Ферментные электроды с использованием полимерных полупроводников и неорганических поликристаллов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА, ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

?7о

На правах рукописи

КАРЯКИН Аркадий Аркадьевич

Ферментные электроды с использованием полимерных полупроводников и неорганических поликристаллов.

02.00.15- химическая кинетика и катализ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук.

Москва -1996

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Алпатова Н.М. доктор химических наук, профессор Иванов В.М. доктор химических наук, профессор Ямсков И.А.

Ведущая организация:

совета N Д.053.05.76 по химическим наукам при Московском государственног университете им. М.В. Ломоносова по адресу: Москва, 119899, ГСП-3, Воробьевы горь Химический факультет МГУ, ауд. 202 кафедры химической энзимологии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МП им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан <ЛЛ(Ц? 1996г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН.

Защита состоится

заседании диссертационноп

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Предлагаемая диссертационная работа посвящена путям сопряжения электродных и ферментативных реакций. Под термином "сопряжение" автор подразумевает, что электрохимическая реакция протекает в ответ на акт биологического узнавания, в качестве которого в данной работе рассматривается ферментативная реакция. Согласно общепринятой классификации ферментные электроды делятся на три группы. Активный центр фермента может обмениваться электронами напрямую с материалом электрода, как это происходит в ферментных электродах, относимых к третьему поколению. Ферментные электроды второго поколения основаны на использовании для этой цели диффузионно подвижных или иммобилизованных медиаторов. До сего времени не потеряло актуальность совершенствование биосенсоров первого поколения, функционирующих по принципу окисления-восстановления сопряженных субстрата или продукта ферментативной реакции. В предлагаемой работе будут рассматриваться все три типа ферментных электродов.

В настоящее время требования клинической диагностики, охраны окружающей среды и различных областей промышленности обусловливают поиск дешевых, специфичных и экспрессных методов анализа. Электрохимические биосенсоры удовлетворяют этим требованиям как нельзя лучше. Простота регистрирующего устройства и специфичность биологического узнавания, помноженная на высокие скорости катализа, обеспечивают биологическим датчикам приоритет в биоаналитической химии. Недаром уже через несколько лет после открытия первого биосенсора, он был принят к серийному производству компанией Yellow Springs Instruments. Успех другого биосенсора, персонального глкжозного детектора, можно проиллюстрировать следующими цифрами: производство, начавшееся скромной фирмой в 1987 году, всего через семь лет достигло оборота в пол-миллиарда долларов США в год.

Не удивительно, что и в предлагаемой работе основное внимание уделяется электроаналитическим устройствам на основе ферментов. Постановка некоторых задач собственно и возникла из необходимости совершенствования существующих биосенсоров.

С практической точки зрения важно отметить применение ферментных электродов также для разработки топливных элементов и систем биоспецифического электросинтеза. И, если задача создания биотопливных элементов в течение последних десяти лет несколько утратила свою актуальность, сместившись географически в страны Ближне- и Юго-Восточной Азии, то проблемы биоэлектросинтеза еще предстоит решать, возможно, в недалеком будущем. С точки зрения технологии будущего системы сопряжения электродных и ферментативных реакций могут найти неожиданное применение в качестве устройств ввода-вывода информации в биологических компьютерах.

Как представлялось при формулировке задачи, подобное исследование должно быть

посвящено применению знаний, накопленных современной электрохимией, для целей биоэлектрокатализа. Однако условия функционирования биологических катализаторов диктуют свои требования к свойствам модифицированных электродов. Таким образом, при выполнении данной работы автору приходилось решать собственно электрохимические задачи. В качестве наиболее ярких примеров можно привести пролонгирование редокс активности полианилина в область физиологических рН и исследование новой группы электрохимически активных полимеров, получаемых электрополимеризацией редокс индикаторов азинового ряда.

Целью работы явился поиск новых путей сопряжения ферментативных и электрохимических реакций для разработки ферментных электродов первого, второго и третьего поколений с использованием полимерных полупроводниковых пленок и неорганических поликристаллов. Разработка ферментных электродов планировалась, в основном, из соображений создания новых, более совершенных электроаналитических систем.

Научная новизна. Предлагаемая диссертационная работа охватывает все существующие типы сопряжения электродных и ферментативных реакций. Начинаясь с явления прямого биоэлектрокатализа, исследование затем переходит в области применения проводящих полимеров и неорганических поликристаллов для создания ферментных электродов первого и второго поколений.

В диссертационной работе заложены основы нескольких научных направлений. Явление биоэлектрокатализа гидрогеназами легло в основу многочисленных работ в этой области. Пожалуй, до сих пор оригинальным является сравнение механизмов действия фермента в гомогенном и электрохимическом режимах. Предложенный молекулярный механизм действия гидрогеназ позволил автору сформулировать гипотезу о включении ферментов в прямой биоэлектрокатализ по механизму непосредственного обмена электронами между активным центром фермента и электродом.

Независимой областью явилось изучение электрополимеризации красителей азинового ряда, являющихся медиаторами биоэлектрохимических реакций. Исследование структуры новой группы полимеров и оптимизация условий их электросинтеза вылились в самостоятельное научное направление. Полученные полимеры сохраняли свойства исходных мономеров, являясь формой иммобилизации медиаторов на электродах, и в то же время проявляли новые нетрадиционные свойства. В частности, полимерные азины оказались эффективными электрокатализаторами регенерации кофакторов, что обусловило возможность создания дегидрогеназных электродов на их основе.

Принципиальным для фундаментальной и прикладной электрохимии проводящих полимеров явился синтез самодопированного полианилина, электрохимически активного в нейтральных и щелочных водных растворах. На примере самодопированного полимера удалось проследить свойства полианилина при высоких значениях рН. При переходе из

<ислых в нейтральные растворы наблюдалось исчезновение одной из редокс форм топианилина, эмеральдина. Обосновано также влияние дефектов на электрохимическую активность незамещенного полианилина в слабокислых растворах.

Было предложено создание потенциометрических биосенсоров на основе юлианилина. Кроме технологических преимуществ использования проводящего полимера з качестве чувствительного элемента, полученные биосенсоры обладали гораздо более 1Ысокой чувствительностью по сравнению с известными системами.

В предлагаемой работе содержится приоритет использования неорганических юликристаллов Берлинской Лазури для целей биосенсоров. Удалось синтезировать шектрокатализатор селективного восстановления пероксида водорода, нечувствительный : кислороду в широкой области потенциалов. Это позволило решить извечную проблему )мперометрических биосенсоров - мешающего влияния восстановителей. ^

Наконец, к несомненным успешным результатам, достигнутым в данной работе, :ледует отнести и оптимизацию иммобилизации ферментов на поверхности модифици-юванных электродов. Предложенный способ формирования ферментсодержащих лембран позволил существенно увеличить стабильность биологических катализаторов.

Практическая ценность состоит прежде всего в создании новых типов ферментных 'Лектродов, пригодных для разнообразных приложений.

Ферментные электроды первого поколения на основе Берлинской Лазури азработаны для применения в электроаналитических системах. Замена платины на лектрод, модифицированный неорганическим поликристаллом, не только понижает тоимость биосенсора. За счет высокой сорбционной активности катализаторы на основе юталлов платиновой группы способны отравляться большим числом низкомолекулярных оединений, включая тиолы, сульфиды и др., что не свойственно злектрокатализаторам а основе Берлинской Лазури. За счет полислойной структуры последних на модифициро-анных электродах удается добиться наивысших плотностей токов восстановления перок-ида водорода в сравнении с известными электрокаталитическими системами. На приме-е глюкозного биосенсора на основе Берлинской Лазури продемонстрированы высокие увствительность и селективность датчиков, удовлетворяющие требованиям неинвазив-ой диагностики.

Синтез на основе Берлинской Лазури электрокатализатора восстановления перок-ида водорода, нечувствительного к кислороду, позволяет существенно снизить потен-иал индикаторного электрода, что делает отклик датчика независящим от присутствия осстановителей типа аскорбата и парацетамола и таким образом позволяет решить аиболее важную проблему амперометрических биосенсоров на основе оксидаз. При-;енение разработанного электрода в качестве детектора в проточно-инжекционной лстеме повышает экспрессность анализа. Кроме продемонстрированных анализа глю-

козы и этанола, подобный биосенсор можно изготовить для анализа любого вещества при наличии соответствующей оксидазы. Из практически важных веществ, анализ которых может быть произведен таким образом, следует отметить холестерин, глицерин, аминокислоты, галактозу. Областями применения биосенсоров на основе Берлинской Лазури является клиническая диагностика и некоторые области пищевой промышленности.

Важным практическим результатом является разработка потенциометрических биосенсоров на основе полианилина. Применение последнего в качестве рН трансдью-сера позволяет повысить чувствительность биосенсоров. Глюкозный ферментный электрод на основе полианилина обладал в три - четыре раза более высоким откликом по сравнению с глкжозочувствительным полевым транзистором. Предел обнаружения фосфорор-ганических веществ биосенсором на основе полианилина составил Ю"? М, что ниже, чем для известных потенциометрических систем (10"5 10~6 М). Потенциометрические биосенсоры на основе полианилина могут применяться в клинической диагностике для анализа той же глюкозы, а также связанного холестерина, триацилглицеридов и пр. Представляется возможность использования потенциометрических биосенсоров на основе полианилина для охраны окружающей среды.

Создание дегидрогеназных электродов открывает большие возможности для электроаналитических целей, поскольку ферменты этой группы насчитывают более 500 наименований и катализируют превращение самых разнообразных веществ. Электрополимеризация представляет собой способ иммобилизации на электроде медиаторов, используемых в биоэлектрокаталитических реакциях. Полученные модифицированные электроды являются более эффективными электрокатализаторами и проявляют в десятки раз более высокую операционную стабильность. Применение полимерных азинов позволяет создавать биосенсоры как на окисляющие, так и на восстанавливающие субстраты дегидрогеназ, поскольку электрохимическая регенерация кофактора NAD+/NADH может быть проведена в любом направлении. Наряду с кофактор-зависимыми, разработаны короткоживущие безреагентные биосенсоры на основе дегидрогеназ.

Дегидрогеназные электроды наряду с безреагентным водородным ферментным электродом могут применяться и для целей создания биотопливных элементов.

Практическую ценность имеет способ иммобилизации ферментов в водонераство-римые полиэлектролиты из водно-спиртовых смесей с высоким содержанием органического растворителя. Ферментсодержащие мембраны Nation обладают высокой стабильностью и хорошей адгезией к поверхности модифицированных электродов. Кроме того, такие мембраны являются биосовместимыми.

Наконец, разработанные модифицированные электроды на основе самодопиро-ванного полианилина, полимерных азинов, Берлинской Лазури и пленок, требующих анодного и катодного инициирования, могут найти применение наряду с биотехнологи-

ческой и в других областях электрохимии.

Методы исследования. В работе использованы электрохимические и кинетические методы в режимах, обеспечивающих максимальную информативность. При кинетических исследованиях концентрация субстрата или продукта ферментативной реакции контролировалась спектрофотометрически либо полярографически. Кинетический анализ проводился с использованием как начальных скоростей реакций, так и полной кинетической <ривой. Для упрощения кинетического анализа была предложена обобщенная форма записи уравнения скорости неразветвленных каталитических реакций в стационарном режиме. Электрохимические исследования основывались на методах стационарных поляризационных кривых и циклической вольтамперометрии. Использовался также метод элект-эохимического импеданса. Электрополимеризация и электроосаждение проводились в ютенциодинамическом и потенциостатическом режимах. Для изучения электрохими-1еской кинетики потребовалось применение метода вращающегося дискового электрода. эазработанные химические и биологические сенсоры исследовались в режимах шперометрии при постоянном потенциале индикаторного электрода и потенциометрии. 1пя анализа структуры полимерных азинов применялись методы спектроэлектрохимии и шфракрасной спектроскопии. С целью повышения экспрессное™ анализа была собрана 1роточно-инжекционная установка с электрохимической ячейкой типа wall-jet, обеспе-(ивающей выгодный гидродинамический режим индикаторного электрода.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на российских и международных конференциях: Международном Симпозиуме по молекулярной биологии идрогеназ (Сегед, 1985), III Всесоюзной конференции "Химические сенсоры" (Ленинград, 989), Международном Симпозиуме по биоаналитическим методам (Прага, 1990), ¡сесоюзном Конгрессе "Сенсоры и Преобразователи информации" (Ялта, 1991), Международной конференции "Биотехнология в Великобритании" (Лидс, 1991), Российско-ёрманских совещаниях по биосенсорам (Москва, 1992, Мюнстер, 1993), VII Всесоюзном импозиуме по инженерной энзимологии (Москва, 1992), Международной научной школе о биосенсорным материалам (Пущино, 1994), семинаре по электрохимии проводящих олимеров Института электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН (Москва, 1995), !еждународном совещании по электрохимии электроактивных полимерных покрытий, /VEEPF'95 (Москва, 1995), IX Международной конференции "Евросенсоры и рансдьюсеры'95" (Стокгольм, 1995), III Международном совещании "Биосенсорные истемы для промышленного применения" (Лунд, 1995), Международной конференции зИОкатализ-95" (Суздаль, 1995), V Международном симпозиуме "Кинетика в чалитической химии" (Москва, 1995), на совещании электрохимических обществ ортугалии и Испании (Алгарве, 1995), на I Международном симпозиуме по биосенсорам гран тихоокеанского региона (Воллонгонг, 1995), на Международном совещании по

многофункциональным полимерам и тонким полимерным системам (Воллонгонг, 1996), на VI Международной конференции по электроанализу "ЕЗЕАС'Эб" (Дарем, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 41 печатная работа, получено авторское свидетельство.

Структура и объем работы. Диссертационная работа представляет собой рукопись из 12 глав, введения и заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы (347 наименований). Объем диссертации составляет 383 страницы, в том числе 76 рисунков и 8 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Диссертационная работа состоит из 3 глав литературного обзора и 9 экспериментальных глав.

Глава I посвящена обзору существующих ферментных электродов в историческом аспекте. Принятая классификация биосенсоров связана со способом сопряжения электродных и ферментативных реакций. К первому поколению принято относить ферментные электроды, основанные на электрохимической детекции сопряженных субстрата или продукта ферментативной реакции. Например, акцептором электронов при окислении глюкозы, катализируемом глюкозооксидазой, является кислород. При этом последний восстанавливается до пероксида водорода. На амперометрической детекции О2 или Н2О2 основаны первые биосенсоры этой группы.

Потенциометрические биосенсоры на основе ион-селективных электродов также следует считать ферментными электродами первого поколения, поскольку детектируемое изменение концентрации ионов гидроксония или прочих ионов происходит в результате ферментативной реакции. Например, при ферментативном окислении той же глюкозы после спонтанного (или ферментативного) гидролиза продукта образуется глюконовая кислота, вызывающая понижение локального значения рН.

К электродам второго поколения относятся исключительно амперометрические системы. Для осуществления обмена электронами между электродом и активным центром фермента применяются редокс медиаторы, как правило, диффузионно подвижные. Дегидрогеназные электроды, основанные на электрохимической регенерации кофакторов, следует также отнести к электродам второго поколения.

Наконец, еще в конце 70х годов была показана возможность прямого обмена электронами между активным центром фермента и электродом. Подобные системы, основанные на прямом биоэлектрокатапизе, иногда называют ферментными электродами третьего поколения.

Глава II диссертации посвящена краткому обзору свойств полимерных полупроводников и неорганических поликристаллов на электродах. Среди полимерных

полупроводников особое внимание уделяется полипирролу и полианилину, как наиболее перспективным материалам для целей биоэлектрохимии. Сделана попытка обобщить некоторые свойства проводящих полимеров с позиций органической химии.

Наличие Главы III продиктовано необходимостью выявления молекулярного механизма гидрогеназного катализа. Здесь рассматриваются структура активного центра и физико-химические свойства гидрогеназ, предваряя наше собственное исследование этих ферментов, представленное в следующей главе. Предложена классификация гидрогеназ по структуре активного центра и каталитической активности.

Глава IV. Механизм гидрогеназного катализа.

Изучение механизма окисления молекулярного водорода, катализируемого гидрогеназами, проводилось кинетическими методами. Единственным постулатом, взятым из литературного анализа, было предположение о гетеролитическом характере разрыва молекулы Н2 в активных центрах этих ферментов. Исследование кинетических параметров ферментативной реакции в стационарном режиме при варьировании всех субстратов и продуктов ферментативной реакции позволило выявить последовательность элементарных стадий и, в частности, подтвердить, что активация молекулярного водорода гидрогеназами приводит к образованию фермент-гидридного комплекса. Также было показано, что взаимодействие гидрогеназ с одноэлектронными акцепторами виологеново-го ряда происходит обратимо в бимолекулярном режиме. Между стадиями взаимодействия с акцептором электронов зарегистрирована медленная внутримолекулярная стадия.

Более подробно схема гидрогеназного катализа представлена на рис. 1, где Е -гидрогеназа, А - одноэлектронный акцептор. |_j+ |_|2

Стадии 1, 2, 6 протекают в квазиравновесном

режиме, что обусловливает проявление k-f^r

нулевого порядка скорости реакции по АГдЗ—v. 1 концентрациям водорода и ионов гидроксония. k^v |

Константа прямого направления 4 стадии для .

фермента из Th. roseopersicina оказалась / (ЕН)

аавной 17 ± 5 с""'. Соотношение прямой и кд^сй*4

эбратной констант третьей стадии \

подчиняется ожидаемой зависимости от \

эедокс потенциала одноэлектронного ^red

акцептора. Рис- 1- Схема гидрогеназного катализа.

Проведение ингибиторного анализа с одновременным контролем ЭПР спектров активного центра позволило выдвинуть гипотезу э молекулярном механизме гидрогеназного катализа (рис. 2). На первой стадии молекула

водорода сорбируется на свободное координационное место никеля. Затем происходит гете-ролитический разрыв молекулы Н2 с образованием фермент-гмдридного комплекса. При этом протон сорбируется ионогенной группой (рКа = 7.5) с последующим выбросом его в раствор. Железосерный кластер последовательно акцептирует электроны гидрида и быстро в бимолекулярном режиме взаимодей- Рис. 2. Молекулярный механизм действия Н^азы. ствует с одноэлектронным акцептором. Таким образом, у однокластерных гидрогеназ железо-серный кластер выполняет функцию внутримолекулярного вспомогательного редокс центра.

Глава V. Прямой биоэлектрокатализ гидрогеназой. Механизм электрохимического действия фермента.

При внесении электрода с иммобилизованной гидрогеназой из Т1г гозеорегеюта в насыщенный водородом раствор на электроде устанавливался потенциал, равный по значению равновесному водородному потенциалу. Как видно из поляризационных кривых (рис. 3), в атмосфере аргона потенциал сильно смещен в положительную область. В присутствии инактивированной или заингибированной окисью углерода гидрогеназы, фоновая реакция электроокисления водорода в данной области потенциалов практически отсутствует. Зависимости наблюдаемого потенциала от концентраций субстрата и продукта, парциального давления водорода и рН раствора, совпадают с предсказанными из уравнения Нернста. Таким образом, на ферментном электроде с иммобилизованной гидрогеназой устанавливается равновесный водородный потенциал.

Для определения порядка скорости электрохимической реакции по отдельным компонентам сравнивались значения плотности тока при фиксированном значении перенапряжения. Как и в случае гомогенного катализа, было найдено, что скорость электроокисления водорода проявляет нулевой порядок по концентрациям водорода и ионов гидроксония. Отсутствие классического Тафелевского наклона на поляризационной кривой в полулогарифмических координатах было интерпретировано в рамках двух (по числу переносимых электронов) последовательных потенциалзависимых электрохимических стадий. Полученное уравнение для тока удовлетворительно описывало поведение

положительном ветви поляризационной кривой. Зависимость параметров данного уравнения от парциального давления водорода и рН раствора свидетельствовало о том, что электрохимические стадии следуют одна за другой.

Подтверждением правомерности предложенной схемы био-электрокаталитического окисления

водорода явилось следующее обстоятельство. При относительно больших перенапряжениях (> 25 мВ) ветви поляризационной кривой оказываются несимметричными относительно начала координат. Тем не менее на основании анализа положительной ветви, соответствующей электроокислению водорода, удалось адекватно предсказать поляризационную кривую для обратной реакции, электровыделения Н2-

По данным электрохимической кинетики не удалось сделать таких же исчерпывающих выводов о полной последовательности элементарных стадий, однако найденные закономерности полностью укладываются в рамки того механизма, который был предложен исходя из анализа гомогенной кинетики действия гидрогеназ. Таким образом, можно предположить, что механизмы действия фермента в гомогенном и электрохимическом режимах идентичны.

О механизме прямого биоэлектрокатапиза. Напомним, что железо-серный кластер выполняет роль промежуточной редокс активной частицы в гидрогеназном катализе. Один из атомов железа в кластере координационно не насыщен лигандами белка. В то же время углеродистая поверхность в окисленном состоянии представляет собой совокупность лигандов, образованных карбонильными и карбоксильными группами. Возможно, комплексование координационно ненасыщенного атома железа с

Рис. 3. Поляризационные кривые окисления и образования водорода на электроде с иммобилизованной гидрогеназой: в атмосфере Н2 (1), аргона (2), (3) - фоновая кривая.

поверхностными лигандами углеродистого электрода и образует цепь переноса электрона, необходимую для осуществления прямого биоэлектрокатализа. Кроме гидрогеназ, также некоторые дегидрогеназы, содержащие железо-серный кластер, оказываются способными к прямому обмену электронами с углеродистыми электродами. Явление прямого биоэлектрокатализа лакказой и пероксидазой не изучалось автором, однако оба названных фермента содержат атомы металла в активном центре, которые могут быть доступны для лигандов электрода.

Глава VI. Совместное осаждение пленок, требующих анодного и катодного инициирования . Полипиррол, контролируемо допированный Берлинской Лазурью.

Разработка каталитически активных электродных покрытий требует подчас совместного осаждения нескольких типов пленок. Полипиррол, например, является оптимальной матрицей для включения биологических макромолекул. Полимерные виологены или неорганические поликристаллы известны своей каталитической активностью.

Для совместного осаждения пленок, требующих различные типы инициирования, был выбран режим циклической вольтамперометрии. Поскольку пиррол полимеризуется при положительных потенциалах, а Берлинская Лазурь осаждается при отрицательных потенциалах, в потенциодинамическом режиме можно независимо контролировать процесс роста этих пленок. Однако необходимо решить вопрос о возможности осаждения одной пленки в присутствии другой. И, если о восстановлении ионов железа на поверхности полипиррола было известно, то полимеризация пиррола на поверхности электродов, модифицированных Берлинской Лазурью, была продемонстрирована в нашей работе. Берлинская Лазурь оказалась даже электрокатализатором полимеризации пиррола, позволившим снизить анодный предел цитирования потенциала.

Соосаждение пленок с анодным и катодным инициированием проводилось из раствора, содержащего все необходимые компоненты: пиррол, хлорид железа (III) и феррицианид железа. Изменяя только электрохимический режим осаждения, удалось добиться совершенно разных по составу электрохимически активных покрытий.

Г лава VII. Электрополимеризация феназинов, фенотиазинов и феноксазинов.

Возможность создания полимера, мономерные звенья которого были бы медиаторами биоэлектрохимических реакций, привлекала внимание исследователей достаточно давно. Попытки синтезировать подобные полимеры осуществлялись самыми разными способами. Однако наиболее простой и интересный путь - это электрополимеризация самих медиаторов на электроде.

Электрополимеризация привлекательна с научной и практической точек зрения.

Используя этот процесс, удается существенно упростить адресацию селективного нанесения покрытий на миниатюрные устройства. С другой стороны, весьма привлекательным представляется использование нетрадиционных свойств получаемых полимеров.

К моменту начала нашего исследования существовало единственное сообщение, являющееся материалами симпозиума по эпектроаналитической химии, что анодное окисление Метиленового Голубого может приводить к образованию редокс активного покрытия на электродах.

Электрополимеризация Метипенового Голубого, представлена на рис. 4. Следствием необратимого окисления мономера при высоких анодных потенциалах является рост электрохимически активного покрытия. Процесс электрополимеризации приводит к появлению новой области редокс активности на циклических вольтамперограммах. Соответствующий редокс потенциал находится положительнее потенциала редокс активности мономера Метиленового Голубого. Таким образом, можно утверждать, что процесс электрополимеризации приводит к :войственной только полимеру. Од-

образованию новой цепи сопряжения, 30

нако было показано, что и мономер-чый тип редокс активности присут-;твует в полимере наряду с новой ^епью сопряжения.

Ввиду наличия побочных процессов не представлялось возможным воспользоваться величиной ■шотности тока окисления мономера Ц1Я оценки скорости роста полимерного Метиленового Голубого. Поэто-лу с целью характеристики последуй было логично сравнить в раз-1ичных условиях редокс активность галучаемого полимера, для чего ¡ыла выбрана величина плотности ока анодного пика после 10 циклов юста. Зависимость данного параметра от рН оказалась крайне невиданной: скорость электрополи-геризации Метиленового Голубого Рис■ 4■ Электрополимеризация Метиленового начительно возрастала при перехо- Гопубого; [МВ] = 2.5-1 СГ4 М, рН 9.14; 50 мВ/с; !в из кислых в щелочные растворы. Ад/АдС1/КС11М

Каталитический эффект гидроксид-иона удалось частично смоделировать исходя из его свойств как нуклеофильного и экранирующего аниона введением в реакционную среду ионов БОз^- и N03" соответственно. Анионы, образующие прочные ионные пары, высаживали мономер.

Не только известные на настоящее время проводящие полимеры (полипиррол, полианилин), но и единственный изученный в этом ключе представитель красителей азинового ряда, Тионин, электрохимически полимеризуются в кислых растворах гораздо эффективнее. Что же касается Метиленового Голубого, то кроме наблюдаемого ускорения электрололимеризации в щелочных растворах, его оказалось невозможно заполимеризовать в кислых рН. Это обстоятельство позволяет выделить полимерный Метиленовый Голубой в отдельную группу электрохимически активных полимеров.

Интересным оказалась демонстрация биоэлектрохимической активности полимерного Метиленового Голубого. На модифицированном электроде удалось детектировать реакцию реокисления активного центра глкжозооксидазы после ее восстановления в ре-

зультате ферментативной реакции. Таким образом было сн,

СП, СИ,

n11,

N..

сн, Метиленовый Голубой (МВ)

XI

N11

СН,

+ сн

Метиленовый Зеленый (Мв)

.с из

XII,

Азур А (АА)

гСсн* Толуидиновый Голубой (ТВ)

осуществлено биоэлектрохи- Сп',' мическое окисление глюкозы.

Электрополимеризация прочих красителей азинового ряда. На рис. 5 представлены структурные формулы красителей азинового ряда, подвергнутых анодному окислению, с целью полимеризации. Данные красители делятся на три группы: феназины, фенотиазины и феноксазины, различающиеся вторым гетероатомом. В качестве последнего выступают атомы азота, серы и кислорода соответственно. Все указанные красители удавалось электро-полимеризовать из нейтральных и щелочных водных растворов. Исключение составлял

только упомянутый Тионин: Рис. 5. Структурные формулы изученных красителей

n11,

Тионин (ТИ)

сн.

сн,-

сн 2сн3

Кумасси (ВС8)

?ш

,сн, Нейтральный Красный (N13)

для его эффективной полимеризации требовались кислые рН, в которых окисление остальных азинов не приводило к образованию редокс активного электродного покрытия.

Редокс индикаторы азинового ряда различаются также амино-группами, являющимися заместителями боковых ароматических колец. Толуидиновый Голубой, Кумасси, Азур А и Нейтральный Красный содержат, кроме третичных амино-групп, первичную амино-группу. Необратимое окисление этих азинов приводит к их депротонированию, что позволяет осуществить полимеризацию при существенно более низких потенциалах по сравнению с Метиленовым Голубым. Что же касается последнего, то его необратимое окисление вероятно приводит к образованию двузаряженного катион-радикала.

Для выяснения структуры новой группы электроактивных полимеров, которую образуют полимерные азины, были проведены спектральные и спектроэлектрохимические исследования. На ранних степенях восстановления полимерных азинов дифференциальные спектры в видимой области, записанные в сторону окисления, показывают синхронное увеличение поглощения при 450 и 600 нм (рис. 6). В области более низких потенциалов основной прирост поглощения наблюдается в основном при 600 нм. Сравним спектры мономеров Метиленового Голубого и Метиленового Зеленого, различающихся всего на один акцепторный

Г I 1 м _

дА Ш

0 03

заместитель бокового кольца (рис. 5). В отсутствии заместителя в интересующей нас области наблюдается поглощение только при 600 нм. Введение нитро-группы приводит как к уменьшению поглощения при 600 нм, так и к появлению новой полосы при 450 нм. Сравнение инфракрасных спектров мономерных и полимерных азинов не дают дополнительной информации о структуре последних и только подтверждают изменение при полимеризации характера замещения ароматических колец.

Гипотеза о структуре полимерных

-0.03

-0.06

300

Рис. б. Дифференциальные (окисленный минус восстановленный) спектры полимерного Толуидинового Гопубого.

азинов основывается на том,

что

электрополимеризация не вызывает значительной деструкции красителеи, в частности, раскрытия циклов. Это подтверждает анализ видимых и инфракрасных спектров полимеров. Связь между молекулами азинов осуществляется мостиками, связывающими

боковые ароматические I + снз

кольца красителей. Для и

иллюстрации эта гипотеза представлена на примере полимерного Метиленового Голубого на рис. 7. Рассмотрим произвольное мономерное звено. Если соседние с ним звенья не не- п^с сут положительного заря-

СН3

СНз

да, то и его спектр, и ред- рис j ¡-ипотетическая структура полимерных азинов. оке активность должны

быть похожи на таковые в мономерном состоянии. Иное дело, если соседние мономерные звенья несут положительный заряд. Они превращаются в электронакцепторные заместители, вызывая повышение редокс потенциала рассматриваемого мономерного звена и появление новой области редокс активности. При этом форма видимого спектра будет напоминать таковую при наличии дополнительного акцепторного заместителя. Образование различных типов связей между молекулами Метиленового Голубого в полимере предложены, исходя из возможности протекания аналогичных органических реакций.

Фундаментальное исследование новой группы электрохимически активных полимеров, получаемых электрополимеризацией красителей азинового ряда, позволило перейти к их использованию для биоэлекгрохимических целей.

Глава VIH. Регенерация NAD+/NADH на электродах, модифицированных полимерными азинами.

Наиболее ярким приложением полимерных азинов для целей биоэлектрохимии явилась электрокаталитическая регенерация NAD+/NADH. Прямое окисление-восстановление этого, пожалуй, наиболее низкопотенциального кофактора требует больших перенапряжений. Например, эффективное окисление NADH на платине или стеклоуглероде протекает в области потенциалов, близких к окислению воды до кислорода. Это делает невозможным применение данной реакции в аналитических системах и драматически сказывается на стабильности самого пиридиннуклеотида. Было известно, что наиболее эффективными катализаторами электроокисления NADH являются красители азинового ряда. Однако попытки иммобилизации последних приводили к нестабильным модифицированным электродам, теряющим свою активность уже в течение нескольких часов.

На рис. 8 представлены циклические вольтамперограммы электрода, модифициро-

-0.25

1,цА

0.5

0.25

-250 0_____ -----250

Е, гтА/

ванного полимерным Метиле-новым Голубым. Добавление 5 мМ МОН приводит к заметному увеличению тока в положительной области потенциалов. Характерно, что и увеличение тока, и изменение характера потенциодинамичес-кой кривой, которая приобретает вид каталитической воль-тамперограммы, наблюдаются в области потенциалов полимерной редокс активности полиэтиленового Голубого). Рис■ 8■ Циклические вапьтамперограммы поли(Метиле-Таким образом, появление нового Г™убого) в фоновом растворе и после новой структуры в полимере добавления 5 мМ ЫАйН, 1 мВ/с.

по сравнению с мономером создает более эффективный катализатор окисления МОН.

Кинетика окисления ИАОН на электродах, модифицированных полимерными красителями азинового ряда, изучалась с использованием метода вращающегося дискового электрода. Плотность анодного тока в зависимости от скорости вращения электрода линеаризовалась в координатах Коугецкого-Левича. Плотность кинетического тока проявляла гиперболическую зависимость от концентрации МЭН, что указывало на предварительное образование комплекса восстановленного кофактора с полимерным азином.

Было обнаружено, что каталитическая активность полимера зависит от структуры исходного мономера. В ряду Толуидиновый Голубой - Кумасси - Азур А - Метиленовый Голубой наблюдалось увеличение кинетических констант окисления кофактора. На примере выбранных красителей можно проследить следующие закономерности: дополнительное замещение боковых ароматических колец красителя ацильными группами уменьшает каталитическую эффективность полимера; полимеры на основе феноксазинов оказываются более активными электрокатализаторами, чем полимеры на основе фенотиазинов; наивысшая каталитическая активность присуща полимерам, приготовленным из красителей, содержащих в своей структуре только третичные аминогруппы в качестве заместителей боковых ароматических колец.

Полимерный Метиленовый Зеленый оказался за счет более высокого потенциала более эффективным электрокатализатором окисления ЫАОН, чем поли(Метиленовый Голубой). Однако последний был выбран для дальнейших исследований из соображений более высокой операционной стабильности. Для потери 50% активности поли(Метилено-

вым Голубым) требовалось не менее недели непрерывной работы электрокатализатора Для сравнения время полуинактивации электродов с адсорбированными или ковалентн< привязанными медиаторами составляло всего 5 -И О часов.

Дегидрогеназные ферментные электроды изготовлялись путем иммобилизацш дегидрогеназ в мембраны Nation на поверхности электродов, модифицированны: полимерным Метиленовым Голубым. Для иллюстрации калибровочные кривые лак-татного, малатного и эта-нольного биосенсоров представлены на рис. 9. Эти биосенсоры требовали наличия окисленной формы кофактора (NAD4") в растворе. Однако обнаружение факта замедленной диффузии пиридиннуклео-тида в пленке полиэлектролита Nafion позволило

разработать короткоживу-

, Рис. 9. Калибровочные кривые дегидрогеназных

щие безреагентные дегид- г

„ ферментных электродов в присутствии 2.5 мМ NAD+. рогеназные электроды. По- г

следние были изготовлены путем преадсорбции некоторого количества кофактора на модифицированном электроде перед нанесением ферментсодержащей мембраны Nafion. В течение как минимум первых 10 измерений отклик безреагентного электрода остается неизменным, учитывая, что проведению измерений обычно предшествовала потенциоста-тическая отмывка электрода в фоновом буфере в течение 0.5 * 1 часа. Соотношение откликов безреагентного и NAD-зависимого электродов является функцией константы равновесия соответствующей дегидрогеназной реакции. Если в случае этанольного сенсора безреагентный электрод проявлял отклики на уровне 50% от кофактор-зависимого, то отклик безреагентного глюкозного биосенсора составлял уже 80%.

Электровосстановление NAD+ в ферментативно активный NADH на электродах, модифицированных полимерным Нейтральным Красным. Электрохимическое восстановление NAD+ - процесс более сложный, чем окисление NADH. Кроме требующихся больших перенапряжений для осуществления процесса, данная реакция осложнена еще двумя факторами. Во-первых, одноэлектронное восстановление кофактора приводит к образованию радикала, димеризующегося с диффузионно

[S], тМ

контролируемой константой скорости. При этом димер невозможно далее восстановить. Во-вторых, ферментативное восстановление NAD+ - стереоспецифическая реакция. Поэтому не удивительно, что для электровосстановления NAD4" известна единственная заслуживающая внимания каталитическая система с использованием комплексов родия в растворе.

Интересно, что некоторые дегидрогеназы содержат флавины в своих активных центрах, отвечающие за регенерацию NAD+/NADH. Структура флавинов похожа на структуру Нейтрального Красного. Значение потенциала данного полимерного феназина в нейтральных водных растворах близко к потенциалу пары NAD+/NADH. Поскольку в процессе электрополимеризации имеют место различные замещения красителя, почему бы это не могло привести к синтезу катализатора восстановления NAD+?

Действительно, добавление в раствор окисленного кофактора приводило к увеличению катодного тока на потенциодинамических кривых полимерного Нейтрального Красного. Путем записи большой серии фоновых кривых было доказано, что наблюдаемой катодной реакцией является действительно восстановление пиридиннуклеотида. Для проверки возможности ферментативного окисления продукта электрокаталитического восстановления NAD+ был создан ферментный электрод (рис. 10). В отсутствии субстрата фермента величина плотности катодного тока пропорциональна потоку окисленной формы пиридиннуклеотида к поверхности электрода. В случае, если продукт электрокаталитического восстановления NAD^ представляет собой ферментативно активный NADH, последний может реокисляться ферментом алкогольдегидрогеназой. Добавление специфического субстрата, ацетальдегида, должно вызвать ферментативную регенерацию кофактора, которая приведет к увеличению локальной концентрации NAD+ в приэлектродном слое и, следовательно, тока его восстановления. Поскольку скорость ферментативного окисления NADH зависит от концентрации специфического субстрата, то и плотность катодного тока алкогольдегид-рогеназного электрода будет

зависеть ОТ содержания ацет- Поли(Нейтральный Красный) Апкогопьдегидрогеназа альдегида в растворе.

Плотность тока биоэпект- Рис. 10. Схема дегидрогеназного электрода.

рохимической реакции на ферментном электроде по крайней мере на порядок превышала плотности токов фоновых реакций, измеренных в отсутствии какого-либо из компонентов. Зависимости плотности тока ферментного электрода от концентраций субстрата и кофактора соответствовали предсказанным выше. Таким образом, продуктом электровосстановления NAD+ на электроде, модифицированном полимерным Нейтральным Красным, является ферментативно активный NADH.

В заключение следует отметить, что применение полимерных азинов позволяет создавать биосенсоры как на окисляющие, так и на восстанавливающие субстраты дегидрогеназ, поскольку электрохимическая регенерация кофактора NAD+/NADH может быть проведена в любом направлении.

1.2

Глава IX. Самодопированный полианилин, электрохимически активный в нейтральных и щелочных водных растворах.

Применение полианилина в биоэлектрохимии ограничивается тем, что в нейтральных водных растворах (рН > 4) полимер становится электрохимически инертным. Адаптацию к физиологической области рН представлялось возможным провести путем синтеза производных обычного полимера введением ионогенных групп в полимерную цепь. Для электрохимического синтеза самодопированного полианилина были выбраны замещенные анилины: о-аминобензойная (антра-ниловая) кислота, м-ами-нобензойная кислота и м-аминобензолсульфоновая (метаниловая) кислота.

Для сравнения свойств сополимеров ани- д д лина с различными заместителями были изучены циклические вольт-амперограммы полученных модифицированных электродов при различных значениях рН. Рис. 11

0.4 2.5

5.0

7.5

рН

ю.о

наглядно иллюстрирует, Рис. 11. рН- зависимость тока пика (I), отнесенного к его что редокс активность со- величине при рН 1 (10) для полианилина (4) и его сополимеров полимеров замещенного с метаниповой кислотой (1), метааминобензойной кислотой и незамещенного анилина (2) и антраниловой кислотой (3).

в нейтральных растворах выше по сравнению с обычным полианилином. Сравнение сополимеров друг с другом показывает, что мета- положение и сульфо- группа являются предпочтительными для выбора оптимального замещенного анилина. Это дало возможность выбрать для дальнейших исследований сополимер анилина и метаниловой кислоты. Как видно из рис. 11, редокс активность последнего сохраняется вплоть до рН 10, таким образом область ее падения сдвинута более, чем на 5 единиц рН в щелочную область по сравнению с незамещенным полимером.

Синтез самодопированного полимера предоставляет уникальную возможность проследить электрохимические свойства полианилина в нейтральных и щелочных водных растворах. Редокс реакции собственно полианилина проявляют различную рН зависимость. Разность их формальных потенциалов стремительно уменьшается с ростом рН. На примере самодопированного полимера удается наблюдать, как в нейтральных водных растворах (рН > 5) редокс реакции полианилина начинают накладываться. Поскольку проводящее состояние попианипина, эмеральдин, располагается как раз между указанными потенциалами, можно предположить, что в нейтральных водных растворах эмеральдин как редокс состояние полианилина не существует. Для проверки этой гипотезы изучалась проводимость самодопированного полианилина, как путем непосредственных <±г измерений, так и из анализа спектров электрохимического импеданса. Результаты применения стационарного и нестационарного методов привели к одному и тому же результату: в нейтральных водных растворах проводимость самодопированного полианилина стремительно падает несмотря на то, что его редокс активность сохраняется вплоть до рН 10. Это подтверждает высказанную гипотезу.

Влияние дефектов в структуре полианилина на его электроактивность и дальнейшая оптимизация синтеза самодопированного полианилина. Несмотря на несомненный успех, достигнутый в предыдущем разделе в области синтеза самодопированного полианилина, целый ряд вопросов оставался открытым. Главным образом, мы не смогли объяснить роль ионогенной группы в проявлении редокс активности полимера в нейтральных водных растворах. Действительно, не может же сульфо- группа смещать локальное значение рН на целых 5 единиц. Да и в электрохимии незамещенного полианилина существовала не до конца разрешенная задача. Как известно, в слабокислых водных растворах (рН > 1) и лейкоэмеральдин, и пернигранилин уже депротонированы. Что же происходит в районе рН 5, когда наблюдается падение электрохимической активности незамещенного полимера?

Мы предположили, что дефекты линейной структуры попианилина влияют на его редокс активность в слабокислых растворах. С целью проверки этой гипотезы сравнивались циклические вольтамперограммы специально синтезированного "линейного" полимера с обычным, содержащим достаточное количество дефектов. Оказалось, что редокс активность "линейного" полианилина стремительно падает уже при рН > 1, тогда как токи

пико8 на потенциодинамических кривых обычного полимера остаются неизменными практически до рН 3. На роль подобных дефектов, определяющих электроактивность полимера, подходили первичные амино- группы, являющиеся акцепторами электронов е протонированном состоянии.

Таким образом получалось, что для обеспечения редокс активности полианилина в слабокислых водных растворах необходимо наличие акцепторных заместителей в концентрациях на уровне дефектов линейной структуры полимера. Это обстоятельство дало возможность пересмотреть синтез самодопиро-ванного полианилина. Если раньше мы пытались включить как минимум 50% звеньев замещенного анилина в цепь полимера (что соответствовало степени кислотного допирования полианилина в 1 М соляной кислоте), то теперь мы решили уменьшить это число. Оптимальным оказалось соотношение анилина к метаниловой кислоте 3:1 в исходном растворе. Анодный предел цитирования не превышал 0.8 В (Ад/АдС1). Полученный полимер оставался электрохимически активным уже вплоть до рН 12. Для иллюстрации на рис. 12 представлена его циклическая вольтамперограм-ма, записанная при рН 9. Острые пики характеризуют все еще высокую редокс активность после Риа 12- Циклическая вольтам-слияния двух редокс реакций: эмеральдин/лей- перограмма самодопированного коэмеральдин и пернигранилин/ эмеральдин. полианилина, рН 9.1, 25 мВ/с.

Глава X. Потенциометрические биосенсоры на основе полупроводниковых полианилиновых пленок.

Фундаментальным пределом чувствительности потенциометрических биосенсоров является чувствительность рН трансдьюсера. Для известных систем зависимость стационарного потенциала от активности ионов гидроксония не превышает 59 мВ/рН. Чувствительность ион-селективных полевых транзисторов, основанных на нитриде кремния, к изменению кислотности среды составляет 44 н- 54 мВ на единицу рН. Это даже ниже, чем для обычных стеклянных электродов (55 -г 58 мВ/рН), которые не нашли широкого применения для конструирования биосенсоров ввиду высокого внутреннего сопротивления и хрупкости.

Для преодоления предела чувствительности в 59 мВ/рН можно использовать

модифицированные электроды, если в результате соответствующей редокс реакции будет переноситься более одного протона в расчете на электрон. С целью создания потенциометрических биосенсоров с повышенной чувствительностью мы выбрали полианилин. Во-первых, этот полимер имеет повышенный потенциометрический отклик на изменение рН. Во-вторых, полианилин может быть синтезирован в качестве пористой матрицы, пригодной для иммобилизации ферментов. Включение последних в полимер также может повысить отклик биосенсора, поскольку генерация протонов будет происходить внутри рН чувствительной пленки.

Модельный потенциометрический биосенсор на основе трипсина был изготовлен путем адсорбции фермента в предварительно синтезированную пленку полианилина на электроде. Биосенсор был способен детектировать субстрат в диапазоне 5Ю~5 -=- 10*2 М. Форма калибровочной кривой оказалась типичной для потенциометрических биосенсоров. Максимальный наклон в полулогарифмических координатах составлял 180 мВ на декаду субстрата, что было заметно выше, чем для известных систем. Максимальный отклик трипсинового электрода в 1 мМ фосфатном буфере составил 270 мВ. Время отклика не превышало 20 40 с.

Самодопированный полианилин в качестве потенциометрического рН трансдьюсера. Несмотря на успехи применения полианилина в качестве рН чувствительного элемента, следует отметить, что в нейтральных водных растворах ни базовая линия, ни отклик обычного полианилина не обладали достаточной стабильностью, что коррелирует с потерей электрохимической активности полимера. Для улучшения аналитических характеристик потенциометрических биосенсоров представлялось возможным использовать самодопированный полианилин.

Зависимость потенциала общей редокс реакции полианилина в нейтральных растворах от рН представляет собой прямую с тангенсом наклона 75 мВ/рН. Потенциал наиболее проводящего состояния незамещенного полианилина в слабокислых растворах оказался также рН зависимым с тангенсом наклона приблизительно 70 мВ/рН. Исходя из этих данных мы ожидали повышенной чувствительности потенциала разомкнутой цепи самодопированного полианилина к активности ионов гидроксония. Действительно, этот потенциал оказался линейным в диапазоне 4 < рН < 9 с тангенсом наклона 70 мВ/рН.

Глюкозный потенциометрический биосенсор на основе самодопированного полианилина был разработан для демонстрации преимуществ использования последнего в качестве трансдьюсера. Для сравнения среди существующих потенциометрических электродов был выбран глюкозочувствительный полевой транзистор (S.D. Caras, J. Janata, et al. Anal. Chem. 57 (1985), с. 1917). В обоих случаях иммобилизация глюкозооксидазы проводилась в мембраны на поверхности рН чувствительных элементов.

Калибровочные кривые глюкозных потенциометрических биосенсоров представлены

на рис. 13. Диапазон концентраций субстрата выбирался в соответствии с концентрацией глюкозы в крови. Фоновый

электролит частично моделировал состав плазмы крови и был практически одинаковым в случае обеих исследованных систем. Анализ рис. 13 показывает, что отклик потенциометрическо-го глюкозного электрода на основе полианилина оказался в три - четыре раза выше, чем отклик биосенсора, основанного на полевом транзисторе. Таким образом, использование полианилина для создания потенциометрических биосен-

80

60

40

20

О

дЕ, mV

0.5

1.0

2.0

5.0

[Глюкоза], шМ

соров, кроме технологичес- Рис. 13. Калибровочные кривые глюкозных ких преимуществ, обеспечи- потенциометрических биосенсоров основанных: (о) - на вает и существенное повы- самодопированном полианилине и (V) • на ион-селективном шение чувствительности полевом транзисторе; 1 мМ фосфатный буфер, рН 7 + анализа. Применение потен- 0.05 М Na2SO^

циометрических биосенсоров в клинической практике перспективно при анализе связанного холестерина, креатинина, триацилглицеридов и т.д.

Биосенсор на фосфорорганические вещества. Обсуждая возможные пути применения потенциометрических биосенсоров, необходимо принимать во внимание чувствительность отклика к буферной емкости раствора. Поэтому область применения подобных устройств ограничивается либо растворами с постоянной концентрацией солей, как, например, плазма крови, либо растворами с низкой буферной емкостью. К последним относятся сточные и грунтовые воды.

Одну из наиболее опасных групп загрязнителей составляют фосфорорганические вещества, используемые как пестициды либо как нервно-паралитическое химическое оружие. Ввиду отсутствия безреагентных методов анализа фосфорорганических веществ, было решено создать потенциометрический биосенсор с использованием специфического фермента, гидролизующего эфиры фосфорной кислоты. Таким ферментом является фосфотриэстераза. Разработанный потенциометрический биосенсор на основе

юлианилина проявлял существенный отклик (до 150 мВ в ответ на добавление 0.1 мМ параоксона). Предел обнаружения составил 10~7 М, что ниже, чем для известных потенциометрических устройств. Время отклика не превышало 1^-2 минуты.

Несмотря на повышенную чувствительность органофосфатного биосенсора на осно-зе полианилина, предел обнаружения недостаточен для прямого применения в целях охраны окружающей среды. Однако ввиду наличия большого количества методов прекон-центрирования органических веществ из водных растворов, разработанный безреагент-ный биосенсор может служить детектором, например, в проточно-инжекционном анализе. Кроме параоксона, таким способом можно определять большой набор фосфор-органических эфиров, включая паратион, все нервно-паралитические газы и т.д.

Глава XI. Амперометрические биосенсоры первого поколения на основе неорганических поликристаллов Берлинской Лазури.

Постановка задачи для данного раздела вылилась из анализа проблем практического применения амперометрических биосенсоров. Рассмотрим электроды первого поколения. Для сопряжения оксидазных реакций необходимо осуществлять детекцию растворенного кислорода или пероксида водорода. Детекция 02 наиболее методически проста, однако неприменима для анализа низких концентраций веществ ввиду избытка кислорода, а также вариации его содержания в анализируемых образцах. Переход к амперометрической детекции пероксида водорода позволил существенно снизить предел обнаружения. Этот метод и сейчас является наиболее перспективным. Однако детекция Н2О2 на платине требует высоких анодных потенциалов (0.6 В Ag/AgCI). В то же время все биологические жидкости содержат большое количество восстановителей, таких как аскорбат, билирубины, парацетамол, мочевина и др. Эти восстановители способны окисляться на электродах, продуцируя фоновый ток.

Одной из задач создания биосенсоров второго поколения было снижение потенциала индикаторного электрода. Однако для того, чтобы успешно конкурировать с природным акцептором электронов, кислородом, медиаторы должны были быть достаточно высокопотенциальными. Кроме того, далеко не все оксидазы способны реагировать с обычно используемыми медиаторами. Поэтому к настоящему времени наиболее перспективной считалась система с биоэлектрохимической детекцией пероксида водорода, хотя биферментные системы не могли обеспечить достаточной стабильности и воспроизводимости анализа по сравнению с моноферментными.

Целью данной главы было применение модифицированных электродов для амперометрической детекции пероксида водорода и разработка биосенсоров на этом принципе.

Электрокаталитические свойства электродов, модифицированных Берлинской Лазурью, изучались методом стационарных поляризационных кривых на вращающемся

дисковом электроде. Потенциал полуволны восстановления Н2О2 на модифицированных электродах был равен редоко потенциалу (Берлинская Лазурь/Берлинский Белый). В то же время потенциал полуволны восстановления кислорода был смещен по сравнению с ними в катодную область. Таким образом, существовал диапазон потенциалов, в котором представлялось возможным детектировать Н2О2 по восстановлению в присутствии кислорода.

Гетерогенная константа скорости восстановления пероксида водорода на модифицированном электроде в области предельного тока оказалась « 0.1 см/с, что выше константы восстановления Н2О2 на специально предобработанной платине в 0.1 М щелочи (5-Ю"2 см/с). Биологические катализаторы активируют пероксид водорода существенно эффективнее Берлинского Белого, однако ввиду следующих факторов: малого размера по сравнению с молекулой белка каталитического центра Берлинской Лазури и возможности функционирования последней в качестве полислойного катализатора, доходящего до нескольких сотен слоев, - полученные модифицированные электроды на основе неорганических поликристаллов можно считать недостижимыми по скорости восстановления пероксида водорода.

Была проведена детекция пероксида водорода на воздухе с использованием электродов, модифицированных Берлинской Лазурью. Линейная зависимость плотности катодного тока в логарифмических координатах наблюдается в диапазоне от 10'® М до 10~2 М пероксида водорода. Величина плотности катодного тока в ответ на добавление 10~6 М Н2О2 составляла 10"6 А/см2.

Глюкозный амперометрический биосенсор на основе электродов, модифицированных Берлинской Лазурью, был создан путем иммобилизации глюкозооксидазы в пленки №Поп на поверхности модифицированных электродов. Зависимость отклика электрода от концентрации глюкозы в логарифмических координатах представляла собой прямую в диапазоне концентраций от 10"6 М до приблизительно 5 мМ. Время отклика электрода варьировало от 2 3 минут в микромолярном диапазоне до 0.5 н-1 минут в миллимолярном диапазоне. Плотность катодного тока, генерируемого биосенсором в ответ на добавление 1 цМ глюкозы, составила 0.18 цА/см2.

Замена платины на электрод, модифицированный неорганическим поликристаллом, не только понижает стоимость биосенсора. За счет высокой сорбционной активности катализаторы на основе металлов платиновой группы способны отравляться большим числом низкомолекулярных соединений, включая тиолы, сульфиды и др., что не свойственно электрокатализаторам на основе Берлинской Лазури. По своим характеристикам (чувствительности и селективности) созданный глюкозный биосенсор удовлетворял требованиям неинвазивной диагностики.

Оптимизация электрокаталитических свойств Берлинской Лазури проводилась путем варьирования электрохимических режимов электроосаждения. В результате был

20

E, mV

лнтезирован электроката- j цД/ст2 изатор селективного вос-тановления пероксида во-орода. Как видно из рис. 4, плотность тока восста- 40 овления кислорода во сем исследованном диапа-эне потенциалов была до-гаточно мала и не пре-ышала плотности тока осстановления О2 на чис-эм стеклоуглеродном лектроде. Каталитическая ктивность полученного мо-

ифицированного элект- " щцГ 150 " 200 250

ода в реакции восстанов-ения пероксида водорода ставалась достаточно вы- Р"с. 14. Стационарные поляризационные кривые окой Это открыло пути восстановления кислорода (о) из раствора, насыщенного .альнейшего понижения по- и пероксида водорода (Ц в концентрации 0.2 мМ

енциала индикаторного на электроде, модифицированном Берлинской Лазурью.

лекгрода в биосенсорах первого поколения.

Электроды, модифицированные Берлинской Лазурью, в проточно-инжекционной истеме. Проточно-инжекционные системы являются привлекательными как с рактической, так и с научной точек зрения. Практический аспект обусловлен требо-аниями быстрого и автоматического анализа. Научный интерес определяется тем, что \пя большинства типов проточных ячеек гидродинамический режим индикаторного элекг-ода удается строго описать математически, что позволяет использовать проточные истемы наравне с вращающимся дисковым электродом для изучения кинетики лектрохимических реакций.

Проточно-инжекционный анализ пероксида водорода проводился в ячейке типа wall-it при использовании электродов, модифицированных Берлинской Лазурью, идродинамический режим проточной системы был эквивалентен вращающемуся .исковому электроду при скорости 900 1000 об/мин. Линейная зависимость отклика аблюдалась в диапазоне концентраций Н2О2 от 1 цМ до 0.2 мМ.

Проточно-инжекционный анализ глюкозы и этанола с использованием ферментных лектродов на основе Берлинской Лазури. Оптимизация эпектрокаталитических свойств

Берлинской Лазури открыла перспективы создания ферментных электродов, основанных на детекции пероксида водорода при низких потенциалах (< 100 мВ). Типичные отклики проточно-инжекционной системы на добавление глюкозы при использовании амперометрического ферментного электрода в качестве детектора приведены на рис. 15. После последовательных добавлений наблюдается стабильный отклик с достаточно высокой воспроизводимостью. Время, затрачиваемое на один анализ в зависимости от концентрации глюкозы варьирует в пределах 30 + 40 с. Отметим, что соотношение сигнал/фон является достаточно высоким. Пределы обнаружения глюкозы в проточной системе составляли 2 5 цМ в зависимости от способа иммобилизации фермента.

Возможность использования электрокатализатора при потенциале 0 В (Ад/АдС1/КС1 1М) приводит к дополнительному улучшению свойств биологических сенсоров. На примере глюкозного ферментного электрода было показано, что отклик биосенсора перестает быть чувствительным к присутствию восстановителей. Наиболее сильное мешающее воздействие на отклик биосенсоров осуществляют аскорбат и парацетамол, присутствующие, напри- сч

мер, в крови в концентрациях до 0.1 мМ и 0.2 мМ соответственно, что на порядок ниже содержания глюкозы. Глюкозные ферментные электроды на основе пленок Берлинской Лазури при данном потенциале индикаторного электрода не проявляли чувствительности к парацетамолу в его предельной концентрации. Отклик биосенсора на добавление 0.1 мМ аскорбата был существенно ниже отклика на 10"5 М глюкозы.

Путем иммобилизации алкогольоксидазы на поверхности электродов, модифицированных Берлинской Лазурью, был из-

<

20

тМ

10

0

0.5 тМ

0.1 тМ

Уж.

200

400

600

time, s

Рис. 15. Типичные отклики проточно-инжекционной системы для анализа глюкозы с амперометрическим биосенсором на основе Берлинской Лазури в качестве детектора; скорость потока 0.7 мл/мин, Е = 0мВ (Ag/AgCIJKCI 0.1 М)

■отовлен датчик на спирты. Пределы обнаружения метанола и этанола в проточно-лнжекционной системе составили соответственно 1 цМ и 50 цМ. При увеличении "идрофобности спирта наблюдалось падение относительной величины отклика.

В заключение отметим, что созданием биосенсоров на основе электродов, модифицированных неорганическими поликристаллами, удалось решить проблему мешающего влияния восстановителей. Кроме того, использование природного акцептора электронов (кислорода) при разработке амперометрических биосенсоров на основе Берлинской Лазури не вносит ограничений на использование других оксидаз. Этим путем могут быть разработаны чувствительные и селективные системы для анализа холестерина, глицерина, аминокислот, лактата, галактозы и др.

Глава XII. Иммобилизации ферментов в полиэлектролитные мембраны из водно-органических смесей с высоким содержанием органического растворителя.

Для иммобилизации ферментов существуют в общем случае два пути: ковалентное привязывание к поверхности и включение в мембраны. Первый метод, однако, не всегда применим, поскольку некоторые модифицированные электроды не содержат подходящих функциональных групп, как в случае неорганических поликристаллов.

Растущий интерес для целей иммобилизации ферментов вызывают полиэлектролиты типа Nafion, растворимого в смеси 90% легких спиртов и 10% воды. Из преимуществ использования Nafion выделим следующие: простота иммобилизации, высокая адгезия к поверхности электрода и низкая степень набухания мембран в воде. Кроме того, Nafion был признан биосовместимым с животными тканями.

Иммобилизацию ферментов в мембраны Nafion предлагается проводить путем суспендирования фермента в водно-этанольной смеси с высоким (> 90%) содержанием спирта, смешиванием с раствором полиэлектролита и высушиванием на поверхности электрода.' Поскольку Nafion наносится из истинного раствора без избыточного разведения водой, ферментные мембраны получаются более однородными и стабильными. Суспендирование фермента в концентрированных спиртовых растворах производится без какой-либо предварительной модификации фермента. Остаточная активность алкоголь-дегидрогеназы и глюкозооксидазы после 30 минут экспонирования вводно-органических смесях достигала в оптимальных условиях 100%. Более того, стабильность ферментов в суспензиях была выше, нежели в водном растворе.

Электрохимические биосенсоры (как амперометрические, так и потенциометричес-кие), изготовленные согласно предлагаемой процедуре иммобилизации фермента, обладали в несколько раз более высоким откликом по сравнению с ферментными электродами, сформированными на основе тех же мембран Nafion, однако используя традиционный путь избыточного разведения полиэпектролита водой.

Наиболее существенным оказалось повышение стабильности ферментсодержащих мембран Nafion, сформированных согласно предлагаемому методу из водно-этанольных смесей с высоким содержанием спирта. Остаточная активность ферментных электродов после циклов высушивания-смачивания достигала 80%, что в 10 раз выше по сравнению с традиционными методами иммобилизации.

ВЫВОДЫ.

1. Для анализа явления биоэлектрокатализа по механизму прямого обмена электронами между активным центром фермента и электродом было проведено сравнительное изучение гомогенной и электрохимической кинетики действия гидрогеназ. Выявлены кинетическая схема и молекулярный механизм биокаталитического окисления-образования молекулярного водорода. Показано, что в биоэлектрокатализе электродная реакция заменяет одну из сопряженных ферментативных реакций.

2. С целью электросинтеза новых каталитически активных электродных покрытий показана возможность совместного осаждения пленок, требующих катодного и анодного инициирования. Проведен синтез полипирропа, контролируемо допированного Берлинской Лазурью.

3. Осуществлена электрополимеризация красителей азинового ряда, использующихся в качестве медиаторов биоэлектрохимических реакций. На основании закономерностей процесса полимеризации и свойств полимерных азинов, последние были выделены в отдельную группу электрохимически активных полимеров.

4. Наиболее ярким приложением полимерных азинов для целей биоэлектрохимии является электрохимическая регенерация NAD^/NADH. Изучение кинетики электроокисления NADH на модифицированных электродах позволило выбрать оптимальный электрокатализатор, поли(Метиленовый Голубой), превосходящий в десятки раз по стабильности существующие электроды на основе ковалентно привязанных или адсорбированных медиаторов. На электродах, модифицированных полимерным Нейтральным Красным, удалось осуществить уникальную реакцию восстановления NAD+ в ферментативно активный NADH.

5. Ферментные электроды второго поколения, основанные на регенерации кофакторов, были изготовлены путем иммобилизации дегидрогеназ на поверхности электродов, модифицированных полимерными азинами. Были разработаны биосенсоры для анализа лактата, малата, глюкозы и этанола. Наряду с кофактор-зависимыми биосенсорами были созданы и короткоживущие безреагентные ферментные электроды. Применение полимерных азинов позволяет создавать биосенсоры как на окисляющие, так и на восстанавливающие субстраты дегидрогеназ, поскольку электрохимическая регенерация кофактора NAD+/NADH может быть проведена в любом направлении.

6. Для применения в биоэлектрохимии полианилина, становящегося >лектрохимически инертным в физиологической области pH, был синтезирован :амодопированный полимер, сохраняющий электрохимическую активность в нейтральных 1 щелочных водных растворах. На примере самодопированного полимера удалось роследить свойства полианилина при высоких значениях pH.

7. Предложено применение полианилина в качестве трансдьюсера для создания ютенциометрических биосенсоров. Потенциометрические ферментные электроды на )снове полианилина превосходили го чувствительности известные системы, в том числе )иосенсоры на основе полевых транзисторов. Проиллюстрирована возможность применена потенциометрических биосенсоров на основе полианилина для целей клинической диагностики и охраны окружающей среды.

8. Предложено применение неорганических поликристаллов Берлинской Лазури для эмперометрических биосенсоров первого поколения. Замена платины на модифицирование электроды позволяет уменьшить стоимость биосенсоров, а также понизить из чувствительность к присутствию как восстановителей (аскорбат, парацетамол), так и низкомоле-сулярных веществ, отравляющих катализаторы на основе платиновых металлов (тиолы, :ульфиды). Разработанный глюкозный биосенсор на основе Берлинской Лазури проявлял высокие чувствительность и селективность, удовлетворяющие требованиям неинвазивной диагностики.

9. Электросинтез пленок Берлинской Лазури, являющихся в присутствии кислорода ;елективным катализатором восстановления пероксида водорода, позволил решить роблему мешающего влияния восстановителей (аскорбат, парацетамол) на отклик высокочувствительных биосенсоров. Последние были применены в качестве детекторов в роточно-инжекционных системах. Таким образом были разработаны селективные и экспрессные методы анализа глюкозы и этанола.

10. Предложен метод иммобилизации ферментов без предварительной модификации в водонерастворимые полиэлектролиты из водно-спиртовых смесей с высоким содержанием органического растворителя. Полученные мембраны обладали повышенной стабильностью даже после циклов высушивания-смачивания, что обусловило их применение для улучшения свойств эмперометрических и потенциометрических биосенсоров.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1.А.И. Ярополов, A.A. Карякин. С.Д. Варфоломеев. Биоэлектрокатализ - феномен ускорения ферментами электродных реакций. Вестник МГУ, (1983) т.24, с. 523-535.

2.А.И. Ярополов, A.A. Карякин. И.Н. Гоготов, H.A. Зорин, С.Д. Варфоломеев. Кинетика и механизм окисления молекулярного водорода в присутствии гидрогеназы из Thiocapsa roseopersicina. Биохимия, (1984), т. 49, с. 610-620.

3.А.И. Ярополов, А.А. Карякин, И.Н. Гоготов, Н.А. Зорин, С.Д. Варфоломеев, И.В. Березин. Биоэлектрокатализ. Механизм окисления молекулярного водорода на электроде с иммобилизованной гидрогеназой. Доклады АН СССР, (1984), т. 274, с. 1434-1437.

4.А.А. Карякин, С.Д. Варфоломеев, И.В. Березин. Стационарная кинетика неразветвленных каталитических реакций. Доклады АН СССР, (1984), т. 275, с. 110-114.

5.A.I. Yaropolov, А.А. Karyakin. S.D. Varfolomeyev, I.V. Berezin. Mechanism of H2-electrooxidation with immobilized hydrogenase. Bioelectrochem. & Bioenergetics (1984), v. 12, p. 267-277.

6.А.И. Ярополов, А.А. Карякин. Н.А. Зорин, С.Д. Варфоломеев и И.Н. Гоготов Способ приготовления водородного ферментного электрода. А.С. СССР N1107050. Приоритет 07.08.84. БИ N29, 1984.

7.А.А. Karyakin, L.T. Serebryakova, N.A. Zorin. Kinetic properties of unidirectional hydrogenase from Rh. capsulata. Abstracts of International Symposium on Molecular Biology of Hydrogenases, (1985), Szeged, Hungary, p. 19.

8.A.A. Karyakin. N.A. Zorin. Kinetics and mechanism of catalytic action of hydrogenase from Th. roseopersicina. Abstracts of International Symposium on Molecular Biology of Hydrogenases, (1985), Szeged, Hungary, p. 20-22.

9.A.A. Карякин. С.Д. Варфоломеев. Каталитические свойства гидрогеназ (обзор). Успехи химии, (1986), т. 55, с. 1524-1549.

10.J1.T. Серебрякова. А.А. Карякин. Н.А. Зорин, И.Н. Гоготов, С.Д. Варфоломеев. Кинетические особенности действия гидрогеназы из Rhodopseudomonas capsulata. Биохимия, (1987), т. 52, с. 832-836.

11.Н.А. Зорин, А.А. Карякин. И.Н. Гоготов, С.Д. Варфоломеев. Механизм действия гидрогеназы из Th. roseopersicina. Биохимия, (1988), т. 53, с. 728-734.

12.А.А. Карякин, М.Д. Леви, Е.В. Лукашова, Т.Т. Березов. Амперометрический сенсор на лизин на основе фермента пизин оксидазы, иммобилизованной в полимерные полупроводниковые пленки. Тезисы Всесоюзной конференции "Химические Сенсоры", Ленинград, (1989), с. 218.

13.А.А. Карякин. А.И. Ярополов. Электрохимическая кинетика действия гидрогеназы Th. roseopersicina. Химическая физика, (1990), т. 9, с. 1237-1243.

14.А.А. Karyakin. Amperometric Enzyme Biosensors Based on Polymer Semiconductor Films. Abstracts of International Symposium on Bioanalytical Methods, (1990), Prague, p.45-46.

15.А.А. Карякин. Полимерные полупроводниковые пленки для разработки биосенсоров. Тезисы III Всесоюзного Конгресса "Сенсоры и Преобразователи информации", Москва-Ялта, (1991), с. 25.

16.M.F. Chaplin, А.А. Karyakin. Enzyme immobilization in Prussian Blue containing polypyrrole films. Proceedings of Conference on "Biotech UK", University of Leeds, England, (1991), E.

I7.S.D. Varfolomeyev, A.I. Yaropolov, A.A. Karyakin. Bioelectrocatalysis. The electrochemical kinetics of hydrogenase action. Journal of Biotechnology, (1993), v. 27, p. 331-339.

18.A.A. Karyakin. A.K. Strakhova, E.E. Karyakina, S.D. Varfolomeyev, A.K. Yatsimirsky. The electrochemical polymerization of methylene blue and bioelectrochemical activity of the resulted film. Bioelectrochemistry & Bioenergetics, (1993), v.32, p.35-43.

19.A.A. Karyakin. A.K. Strakhova, E.E. Karyakina, S.D. Varfolomeyev, A.K. Yatsimirsky. The electrochemical polymerization of Methylene Blue and bioelectrochemical activity of the resulting film. Synthetic Metals, (1993), v.60, p.289-292.

20.A.A. Karyakin, A.K. Strakhova, E.E. Karyakina. Amperometric and potentiometric biosensors based on polymeric semiconductor films. Abstracts of Russian-German Workshop on Biosensors, Munster, Germany, November 1993, p.61.

21.A.A. Karyakin, A.K. Strakhova, A.K. Yatsimirsky. Self-doped polyanilines electrochemically active in neutral and basic aqueous solutions. Electropolymerization of substituted anilines. J. of Electroanal. Chem., (1994), v.371, p.259-265.

Z2.A.A. Karyakin, E.E. Karyakina, W. Schuhmann, H.-L. Schmidt, S.D. Varfolomeyev. New amperometric dehydrogenase electrodes based on electrocatalytic NADH-oxidation at poly(Methylene Blue)-modified electrodes. Electroanalysis, (1994), v.6, p.821-829.

23.A.A. Karyakin. M.F. Chaplin. Polypyrrole-Prusslan Blue films with controlled level of doping. Copolymerization of polypyrrole and Prussian Blue. J. of Electroanal. Chem., (1994), v.370, p.301-303.

24.E.E. Karyakina, O.A. Shkurko, S.D. Varfolomeyev. A.A. Karyakin. Potentiometric biosensor based on polyaniline semiconductor film. In: Modern enzymology: problems and trends; B.I. Kurganov, S.N. Kochetkov, V.I. Tishkov eds., Nova Science publishers, NY, (1994), p. 809813.

25.A.A. Karyakin. O.V. Gitelmacher, E.E. Karyakina. A high sensitive glucose amperometric biosensor based on Prussian Blue modified electrodes. Analytical Letters, (1994), v.27(15), p.2861-2869.

26.E.E. Karyakina, L.V. Neftyakova, A.A. Karyakin. A novel potentiometric glucose biosensor based on polyaniline semiconductor film. Analytical Letters, (1994), v.27(15), p.2871-2882.

27.A.A. Karyakin. O.V. Gitelmacher, E.E. Karyakina. Prussian Blue based first generation biosensor. A high sensitive amperometric electrode for glucose. Abstracts of International Scientific Summer School "Analytical Biotechnology", Biosenslng Materials, Pushchino, Russia, Moscow, MSU, (1994).

28.E.E. Karyakina, L.V. Neftyakova, A.A. Karyakin. A novel potentiometric glucose biosensor based on polyaniline semiconductor film. Abstracts of International Scientific Summer School "Analytical Biotechnology", Biosensing Materials, Pushchino, Russia, Moscow, MSU, (1994).

29.A.A. Karyakin. O.V. Gitelmacher, E.E. Karyakina. Prussian Blue based first generation

biosensors. A high sensitive amperometric electrode for glucose. Analytical Chemistry,, (1995), v.67, p.2419-2423.

30.D.D. Schlereth, A.A. Karyakin. Electropolymerisation of phenothiazine, phenoxazine and phe-nazine derivatives: characterisation of the polymers by UV-visible difference spectroelectroche mistry and Fourier transform IR spectroscopy. J. Electroanal. Chem., (1995), v.395, p.221-232.

31.A. A. Karyakin. O. A. Bobrova, E. E. Karyakina. Electroreduction of NAD+ to enzymatically active NADH at poly(Neutral Red) modified electrodes. J. Electroanal. Chem., (1995), v.399(1-2), p. 179-184.

32.A.A. Karyakin. Self-doped polyaniline electrochemically active in neutral aqueous solutions: synthesis and properties. Abstracts of International Workshop on electrochemistry of electroactive polymer films, "WEEPF'95", 8-12 April 1995, Uzkoye, Moscow, Russia, p. 12-13.

33.A.A. Karyakin. First generation biosensors based on inorganic polycrystals. Abstracts of "International Symposium on Analytical Chemistry, SAC-95", University of Hull, England, 11-1 £ July 1995, p. S1.12.

34.A.A. Karyakin. Self-doped polyaniline as a transducer for potentiometric biosensors. Abstracts of the 8th International Conference on Solid-State Sensors and Actuators, "Eurosensors IX, Transducers'95", June 25-29, Stockholm, Sweden, 119-PC1.

35.A.A. Karyakin. Prussian Blue based first generation biosensors. Application for flow-injection analysis. Abstracts of III COMETT Workshop on Biosensor Systems for Industrial applications, Lund, Sweden, 29-30 August 1995, p.2.

36.A.A. Karyakin. O.V. Gitelmacher, E.E. Karyakina. Prussian Blue based first generation biosensor. Abstracts of V International Symposium on "Kinetics in Analytical Chemistry", Moscow, September 1995, Russia, L22.

37A.A. Karyakin. The electrochemical regeneration of NAD+/NADH at polyphenazine,

polyphenoxazine and polyphenothiazine modified electrodes. Abstracts of VII meeting of the Portuguese Electrochemical Society and III Iberian meeting of electrochemistry, Algarve, October 1995, Portugal, CC6.

38.A.A. Karyakin. Prussian Blue based first generation biosensors. Application for flow-injection analysis. Abstracts of the First Asia Pacific Symposium on Biosensors. Wollongong, November 1995, Australia, p. 13.

39.A.A. Karyakin. The improvement of electrochemical biosensors using enzyme immobilisation from water-organic mixtures with a high content of organic solvent. Abstracts of the First Asia Pacific Symposium on Biosensors. Wollongong, November 1995, Australia, p.58.

40.A. A. Karyakin, I. A. Maltsev, L. V. Lukachova. The influence of the defects in polyaniline structure on its electroactivity. The optimisation of 'self-doped' polyaniline synthesis. J. Electroanal. Chem., (1996), v.402, p.217-219.

41 .A.A. Karvakin. Self-doped polyaniline electrochemically active in neutral aqueous solutions: synthesis, properties and application. Abstracts of Workshop on multifunctional polymers and smart polymer systems. Wollongong, February 1996, Australia, p.86.

42.A.A. Karvakin, E.E. Karyakina. Prussian Blue based first generation biosensors. Application in flow-injection analysis. 6th Abstracts of 6th. European Conference on Electroanalysis "ESEAC 96", Durham, March 1996, England. /7