ гсксаметоксифлавона (8), пентаметоксифлавона (7), метилендиоксифлавона (5), диметоксифлавона (4).

Метоксифлавоны (4-6, 9) ранее выделялись из Р. veris L., метоксифлавоны (7) и (8) го растений рода Primula ранее не выделялись, но были выделены из фракции этилацетатпого экстракта листьев африканского растения Casimiroa tetrameria.

Выделение бисбибензилое

Мажорным компонентом ацетонового экстракта надземной части P. macrocalyx являлось соединение (10), которому соответствует пик 15 на рис. 7.

Двукратной колоночной хроматографией ацетонового экстракта на силикагеле и хроматографией полученных фракций на обращенной фазе была получена достаточно чистая фракция мажорного метаболита ацетонового экстракта (рис. 8), для которой записали необходимые спектры ЯМР 'II и 13С.

ПЛ а11 лоща

1 13 4 I « Т( 9 11 11 13 13 14 15 14 1Т II

Рис. 8 Хроматограмма риккардина С (10) из ацетонового экстракта

На основании сравнения полученных спектральных данных с литературными, выделенное соединение было идентифицировано как риккардин С (10). В дальнейшем было показано, что риккардин С является также мажорным компонентом малополярных экстрактов подземной части Р. тасгоса1ух (рис. 9).

Рис. 9 Хроматограмма бензольного экстракта подземной части растения (пик 12 - риккардин С)

Риккардин С (10) был впервые описан в работах японских ученых и выделен из горного японского мха Reboulia hemispherica. Как показал литературный поиск, это соединение и подобные ему бисбибензильные системы ранее выделялись только из бриофитов -мхов-печеночников (из родов Riccardia, Marchantía, Plagiochila и др.), а в высших растениях, водорослях и грибах обнаружены не были. Выделение соединения (10) из высшего растения Р. macrocalyx стало своеобразным поворотным пунктом в нашей работе. По литературным данным, такие соединения проявляют широкий спектр цитотоксической, антибактериальной и фунгицидной активности. Риккардин С увеличивает экспрессию генов АВСА1 и ABCG1, тем самым активируя обратный транспорт холестерина, и является ингибитором NO-синтазы, снижая выработку оксида азота в макрофагах.

Из ацетонового экстракта надземной части Р. macrocalyx было выделено также соединение бисбибензилъного типа (11), которое на основании данных спектров ЯМР 'Н и 13С было идентифицировано как перроттетин Е (пик 4 на рис. 10). Это соединение проявляет NOS-ингибирующие и фунгицидные свойства. Как и риккардин С (10), перроттетин Е (11) из высших растений ранее не выделялся.

1 1 3 4 5 Í 7 В 9 10 11 13 13 14 15 16 17 Ц

Рис. 10 Хроматограмма перроттетина Е

Сезонная динамика накопления риккардпна С в надземной части

Р. тасгоса1ух

Хотя риккардин С проявляет незначительную ингибирующую активность по отношению к ЫО-синтазе, его природные метиловые

эфиры, по литературным данным, высокоактивны. В связи с этим, нами было запланировано проведение химических трансформаций природного риккардина С и отработана методика его выделения из надземной и подземной частей дикорастущей Р. тасгоса1ух. Нами был получен патент на выделение риккардина С для его химической модификации и получения производных, обладающих свойствами ингибиторов Ж)-синтазы. Однако, решить поставленные синтетические задачи с использованием риккардина С (10), выделенного только из дикорастущей Р. тасгоса1ух не представлялось возможным, ввиду низкого содержания бисбибензила (10) в растении и ограниченных объемов сбора растительного сырья. Кроме того, сбор подземной части означает истребление популяции, что крайне нежелательно. В связи с этим, в природных ценопопуляциях этого вида были собраны семена, которые высевались на экспериментальном участке Центрального сибирского ботанического сада СО РАН (названия ценопопуляциям даны по местам сбора семян). Затем изучалось накопление соединения (10) в надземной части растений по сезонам (четвертая глава диссертации). В течение 2-х лет нами проводился анализ содержания риккардина С в надземной части семи интродукционных и одной дикорастущей популяций Р. тасгоса1ух (Табл. 1). Сбор сырья осуществлялся в весеннее-летний период с учетом фазы развития растения от начала вегетации до плодоношения.

Табл. 1 Сезонное содержание риккардина С в листьях Р. тасгоса1ух

Популяция Фенологические фазы

Бутонизация Цветение (%) Плодоношение (%)

2007 г. 2008 г. 2007 г. 2008 г. 2007 г. 2008 г.

Каменушка (дикорастущие растения) не найд. не найд. 0.02 0.05 0.19 0.22

Каменушка не найд. не найд. 0.08 0.10 0.20 0.23

Каменушка* не найд. не найд. 0.10 0.10 0.19 0.24

Ябоган не найд. не найд. 0.12 0.17 0.18 0.20

Ябоган* не найд. не найд. 0.12 0.13 0.20 0.18

Горно-Алтайск* не найд. не найд. 0.07 0.05 0.20 0.24

Анос-1* не найд. не найд. 0.05 0.06 0.32 0.30

Анос-2* не найд. не найд. 0.07 0.11 0.4 0.3

Примечание: название интродукциопной ценопопуляции без знака * -растения перенесены непосредственно из природы; название интродукцигашой ценопопуляции со знаком * - растения выращены из семян, собранных в природе.

Как показали двухлетние исследования, риккардин С (10) не присутствует в растении постоянно, а постепешю накапливается в течение вегетации. В период бутонизации в надземной части Р. тасгоса1ух риккардин С отсутствует, появляется в период цветения и накапливается в период плодоношения. Так, в период цветения количество риккардипа С (10) в ацетоновых экстрактах составляет от 0.05 до 0.17% по массе в расчете на воздушно-сухое сырьё. В период плодоношения происходит накопление соединения (10) - от 0.18 до 0.40 мас.% (см. табл. 1). Таким образом, было показано, что сбор растительного сырья с целью выделения риккардина С (10) целесообразно проводить в фазе плодоношения растения.

Химическая модификация риккардина С

Природные риккардины С, Б, А (рис. 11), отличающиеся друг от друга лишь заместителями (Кп), в той или иной степени ингибируют ¡N08 с соответствующими значениями 1С50 (мМ) для (10)>100, для (12)=5, для (13)=2.5. Причём в литературе отмечается, что более высокую ЫОЗ-ингибирующую активность проявляют замещенные

бисбибензилы (например, R2=H, Ri=R3=CH3).

10: R!=RÍ=R3=H 12:ri=me,r2=r3=h 13: r,=r2=h, rj=mc рис. 11

Ввиду имеющихся данных, нами была проведена серия направлешшх модификаций риккардина С с различными галогенангидридами кислот и алкилгалогенидами в присутствии оснований по фенольным группам с получением сложных я простых эфиров (14-25) (схемы 1 и 2; пятая глава диссертации). В результате было получено 12 moho-, ди- и триэфиров риккардина С (10), строение которых подтверждено данными спектров ЯМР *Н, 13 С и масс-спектрометрии.

Как показывает анализ строения продуктов (14-25), наибольшей реакционной способностью в реакциях получения эфиров обладает фенольная группа в кольце С соединения (10), в случаях образования монозамещенных эфиров в реакцию вступает именно эта группа (соединения 14, 22), исключение составляет лишь реакция соединения (10) с бензоилхлоридом в присутствии триэтиламина, в которой в качестве единственного продукта образуется моноэфир по ОН-группе в кольце В (эфир 17). Объяснить такую активность группы ОН-С1 можно, по-видимому, положительным мезомерным эффектом кислорода в орто-положении. Низкая реакционная способность фенольной группы в кольце D - эта группа вступает в реакции ацилирования и алкилирования только в случаях большого избытка соответствующего галогенида - объясняется её стерической затрудненностью, так как в кольце D в орто- и мета-положениях есть заместители. Наибольшие стерические проблемы в этом случае скорее всего возникают из-за бензольного кольца в орто-положении.

10

10

10

10

10

Cl, CHCIj, Py

QpCI,CHCI3.NEt3 ноД

-- об-

Ara

¿ , Et20 , NEt3, DMAP

>rcl

, Et20, NEt3

DMAP

CI

î^o > CHCI3 NEt3,

DMAP

Схема 1. Получение сложных эфиров риккардина С

Вг

К2С03, , ОМРА

ОВи

24 (12%)

Схема 2. Получение простых эфиров риккардина С

Все соединения, полученные нами в результате химической трансформации риккардина С (10), являются новыми, ранее неописанными в литературе соединениями. Полученные эфиры были отданы на испытания биологической активности как потенциальные ингибиторы ЫО-синтазы1. Стоит отметить, что все протестированные соединения проявили ингибирующую МО-активность.

1 Эти эксперименты были проведены сотрудником Института иммунологии и клинической медицины к.б.н. В. О. Ткачёвым.

Выводы

1. Впервые проведено систематическое исследование качественного и компонентного химического состава Первоцвета крупночашечкового (Primula macrocalyx Bge.) Предложен результативный подход, позволяющий получить простые для хроматографического разделения экстракты и выделить из них основные вторичные метаболиты P. macrocalyx.

2. Исследован качественный состав и определено массовое содержание жирных кислот в надземной части P. macrocalyx. Показано, что в исследуемом растении присутствуют все монокарбоновые кислоты нормального строения с числом атомов углерода от 6 до 30 и незначительное количество дикарбоновых кислот, причем доминирующими кислотами надземной части Р. macrocalyx являются пальмитиновая (С16:0), октадекатетраеновая (С18:4Д6'9'12'15), линолевая (С18:2Д9,12) и а-линоленовая (С18:ЗД9,12'15) кислоты.

3. Из различных экстрактов надземной и подземой частей Р. macrocalyx выделены салицилаты (1) и (2), шесть метоксифлавонов (49) и гликозид примверин (3). Метил-4-метоксисалицилат (1) и метоксифлавоны (7 и 8) ранее из растений рода Primula не выделялись.

4. Впервые из надземной и подземной частей высшего растения P. macrocalyx выделены соединения бисбибензильного типа, риккардин С (10) и перроттетин Е (11), проявляющие NOS-ингибирующую активность. Разработана оригинальная, эффективная методика выделения риккардина С из надземной и подземной частей растения (защищено патентом РФ).

5. Изучена сезонная динамика накопления риккардина С в надземной части P. macrocalyx. Показано, что содержание последнего достигает максимума в период плодоношения.

6. Впервые получены сложные и простые эфиры риккардина С (14-25), проявляющие более высокую NOS-ингибирующую активность, чем исходный риккардин С.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Косенкова, Ю. С., Половинка, М. П., Корчагина, Д. В., Комарова, Н. И., Курочкина, Н. Ю., Черемушкина, В. А., Салахутдинов, Н. Ф. Риккардин С - соединение бисбибензильного типа из Prímula macrocalyx Bge. // Химия природ, соединений. - 2007. - № б. - С. 591-592.

2. Косенкова, Ю. С., Половинка, М. П., Корчагина, Д. В., Комарова, Н. И., Морозов, С. В., Вялков, А. И., Курочкина, Н. Ю., Черемушкина, В. А., Салахутдинов, Н. Ф. Жирнокислотный состав и вторичные метаболиты малополярных экстрактов надземной части Prímula macrocalyx Bge. // Химия природ, соединений. - 2008. - № 5. -С. 457-460.

3. Косенкова, Ю. С., Половинка, М. П., Корчагина, Д. В., Комарова, Н. И., Курочкина, Н. Ю., Черемушкина, В. А., Салахутдинов, Н. Ф. Сезонная динамика накопления риккардина С в Prímula macrocalyx Bge. // Химия в интересах устойчивого развития. -2009.-т. 17.-С. 507-511.

4. Косенкова, Ю. С., Половинка, М. П., Корчагина, Д. В., Комарова, Н. И., Салахутдинов, Н. Ф. Получение эфиров риккардина С- потенциальных ингибиторов NO-синтазы // Химия в интересах устойчивого развития. - 2009. - том 17. - С. 495-506.

5. Пат. 2340350 РФ. Способ получения риккардина С / Половинка, М. П., Косенкова, Ю. С., Комарова Н. И., Салахутдинов, Н. Ф. Патент на изобретение № 2340350 РФ (2008).

Формат бумаги 60x84 1/16. Объем 1 печ. л. Заказ № Тираж 100 экз.

Отпечатано на ротапринте Новосибирского института органической химии СО РАН им. Н. Н. Ворожцова. 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 9.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ИНГИБИТОРЫ NO-СИНТАЗЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

2; 1. Введение. Общие сведения.

2.2 Ингибиторы iNOS природного происхождения.

2.2.1 Алкалоиды, изопреноиды, стероиды.

2.2.2 Стильбены, бибензилы и бисбибензилы.

2.2.3 Диарилалканоиды и флавоноиды.

2.3 Функциолизированные природные агенты.

2.3.1 Производные аминокислот.

2.3.2 Халконы и кумарины.

2.3.3 Тритерпеновые кислоты, фенольные соединения.

2.4 Ингибиторы iNOS синтетического происхождения.40s

2.4.1 Амидины.

2.4.2 Азотсодержащие гетероциклические соединения.

2.5 Наиболее известные ингибиторы iNOS.48v

3. ВТОРИЧНЫЕ МЕТАБОЛИТЫ НАДЗЕМНОЙ И ПОДЗЕМНОЙ? ЧАСТЕЙ P. MACROCALYX. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1 Вторичные метаболиты рода Primula.

3.2 Подходы к экстракции*Р: macrocalyx.

3.3 Экстракция гексаном.

3.4 Экстракция диэтиловым эфиром.

3.5 Качественный и количественный состав жирных кислот в надземной части Р. macrocalyx.

3.6 Вторичные метаболиты P. macrocalyx.61'

3.6.1 Выделение салицилатов и примверина.

3.6.2 Выделение метоксифлавонов.:.

3.6:3 Выделение бисбибензилов.

4. СЕЗОННАЯ ДИНАМИКА НАКОПЛЕНИЯ РИККАРДИНА С В

НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ P. MACROCALYX.

5. ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ РИККАРДИНА С.

5.1 Получение сложных эфиров риккардина С.

5.2 Получение простых эфиров риккардина С.

6. ДАННЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ.

6.1- Тестирование сложных и простых эфиров риккардина С на способность ингибировать iNOS.

6.2 Тестирование некоторых вторичных метаболитов P. macrocalyx на зародышах морского ежа Paracentrotus lividus.

7. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

7.1- Экстракция гексаном.

7.2 Экстракция диэтиловым эфиром.91*

7.3 Количественное определение жирных кислот.

7.4 Выделение салицилатов и примверина.

7.5 Выделение метоксифлавонов.

7.6>Выделение бисбибензилов.

7.6.1 Выделение и очистка риккардина С.

7.6.2 Выделение перроттетина Е.

7.7 Сезонная^ динамика накопления риккардина С в надземной части P. macrocalyx.

7.7.1 Растительный материал.

7.7.2 Пробоподготовка и анализ образцов.

7.8 Химическая модификация риккардина.С.

7.8.1 Реакции с бензоилхлоридом.

7.8.2 Реакция с метакроилхлоридом.

7.8.3 Получение триизобутирилриккардина С.

7.8.4 Получение О1 ,Оп-дидигидробетулоноилриккардина С.

7.8.5 Реакция с бутилбромидом.

7.8.6 Получение триаллириккардина С.

8. ВЫВОДЫ.

Богатая и разнообразная дикорастущая флора Алтая и Западной Сибири может быть источником доступного и дешевого сырья для-производства жизненно важных фитопрепаратов.широкого спектра действия. Однако состав многих лекарственных растений, широко используемых в народной медицине, практически не изучен. Выбранный нами объект исследований - Primula macrocalyx Bge. - произрастает в лесостепной и степной зонах Западной Сибирщ широко используется в народной медицине. Растение встречается в Крыму, на Кавказе, на Южном Урале, широко распространено на юге Западной Сибири и Красноярского края, восточнее' -очень редко. Корневища P. macrocalyx в народной медицине используются при бронхитах, воспалениях легких, эмфиземе легких и, других бронхолегочных заболеваниях; по данным тибетской медицины, это растение способно подавлять развитие опухолей* и излечивать заболевания крови. Кроме того, благодаря довольно высокому (до 2 %) содержанию витамина-С, листья^ первоцвета употребляют в < пищу в виде салатов, чаев' и приправ к различным блюдам. Растение прекрасно» культивируется, а потому сырье, богатое биологически активными веществами, становится еще более доступным. Но химический состав P. macrocalyx Bge. практически не изучен. Имеются* сведения по качественному составу растения, указывающие на наличие в P. macrocalyx тритерпеновых сапонинов, флавоноидов,, фенолкарбоновых кислот. Таким образом, есть основания считать, что Р. macrocalyx является ценным представителем флоры- Западной Сибири и изучение химического состава, этого растения актуально. Целью данной работы являлось изучение химического состава надземной и подземной частей Pi macrocalyx, выделение вторичных метаболитов из экстрактов растения, установление их строения, тестирование доступных метаболитов на биологическую активность и их последующая химическая модификация с биотестированием полученных производных.

Для реализации поставленной цели необходимым является решение следующих задач:

1. подбор условий экстракции надземной и подземной частей растения, выделение групп биологически активных соединений: жирных кислот, флавоноидов, гликозидов и др;

2. отработка методов выделения индивидуальных соединений, установление их структуры с применением современных физико-химических методов анализа;

3. проведение биологического скрининга индивидуальных соединений, полученных из.P. macrocalyx Bge;

4. разработка* и проведение химических трансформаций выделенных вторичных метаболитов с целью повышения их биологической активности.

Настоящая* работа состоит из восьми глав. Первая глава диссертации -это введение, которое отражает цели, основные задачи и содержание работы. Вторая глава - литературный,обзор, посвященный поиску и синтезу веществ, обладающих свойствами ингибиторов NO-синтазы, охватывающий химические и биохимические исследования 2003-2009 гг. До. 2003 года материал по этой теме широко освещается в обзоре В: F. Гранина-[1]. Выбор данной темы для литературного обзора обусловлен тем, что мажорный метаболит малополярных экстрактов P. macrocalyx Bge. - риккардин С, бисбибензильное соединение, выделенное нами из ацетонового экстракта растения, - является перспективным ингибитором NO-синтазы. В связи с этим, выявление последних общих тенденций в поиске ингибиторов NO-синтазы было для нас крайне актуальным. Проведенный, литературный поиск показал, что. огромный массив соединений, проявляющих ингибирующую активность по отношению к NO-синтазе, можно условно поделить на три группы:

1) ингибиторы NO-синтазы природного происхождения, в частности, соединения, полученные экстракцией растительного сырья;

2) соединения,, полученные на базе природных соединений путем их химической трансформации с целью увеличения биологической активности;

3) синтетические агенты.

На основании • анализа литературных источников; был сделан вывод о том, что наиболее: перспективными и селективными? ингибиторами. NO-синтазы являются соединения^ полученные на базе природных соединений и синтетические агенты.

Третья глава диссертации посвящена вторичным метаболитам надземной-и.подземной частей Р: macrocalyx Bge; Для экстракции надземной части было опробовано два. подхода — экстракция кипящими растворителями и экстракция настаиванием. Наиболее оптимальной схемой экстракции надземной части оказалась, экстракция настаиванием-. Именно эта схема позволила получить уже на стадии экстракции сырья максимально простые фракции для выделениям индивидуальных веществ- хроматографическими, методами. Так при экстракции • надземной? части эквимолярнош смесью* гексан-диэтиловый эфир был получен экстракт, в котором с помощью методов^ ГХ (газовой хроматографии) и ГХ/MG (хромато-масс-спектрометрии) были определены состав и содержание свободных жирных кислот в надземной части P. macrocalyx: Было показано, что доминантными: кислотами надземной части Р: macrocalyx являются пальмитиновая (С 16:0);, октадекатетраеновая (G 18:4А6,9,12,15), линолевая (С 18:2А9,12) и а-линоленовая; (С 18:3А9,12'15) кислоты.

Для подземной части растения нами проводилась дробная экстракция, большим; количеством; растворителей . различной полярности. Так из экстракта четыреххлористым' углеродом были выделены два соединения -метил-4-метоксисалицилат и пеонол^ из: ацетонового экстракта корней Р.1 macrocalyx был выделен5 гликозид метил-4-метоксисалицилата — примверин — одно из основных соединений полярных экстрактов растений рода

Primula.

Из ацетонового экстракта надземной части исследуемого растения колоночной хроматографией на силикагеле было выделено шесть метоксифлавонов и бисбибензильные соединения — перроттетин Е и риккардин С. Причем в дальнейшем было установлено, что последнее соединение - риккардин С — является мажорным компонентом малополярных экстрактов P. macrocalyx. Это соединение впервые было выделено из мха Reboulia hemispherica в 1982 году [2]. Как показал литературный поиск, риккардин С и подобные ему бисбибензильные системы* ранее выделялись только из бриофитов — мхов-печеночников (из родов Riccardia, Marchantia, Plagiochila и др.) [3, 4, 5], а в высших растениях, водорослях и грибах обнаружены не были. Выделение этого соединения из высшего растения P. macrocalyx стало своеобразным поворотным пунктом в нашей работе. По литературным данным, такие соединения проявляют широкий спектр цитотоксической, антибактериальной и фунгицидной активности [6]. Риккардин С увеличивает экспрессию генов8 АВСА1 и ABGG1, тем самым активируя обратный транспорт холестерина [7], и является ингибитором NO-синтазы [8], снижая выработку оксида азота в макрофагах. Известно, что накопление избыточного количества оксида азота (II) NO в организме приводит к целому ряду патологических состояний, к которым относятся септический шок, нейродегенеративные заболевания, острые и хронические воспалительные процессы [1]. Выделение веществ, отвечающих за ингибирование NO-синтаз и создание новых препаратов соответствующего действия является одной из важнейших проблем в медицине. Хотя риккардин С проявляет незначительную NO-ингибирующую активность, его природные метиловые эфиры высокоактивны [9]. В связи с этим, после анализа литературных данных, у нас возникла идея* трансформации риккардина С в различные простые и сложные эфиры.

Нами была отработана и запатентована методика выделения риккардина С из надземной и подземной частей дикорастущей P. macrocalyx [10] для проведения его химической модификации и получения производных. Но, так как природного сырья для осуществления химической трансформации риккардина С было недостаточно, сотрудниками ЦСБС СО РАН была выращена P. macrocalyx из семян дикорастущего растения. На образцах интродуцированной P. macrocalyx нами было проведено изучение сезонной динамики накопления риккардина С в растении. Именно этому аспекту работы посвящена четвертая глава диссертации. В ней, на основании анализа химического состава ацетонового экстракта надземной части, собиравшейся в течение двух лет на площадках ЦСБС в различные фенологические фазы развития примулы, было показано, что риккардин С не присутствует в растении постоянно. Так, в период бутонизации он вообще отсутствует, начинает появляться в период цветения, достигая своего максимума в период плодоношения. В результате было установлено, что оптимальным временем сбора растительного сырья для выделения из него риккардина С, является период плодоношения.

Пятая глава диссертации посвящена химическим трансформациям риккардина С. Согласно общеизвестным методикам, риккардин С вводили в реакции по получению сложных и простых эфиров по фенольным группам с различными алкилгалогенидами и галогенангидридами кислот в присутствии оснований. В результате проведенных превращений были получены простые и сложные эфиры риккардина С.

Шестая глава содержит результаты проведенного биологического скрининга риккардина С, его производных и некоторых метоксифлавонов, выделенных из P. macrocalyx. Производные риккардина С были протестированы на ингибирующую способность NOS сотрудником Института иммунологии и клинической медицины СО РАМН (г. Новосибирск) к.б.н. В. О. Ткачёвым. Стоит отметить, что все протестированные соединения проявили NOS-ингибирующую активность более высокую, чем исходный риккардин С, однако сделать однозначные выводы и вывести закономерность структура-ингибирующая активность на данном этапе испытаний не представляется возможным. Метоксифлавоны проверялись на антипролиферативную активность. Эти эксперименты были выполнены сотрудником Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН (г. Москва) к.б.н. М. Н. Семёновой. Было показано, что метоксифлавоны (226, 212) обладают антипролиферативной активностью, не связанной с действием на тубулин (основной структурный компонент митотического веретена).

Седьмая глава представляет собой экспериментальную часть.

Подводя итог, можно сказать, что настоящая работа представляет собой целостное исследование, которое развивалось по двум основным направлениям: 1) фитохимическое направление, которое заключалось в выделении вторичных метаболитов P. macrocalyx, установлении их строения и в ряде случаев оценки количественного содержания м растительном сырье; 2) химическое направление, задачей которого было проведение химических трансформаций риккардина С с целью получения новых соединений, потенциальных ингибиторов NO-синтазы.

Результаты выполненной работы обсуждались- на семинарах Отдела природных и биологически активных веществ, молодежных конкурсах научных работ НИОХ СО РАН. Отдельные части работы были доложены на IV и V Всероссийских конференциях «Химия- и технология^ растительного сырья» (г. Сыктывкар, 2006; г. Уфа, 2008), VI Всероссийском научном семинаре «Химия и медицина. Молодежная научная школа" (г. Уфа, 2007), Всероссийской научной конференции «Современные проблемы органической химии» (г. Новосибирск, 2007), а также на Международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, 2007), VII Международной научно-практической-конференции «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии» (г. Барнаул, 2008), X Международном симпозиуме "Эколого-популяционный анализ полезных растений: интродукция, воспроизводство, использование" (г. Сыктывкар, 2008), Международной конференции «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, 2009) и на VII Всероссийской конференции «Химия и медицина, 0рхимед-2009» (г. Уфа, 2009).

Автор выражает искреннюю благодарность к.х.н. Половинка М. П. за неоценимую помощь в процессе работы над диссертацией и постоянную поддержку, ведущему инженеру ЛЛиПБАС Комаровой Н. И. за выполнение хроматографических анализов и ценные советы, сотрудникам ЛФМИ и лично к.х.н. Корчагиной Д. В. за помощь в установлении структур выделенных соединений, сотрудникам ЛЭИХА НИОХ и лично Морозову С. В. за выполнение газохроматографических анализов и обсуждение полученных результатов. Отдельно автор благодарит д.м.н. Лифшиц Г. И., к.б.н. Ткачева В. О. и к.б.н. Семёнову М. Н. за проведенные биологические испытания выделенных и синтезированных соединений. Также автор благодарит научного руководителя д.х.н. Салахутдинова Н. Ф. за проявленное терпение и внимательное отношение.

8. Выводы

1. Впервые проведено систематическое исследование качественного-и компонентного химического состава Первоцвета крупночашечкового (.Ргшш/а macrocalyx Bge.). Предложен результативный подход, позволяющий, получить простые для. хроматографического разделения экстракты, и выделить из них основные вторичные метаболиты P. macrocalyx.

2. Исследован- качественный состав и определено массовое содержание жирных кислот в надземной частиmacrocalyx. Показано, что в исследуемом растении присутствуют все монокарбоновые кислоты нормального строениям числом.атомов<углерода от 6 до^ЗО и незначительное количество- дикарбоновых кислот, причем, доминирующими кислотами надземной части P. macrocalyx являются- пальмитиновая» (С 16:0), октадекатетраеновая^ (С18:4Д6'9'12'15), линолевая (С18:2Д9'12) и ос-линоленовая (С 18:3 Д9'12'15)-кислоты.

3. Из. различных экстрактов', надземной- и подземой частей: Р. macrocalyx выделены-салицилаты-(225) • и (202), шесть метоксифлавонов (208, 209, 212, 226, 227, 228)*и гликозид.примвёрин (218). Метил-4-метоксисалицилат (225). и метоксифлавоны (227 и 228) ранее из* растений- рода Primula невыделялись.

4. Впервые из надземной и подземной частей* высшего-растения*Р. macrocalyx выделены соединения бисбибензильного типа, риккардин С (60) и перроттетин Е (229), проявляюшие NOS-ингибирующую активность. Разработана оригинальная, эффективнаяшетодика выделения риккардина С из надземной-и подземной частей растения (защшцено патентом РФ).

5. Изучена-сезонная динамика накопления риккардина С в надземной части Р: macrocalyx. Показано, что содержание последнего достигает максимума в период плодоношения.

6. Впервые получены сложные и простые эфиры риккардина С (243

254), проявляющие более высокую NOS-ингибирующую активность, чем исходный риккардин С.

1. Граник, В. Г., Григорьев, Н. Б. Ингибиторы синтаз оксида азота -биология и химия // Известия АН. Серия химическая. 2002. - № 11.- С. 1819-1841.

2. Asakawa, Y., Matsuda, R. Riccardin С // Phytochemistry. 1982. - V. 21. -N 8.-P. 2143-2144.

3. Wu, C.-L., Lin, H.-R. Labdanoids and bis(bibenzyls) from Jungermannia species // Phytochemistry. 1995. - V. 44. -N 1. - P. 101-105.

4. Martini, U., Zapp, J., Becker, H. Chlorinated macrocyclic bis(bibenzyls) from the liverwort Bazzania Trilobata II Phytochemistry. 1998. - V. 47. - N 1. - P. 8996.

5. Toyota, M., Yoshida, Т., Matsunam, J., Asakawa, Y. Sesquiterpene and other constituents of the liverwort Dumortiera Hirsuta II Phytochemistry. 1997. - V. 44.-N2.-P. 293-298.

6. Zinsmeister, H.D1, Becker, H., Eicher, T. Rewiew. Bryophytes, a source of biologically active, naturally occurring material // Angew. Chem. — 1991. Vol. 3. -N2. -P.130-147.

7. Tamehiro, N., Sato, Y., Hashimoto, Т., Asakawa, Y. Riccardin C: A natural product that functions as a liver X receptor (LXR)a agonist and an LXRJ3 antagonist // FEBS Letters. 2005. - 579. - P. 5299-5304.

8. Пат. 2340350 РФ. Способ получения риккардина С / Половинка, М. П., Косенкова, Ю. С., Комарова Н. И., Салахутдинов, Н. Ф. Заявка № 2007129210; 30.07.07.

9. Furchgott, R. F., Zavadski, J. W. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of vascular smooth muscle by acetylholine // Nature. 1980. - V. 286.-P. 373-376.

10. Малкоч, А. В., Майданник, В. Г., Курбанова, Э. Г. Физиологическая роль оксида азота в организме (часть 1) // Нефрология и диализ. 2000. - Т. 2. - № 1-2. - С. 69-75.

11. Palmer, R. М. J., Ferigge, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium derived relaxing factor // Nature. 1987. -V. 327.-P. 534-526.

12. Nathan, C., Hibbs, J. B. Role of nitric oxide synthesis in> macrophage antimicrobial activity // Curr. Opin. Immunol. 1991. -N 3. - P. 65-70.

13. Palmer, R. M., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor // Nature. 1987. -N 327.-P. 524-526:

14. Nakaki, T. Phisiological and clinical significance of NO (nitric oxide) a review // Keio J. Med. - 1994. - V.43. - P. 15-26.

15. Culotta, E., Koshland, D. E. NO news is good news // Science. 1992. - V. 258.-P. 1862-1865.

16. Kerwin, J. F., Lancaster, J. R., Feldman, P. L. Nitric oxide: a new paradigm for second messengers // J. Med. Chem. 1995. - 38 (22). - P. 4343-^1362.

17. Stamler, J. S. Redox signaling: nitrisylation and related target interactions of nitric oxide // Cell. 1994. - 78. - P. 931-936.

18. Kikuchi, K., Nagano, Т., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Real time measurement of nitric oxide produced ex vivo by luminol-H202 chemiluminescence method // Ji Biol. Chem. 1993. - V. 268 (31). - P. 23106 -23110.

19. Gow, A. J., Stamler, J. S. Reactions between nitric oxide and haemoglobin under physiological conditions // Nature. 1998. - V. 391(6663): - P! 169-173.

20. Schmidt, H. H., Walter, U. NO at work // Cell. 1994. - 78. - P. 919-925.

21. Nitric oxide donors. For pharmaceutical and biological applications / Edited by Wang P.G., T.B. Cai, N. Taniguchi / Wiley. 2004 - 390 p.

22. Nathan, C., Xie, Q.-W. Nitric oxide synthases: roles, tolls, and controls // Cell. 1994. - 78 - P. 915-918.

23. Менщикова, E. Б., Ланкин, В. 3., Зенков, H. К., Бондарь, И. А., Круговых,

24. H. Ф., Труфакин, В. А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. -М.: Слово, 2006. 556 с.

25. Forstermann, U., Closs, Е. I., Pollock, J. S., Nakane, M., Schwarz, P., Gath,1., Kleinert, H. Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification; molecular cloning, and functions // Hypertension. 1994. -23.-P. 1121 - 1131.

26. Busse, R., Mulsch, A. Induction of nitric oxide synthase by cytokines in vascular smooth muscle cells // FEBS Lett. 1990. - V. 275. - P. 87-90.

27. Solhaug,,M. J., Ballevre, L. D., Guignard, J.-P. Nitric oxide in the developing kidney // Pediatr. Nephrol. 1996. - V.10 (4). - P. 529-539.

28. Geller, D}: A., Billiar, T. R. Molecular biology of nitric oxide synthases // Cancer Metastasis Rev. 1998. .- 17. — P. 7—23

29. Shirato, Ml, Sakamoto; 'Г., Uchida, Y., Nomura, A., Ishii, Y., Iijima, H., Goto,1. Л I

30. Marietta;. Mi A. Nitric oxide synthase: structure: and; mechanism II J. Biol. Chem. 1993.-268.- 17.-P. 12231-12234.

31. Groves, J.T., Watanabe, Y. Reactive iromporphyrin; derivatives relatedltorthe catalytic cycles of cytochrome P-450 and peroxidase. Studies of the mechanism of oxygen activation // J. Am: Chem. Soc. 1988'. - 110 - P. 8443.

32. Yamaguchi, К., Watanabe, Y., Morishima, I. Direct observation of the push effect on the O-O bond cleavage of acylperoxoiron (111) porphyrin complexes // J. Am. Chem. Soc. 1993. - 115. - PI 4058.

33. Huang, H., Hah, J.-M., Silverman, R. B. Mechanism of nitric oxide synthase. Evidence that direct hydrogen atom abstraction from the О—H bond of NG-hydroxyarginine is not relevant to the rechanism // J. Am. Chem. Soc. — 2001. — 123 (11).-P. 2674-2676.

34. Babu, B. R.; Griffith, O. W. Design of isoform-selective inhibitors of nitric oxide synthase // Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. - 2. - P: 491-500.

35. Moore, W. M., Webber, R. K., Jerome, G. M., Tjoeng, F. S., Misko, T. P., Currie, M. G. l-N6-(l-Iminoethyl)lysine: a selective inhibitor of inducible nitrictoxide synthase // J. Med. Chem. 1994. - 37. - P. 3886-3888.

36. Fast, W., Nikolic, D., Van Breemen, R. В., Silverman, R. B. Mechanisticчstudies of the inactivation of inducible nitric oxide synthase by N5-(l-Iminoethyl)1.ornithine (1-NIO) //J. Am. Chem. Soc. 1999. - 121 (5). - P. 903-916.

37. Jin, H. Z., Lee, J. H., Lee, D., Hong, Y. S., Kim, Y. H., Lee, J. J. Inhibitors of the LPS-induced NF-kB activation from Artemisia sylvatica II Phytochemistry. — 2004. 65(15). - P. 2247-2253.

38. Zhang, X., Xu, J.-K., Wang, J., Wang, N.-L., Kurihara, H., Kitanaka, S., Yao, X.-S. Bioactive bibenzyl derivatives and fluorenones from Dendrobium nobile II J. Nat. Prod. 2007. - 70(1). - P. 24-28.

39. Yoshida, Т., Hashimoto, Т., Takaoka, S., Kan, Y., Tori, M., Asakawa, Y. Phenolic constituents of the liverwort: four novel cyclic bisbibenzyl dimers from Blasiapusilla L. // Tetrahedron. 1996. - 52(46). - P. 14487-14500.

40. Taira, J., Nanbu^ H;, Ueda, K. Nitric oxide-scavenging compounds in Argimonia pilosa Lebed on LPS-induced RAW 264.7 macrophages-// Food Chemistry. 2009. ~ 115(4). - P: 1221-1227.

41. Wolff, D. J., Luberskie, A., Gauld, D. S., Neulander, M. J: Inactivation of nitric oxide synthases and cellular nitric formation by: NMminoethyl-l'-lysine and N5-iminoethyl-l-ornithine ;// Eur. Ji Pharmacol; 1998: - 350; - 325-3341

42. Moore; W. Ml, Webber, R. K., Jerome, G; M;, Tj oeng; F. S., Misko, Т. P., Gurrie, Mi G. l-N6-(r-Iminoethyl)lysine: A selective inhibitor of inducible: nitric: oxide synthase // JtMed; Chem. 1994. -37. — P13886—3888.

43. Komori, Y., Wallage, G. C., Fukuto, Л M! Inhibition of purified nitric oxide synthase from rat cerebellum; and macrophage by L-arginine analogs' // Arch.' Biochem. Biophys. 1994. - 315. - P. 213-218.

44. Fishlock, D., Perdicakis, В., Montgomery, Hi J;,:Guillemette, JiG., Jervis, E;, Lajoie, G. A. Synthesis and evaluation' of ^ra«5-3,4-cyclopropyl L-arginine analogues as isoform selective inhibitors of nitric oxide synthase // Bioorg. Med.

45. Chem. 2003. - 11(6). - P. 869-873.

46. Wolff, D: J.,Gauld, D. S., Neulander, M. J., Southan, G. Inactivation of nitric oxide synthase by substituted aminoguanidines and aminoisothioureas // J.Pharmacol. Exp. Ther. 1997. - 283. - P. 265-273.

47. Martin, N. I., Beeson, W. Т., Woodward, J. J., Marietta, M: A. №-Aminoguanidines from primary amines and the preparation of nitric oxide synthase inhibitors // J. Med. Chem. 2008. - 51 (4). - P: 924-931.

48. Rossiter, S., Smith, C. L., Malaki, M., Nandi, M.-, Gill, H., Leiper, J. M., Vallance, P., Selwood, D: L. Selective substrate-based inhibitors of mammalian dimethylarginine dimethylaminohydrolase // J. Med. Chem. 2005. - 48 (14). - P. 4670^4678.

49. Differential binding modes dependent on nitrogen substitution // J. Med. Chem. -2004. 47 (12). - P. 3320-3323.

50. Beaton H. G., Hamley P., Nicholls D. J., Tinker A. C., Wallace A. V. 3,4-Dihydro-l-isoquinolinamines: a novel class of nitric oxide synthase inhibitors with a range of isoform selectivity and potency // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000. -11.-P. 1023-1026.

51. Oh; H., Shin, H., Oh, G.-S., Рае, H.-O., Chai, K.-Y., Chung, H.-T., Lee, H.-S. The absolute configuration of prunioside A from Spiraea prunifolia and biological-activities of related compounds // Phytochemistry. 2003. - 64 (6). - P. 1113-1118.

52. Honda, Т., Rounds, В. V., Bore, L., Finlay, H. J., Favaloro F. G., Suh, Jr. N.,

53. Wang, Y., Sponv M. В.", Gribble, G. W. Synthetic oleanane and ursanetriterpenoids with modified rings A and C: a series of highly active inhibitors-ofnitric oxide production in mouse macrophages // J. Med. Chem. 2000. - 43. - P. 4233-4246.

54. Fast, W., Nikolic, D., Van Breemen, R. В., Silverman, R. B. Mechanistic studies of the inactivation of inducible nitric oxide synthase by N5-(l-Iminoethyl)-1-ornithine (1-NIO) //J. Am. Chem. Soc. 1999. - 121 (5). - P. 903-916.

55. Zhu, Y., Nikolic, D., Van Breemen, R. В., Silverman R. B. Mechanism of inactivation of inducible nitric oxide synthase by amidines. Irreversible enzyme inactivation without inactivator modification // J. Am. Chem. Soc. 2005. - 127 (3).-P. 858-868.

56. Hutzler, J. M., Melton, R. J., Rumsey, J. M., Schnute, M. E., Locuson, C. W., Wienkers, L. C. Inhibition* of cytochrome P450 3A4 by a pyrimidineimidazole: evidence for complex heme interactions // Chem. Res. Toxicol. 2006: - 19 (12). -P.1650-1659.

57. Kawanaka, Y., Kobayashi, K., Kusuda, S., Tatsumi, Т., Murota, M.,

58. Ahmad, V. U., Shah, M. G., Mohammad, F. V., Ismail, N., Noorwala, M. Macrophylloside, a flavone glucoside from Primula macrophylla II Phytochemistry.- 1991.-V. 30.-N 12.-P. 4206-4208.

59. Goris, Albert;-Canal, Henri. Chemical composition of the essential oil of Primula farinosa L // Compt. Rend. 1945. - N 220: - P. 925-926.

60. Биоактивные вещества растительного происхождения, М.: Наука, 2001. — 189 с.

61. Pharmacognosy. Phytochemistry. Medical Plants / Jean Bruneton, New York, 1999: 847 p.

62. Budzianowski, J., Morozowska, Ml, Wesolowska, M. Lipophilic'flavones of Primula veris L. from field cultivation and in vitro cultures // Phytochemistry. -2005.-V. 66. — № 9: — P.5 1033-1039.

63. The chemistry of flavonoid* compounds / Edited by T. A. Geissman. Los-Angeles: Department of Chemistry University of California, Pergamon Press, 1962.-666 p.

64. Harborne, J. B. Anthocyanidins of the Primulaceae // Nature. 1958. - N 460.-P. 126-27.

65. Kendrick, L., Marr, Bruce., Bohm, A. et. al. Flavonoids of Hawaiian endemic Lysimachia// Phytochemistry. 1998. - V. 49. -N 2. - P. 553-557.

66. Kitagawa, I., Matsuda, A., Yosioka, I. Saponin and sapogenol. Sapogenol constituents of five Primulaceous plants. // Chem. Pharm. Bull. 1972. - 20(10). — P. 2226-2234.

67. Ульченко; Н. Г., Беккер, Н. П., Глушенкова, А. И: Липиды и липофильные компоненты надземной части Daucus sativus II Хим. прир. соед. 2000; - № 6. - С. 29-32. ■:••■.".

68. Zinsmeister, Hi D., Becker, Hi, Eicher, Т., Bryophytes, as source of biologically active, naturally occuring material // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. -1991.-Vol. 30.-P. 134-151.

69. Qu, J., Xie, C., Guo, H., Yu, W., Lou, H. Antifungal dibenzofiiran bis(bibenzyl)s from the liverwort Astrella angusta II Phytochemistry. — 2007. — 68. -P. 1767-1774.

70. Erba, E., Pocar, D., Possi, L. M. New esters of R-(+)-usnic acid // II farmaco. -1998. Vol. 53. -№ 10-11. - P. 718-720.

71. Semenova, M. N., Kiselyov, A., Semenov, V. V. Sea urchin embryo as a model organism for the rapid functional' screening of tubulin modulators // BioTechniques. 2006. - Vol. 40. - № 6. - P. 765-773.

72. Препаративная органическая химия; под общ. ред. Н. С. Вульфсона. -М. -Л., Химия, 1964. 907 с.

73. Физер, JL, Физер, М. Реагенты для органического синтеза. т. 1. - М.: Мир, 1970.-445 с.

74. Fourie, Т. G., Ferreira, D., Roux, D. G. Flavonoid* synthesis based, on photolysis of flavan-3-ols, 3-hydroxy-flavanones, and 2-benzylbenzofuranones // J. Chem. Soc. Perkin Tr. 1 EN. 1977. - P. 125-133.

75. Sadtler standard spectra: Nuclear magnetic resonance spectra. V. 30. -19659. Philadelphia: Sadtler research lab., 1974.

76. Wannab, A., Ottosen, M., Bachelor, F. W. The synthesis of nor- and bisnorlupanes // Can. J. Chem. 1991. - Vol. 69, - P. 570-577.