Химически модифицированные кремнеземы с дифильной поверхностью. Синтез, свойства и применение в жидкостной хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Мое 40 в оiордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет тэт М.В.Ломоносова

ХИШЧЕСКШ ФАКУЛЬТЕТ . Кафедра химии нефти и органического катализа

На правах рукописи

ЛЯШЕНКО АЛЕКСАНДР ГЕОРГИЕВИЧ

УДК 541.183.02:547.143 ■ЛШ ЕСКИ М(ШИЦИР0ВАН1>£ КРЕМ-ЕЗЕМЫ С ДО?ИЛЬНСИ ПОВЕРЖОСТЫа СЖТЕЗ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ В ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФА

Спедальность: 02.00.04 - физическая хгшия1

• яВТОРЕФЕР А Т диссертации, на соискщшеучсндЗ-ЬтоПщй. , (/ кпндид^га хотямяйотдаут/ I/ /*" ^

Москва - 1990

Работа выполнена на кафедре химии нефти и органического катал за Химического факультета Московского государственного университет имени М.В.Ломоносова.

Научные руководители:

дсктор химических кэук, ведущий научный сотрудник Г.В.Лисвчкнв

кандидат химических наук, научный сотрудник ; А.А.Сердан

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор К.И.Сакодынский

доктор химических нзук, гэдущий научный сотрудник А.Т.Меях:

Ведущая организация:

Институт нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиэва АН СССР

Защита состоится " ¥ " 990 г. в ч. на гаседани

1 специализированного Ученого Совета Д-053.05.44 по химическим наука при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова п адресу: 11989Э, ГСП-3, Москва, Ленинские Горы,-Химический факульте

МГ^ у ■ ■ ' * ■ •

С диссертацией" моано ознакомиться в библиотека Химическог факультета МГУ.

Автореферат разослан

ЭЭО

Ученый секретарь -

Специализированного Ученого Совета

кандидат химических наук ' ■ Е.В.Квлеашиков£

■' Г* « ■ ' г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работа. В настоящее время актуальней представляется работа в области .синтеза и исследования химически модифицированных кремнеземов, в частности, для анализа и разделения биологических жидкостей, что сеязэно с развитием биотехнологии, медицины и фармакологии.

Особенно в;шшм является определение лекарственных препарзтов в биологических кидкостях с целью поддержания контролируемой терапевтической дозы у пациентов, изучения фармвкокянэтики и метаболизма лекарственных препаратов и т.д.. ^

Решение данной задачи в настоящее время достигается за счет применения дсрогостсячях, трудоемких или''. продолжительных методов контроля: радиоиммунологических, иммунологических,, ферментативных к т.д. Применение более простых и универсальных хроматографичесхих методов ограничено трудоемкостью и длительность» подготовки проб, что связано с проблемой предварительного отделения белковой Фракции.

Необходимо создание новых способов модифицирования поверхности кремнезема для синтеза сорбентов, оолздазевдя свойствами применяемых в кзетоящез время обичных сорбентов и но ззадаодейсязуодшс с белками пробы, то есть сорбентов, внешняя поверхность которых гидрофильна и на взаимодействует с молекулами белков, а внутренняя предназначена для разделения кигкемолекуляршх соединений и модифицирована нс-оОходкмыми для этого функциональными группами. .Эти сорбенты т в дальнейшем называем .симически модифщкровашшгли кремнеземами с дафильаой поверхностью (Х1Ж ЯП).

ХМК ДП - принципиально ноеый класс сорбентов, предназначенный для разделения-сложных смесей, содержащих высоко- и нпзкомолвкулпр-ныо соединения, причем взаимодействие-частной такого сорбента с компонентами разделяемой пробы -происходит по разным механизмам, в зависимости ст размера молекулы данного компонента» Большие молекулы биополимеров не попадают в поры частицы ¡РЖ ДП и контактируют только с ее внешней поверхностью, модифицированной гидрифйльшм пряватчм слоем. Поскольку в этом случае сдерживания еэ происходит, то мслеку-лн биохгалимрров выходят единым шасок благодаря оптовому эффекту. Низкомодекуляркыэ соединения попадают в поры чзстиш ХМК ДО и удэр-

живаются в соответствии с принципами адсорбционной, разделительной ели ионообменной хроматографии.

В настоящее время неизвестны метода синтеза, позволяющие получать ХМК ДП с любым сочетанием свойств внешней и внутренней по- ' верхности, е, следовательно, неизвестен механизм формирования поверхности чбстицк ХШ ДП. В то ко время, такие сорбенты могут иметь широкую сферу применения и существенно облегчить упомянутые выше задачи. Этим и определяется актуальность данной диссертационной работа.

Двль работы. В работе были поставлены следующие основные задачи:

- разработка методов получения химически модифицированных кремнеземов с дафильной поверхностью;

- исследование физико-химических характеристик полученных сорбентов;

- исследование процесса формирования дифилыгой поверхности на кремнеземной частице;

- разработка хроматографических методов определения низкомолекулярных соединений в биологических кздкостях с использованием полученных в работа новых хроматографических сорбентов - ХМК ДП.

Научная новизна. Разработан ноыгй принцип получения химически модифицированных кремнеземов с дифильной поверхностью. Впервые иммобилизован на внесшей .поверхности кремнеземной частицы модифицированный азросил, различными физико-химическими методами установлено су-вгестБо^рние химических связей, мекду Частицами модифицированного аэросила и кремнеземной частицей, подробно исследован процесс формирования дифильной поверхности.

Практическая значимость„Првдлокекы методы синтеза химически модифицированных кремнеземов с дифильной поверхностью (ХМК ДП). Создан новый геле с с гоаматогрбфичееккх сорбейгов для анализа ■ низкомолекулярных соединений различной природа в присутствии биополимеров. Разработаны прямые способы опроделешя концентрации ряда низ-комопбкулярных соединений методами жидкостной хроматографии.

На защиту вкносятся; физико-химические исследования к метод синтеза ЖС ЛИ, полученнох'о с применением -глйцил-ь-яейцина и папа-ина;

метода синтеза и физикскхикячесгаге исследования нового класса

-я -■■•-.■.

хромэтографических сорбентов - ХМК ДП, получениях методами традиционней химии;

исследование процесса формирования дифилъной поверхности;

метода хроматографического анализа биологических жидкостей с применением ХМК ДПТ.

Алробпция работы.Отдэдыша части диссертации докладывались и обсуждались на IV Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Алма-Ата, 1Э87), М-эядународном симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографии памяти А.В.Киселева (Москва, 1988), XVI Ыекзузовской конференции молодых ученых по физике и химии твердого тела (Ленинград, 1989), Конференции по прямонению хроматографии нэ предприятиях химического комплекса (Пермь, 1989), . vi Всесоюзной школе молодых ученых и специалистов (Иезново, 1989), конференциях молодых ученых МГУ им-М.В.Ломоносова (Москва, 1988, 1989).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения , трех глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Она содэрнит 168 страниц, включая 27 таблиц и 42 рисунка. Библиография 140 ссылок. В приложении представлены акты об испытании л. внедрении полученных в работе хроматографических сорбентов.

Публикации. Результаты работы изложены в 10 публикациях, в том числа в 5 авторских свидетельствах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ЧАСТЬ 1

Модель дифилъной кремнеземной частицу сорбента для анализа биологических жидкостей

Существует разные.метода модифицирования поверхности пористого кремнезема, однако все они приводят к равномерному заполнению поверхности исходного носителя молекулами модификатора или смесью модификаторов с различные функциональными группами. В результате применения этих методов на поверхности образуется слой химически привитых функциональных груш, взаимодействующих с молекулами веществ. входящих'В состав пробы.

При анализе биологических жидкостей существует вероятность исключения из хроматографического процесса значительной части поверхности вследствие многоточечной адсорбции молекул биополимеров ка функциональных грушах, предназначенных для разделения низкомо-

.пекулярных соединений. Это приводит к снижению эф£ективности и селективности разделения, повышению давления и, наконец, к -выходу хроматографовской колонки из строя.Очень сильно такие эффекты проявляются при анализе лроб, содержащих биополимеры на обращенно-фазоных сорбентах, несколько меньше, но тем не менее существенно,-при использовании сорбентов с другими функциональными группами.

В качестве альтернанты традиционным химически нодафадгровэнным кремнеземом (ХМК) поено предложить другой сорбент, на 'частицах которого, благодаря ситовому эффекту, высокомолекулярная фракция вшсодат единым пиком' - не попадая в поры частиц и но взаимодействуя с их внешней поверхностью - до выхода наименее удерживаемого низкомолекулярного соединения, а все последующие соединения выходят в соответствии с принципами адсорбционной,. распределительной или ионообменной хроматографии. Внешняя поверхность частиц такого сорое-нта должна быть кодифицировало неслецмфичными к биополимера» функциональными .грушами, а недоступная молекулам биополимеров дааэрхность внутри пор должна иметь привитые функциональные группы, уа. которых осуществлялось бы селективное разделение малых молекул по одному или нескольким известным в молекулярной амдхостной хроматографии механизмам, и-диаметр пор, на поверхности которых происходит разделение . малых молекул, был бы меньше диаметра самой малой молекулы биополимера в анализируемой биологической кидкссга.

Исходя из перечисленных условий, нами разработана л схеквп:-чэсзш представлена на рисунке 1 модель частицы 1МК ДП для еналдзэ л^ескпх жидкостей.

ЧАСТЬ 2

Способ формирования давильной поверхности с прзкоЕеншм ферлентоЕ В основе этого ¡/огода, предложенного Пинкертоном в 1335 г., возшжость изменения внешней, доступной фердеяту, поверхности кремнеземной частицы, если эта частица была предварительно шдафнця-рована молекулами, содйрнащими пептидные связи. В этом случае вкут-рэяняя поверхность час-тицы остается без изменений, при условии, что размер пор достаточно мал и фзх>мент в них не проникает.

Б качестве кодификаторов для такого сорбента используот пел-тада, шзвшв в с.воэм составе тедрофьяызде я гидрофобные а-рагмен-J та, а з качестве фермеатов-карбокевпептвдазу А или пвпага.Х>шичес-

А

■яр -Ц

Молекула биополимера ____ь

пори

Внутренняя поверхность (поверхность внутри пор) ;-с сн., )3-мн-с сн5 >3-сн3

§-0-3|-ССНя >3-МН-ССНа Зц-СКэ^

У

й < В

Внешняя поверхность

Моди^нцмруга'диз ело л

ОН 04 1

——- щ-о-ена-сн-сн.

5-о-з; -с сна снг }а -мн, •

Рис. 1. Схематическое изображение дифильной кремнеземной частица для анализа йлологических :.-мдкостей.

кое модифицирование осуществляют методом "поверхностной сборки".

8 настоящей работе нами были синтезированы и исследованы ХШ 1ЦТ, полученные путем иммобилизация на поверхности кремнеземной чястицн гли^кл-ь-лаЯцина (ог^-ь-Хеи), сорбенты, полученные с применением фермоига, получили обозначение ХМК ДП®.

В качестве исходных носителей применяли несколько марок сшш-кагелей. Результаты модифицирования представлены в таблице 1.

Зная размеры используемых для синтеза ХШ ДПФ ферментов, мозно сделать вывод, что для получения ШС ДП'5 необходимы кремнеземы с начальным размером пор менее 10 км. 3 этом, случае меняю получить ХЖ ДП с развитой гидрофобной-внутренней поверхностью, недоступной молекулам фермента, и незначительной по величина долей гидрофильной внешней поверхности, подвергающейся действии фермента.

Получешма днфилькне сорбенты упаковывали в стеклянные хрома-теграфические колош® с размерами 50x5 мм сухим способом я испытывали на хроматографе РУТ.С (Р'пагтаасга, Швеция).- На рисунке 3 приведены хроматограммы раствора фенобарбитала я альбумина, а также смеси протиеосудорожных препаратов в алэзме крови.

£>!-ОН ♦ ССгН30Э35КСНяЭ30СНгСН-СНа , ВОДНЫЙ буф.р-р, рН = 5,6'

он ,---------

I А

«¡С-Н50>35!ССН3ЭаОСМ2СН;Н2-51 у-Ц-Сви /О

(и2о, рН-5,6) ,----,__|!-о-з;ссна>аоснасн-^на

к ¡нго

С! у-С в ДМФАэ

к он он

£ I I

5! -О -51С СН2 Э30СН=СН--СН3

Активатор С Ас 5

он (

С! у-1.-

2; -0-5 ¡ССН2 ?3ОСНаСНСНаО-Ас

ои Н20 , рН=8

& ?Н ' Фермент (папаин)

5« -О-ЙКСИд >30СНаСНСН2-С1 y-l.-l.eu----

Внешняя поверхность

з;-о-з;ссня>3осн2сисИз,-с1 у он

___ Внутренняя поверхность

^¡-О-БКСИа 530СН2СНСН2-С! уЧЧги й I

он

Рис..2.Схема синтеза ХЖ ДПФ с применением фермента (г.атаина) и пептида (-\.чицил -ь-лейцика).

Таблица 1.

Свойства получаемых в процессе синтеза ЖК ДПУ.

Исходный кремнезем Удельн.поБ-ть 1.Г/Г Плотность прививки Б! МКМОЛЪ/Г Сред, дпамото | пор, Н?,'.

КСС-£- 517 585.3 3.7

Б1-600 530 469.7 3.5 I

Ег-ЗОС) 297 385.5 4.8 |

КСК-2 230 .1 6.7 !

Шг использовании данного метода определения. концентрами» «.яатаво судорожных препаратов погрешность определения нэ более (по фенобарбиталу) 1 ыкг/ил, что составляет от Б до 15% е диапазона концентраций от Б до 40 мкг/мл и позволяет определять терапев-таческие концентрации протиБосудороашк; препаратов в плазме крогл при использовании малых (50-100 ккл) объемов • отбираемой у аащ:оь-гг. урови. Наряду с использованной нами хрокатсгрефгачской колонкой ьстарвтурой умеренного (до БШэ) давленая возможно тхшэкизх

_ в -

Бремл (млн)

Рис.3: а - хроыатограмма раствора альбумина на колоше с сорбентом, нэ оброЛшаишм фермеитоы; б,ъ- ху оматсграгма рэстзсра альбумина (1) и фенобарбитала (2) на ХЫК ДП^/КСС-З , 0.1 Ы натай-ацетатный буферный расгзою <рН 5,6) - ацетснитрил (90:10), 0,5 мл/<яш, УФ, Х---?.5-1 нм; в - хроматографа кланмн крови б&з фермент« элементов, содеряа-вдей смусь иротквосудорокных препаратов: 1-белки и неудерзазаемые шзкомолекулкрлыэ компоненты плазмы кроьп, 2-фенобарбитал, 3-карбемазепин, 4-дифэяш.

хромэтографических колонок для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и более слоимой аппаратуры.

Метод определения иротиаосудоролзшх препаратов может быть применен в системе Минздрава ССОР для фермакокиве-гагееских измерений концентрации противосудороиых препаратов у больных эпилепсией. Потребность в таких анализах весьма велика ('десятки тысяч анализов в год).

• ЧАСТЬ 3

Химический способ формирования дифилъной поверхности на кремнеземной частице Разработанная наш новая хсонцепцил синтеза ХМК ДП состоит в получении нэ внешней и внутренней поверхностях кремнеземной частицы модифицирующих слоев разной химической природы без применения фэр-мэнтов и пептидоЕ.Такой синтез осуществляется путем проведения реакций пзаимодействия функциональных' групп, привитых на поверхность кремнеземяса частиц«,• с-призитыш органическими ссюдкнеянями на поверхности других- .частиц, размеры которых намного меньше и зодастава-мы с размерами пор исходной кремнеземной чптицы. При этем образуются химические связи между 'исходной кремнеземной частицей и маличи частицам», в рооультатэ чего на внешней и внутренней поверхности кремнеземной частицу получаются два раз:шх ттта функциональна, групп. Один, на внусронаей поверхности, состоит из сстаотихс . неаз-

монэшиж первоначальных функциональных групп, s второй, на внешней поверхности, состоит из органических соединений, закрепленных на поверхности малых частиц, причем последние хижчески связаны с исходной кремнеземной частицей. Дальнейшее модифицирование осуществляется поверхностной сборкой ^ по внешним к внутренним функциональным группам, в результате чего получается кремнеземная частица с дкфиль-кпй поверхностью, отвечмощзя представленной на рисунке 1 модели.

Малые кремнеземные частицы подбираются таким образом, чтобы их размеры были бы примерно равны размерам самых маленьких-молекул белков пробы, и, вместе с тем, чтобы размер этих частиц был несколько больше размеров пор исходной крамнезелиой частицы. В этом случае малые кремнеземные частицы блокирует все доступные белкам пробы биологической жидксстк исходные ■ функциональные группы на большой кремнеземной частице и оставляют эти группы без изменений на очень большой доле внутренней поверхности, в порах этой частицы.

Дхя етсго необходимо d/ло превратить функциональные группы на внутренней- поверхности в необходимый, привитый слой для разделения нужного класса•. ниакомолекудярши -со&диаений. Органические ке соединения,- прибитые -на малых хрекшеземных частицах, -и, следовательно, на внешней поверхности полученной • частицк сорбента - з привитый слой, нбепепйичикй к молекулам биополимеров.,--т.е.'- не взаимодействующий с белками пробы ваолагзггеска& ' квдкости. <&1з©га-оси«яюскиб исследования закономерностей образования к формирования &тяг. слоев к стали предметом данного раздела работы.

S. 1.Иммобилизация аэросияа-ка поверхности химически модифицированных кремнеземов Й качестве малых частш, прелназначеиных . дйя' мммобалпзадаи ко пяеин-зй ссввргносгн исходной кремнеземной" Чйсташ ж выбрали аэро-си.п, частицн которого представляют. собой нопорйстые сфэрк, размеры которых могут;."екать в пределах от до 1L0 км. Отечественная промышленность выпускает 'еэрооил с удельвой поверхностью от 50 до ¡000 м*/г, и при та\яйз разнообразии легко подобрать «эосх заый для получения ХШ: ЦП обрззац.

Для химического модифицирования -m Есиользовали аэросил марки А-300 (удельная поверхность '¿СЮ vr/т-у с размерами ч&стчц- около. 10 ш. Для создания моднфиврфуадкх • слоев на -трзерхностя а&росила а

исходного носителя попользовали 7-шицюпроишт{егатск№саяеы и у-бро№1ро1Шлтрих,торс!Илан соответственно. После модифтадироБакая кремнезема и эзросила проводили реакцию иммобилизации аминоаэроси-ла на частицах Сромпропклкремнезема. н2ирч

и

______^

" 4

I

У Щ ^¿г

Средой для проведения реакция юдаосйдизащш служит 0,1 К раствор бикарбоната натрия. Однако з таких условиях плотный угснсслэй ачннсаэросила не образуется,.поэтому рэакцио5~тую смесь обрабатква-ли ультразвуком. Под действием ультразвукового поля в жидкости (кзвлтэцйи, акустических-, течений, звукового давления и т.п.) на поверхности кремнезема, в отличие ог механического перемешивания, образуется очень тонкий диффузной граничный слой, вследствие чего интенсифицируются массообмэннне "роцбссн, возрастает глубина проникновения жидкости,- а вместе с ней и частиц пэроспла в поры кремнеземной частицы (ззукокапиллярннй эффект), что нсзесляот блокировать все дост/ишз честкцэ?* -оьрсскла, а, следовательно, ч молекулам Оелкоз, участки поверхности исходной'кремнеземной частицу. Наконец, иод действием звухокалклляряогб зфф&ктг я.интенсивных микропотоков происходи? разруяганэте агрегатов азрссила л их дкошрпгооБзииэ до отдельных частиц. ■

. При иммобилизации эигнсаэросила -происходитобразование химических связей ыввду' частица?-® аминовэросила и бромяролилкрэмнвзема л появление -вторичныхаминогрупп. Их наличие доказывали методом УФ- и ЭПР-спектроскопки образцов.после. их обработки тетрацианохи-нодиметаном (ЩХДМ). в хлороформе. Это соединение, как село ранее показано в .напей- лаборатории, образует с первичными аминогруппами продукты замещения (1)-, а со вторичшда - исп-радшсзльяые соля (2), электронные спектры которых имеют существенное отличие и даят сигнал при 311Р-спектроскопия.

Следует отметить, что заметное огразовгщкэ вторичных аминогрупп происходит только .при обработке реакционной смеси, содордащей- амипо-азросил и бредарошшерзкнеззм, ультразвуком;

(I)

Б^КСНа >аННя

игам. %

Т11ХЛМ ^ +

) 5-05 К.СИ;, %,МНССН2 З^ОЗ Г $Ч031ССН3 )-ЫНССН2 }3!>.'05»;

^ - ^ §

На рисунке 4 приведены.•электронные спектры образцов, обработанных 'ТЦЩ! ь хлороформе, из которых видно, что после иммобихиза-. ции аминоаэросила образуются вторичные аминогруппы, подтверядаю'цие образование химических свяеей мевду частицами акиноаэросала и исходной кроше земной чэстьцёй.

0.1

■•■ }

.».,¿1 №

250

350 450

630 еос>

X (КМ)

Рис.4. Злзктроккэ схгекгры:а - ашлопярооалэ, б - гкетыоагзросиля иммобилизованного на брошфовилкрбшэзеке;. в • - вявмнвзеыа с ярявнтымп вторичными аминогруппами. после их обрабо.-хи "ИЗДН в жлррофорке.'

З.й.Хишчзсшо ивмалешя хфиштьж слсев при ФоркмЕанйн дафияъиай поверхности В разделе 3.1. описано получе;яие частши, на внутренней поверхности которой привиты бромпропяльше Группы, -з ьнешняя поверхность покрыта слоеч имкрбшизованяогс амшюазросила, и, следовательно, приЕатюз! пгдшогр^тгпа.'.а. Такэк частица является дифильыой, поскольку иыеет отличающиеся по природе участки поверхности и по -разному взаимодействует с молекулами полимеров и с молекулами ниь~ комолекулярных соединений. Однако такой ХМК £ не -¿ряб* быть использован в ¡¡качестве .сорбента, -для -БЭ»: биологкчсскиг ькдкостей, поскольку: его внеонЕй слой адсорбирует белгси, .а . внутренний . - не селективен относительно большинства локарстгеш:нх соединений и их метаболи-юз, составлявших анализируемую часть биологических згид-. .

костей. Дальнейшее модоЗицировшше привитых слоен происходит' методом поверхностней сборта и направлено на изменение гдеорбционнкх характеристик знойней и внутренней поверхности в требуемом направлении.

В настоящее время большинство хроматографических ■ разделений осуществляют методом обрашенно-фазовой хроматографии (ОФХ), т.е. на сороентах с привитыми э.шмлышми радикалами в водно-органическсй подрлилой фазе. Этот хромзтографический метод, отличается пасокой оффскткнностыо и универсальностью. Вместе с тем, белки высокомолекулярной фракции растворимы е йлюенте и по денатурируются. Это определило выбор дальнейшего модифицирования внутренней поверхности да-фклышх кремнеземных частиц. В качестве модификатора мы использовали елкилам&чы с различной длиной углеводородной цепи, которые при взаи-модейпгьии о приБиташ па' внутренней поверхности бромгдопильшгога •группами образую?• гидрофобный слой и нэ взнимсдействукт с привитые на внешней поверхности аминогруппами,

I •

к -л 3«.

£ О/Х 5 /?У/\

SiRNV.RSiy.Sit?

--- сн=сснл? Р----

Э| 0; | КВг •--2-> з; RNHi. CH.. > СН3 Н3№

а I ■■ а " »

й----? ^Э! ^-—----у ^К

2? '-/Л ^ '

Я </</ ■ й Ч'/У

п = в, 7, 1г; Я - -ССНг>3~

Продукты рэаи(ии взаимодействия алкалсшшов с привитыми бром-пропилышми группами на внутренней поверхности кремнеземной частицы изучали. методами электронной спэктроскопки, ЗПР и элементного анализа. . .

Из рисунков вицяо, что после обработки гексилалинои существенно увеличивается интенсивность полосы, характеризующей вторичные амвно-группы (ом. рис.4), вместе'о тем сохраняется полиса 420 на, укззнва-щян на имеющиеся з шнебшдааованвом зминоаэросиле первичные аминогруппы. 3'спектре сорбента, у которого отсутствует стадия обработки рмпноззросялом полоса 420 нм яе наблюдается.

В спектре ЭПР, нгряду с .умиренной. частью (ширина более 15 Гс)( заметен обменный., сингле тс шириной около 2 Тс, ссотвэтствувдий

ион-ра^ткальним солям ТЦХДМ со вторичными аминох'рушгпшг на внутренней поверхности сорбента. ■

Е

Гх- S / i 0

0.1

Г

ЮГс

1 I

гъо

350 450

630 300

(нм)

Рис.Б.с'лектрошше спектры поглощения: 1а - сорбента с вшобилизовэк-ним йми.чсаэросшом и прнзитыш через пропилькый спвйоер молекулами гексиламша, 16 - оорбонта с привилыми чеша ' иропальньй спойсет) молекулами гекспламина, ЭПР спектры (С) тех*ко образцов. Eco сороенты обрэбатьвади Т1ЭД1М в хлороформе.

Слодую'цей стадией модифицирования полученных сорбентов является изменение вношей поверхности частиц с ш-мобилнзованкьм на ной ысг-ноаэросчлсм. 3 качестве реагента мы использовали 7нглкцидок.сипроаилтриэто1;сисилан (ГОПТЭО), который Езаимодг.йстг^ет о -первичными аминогруппами и силгнольннми группам на- поверхности кр-эмйвзеиа, нэ не взаимодействует с пргзитим слоем на одутрзкнэй иоворхностм (с бромпропильннми, алккльшмк и цие-шродплышми

группами)

%-т-

=тг.н g

-он

-с wij ->~т3 -он

-с сн, >jlhz

гопгэл ;>

рИ 5,6

-uH-0m:iH—«

он ОН

|-мк-'

Ï-HH-Ï

ьн~он

о» он

• Протекание г того процесса контролировали по дачным электронной спектроскопии образцов а по язмянэкки адсорбционных свойств и структурнс-геомзтр1!чеекиу характеристш: сорбентов. .

Сгруктурко-гвомотръческие характеристики (СГХ) сорбэктов иа разных стадиях синтеза ЗЫК ДП измерял-! методом низкотемпературной адсорбция азота. Мотсд ртутной аоромеирии оказался, .uenpi-.тедкнм, поскольку не позволяет определять ОГХ для- сорбентов а малыми (<10 нм) порами, а именно такие сорбенты являлись, объектом наакх исслз-

Таблица 2.

Плотность прилики тзаьличных алкиламшюв на кремнеземах с привитыми сромпропилыддл группами по дпшжм пльменгкого анализа.

Ксситель Стадия , обработки %с плотность о -ссна ?3-,гр/шГ Плотность о -ссн3?, в-снл,гр/;тм

1 3,6 1,31 -

1.2 3,5 1,81 __

ксс-з

»,3 7,3 1,81 1,21

1,2,3 6,8 1,81 1,03

Эг-бОО 1 1 .2 1.3 1,2,3 .............. 4.3 4.2 5,8 6.4 1,50 1,47 1 ,50 1,47 0.84

Л1 -обработка 7-бр0шр0Юь.таряы:орсплш1ом, 2-яглмоСялизация амивоаэ-росила, 3-обрабстка гыггилбмшом.

Таблица 3.

Содержание углерода, в % для различных сорбентов поело га обработки ■г-глицидоксяиропилтр5это11Сксилзнон в различных _ ' _условиях.__

Носитель Поверхность Условия обработки ГОПТЗС % С

- й:-ССЧ2>гвг необработан з.а

БОДЯ.буф.р-р, рн = 5,6 4,2

Т *Т1 о £ КН, ___%~ип-Л}-ын7 -|-Г СН2 ->3&Г КН3 необрзботап водн.буф.р-р, рН -- Ь,о абс. диме'пи:фор.мажд 3,3 7,5 5^2

ф-КН-Ь-НН? необребоган водн.буф.р-р, рЯ 5,6 Б,3 12,0

£-1-600 й ЫН-, Й ^-К-КН-С СН= >3 7СН3 необработан подк.буф.в-р, РН - 5,0 -в^г-11,2

довагп'.й. По получениям дегажч видно, что при синтеза. Xf.CC ДП ни тр-еых стадиях модифицирования, внутренний объем (V) и удельная поверхность (Еуд) закономерно уменьшается, что связано с появлением пз поверхности сорбента нркштего слоя и увеличением его ташцинк при поверхностной сборке. При обработке ГОПТЗС в водном буферном ргствс-

л

!-_„■'. -.....„1, .... L. ........t-..... I. ... Г , »,

sao 3E0 4L0 650 еооЯ(км)

Рпо.б.Элоктротше спектры сорбента: а - с иммобилизованным еминоаэ-¡фсодом. ооработаеком ГОЯТЭС в водном буферном растворе; б - обработало» ГОШ лС в або.ДИФА; 'в - с птавитыч ,на внутренней поверхности, гнпткла&зшом и Обработанном ГОПТЭС s. водном буферном растворе. Все образу обрабаткшатг ТЦВДЛ в хлороформе.

ре сорбента с иммобилизованным аминоаэрссилом изменения v и Зуд оч-hhh значительны, откуда можно, приняв во внимание данные по увелкче-ки® содержания углерода в сорбенте после последней стадии, сделать пивол либо о появлении слоя большой толщины внутри пор, либо о значительном уменьшении устьев пор из-за образования полимерного слоя кэ галмобклизовачном ашноаэросиле. На рис.'/ приведены распределения пор по размерам для кромнэземов в. процессе синтеза Ж< ДП, которые в сумма отражаюf изменения V и Зуд.При. исследовании хроматографических свойств ЖК ДП установлено, что хроматографичеокио колонки, запол-нзнлыс ХШ ДП? сохраняют высокую эффективность и селективность разделения, откуда следует, что внутренняя привитый слой доступен молекулам низкомолекуляршх соединений и сохраняет свои размеры после последней стадии модифицирования, а, следовательно, гидрофильный слой привитого ГОПТЭС образуется на поверхности иммобилизованного амияоа-эросила,и происходит связанное.с вшм уменьшение устьев нор.

Хроматогрефическкй сорбент ка основе ХМК ДП с привитыми нз внутренней поверхности гидрофобными фуыкцйопалышмк группами не уни-ьорсашн. •Гндрофклькнв лекарств-тные препараты, "витамина, сахара и многие другие компоненты биологических жидкостей практически не удерживаются '. на сорбентах с прааиткми алагмьтш радикалами. Вместе с тем, существует mofíxo трость уса спределений в биологических жидкостях. Дев решения таких задач нами. разработан .и осуществлен синтез ш да с привитыми на внутренней поверхности .»герйлыйялг- труяначи

12 3 4 5 г,»а 1 2 3 4 & г.н»

Рис.?. Распределение пор по размерам для сорбентов на основе КСУ-3 (!) и на основе 81-600 (2).Сорбент: а - с привитыми бромтюпилышми группами; б - с иммобилизованным вминоаэросилом; в - ,Щ1 после всех стадий обработки.

.(Ибо первичными аминогруппами по приведенной гагае схема.

^¡ОЗКСНг ЭаВг-

С?

к«сг), кем /

(этанол) '

V

он ом

5г'. _1

ц- '.он он

ч н2?к сна Э3МНЯ

^атакол)__

£; оз! с сн 2 V ;вс си»

.3. Хроматогрсфпчоскиа свойства химически модифицированных

кремнеземов с дкф-дяьной поверхность» '■ноштсе назначение синтезированных и описаниях в настоящей

■ ХЖ ЛЛ состоит в ах использовании как сорбентов для

-.тней ^роматогр;:-,йз1 ¡шгкомслокулярннх соединений в биологичо-

■ лдкостях. Даяние об уд-зрззззагоа различиях низкомолэкулярних . >ний смоль ваг^-1 для практического иепользовэввя ХШ ДЦ. а /18вие бвоподггрров, точнее его стсутотвмо, может служить гш егпклльвос.'И миюлившш опертой пс получению -ЖК ДП.

■Типичная хроматограмма пробы, содержащей биополимер, представлена на рисунке 8. Биополимер (!) - альбумин - выходит первым, т.о. не попадает в поры сорбента и но удерживается, затем следует растворитель - вода (2, "ишюкпчоншй" пик) и, наконец, кофеин (3), который попадает з поры и удерживается *?а привитом внутри пор гидрофобном слое.

Рис.В. Хроматографическое разделение смеси, содержащей альбумин (1 ) и кофеин' (3) на колонке 250x4, в мм с ХМК ДП (Б1-Ь00,гексилз:лин)- Элюецт - натрий-ацетатный буф.р-р 'чрН 6,0)-ацетошггрил (85:15), 1мл/мин. Детектор - УФ, К=254 км.

Для исследования удерживания кизкомолекуляршх соединений на ХМК ДО хроматогрэфировали отделыше бенздиазешшовые транквилизаторы и их смеси в присутствии и без биополимеров в подвигам*. фазах разного состава. Установлено, что при изменении рН и концентрации органического модификатора в подвижной фазе время удерживания низкомолекулярных соединений на ХМК ДГ1 с привитым на внутренней. поверхности гидрофобным слоем изменяется аналогично подобии;.! изменения;,' прч использовании -обычных обращение-фазовых сорбентов. Это дает.возможность легко прогнозяровать•время 'выхода и состав подвижной фазы дяя других определяемых иизкомолакулярных компонентов биологических жидкостей, используя накопленные в литературе данные ш удерживания этихсоединений на обычных сорбентах.

.Исследовали также предел зкеклвззии ХМК ДГ1, т.е. определяли мак- ■ сималышо размеры молекул; попадающих в поры ХЖ ДП, методом зкеклв-зионной хроматографии. Использовал;! набор стандартных юлиэталеагли-колой (ПЭГ) с известными молекулярными массами. НЗГ с молекулярной массой пенсе в тыс. дальток включительно удерживается и выходит посла "иккекционного" пика. 1ГЭГ с молекулярной массой солее 1С тыс. дальтон выходят раньшэ, т.е. но попадают в пары. Текил образом, продол эксклюзии ХМК ДП легят в пределах от 6 до ¡0 тыс. дальтон.

Ь Время (ми)

2.0 1-5 1.0

0.5,

2.0

г^ 1 .о -

0.5

' 0.&Б" оЬ о.с

1ек»

V

■ч ^

Чг

о.

Л%)

СН3СНС ОН ХИд

Рис.3. Зависимость емкостного фактора (К') для нитрззапама (1) и дезэлкюцазазехймз: (2) а - от концентрации уксусной кислоты и б -лзолротшлового. сшфта а подв»шюЯ фазе. Кл 150x3 и, ХМК ДО (КСС-3,

-С7Н,.3).

Таблица 4.

Структурные фэрчулы бепздиагвтшов.

ч<

Г

п—

N Препарат | г?^ Й3 1 к*

1 деаметилдиааопам н и и С1

2 дашзепам. си3'"Н н с»

3 нитразопам н н н

4 лоразепш н он С1 С1

5 трдакскфоназонам н он С! Вг

6 фэназепач н н С1 0 Г

о

ЧАСТЬ 4

Практическое пршенениэ полученных результатов. С -1тэз1фован5шэ и мсследозшшш в работе ХМК ДП успешно гг • для гнализэ различных образцов в медицина, биотехнологии а ф' тйй. Росработпгсг методики определения п биологических яид-кч, ротивосудорсжах препаратов, Ознздиезешшэв, теофшглша, тг;," р-сксипстидшз я налогорых других лекарственных препаратов я болктоя. Рир^ботэп и внедрен во ЕНШ'енэтаки и селекции

т~ гт- ' изг'оз метод опрэдологшл кампононгоз реакционной смеси а 5 геном синтеза неугловодаого оаодкятзля сахарз - аспартама.

■кг рпс.Ю пр5пгедянэ "уипкчнея хроматегромма биологической

жидкости (плазмы крови без фориевиах адемзнтов), содержащей -лекарственные препараты (Сенздказепшм) н их метаЗолйШ Ь терапевтической

Рис.10. Хрсматографическов определение бенздиазепинов 2-7 (табл.4) в плазме крови без $орм&шшх элементов. ХМК ДО (Зг-600, гептила-дш) Ял 250x4 мм.'-белки и неудеркиваекае компоненты плазмы крови.

вывода

1. Получен хроматографический дифильный сорбент для. прямого определения низксмолекулярних соеданений в биологических жидкостях с применением ферментов (кзрбоксилептидазы А, палайна) и пептида Сг-та-цин-1-ле2цинэ). Показано, что образование даф11льной поверхности на частице сорбента к подбор носителя с соответствуй™.;® порами позволяют избежать предварительного отделения биополимеров из анализируемой пробы и определять отзкомолекулярнш сседсиненяя непосредственно в биологической згадкоотк.

2. Впервые доказана возможность получения дкфильннх сорбентов без прикеношгя' ферментов и пептидов, но чисто химичоашм путем с использовавшем экр?кируицэго покрытия из частиц модкфицироваяяох'о аэроелла, хиъшчаски связанных с поверхностью кремнеземных частиц. Различна« ф:та15к0-хкуическими мзтодами (ЭПР, электронная спектроско-цкп и электронная спектроскопия диффузного отражения, измерение структурно-геометрических к адсорбщюнннх характеристик) доказано, что шютшй мскослой аэроскла 'прочно закрепляется на поверхности кр^таез&адння чаогщ зг. счет образования химических связей между пришвами слоя,ми, модифицирующими частицы аэросила л кремнезема.

3. На основе предложенного химичоского способа синтеза разработаны различные кремнеземные сорбенты с дафяльной поверхностью, отличающиеся друг от друга химической природой модифицирующих слоав. Эти сорбенты являются представителями нового класса сорбентсЕ для прямого хромвтографического анализа биологических жидкостей.

4. Гюлуччнные в работе дифилыше сорбенты позволили разработать нозыо методики определения различных лекарственных препаратов в биологических жидкостях, компонентов реакционных сносей в ферментативном силтозе аспартома, антибиотика тилозина в культуральной жидкости продуцента, олшосэхаридов (СП = 1--7) в растворе декстранз методам высокоэффективной жидкостной хроматографии (при высоком давлении) и жидкостной хроматографии при умеренном (до 5 ЫПа) давлении.

5. Показано, что применение синтезированных давильных сорбентов позволяет значительно сократить время анализа перечисленных в работе объектов, повысить точность определения низкомолекулярных сое дины шй в присутствии.молокул биополимеров, снизить расход реактивов и сорбентов, а также значительно сократить объем отбираемой у пацтл:та крови для анализа на содержание лекарственных препаратов к их метаболитов .

Основное содер&аниг работы изложено в следуизнх публикациях г

1. Сбрдан A.A., Лякенко А.Г. Уроматографические сорбенты для одновременного разделения больших и малых молекул. .8 кн.: 1У Всесоюзный симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии. Тезисы докладов. Алма-Ата. 1387. С.146-147.

2. Болов H.H., Богачев Н.Й., Гольдин В.А., Лисичкин Г.В., Ляиеяко А.Г., Рудаков А.Б., Сердан A.A., Черняева Г.А., Шифрина P.P., Янкелевяч А.З. Изучение устойчивости бутоксиаэросила к воздействию 7-излучэвия.// Хишя высоких энергий. 1Э88. Т.22, JÖ. С.221 -224.

3. Сердан A.A., Дяшэнко А.Г., Строганов Л.Б., Лисичкин Г.В., Минасян K.M. Способ спрэдэлэния протявосудорожных препаратов в биологических жидкостях. A.c. № 1476S77 , Е.И. № 16 от 30.04.1930 г.

4. Сердан A.A.. Ляаенкс А.Г., Гайда А.З.. Староверов С.М. Лисичкин ' Г.В. Способ получения сорбента для разделения биологических жидкостей кидкостной хроматографией. A.c. JS 1478112 , Б.И. 17 от 07.05.19S0 Г.

5. Ляшенко А.Г., Сердан A.A., Староверов С.М., Jlvctmam Г.В. Способ получения сорбента для хждкосгноД хроматограф низкомолзкулярных соединений в биологических жидкостях. Решение о выдаче A.c. по аеявке J6 4389811/31-26(036243) с правом публикации в открытой печати.

6. Лшенко А.Г., Оардак A.A., Лисичкин Г.В., Викторова В.А. Способ получения сорбента для жидкостной хроматографии биологических кидкостей. Решение о выдаче А.с.по заявке Л 4413199/31-1:6(062071) с правом публикации в открытой печати.

7. Ляшенко А.Г., Сердан A.A., Лисичкин J'.B. Способ получения сорбента для анализа кизкомолекулярных соединений в биологических жидкостях методом жидкостной хроматографии. Fönen® о видаче A.c. по заявки Л 4423318/31-26(073663) с праЕом публикации в открытой печати.

8. Сердан A.A., Ляшзнко А.Г. Крошвземгшо сорбенты о дкфильпой поверхностью. В кн.: Применение хроматографии на предприятиях химического комплекса. Тезисы докладов. Пермь, 193У, С.21.

9.Ляшенко Сердан A.A. Дифилыше кремнеземные сорбента. В кн.: ХУ1 Межвузовская конференция молодых ученых "Химия и физика твердого тола". Тезисы докладов. Ленинград, <039, с.35-36.

Ю.Котловп Е.К., Юсупова М.П., Левин Е.Д., Семиэхнна Е.А., Ляшенко А.Г. Анализ аспартама и ого производных методом обращекно-фазорой высокоэффективной жидкостной хроматографии. В кн.: Химия пищевых добавок. Тездсы докладов Всесоюзной конференции. Черновцы, 1939, С.131. '