Иммобилизованная ДНК как реагент для вольтамперометрического определения низко- и высокомолекулярных эффекторов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ
|
Зявкина, Юлия Игоревна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Казань
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2000
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.02
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
РГ6 01
ЗЯВКИНА ЮЛИЯ ИГОРЕВНА ^ ЯНЗ ^
ИММОБИЛИЗОВАННАЯ ДНК КАК РЕАГЕНТ ДЛЯ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИЗКО-И ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЭФФЕКТОРОВ
02.00.02 - Аналитическая химия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Казань - 2000
Работа выполнена на химическом факультете Казанского государственного университета
Научные руководители:
доктор химических наук, профессор Н.А. УЛАХОВИЧ кандидат химических наук, доцент С.С. БАБКИНА
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор М.И. ЕВГЕНЬЕВ кандид ат химических наук, с.н.с. В.М. ГОРОХОВСКИЙ
Ведущая организация:
Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН, г. Москва
Защита состоится
2000
г. в
часов на заседании
диссертационного Совета К 053.29.02 по химическим наукам Казанского государственного университета, 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, химический факультет, Бутлеровская аудитория.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета.
Отзывы на автореферат просим присылать по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, КГУ, научная часть.
Автореферат разослан
2000 г.
Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат химических наук
Федотова
ГУА^.ИЪА-бМ-О, Г)
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Определение нуклеиновых кислот и их эффекго-IB - актуальная проблема современной аналитической химии. Один из пер-екгивпых 1зутей решения этой проблемы - объединение возможностей чувст-ггельных методов детекции и использование высокой специфичности биоло-ческпх процессом, достижений биохимии и химии координационных соединяй.
Испол1.эов;1н!ге биосенсоров (БС) на основе иммобилизованной дезокси-;бон)тслеиновой кислоты (ДНК) позволяет расширить возможности элекгро-мичесгшх методов ан;шиза эффекторов ДНК как в экологических объектах, сколысу молекулы ДНК очень чувствительны к присутствию различных за-язнителей окружающей среды, вызывающих повреждение структуры моле-л, так и для анализа различных биосред организма, подвергшегося воздейст-ю токсикантов. В результате может быть получена информация не только о держании токсикантов, но и об их генетической токсичности и потенциаль-й опасности для последующих поколений.
ЕС на основе ДНК могут быть также использованы для высокочувстви-пьного определения онкопрепаратэв в сложных многокомпонентных систе-IX как на стадии их синтеза и изучения фармакокинетики, так и в процессе чения онкобольных.
Изучение взаимодействия ДЕК с высокомолекулярными биологически тивными веществами с помощью БС, в частности с антителами (Ат), специ-гаными к ДНК (аутоАт), позволяет моделировать участие ДНК в иммуноло-ческих реакция:; и проводить диагностику различных аутоиммунных эолегалий.
Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных ис-едований "Использование принцшюв иммунохимического анализа в вольт-лерометрин" (номер проекта 97-03-33232а) и международным грантом СО- Copernicus (номер проекта ERBIC 15 СТ-98-0910).
Цель работы. Целью является разработка способа ковалентной иммоби-зацшг денатурированной ДНК на гапроцеллюлозной мембране для создания лерометрического БС и его использование для изучения взаимодействия Ж с биологически активными соединениями - эффекторами ДНК, такими как ны тяжелых металлов, противоопухолевые препараты на основе комплексов TI) и Pt(IV)., аутоаититела с целью их определения в природных и биологиче-их объектах.
Научная новизна и тактическая значимость работы. Предложен но вый способ ковалентной иммобилизации молекул ДНК, входящих в со ста биочувствительной части амперометрического БС. ДИК иммобилизована 1 однонитевой денатурированной форме для создания новых возможностей взаи модействия эффекторов с ДНК и повышения чувствительности работы БС Выявлены оптимальные условия функционирования БС (рН, температура, бу ферная емкость, ионная сила).
Исследована сорбционная способность свинца и кадмия по отношению I денатурированной ДНК (д-ДНК). Показана возможность определения низкш содержаний ионов РЬ(П) и С<1(П), в том числе при совместном присутствии, зг счет их предварительного концентрирования на биочувствительной части сенсора.
Обнаружены каталитические волны выделения водорода в система? Р1(П)-ДНК и Р1(ГУ)-ДНК, которые использованы в качестве аналитического сигнала для определения содержания 14(11) и 14(1 V).
На основе высокой специфичности иммунологической реакции ДНК-аутоАт стало возможным определение с помощью БС содержания высокомолекулярных эффекторов - аутоАт в широком диапазоне концентраций, что позволило проводить диагностику аутоиммунных заболеваний, характерной особенностью которых является повышенное содержание в сыворотке крови Ат к д-ДНК.
Найдены условия реактивации биочувствительной части сенсора на основе иммобилизованной д-ДНК (д-ИДНК) в зависимости от природы анализируемого объекта для многократного использования БС. Оценены значения констант связывания ДНК-аутоАт и ДНК-ион тяжелого металла с помощью предложенного БС.
На основе ДНК-содержащего амперометрического БС разработаны методики селективного, чувствительного и экспрессного определения ионов тяжелых металлов в биологических и экологических объектах, платиносодержащих фармпрепаратов в сыворотке крови человека, Ат алеутской болезни норок, специфичных к ДНК, в сыворотке крови животных.
На защиту выносятся:
-способ ковалентной иммобилизации д-ДНК на шпроцеллюлозной мембране путем подбора соотношения носитель - растворитель - биокомпонент для получения биочувствительной части амперометрического сенсора на основе стационарного ртутн о-пленочного электрода с серебряной подложкой;
-оптимальные условия функционирования разработанного амперометри-¡ского БС (температура, рН и буферная емкость; условия реактивации биочув-вигельной части сенсора с целью многократного его использования;
-использование ДНК-содержащего БС для предварительного концентри->вания микроколичеств ионов свинца и кадмия на биочувствигельной часта нсора за счет комплексообразования ион тяжелого металла -ДНК и исполь-вание реакции комплексообразования РЬ(П)-комплексон Ш и Сс1(11)-комплек-1Н Ш для определения низких содержаний ионов РЬ(П) и Сс1(П) в модельных [створах. Изотермы сорбции Ленгмюра ионов РЬ(П) и Сс1(П) на д-ДНК-»держащей биочувствигельной части амперометрического сенсора;
-результаты исследования электрохимического поведения комплексов (П) и Н(ГУ) в присутствии БС на основе д-ИДНК; установление природы то-)в, полученных при комплексообразования 1Ч(П)-ДНК и Р1(1У)-ДНК; резуль-ггы определения содержания 14(11) и И(1У) при их совместном присутствии с ^пользованием разработанного БС;
-возможность использования БС на основе д-ИДНК для контроля проте-шия иммунологической реакции ДНК-аутоАт и использования комплексооб-»ования аутоАт-Р^П) для расширения области определяемых содержаний /тоАт;
-результаты определения констант связывания ДНК- аутоАт и НК-тяжелый металл с помощью разработанного амперометрического БС;
-методики индивидуального определения и определения при совместном зисутствии тяжелых металлов в биообъектах и объектах окружающей среды с эмощью БС на основе д-ИДНК;
-методики определения противоопухолевых препаратов цисплатина и ксоплатина в сыворотке крови;
-методики определения содержания аутоАт к ДНК в сыворотке крови с эмощью БС на основе д-ИДНК для диагностики аутоиммунных заболеваний а ранних стадиях.
Апробаиия работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждаясь на Международной школе по биоэлектрохимии им. Джулио Милаццо (г. егед, Венгрия, 1997г.), XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной амии (г. Санкт-Петербург, 1998 г.), Поволжской региональной конференции Физико-химические методы в координационной и аналитической химии" (Ка-шь, 1999 г.), Всероссийской конференции по электрохимическим методам
анализа "ЭМА-99" (г. Москва, 1999 г.), Итоговой конференция Казгяского государственного университета (Казань, 2000 г).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ. Из них 3 статьи в рецензируемых научных журналах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и 25 рисунког. Работа состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы, включающего 181 ссылку.
В первой главе представлен обзор литературы, посвященный низко - и высокомолекулярным эффекторам ДНК, рассмотрены особенности их »займадействия, предпочтительные центры координации в молекуле ДНЕС в зависимости от типа эффекторов; обсуждены последствия влияния тяжелых металлов на ДНК организма, описаны электрохимические методы анашгаа 1сак нуклеиновых кислот, так и эффекторов ДНК, систематизщэована информация о существующих на сегодняшний день элекгрохимическкх БС на основе «£уклеиновш. кислот, рассмотрены их аналитические возможности.
Во второй главе формулируется задача исследования, охшсьшглотся объекта исследования, реагенты, аппаратура и усповия проведения эксперимента.
В третьей главе рассмотрены особенности иммобилизации денатурированной ДНК для приготовления биочувствитсльной части сенсора и обосновывается выбор оптимальных условий функционирования БС.
Четвертая глава посвящена изучению электрохимического поведения ионов Cd(II) и РЬ(П) в присутствии д-ИДНК содержащего БС, и возможности их определения с помощью данного БС и реакции комплексообразовгяия тяжелый металл - Комплексен Ш, установлены параметры оптимизации опргделе-ния ионов Cd(II) и РЬ(П). Показана возможность рсактиващш биочувствшель-ной части сенсора для его многократного использования.
В пятой главе представлены результаты исследования электрохимического поведения комплексов ДНК-Р1(П) и ДНК-Pf(IV), пэл}-ченЕЫх в результате комплексообразования т-рХЫНз^СЬ] и К^РЧСЦ] с д-ИДНК, изучена природа аналитического сигнала, обусловленного выделением каталитических токов водорода. Приводятся результаты определения содержании противоопухолевых препаратов цисплатина и оксоплатина в модельных растворах с помощью БС.
В шестой главе приведены результаты изучения биоспецифического взаимодействия д-ДНК с высокомолекулярными эффекторами- аутоАт, онреде-ление константы связывания ДНК-аутоАт и использование ргавдгн комплексо-образования ДНК-Р^П) для определения аутоАт к ДНК с помоитыо КС на осно-
ie д-ИДНК, а также возможность использования комплексообразования аутоАт ! Pt(II) для расширения области определяемых содержаний ауто-Ат.
Седьмая глава посвящена различным аспектам аналитического примене-шя амперометрического БС на основе д-ИДНК. Описываются методики анализа реальных биологических и экологических объектов с помощью ДНК-юдержащего БС на содержание низко- и высокомолекулярных эффекторов ДНК.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Вольтамперограммы регистрировали на приборах ППТ-1, ПУ-1 (СССР) и ГВА МБ-01 (Болгария). Циклические осцилловольтамперограммы регистриро-¡али на осциллографическом полярографе ЦЛА ПО-5122, модель 03 (СССР) на сафедре аналитической химии КГУ. Рабочим электродом служил разработан-шй БС на основе стационарного ртутно-пленочного электрода с серебряной тодложкой. Электрод сравнения - насыщенный каломельный электрод.
Объекты исследования: комплексные соединения ciy-fPtfNHj^Cb] и £2[PtCU] (синтезированы профессором В.К. Половняком (кафедра неорганиче-жой химии КГТУ)), противоопухолевые фармпрепараты: цисплатин (cis-1ихлородиаммтшлатнна(П)) (любезно предоставлен ВЭО "Саламат" (г. Казань)), оксоплатин (от-дихлордиаммин-трамс-дигидроксоплатина (IV)) (лю-зезно предоставлен профессором H.H. Желиговской (кафедра аналитической шмии МГУ)). Использовали Cd(N03)2 и РЬ(ЫОз)2 марки "хч". Использовали оуферные растворы различной природы: (фосфатно-солевой буферный рас-гвор(ФСБ), ацетатный буферный раствор, аммиачный буферный раствор, нитратный буферный раствор, боратный буферный раствор) с pH от 3.5 до 10.5. Растворы трилона Б готовили на основе стандартных фиксаналов.
Были использованы следующие биологические препараты: ДНК селезенки крупного рогатого скота фирмы "Яеапа1"(Венгрия), соотношение N/P - 1,61,7 , 8р при Ащах 280 нм = 6.500-7.500; иммуноглобулин G сыворотки крови норок, инфицированных алеутской болезнью, выделение Ig G проводили методом ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЕ- целлюлозой. Коммерческая сибиреязвенная сыворотка крови лошади (Тобольская биофабрика). Коммерческая сыворотка крупного рогатого скота против аденовируса (Курская биофабрика), контрольные сыворотки крови здорового человека, и сыворотки крови больных при отравлении тяжелыми металлами (предоставлены отделением профпатологии 12-й горбольницы, г. Казань). Для приготовления биочувствительной части сенсора была использована шпроцеллюлоза(НЦ) ФТ-30 типа
коллоксилин марки ч. со средним содержанием азота 11.5-12%; органич с кие растворители х.ч. (ацетон, толуол, гексан) и 25 % раствор глутарового ал дегида фирмы "КеапаГ (Венгрия).
РАЗРАБОТКА СПОСОБА КОВАЛЕНТНОЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ ДЕНАТУРИЮВАННОЙ ДЬЖ
Большинство описанных в литературе ДНК-содержащих БС основаны I физической, менее эффективной иммобилизации молекул нуклеиновых кисло Поэтому, одна из задач исследования в этой области- улучшить качество ме» бран за счет ковалентной иммобилизации ДНК, повысить их однородность, у< тойчивость во времени и к различным воздействиям в условиях эксперимент; Использование в качестве матричного материала при химической иммобилиз; ции нитроцеллюлозы (НЦ) дает ряд преимуществ: НЦ обладает минимально неспецифической сорбцией, отличается высокой степенью гидрофшшюсп наличие большого числа гидрофильных групп позволяет легко ее модифицирс вать введением различных заместителей. При этом особый интерес предстааш ла иммобилизация однонитевой д-ДНК, поскольку низко- и высокомолекуля{ вые эффекторы ДНК специфичны именно к денатурированной форме, так ка при взаимодействии ее с ионами металлов, такими как Р1(П), РК1У), РЬ(П С<1(П) и др., они связываются преимущественно с азотистыми основаниями ил с фосфатными группами одной цепи ДНК, которые не экранированы водород ными связями, при этом межнитевое связывание составляет менее 1%; кром того, аутоАт также специфичны именно к д-ДНК, в которой антигенные детер мин анты не экранированы вторичной структурой. Таким образом, использова ние д-ДНК позволяет, с одной стороны, обеспечить большую прочность и од нородность связывания с НЦ-матрицей при иммобилизации за счет отсутстви межнитевых водородных связей, а с другой стороны, позволяет создать наибо лее благоприятные условия для специфичного взаимодействия эффекторо ДНК с поверхностью БС с целью их изучения и определения.
Иммобилизация д-ДНК проводилась на НЦ-мембране с использование! ацетона и толуола в качестве легколетучих растворителей НЦ, что позволил! сократить время контакта биомолекул с органическими растворителями (до II мин) и максимально сохранить их биологическую активность; ковалентное свя зывание д-ДНК с НЦ-мембраной осуществлялось с помощью бифункциональ ного реагента - глутарового альдегида. Для предотвращения неспецифическоп связывания мембраны с д-ИДНК перед употреблением выдерживались в тече ние 30 мин в 1 % растворе бычьего сывороточного альбумина.
Из литературы известна способность 14(11) образовывать с ДНК устойчивый комплекс. Аналитическим сигналом служил максимум тока при Е=-1.2 В, появляющийся на катодной волыпмперограмме раствора комплекса 14(11) в присутствии д-ИДНК. Неличина максимума зависит от рН и буферной емкости. Наблюдаемый максимум является каталитической волной выделения водорода, обусловленной образованием каталитически активного комплекса ДНК-14(П). Величина этого сигнала линейно связана с концентрацией 14(11) в растворе и может быть использована для котроля за активностью ДНК в НЦ-мембране. Было установлено, что д-ДНК в иммобилизованном состоянии сохраняет свою активность на 78 % по сравнению с д-ДНК в растворе, д-ИДНК не вымывается из НЦ-матрицы и не снижает актшность в течение 30 дней. Однородность полученной мембраны контролировалась анализом ее различных участков по высоте катодного шша при Е=-1.2 В в присутствии комплексов 14(П). Полученные полуггрошщаемые мембраны с д-И^ДНК площадью 7.95±0.5 см2 были использованы в качестве биочувствительной часта амперометрического БС на основе стационарного р1упго-шгеночного электрода с серебряной подложкой. С помощью полученного ЕС проводилось 15-18 измерений с учетом реактивации биочэ'вствнгельнсй части сенсора. Мембраны, с д-ИДНК, потерявшие активность, заменялись на новые.
ВЗАШуЮ ДЕЙСТВИЕ ДЕНАТУРИРОВАННОЙ ДНК С НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ ЭФФЕКТОРАМИ - КОМПЛЕКСАМИ Р«71) И Р1(Г/) И ТЯЖЕЛЬМИ МЕТАЛЛАМИ И ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ БИОСЕНСОРА
На основе разработанного БС было изучено взаимодействие комплексов платины с ДНК с целью определения противоопухолевых препаратов в биосредах. Для платины характерно образование устойчивых связей с азотсодержащими лигавдами. что приводит к протеканию нуклеофильного замещения аци-долигандов комплексов 14(11) - цисплатина и Р^У) -оксоплатина на азотистое основание ДНК, На вольтамперограммах раствора, содержащего Б4(П) и БС с д-ИДНК наблюдается катодный пик при Е= -1.2 В; 14(1У) в присутствии БС с д-ИДНК дает катодный ггик при потенциале -0.9 В. Оба пика возрастают пря-мопропорционалъно увеличению концентрации комплексов платины. Эти сигналы являются каталитическими волнами выделения водорода, возникающими з результате образования каталишчески активных комплексов ДНК-Е4(П) и ДНК-Р1([У). Комплексообразование платаны с ДНК происходит в основном с
образованием внутринитевого хелата с N(7) и 0(6) атомаш гуашша молекулы ДНК. Так как в нашем случае иммобилиювана денатурирэвашпш ДНК, ком-плексообразование с Pt(II) и с Pt(IV) происходит в основном, с N(7) атомам® соседних молекул гуанина одной спирали, т.е. имеет место так называемое внутринитевое сшивание. Отсутствие водородных связей между азотистым! основаниями, имеющих место в случае нативнон ДШС делает возмошшм i комплексообразование Pt(H) и Pt(TV) с N(3) атомами цигозина, и Pt(II) за счет N(7) и N(1) атомов аденина. Уравнения градуяровочных ¡рафиков имеют вид: Pt(II): /,= (2.21 ±0.03) сп+(0.65 ±0.02) 14(11/): /„= (LIS ±й.04) сп+(0.32 ±0.01, Области определяемых содержаний: для Р1(П) -[1,0хШ^-5.0х 10"'°]мол:!>/л, цш Pt(IV) -[1.0х10'6-5.0х10"и]моль/л. Значения Сщш, рассчэташше по Зв-критерию составляет 6хЮ"10 моль/л для оксоплалша и 5х10"9 моль/л да! шсшшша. Ре зультаты определения приведены в таблица 1.
Таблица 1
Результаты определения содержания цисплатана и сксоплатина
_в модельных растворах (n=5JP=0,95)___
Определяемое Введено, Найдено, Sr
соединение_сх 108, моль/л (cfc8)x 10s, моль/л
Цисплатан (Pt(II)) 1,50 1,5±0,3 0,16
5,00 4,9±0,6 0,10
10,0 9,9+0,2 0,02
50,0 51±1 0,02
OKCorniaraH(Pt(TV» 0,10 0,09±0,08 0,27
0,50 0,52±0,09 0,14
1,00 1,0±0,1 o,ot:
3,0 3,Ш,2 0,05
БС на основе иммобилизованной ДНК позиоляет определял содержание: цис- и оксоплатина при их совмеством присутствии благодаря достаточной разнице потенциалов описанных выше пиков (табл 2.), а также делает возможным определение их в биосредах организма без предварительной пробоподготозки.
Таблица
Результаты определения оксоплатина в присутствии идешшина
(п=5, Р= 0.95, Чтабд^ 2.78)
Введено Соотношение -•'-J -lOOil
оксоплатина, оксоплаткн: цисплахин Найдено оксоплатина Sr t расч
мкг/мл в пробе (с±5), шт/мл
0.005 1:1 0.060±0.01:5 0.20 1.49
0.012 1:1 0.013±0.002 0.12 1.40
0.012 1:10 0.015±0.003 0.16 2.78
0.012 1:50 0.010Ю.002 0.16 2.78
Проведено также определение цисплатина в образцах сыворотки крови. Эценку правильности этой методики проводили способами удвоения массы тробы и введения добавки определяемого компонента. Данные табл. 3 свидетельствуют об отсутствии значимых систематических погрешностей, поскольку шполняются следующие соотношения: а < t а«,«. Я,, Ь-1 <1 «5*
Таблица 3
Оценка систематической погрешности при определении цисплатина
в сыворотке крови (п = 8, Р - 0.95)
Образцы сыворотки »•Б, ЬБь
крови (2+5), мг/л а Ь-1 0.95; 0.95;
1 0.14±0.02 0.050 0.070 0.09 0.08
2 0.28±0.05 0.060 0.100 0.065 0.148
3 0.06±0.01 0.005 0.030 0.013 0.032
Высокая чувствительность молекул ДНК к присутствию экотоксикантов,
в частности, к ионам тяжелых металлов, вступающих в комплексообразование с ДНК и нарушающих ее структуру и функции вплоть до денатурации, позволяет использовать БС на основе ДНК как еще одно перспективное средство экологического контроля на примере определения ионов тяжелых металлов (РЬ(П) и Сс1(1Г)). На основании изучения зависимости высоты тока пика восстановления ионов РЬ(П) и С<1(П) от времени накопления при различных концентрациях исходных растворов ионов металлов установилено минимальное время накопления этих ионов на биочувствительной части сенсора - 15 мин (рис. 1).
Определена сорбционная емкость д-ИДНК содержащей поверхности предлагаемого БС в присутствии ионов тяжелых металлов. Изотермы сорбции этих ионов на д-ИДНК построены на основании уравнений Лэнгмюра (рис. 2). Максимальная сорбирующая способность биочувствительной части сенсора составляет 4.8Х10"6 моль (РЪ(П)) и 3.3x10"6 моль (Са(П)), что свидетельствует о большем сродстве ионов РЬ(П) к д-ДНК, чем ионов С<1(11). Рассчитанные по методу Скэтчарда константы связы-
,МИН
Рис. 1 Зависимость величины тока пика при Е= -0.65 В от времени накопления С<1(11) на д-ИДНК; Сокщ:1- 0.5х10'} моль/л; 2- 1.0x10^ моль/л; 3- 1.0x10"7 моль/л; аммиачный буферный раствор рН 7.3, БС.
вания ионов металлов д-ДНК равны (1.2±0.3)х1 л/моль и (0.6±0.2)х105 л/м! для РЬ(П) и С<1(П) соответх венно. Эти данные свидетх ствуют о прочном связыва ионов тяжелых металло д-ДНК, что приводит к их тагенному действию и укг вает на необходимость ощ деления содержания тяжед металлов в различных объ тах именно с помощью ДЕ содержащего БС.
ста на предел а».
Для многократного использования БС были разработаны условия реакга вации биочувствительной части с д-ИДНК с помощью комплексона Ш. На ос новании зависимости величины тока восстановления комплексонатов Сс1(П) 1 РЬ(П) при потенциалах -0.9 и -0.7 В соответственно от времени реакгивацш при различных концентрациях иона металла было выбрано оптимальное врем; реактивации - 20 мин (рис. 3). Устойчивость комплексоната металла и концен трирование ионов тяжелых металлов в приэлектродном слое на биочувстви тельной части сенсора за счет комплексообразования с ДНК позволяет опреде лять концентрации ионов Сс1(П) до 1х10'9 моль/л, и РЬ(П) до ЗхЮ"10 моль/л Достаточная разница в потенциалах восстановления комплексонатов С<1(11) I РЬ(П) позволяет определять ионы свинца и кадмия в модельных растворах пр* их совместном присугствии(табл. 4) с фактором селективности 1:10.
Таблица 4
Результаты определения РЬ(П) И С(1(П) в модельных растворах при совместном _присутствии (п=5, Р=0.95)_
Введено Найдено Бг сх108, моль/л_(с±8)х 108, ыоль/л_
РКП) Сс1(П) РЬСП) С(1(И) РЬ(П) Сё(П)
0.25 0.25 0.26М.03 0.23±0.08 0.28 0.28
1.0 1.0 2.0. ±0.3 1.0±0.4 0.23 0.32
5.0 5.0 5.1±0.05 5.2±0.9 0.13 0.14
1.0 2.0 0.97Ю.06 2.1±0.3 0.04 0.11
1.0 10.0 0.98±0.06 9.8±0.4 0.05 0.03
ахЮ3 моль/м2
моль/л
Рис. 2 Изотермы сорбции Ленгмюра ионов С<1(П) на д-ИДНК; области: I - прямолинейной зависимости, II - искажения прямолинейной зависимости, Ш - выхода зависимо-
На основании разработанной методики было проведено определение содержать тяжелых металлов в реальных экологических объектах, предоставленных СЭС г. Казани - молоке и питьевой воде до и после использования бытового фильтра.
[I, мкА
3 ■ 53 > -
10
20 25
'с' ,м ин
I, мкА
252015
1С-5-
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6 -Е, В
Рис. 3 Зависимость асличнмы тока пика при Е= -0.9 В от иреме п! рсакпвга-щш БС при р пличных концентрациях ионов Сс1(П): I-1 >с 10' моль/л, г-0.5x10 е моль'л, з-1:< 10"7 моль/л, ам-миачшга буферный раствор рН 7.3.
Рис. 4 Вольтамиерограммы растворов Р1(П): 1- в отсутствие Ат к ДНК; 2- в присутствии 0.7х10"9 моль/л Ат к ДНК; 3- 1.3х10"9 моль/л Ат к ДН1С; 4- 0.7x10"* моль/л Ат к ДНК. фосфатно-солевой буфер, рН 6.7, Свд = 1х10"5 моль/л, БС на основе д-ИДНК.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДЕНАТУРИРОВАННОЙ ДНК С ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ ЭФФЕКТОРАМИ- АУТОАНТИТЕЛАМИ И ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ БИОСЕНСОРА
Показана тагатсе возможностъ использования разработанного БС для контроля протекания иммунологических реакций с участием ДНК и диагностики заболеваний. Была изучена реакция иммунологического связывания ДНК с вы-сокомоле1сулярными эффиггорами - аутоАт. Они образуют иммунологический комплекс ДЕЖ-Ат за счет компле ментарносш пептидных функциональных групп антитела фосфатно-сахаридному скелету молекулы ДНК. При введении аутоАт в раствор, содержащий БС с д-ИДНК и Р1(П), величина катодного максимума при Е= -,[.2 В уменьшается по мере повышения концентрации Ат вследствие экранирования части каталитически активных комплексов ДНК-Р1(11) в результате биоопецифичгского взаимодействия ДНК с аутоАт
(рис. 4, кривая 2). При добавлении к раствору избытка И(П) появляется второ! максимум токи при -1.4 В, увеличивающийся с ростом концентр.щии Ат (см рис. 4, кривая 3). Величина первого аналитического сигнала при Е=-1.2 В и< пользована для разработки методики определения аутоАт в диапазоне концен траций 5.0х10"10-1.3хЮ'9 моль/л, схема имм^дюаналнза приведена на рис. 5(а).
-РЩ ея—*гв
ЛИК
&
^-глв
лнк
АПК
й
<дт* ? й
лнк
Рис. 5 Схема иммуноанаггиза с помощыэ БС на д-ИДНК: а - при: Сдт~
5x10-10
1.3x10-9 моль/л; б - при сЛт= 1.3x10'9-7.0:с 1моль/л; * - несвязанные Ат в рас творе при сдт > 1,3x10-9 моль/л.
При содержании Ат в исследуемом растворе, превышающем 1.3х105 моль/: сигнал при Е=-1.2 В исчезает из-за полного насыщенил меегг связывания ДШ антителами. Для расширения области определяемых коищентраций аугоАт ] возможности использования БС для определения более высоких содсржашп иммуноглобулинов в сыворотке крови проведено изучение второго катодноп максимума при Е=-1.4 В, появляющегося при концетрацлях Ат выше 1.3x10" моль/л. Этот катодный сигнал также обязан каталипгеескому выделению вода рода, возникающему при комплексообразо]шнни Р1(И) с Ат. Полная схема им муноанализа приведена на рис. 5. Результаты определения аутоАт в широко« диапазоне концентраций от 7.0Х10"8 до 5.0x10"'° моль/л представлены в табл. 5. На основании графика Скэтчарда определены констшпы сшгаявашм биоспецифического взаимодействия ДНК-Ат: К1 св»э=1- 25x10® л/моль, К2гаи=2.5х108 л/моль. Полученные значения констант свидетельствуют о прочном, а следовательно специфичном взаимодействии компонентов иммунохимиче&кой рсакциЕ ДНК-аутоАт. Проведены определение аутоАт в сыворотке крови животных и диагностика алеутской болезни норок(АБН) по ЗБ-кркгерию с помощью БС, результаты диагностики контролировались иымуноферменткым анализом (ИФА) со спектрофотометрической индикацией сигнала (табл. б). Из данных табл. (
Таблица 5
Результата определения специфических аутоантител в модельных растворах _(п=5, Р=0.95)_
Введено, с-10® моль/л Найдено, (с±5)-109 моль/л Б,
0.50 0.52±0.05 0.07
0.75 0.73±0.04 0.05
1.00 0.98Ю.05 0.04
3.0 3.0±0.1 0.03
5.5 5.6±0.1 0.02
10.0 9.9Ю.2 0.02
20.0 22±0.6 0.02
следует, что результаты диагностики с помощью разработанного иммуноанали-за с использованием БС хорошо согласуются с результатами контрольного метода.
Таблица 6
Определение ауто-АТ и диагностика АБН с помощью биохимического сенсора на основе д-ИДНК и методом ИФА. (БС: 1р°= 15 мкА, Зз=1,5 мкА; ИФА : А°=0,035*, 38=0,105)
1Р, мкА Сдт, моль/л А при Х-492 нм Результаты диагностики**
_БС_ИФА
5,0 5,0-10"8 0,507 + +
8,0 5,0-10"9 0,311 + +
15,0_2,0- Ю"10_0,012_-_-_
*А° - величина поглощения раствора сыворотки неинфицированных животных
** + - животное инфицировано; - - животное не инфицировано
Таким образом, разработан способ ковалентной иммобилизации денатурированной ДНК на шпроцеллюлозной мембране, амперометрический БС на основе д-ИДНК использован для изучения и количественной оценки взаимодействия ДНК с различными низко- и высокомолекулярными эффекторами и для их чувствительного специфичного определения в биологических и экологических объектах.
ВЫВОДЫ
1. Разработан способ ковалентной иммобилизации д-ДНК на шпроцеллюлозной мембране. Нитроцеллюлозные мембраны с д-ИДНК однородны, д-ИДНК, сохраняет свою реакционную способность по сравнению с неиммоби-лизованной на 78%. Предложен амперометрический БС, состоящий из транс-дьюсера - стационарного ртутно-пленочного электрода с серебряной подлож-
кой и биочувствительной части на основе д-ИДНК. Биочувствительшя час сенсора сохраняет стабильность, реакционную способность, и еосщюязвод мость в работе в течение не менее 30 дней. Подобраны оптимальные услош функционирования разработанного амперометрического БС. Найдены способ реактивации биочувствительной части сенсора исходя из природы анализиру мых эффекторов с целью многократного ее использования.
2. Оценена сорбционная емкость д-ИДНК-шдер/кащей поверхнос-предлагаемого БС в присутствии ионов тяжелых металлов. Выявлены р;шич] в сорбируемости ионов РЬ(П) и С<1(П) на биочувствительной поверхности се сора Изотермы сорбции этих ионов на д-ИДНК из фосфашо-солевого буфе ного раствора с рН 6.7-7.3 описываются уравнениями Ленгмюра. Магашальи сорбирующая способность биочувствигельной части сенсора составля З.ЗхЮ"6 моль (Сс1(П)) и 4.8x10"® моль (РЬ(П)), что свидетельствует о бэльпк сродстве ионов РЬ(П) к д-ДНК, чем ионов С(1(П). В соответствии с этим рассч танные по методу Скэтчарда константы связывания ново» металлов с д-ДН равны (1.2±0.3)х106 л/моль и (0.6±0.2)х105 л/моль дня РЬ(П) и С(1(П) соответс венно.
3. Установлены оптимальные условия определения Г'Ь(П) и Сё(П) в м дельных растворах в результате предварительного концентрирования на би чувствительной части сенсора в виде комплексов РЬ(Н) и С{|(П) с д-ИД1Ж с п следующим десорбированием в виде их кэмплексонатов, тэки восстановлен] которых позволяют определял, кадмий и свинец с пределом обнаружен) 1х10"9 моль/л и ЗхЮ'10 моль/л соответственно.
4. Обнаружена каталитическая активность по отношению к выделен» водорода на электроде Р1(П) и 1Ч(1У) в прис>тсгвии д-ЩЦПС в составе БС. Д казана природа аналитического сигнала, определены факторы, влияющие на е величину, показана возможность его использования для селективного опрел ления содержания И(П) и Р1(ГУ) в анализируемых растворах Выбраны услов! определения противоопухолевых препаратов на основе Р1(П) и 1Ч(1У) циспл тина и оксоплатина. Пределы обнаружена! фармнрешратоЕ; составляют 6x10 моль/л (оксоплатан) и 5x10"' моль/л (цисшшин) в присутствии м^ганда, жел за, меди и цинка.
5. Амперометрический БС на основе д-ИДНК использован для контро. прохождения иммунохимической реакции д-ДНК с а>тоАт. Использование I
в иммунохимии основано с одной стороны, на аналитическом сигнале, обу-словлешшм выделением каталитических токов выделения водорода в результате образования каталитически активного комплекса Р1(П)-д-ДНК, а с другой стороны, на уменьшении данного аналитического сигнала, происходящем вследствие экранирования части каталитически активных комплексов ДНК-14(11). Экранирование наблюдается при введении в эту систему Ат, специфичных к ДНК, которые образуют иммунокомшгексы ДНК-Е4(И)-аутоАт. Определены константы связывания при взаимодействии аутоАт с д-ИДНК. Показано, что комплексы ДНК-а:утоАт обладают достаточной прочностью, константы связывания для ¿»ух гидов аутоА" составляют 1.25х109 л/моль и 2.5><108 л/моль. Показана возможность селективного, быстрого, высокочувствительного определения компонентов биоспгцифического взаимодействия.
6. На оспом предложенного амперометрического д-ИДНК-содержащего БС разработаны иетодикн определ ения низко- и высокомолекулярных эффекторов, ДНК в биологических объектах и объектах окружающей среды. На основании предложенных метода: было проведено определение содержания ионов РЬ(П) и Сё(П) в сыворотках гфови, молоке, а также в образцах воды до и после очистки с помощью производственного фильтра, онкопрепарата цисплатина в сыворотки крови, содержания аутоАт в сыворотке крови животных, пораженных алеутской болезнью. Сравнением результатов, полученных при проведении анализа по предложенным методикам с участием д-ИДНК-содержасцего БС, с результатами контрольных методов, а также методом удвоенш массы пробы и г.ведепия добавки определяемого компонента оценена правильность аналитических методик.
Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:
1. Бабкина С.С., Улахович Н.А., Медянцева Э.П., Зявкина Ю.И. Амперо-метрнческнй бносенсо]» на основе дезоксирибонуклеиновой кислоты и комплексов платины(П): новые аналитические возможности// Журн. аналит. хи-М1Ш.-1999.-Т 54, № 11.» С. 1205-1211.
2. Улахович Н А, Бабкина С.С., Зявкина Ю.И. Определение эффекторов дезоксирибонуклеиновой кислоты с помощью биохимического амперометрического сенсора// Российский химический журнал. Журн. РХО им Д.И. Менделеева..-1999,-Т 43. X® 3-4,- С.147-149.
3. Babkina S.S., Ulakhovich N.A., Medyantseva E.P., Zyavkina Yu.I. Ampero-metric biochemical sensor based on immobilized deoxyribonucleic acid (DNA): a new tool for ecological monitoring// Ecological congress.-2000.-V. 3, № 2,- P. 37-42.
4. Бабкина C.C., Улахович H.A., Зявкина Ю.И. Амперометрический биосенсор на основе иммобилизованной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) для экологического и биохимического анализа// Тез. докл. XVI Менделеевской съезда по общей и прикл. химии.-М., 1998.- С. 19.
5. Babkina S.S., Ulakhovich N.A., Medyantseva Е.Р., Zyavkina Yu.I. New amperometric biosensors based on DNA for anti-DNA antibodies immunoassay// Abstr. 7th European Conference on Electroanalysis (ESEAC'98) -Portugal, Coimbra.-1998,-P. 194.
6. Бабкина C.C., Зявкина Ю.И., Нугаева З.Т. Вольтамперометрическое определение Pt(IV) и Pt(II) в биообъектах с помощью биосенсора на основе иммобилизованной иммобилизованной дезоксирибонуклеиновой кислоты// Тез. докл. Поволжской региональной конференции: Физико-химические методы в координационной и аналитической химии. Казань, 1999,- С. 88.
7. Бабкина С.С., Улахович Н.А., Зявкина Ю.И. Вольтамперометрическое определение биологически активных веществ на основе их комплексообразова-ния с иммобилизованной ДНК// Тез. докл. Всеросс. конф. по электрохимия, методам анализа- ЭМА-99,- Москва.- 1999,- С. 7.
8. Babkina S.S., Ulakhovich N.A., Zyavkina Yu.I. Voltammetric sensor based on mercury film-covered silver electrode and immobilized DNA and its use in DNA effectors assay// Abstr. of conf. "Modern Electroanalytical Metods "Czech. Republic, Pardubice. 1999.-PO/45.
9. Улахович H.A., Бабкина C.C., Зявкина Ю.И., Моисеева Е.Н. Влияние тяжелых металлов на дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и оценка их экотоксичности с помощью биосенсора на основе ДНК// Тез. докл. IV Всерос. конф. "Экоаналитика 2000", Краснодар, 2000.- С. 140-141.
10. Бабкина С.С., Улахович Н.А., Зявкина Ю.И. Определение платины в фармпрепаратах и биообъектах с помощью амперометрического биосенсора на основе дезоксирибонуклеиновой кислоты// Завод, лаборатория,- 2000,Т. 66, № 12. (в печати).
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК С НИЗКО- И ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ ЭФФЕКТОРАМИ И ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ С УЧАСТИЕМ ДНК.
1.1. Взаимодействие ДНК с низкомолекулярными эффекторами -металлами.
1.1.1. Взаимодействие ДНК с ионами металлов.
1.1.2. Влияние взаимодействия переходных металлов с ДНК на живой организм
1.1.3. Взаимодействие ДНК с платиновыми металлами. Противоопухолевая активность комплексов металлов платиновой группы.
1.2. Взаимодействие ДНК с высокомолекулярными эффекторами.
1.3. Электрохимические методы изучения взаимодействия
ДНК с переходными металлами
1.4. Электрохимические биосенсоры на основе нуклеиновых кислот.
1.4.1. Иммобилизация нуклеиновых кислот
1.4.2. Аналитические возможности электрохимических биосенсоров на основе нуклеиновых кислот.
2. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ, АППАРАТУРА, ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА.
2.1. Постановка задачи исследования
2.2 Объекты исследования и приготовление растворов.
2.3 Приборы и техника измерений.
2.4. Методика иммобилизации денатурированной ДНК.
2.5. Устройство амперометрического биосенсора на основе денатурированной иммобилизованной ДНК.
3. РАЗРАБОТКА АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО БИОСЕНСОРА
НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ДЕНАТУРИРОВАННОЙ ДНК И ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЕГО ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ.
3.1. Способ ковалентной иммобилизации денатурированной ДНК и его преимущества.
3.2. Основные характеристики биочувствительной части амперометрического биосенсора на основе иммобилизованной денатурированной ДНК.
4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДЕНАТУРИРОВАННОЙ ДНК С НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ ЭФФЕКТОРАМИ - ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ
И ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ БИОСЕНСОРА
4.1. Поведение ионов РЬ(П) и С<1(11) в присутствии ДНК- содержащего биосенсора.
4.2. Выбор оптимальных условий определения ионов РЬ(Н) и Сс1(П). Изотермы адсорбции Ленгмюра и константы связывания д-ДНК с тяжелыми металлами как параметры оптимизации.
4.3. Реактивация биочувствительной части сенсора и использование комп-лексообразования М(П) - комплексен Ш для определения ионов Pb(II) и С<1(11) с помощью биосенсора на основе денатурированной иммобилизованной ДНК в модельных растворах.
5. КОМПЛЕКСЫ 14(11) И И(1У) КАК НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЭФФЕКТОРЫ ДНК И ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ АМПЕРО-МЕТРИЧЕСКОГО БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ д-ИДНК.
5.1. Использование каталитических токов выделения водорода для определения комплексов Р1(П) и Р<:(1У).
5.2. Определение противоопухолевых препаратов цисплатина и оксо-платина в модельных растворах с помощью БС
6. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ д-ДНК С ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ ЭФФЕКТОРАМИ- АУТОАНТИТЕЛАМИ И ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
С ПОМОЩЬЮ БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ д-ИДНК.
6.1. Влияние комплексообразования ДНК-аутоАт на аналитический сигнал биосенсора в присутствии комплекса Р^Н) и определения аутоАт в модельных растворах.
6.2. Определение констант связывания биоспецифического взаимодействия ДНК-аутоантитела.
7. ПРИМЕНЕНИЕ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ДЕНАТУРИРОВАННОЙ ДНК
ДЛЯ АНАЛИЗА РЕАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ.
7.1. Определение ионов Сё(П) и РЬ(П) в сыворотке крови с помощью биосенсора.
7.2. ДНК-содержащий амперометрический биосенсор как новое средство экологического контроля.
7.3. Определение содержания онкопрепаратов на основе платины в сыворотке крови человека с помощью биосенсора
7.4. Применение амперометрического биосенсора на основе д-ИДНК в иммуноанализе и диагностике аутоиммунных заболеваний
ВЫВОДЫ.
Актуальность темы. Определение нуклеиновых кислот и их эффекторов - актуальная и сложная проблема современной аналитической химии. Один из перспективных путей решения этой проблемы - объединение возможностей чувствительных методов детекции и использование высокой специфичности биологических процессов, достижений биохимии и химии координационных соединений[1-3].
Разработка чувствительных и высокоселективных биосенсоров (БС) значительно расширяет возможности электрохимических методов анализа объектов окружающей среды и биообъектов. Ферментные БС и сенсоры на основе иммунологических реакций уже применяются в этой области.
В то же время использование биосенсоров на основе дезоксирибонук-леиновой кислоты (ДНК) пока крайне ограничено, хотя такие БС могут быть с успехом использованы как для анализа экологических объектов, поскольку молекулы ДНК очень чувствительны к присутствию различных загрязнителей окружающей среды, вызывающих повреждение структуры молекул, так и для анализа различных биосред организма, подвергшегося воздействию токсикантов. В результате может быть получена информация не только о содержании токсикантов, но и об их генетической токсичности и потенциальной опасности для последующих поколений даже при незначительном их содержании в экологических и биологических объектах.
Кроме того, сочетание активного индикаторного слоя ДНК с электрохимическим трансдьюсером позволяет использовать высокую чувствительность биологических реакций и преимущества способа детекции для изучения механизма взаимодействия ДНК-токсикант, определения количественных параметров взаимодействия.
Низкомолекулярные биологически активные вещества, в частности, ионы металлов, попадая в клетки организма, меняют структуру ДНК вплоть до ее денатурации, нарушая процессы передачи генетической информации. Оценка влияния тяжелых металлов на ДНК особенно актуальна в связи с растущим загрязнением окружающей среды, поскольку исследования показали, что образование злокачественных опухолей сопровождается увеличением содержания металлов не только в белках, но и в ДНК раковых клеток. В данном случае БС, в частности амперометрические сенсоры на основе иммобилизованной ДНК, могут служить не только для оценки токсичности различных веществ, но и новым средством экологического контроля[4,5].
Использование при лечении онкологических заболеваний фармпрепаратов на основе комплексов таких металлов, как ГЧ(П), 14(1 V), Ю1(Ш) и Си(П), которые способны, связываясь с молекулой ДНК, остановить неконтролируемое деление раковых клеток, делает электрохимические БС на основе ДНК необходимым инструментом для высокочувствительного определения онкопрепаратов в сложных многокомпонентных системах как на стадии синтеза и изучения фармакокинетики, так и в процессе лечения онкоболь-ных[6].
Изучение с помощью БС взаимодействия ДНК с высокомолекулярными биологически активными веществами, в частности с антителами (АТ), специфичными к ДНК (аутоАт), позволяет моделировать участие ДНК в иммунологических реакциях. ДНК-содержащие БС могут стать основой новых экспрессных, без дополнительного разделения компонентов, методов диагностики аутоиммунных заболеваний.
Определение самой ДНК, особенно в ее менее изученной, денатурированной форме, позволяет оценить степень тяжести заболевания и зависимость ее от различных воздействий.
Цель работы. Целью является разработка способа ковалентной иммобилизации денатурированной ДНК на нитроцеллюлозной мембране для создания амперометрического БС и его использование для изучения взаимодействия ДНК с биологически активными соединениями - эффекторами ДНК, такими как ионы тяжелых металлов, противоопухолевые препараты на основе комплексов Р^Н) и РЧ(1У), аутоантитела, с целью их определения в природных и биологических объектах.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Предложен новый способ ковалентной иммобилизации молекул ДНК, входящих в состав биочувствительной части амперометрического БС. ДНК иммобилизована в однонитевой денатурированной форме для создания новых возможностей взаимодействия эффекторов с ДНК и повышения чувстви тельности работы БС. Выявлены оптимальные условия функционирования БС (рН, температура, буферная емкость, ионная сила).
Исследована сорбционная способность свинца и кадмия по отношению к денатурированной ДНК (д-ДНК). Показана возможность определения низких содержаний ионов РЬ(И) и Сс1(П), в том числе при совместном присутствии, за счет их предварительного концентрирования на биочувствительной части сенсора.
Обнаружены каталитические волны выделения водорода в системах Р1(П)-ДНК и Р1(1У)-ДНК, которые использованы в качестве аналитического сигнала для определения содержания Р^П) и Р^1У).
На основе высокой специфичности иммунологической реакции ДНК-аутоАт стало возможным определение с помощью БС содержания высокомолекулярных эффекторов- аутоАт в широком диапазоне концентраций, что позволило проводить диагностику аутоиммунных заболеваний, характерной особенностью которых является повышенное содержание в сыворотке крови Ат к д-ДНК.
Найдены условия реактивации биочувствительной части сенсора на основе иммобилизованной д-ДНК (д-ИДНК) в зависимости от природы анализируемого объекта для многократного использования БС. Оценены значения констант связывания ДНК-аутоАТ и ДНК- ион тяжелого металла с помощью предложенного БС.
На основе ДНК-содержащего амперометрического БС разработаны методики селективного, чувствительного и экспрессного определения ионов тяжелых металлов в биологических и экологических объектах, платиносо-держащих фармпрепаратов в сыворотке крови человека, Ат алеутской болезни норок, специфичных к ДНК, в сыворотке крови животных.
На защиту выносятся:
-способ ковалентной иммобилизации д-ДНК на нитроцеллюлозной мембране путем подбора соотношения носитель - растворитель - биокомпонент для получения биочувствительной части амперометрического сенсора на основе стационарного ртутно-пленочного электрода с серебряной подложкой;
-оптимальные условия функционирования разработанного амперометрического БС (температура, рН и буферная емкость; условия реактивации биочувствительной части сенсора с целью многократного его использования;
-использование ДНК-содержащего БС для предварительного концентрирования микроколичеств ионов свинца и кадмия на биочувствительной части сенсора за счет комплексообразования ион тяжелого металла -ДНК и использование реакции комплексообразования РЬ(П)-комплексон Ш и С<1(11)-комплексон Ш для определения низких содержаний ионов РЬ(П) и С<1(11) в модельных растворах. Изотермы сорбции Ленгмюра ионов РЬ(П) и Сё(И) на д-ДНК-содержащей биочувствительной части амперометрического сенсора;
-результаты исследования электрохимического поведения комплексов В(Н) и Рг(1У) в присутствии БС на основе д-ИДНК; установление природы токов, полученных при комплексообразовании Р1(П)-ДНК и Р1(1У)-ДНК; результаты определения содержания Р1(П) и Р^У) при их совместном присутствии с использованием разработанного БС;
-возможность использования биосенсора на основе д-ИДНК для контроля протекания иммунологической реакции ДНК-аутоАт и использования комплексообразования ayToAr-Pt(II) для расширения области определяемых содержаний аутоАт;
-результаты определения констант связывания ДНК-аутоАт и ДНК- тяжелый металл с помощью разработанного амперометрического БС;
- методики индивидуального определения и определения при совместном присутствии тяжелых металлов в биообъектах и объектах окружающей среды с помощью БС на основе д-ИДНК;
- методики определения противоопухолевых препаратов цисплатина и оксоплатина в сыворотке крови;
- методики определения содержания аутоАт к ДНК в сыворотке крови с помощью БС на основе д-ИДНК для диагностики аутоиммунных заболеваний на ранних стадиях.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Международной школе по биоэлектрохимии им. Джулио Милаццо (г. Сегед, Венгрия, 1997г.), XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (г. Санкт-Петербург, 1998 г.), Поволжской региональной конференции "Физико-химические методы в координационной и аналитической химии" (Казань, 1999 г.), Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа "ЭМА-99"( г. Москва, 1999 г.), Итоговой конференции Казанского государственного университета (Казань, 2000 г).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ. Из них 3 статьи в рецензируемых научных журналах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и 25 рисунков. Работа состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы, включающего 181 ссылку.
129 ВЫВОДЫ
1. Разработан способ ковалентной иммобилизации д-ДНК на нитроцеллюлозной мембране. Нитроцеллюлозные мембраны с д-ИДНК однородны, д-ДНК сохраняет свою реакционную способность по сравнению с неиммобилизованной на 78%. Предложен амперометрический БС, состоящий из трансдьюсера - стационарного ртутно-пленочного электрода с серебряной подложкой и биочувствительной части на основе д-ИДНК. Биочувствительная часть сенсора сохраняет стабильность, реакционную способность, и воспроизводимость в работе в течение не менее 30 дней. Подобраны оптимальные условия функционирования разработанного амперометрического БС. Найдены способы реактивации биочувствительной части сенсора исходя из природы анализируемых эффекторов с ' целью многократного его использования.
2. Оценена сорбционная емкость д-ИДНК-содержащей поверхности предлагаемого БС в присутствии ионов тяжелых металлов. Выявлены различия в сорбируемости ионов РЬ(П) и Сс!(П) на биочувствительной поверхности сенсора. Изотермы сорбции этих ионов на иммобилизованной денатурированной ДНК из фосфатно-солевого буферного раствора с рН 6.7-7.3 описываются уравнениями Ленгмюра. Максимальная сорбирующая способность биочувствительной части сенсора составляет 3.3x10"6 моль (Сс1(П)) и 4.8x10"6 моль (РЬ(П)), что свидетельствует о большем сродстве ионов РЬ(Н) к д-ДНК, чем ионов Сс1(П). В соответствии с этим рассчитанные по методу Скэтчарда константы связывания ионов металлов с д-ДНК равны (1.2±0.3)х106 л/моль и (0.6±0.2)х105 л/моль для РЬ(П) и С<1(П) соответственно.
3. Установлены оптимальные условия определения РЬ(П) и Сс1(И) в модельных растворах в результате предварительного концентрирования на биочувствительной части сенсора в виде комплексов РЬ(И) и Сс1(П) с д-ИДНК с последующим десорбированием в виде их комплексонатов, токи восстановления которых позволяют определять кадмий и свинец с пределом обнаружения 1х10"9 моль/л и 3x10"10 моль/л соответственно.
4. Обнаружена каталитическая активность по отношению к выделению водорода на электроде Р1(П) и Р1(1У) в присутствии д-ИДНК в составе БС. Доказана природа аналитического сигнала, определены факторы, влияющие на его величину, показана возможность его использования для селективного определения содержания Р1(П) и Р1(1У) в анализируемых растворах. Выбраны условия определения противоопухолевых препаратов на основе Р1(П) и Р1:(1У) цисплатина и оксоплатина. Пределы обнаружения фармпрепаратов составляют 6хЮ"10 моль/л (оксоплатин) и 5х10"9 моль/л (цисплатин) в присутствии марганца, железа, меди и цинка.
5. Амперометрический БС на основе д-ИДНК использован для контроля прохождения иммунохимической реакции д-ДНК с аутоАт. Использование БС в иммунохимии основано с одной стороны, на аналитическом сигнале, обусловленным выделением каталитических токов выделения водорода в результате образования каталитически активного комплекса Р1(П)-д-ДНК, а с другой стороны, на уменьшении данного аналитического сигнала, происходящем вследствие экранирования части каталитически активных комплексов ДНК-Р1(П). Экранирование наблюдается при введении в эту систему антител, специфичных к ДНК, которые образуют иммунокомплексы ДНК-Р1(П)-аутоАт. Определены константы связывания при взаимодействии аутоантител с д-ИДНК. Показано, что комплексы ДНК-аутоАт обладают достаточной прочностью, константы связывания для двух видов аутоАт
131 составляют 1.25x10 л/моль и 2.5x10 л/моль. Показана возможность селективного, быстрого, высокочувствительного определения компонентов биоспецифического взаимодействия.
6. На основе предложенного амперометрического д-ИДНК-содержащего БС разработаны методики определения низко- и высокомолекулярных эффекторов ДНК в биологических объектах и объектах окружающей среды. На основании предложенных методик было проведено определение содержания ионов РЬ(П) и Сё(П) в сыворотках крови, молоке, а также в образцах воды до и после очистки с помощью производственного фильтра, онкопрепарата цисплатина в сыворотке крови, содержания аутоАт в сыворотке крови животных, пораженных алеутской болезнью. Сравнением результатов, полученных при проведении анализа по предложенным методикам с участием д-ИДНК-содержащего БС, с результатами контрольных методов, а также методом удвоения массы пробы и введения добавки определяемого компонента оценена правильность аналитических методик.
1. Будников Г.К. Современное состояние и перспективы развития вольтамперометрии // Ж. аналит. химии. 1996.- Т. 51, № 4. С. 374-383.
2. Palecek Е., Jelen F., Teijeiro С. Biopolymer modified electrodes in the voltammetric determination of nucleic acids and protein at the submicrogram level// Anal. Chim. Acta.-1993.-V.273, № 1-2.-P. 175-186.
3. Металлокомплексы нуклеиновых кислот в растворах/ Ю.П. Благой, В.Н. Галкин, Г.О. Гладченко.- Киев: Наукова думка, 1991.- 372 с.
4. DNA electrochemical biosensor for environmental monitoring/ J. Wang, G. Rivas, X.H. Cai, E.Palecek// Anal. Chim. Acta.-1997.- V. 347, № 1-2.- P. 1-8.
5. Brett A.M.O., Serrano S.H.R., La-Saalea М.А/Applications of an electrochemical DNA-biosensor to environmental problems// Biosensor for direct monitoring on environmental pollutants in field, kluwer academic publishers.-1998.-P. 78-86.
6. Kaufftnann J.M., Vire J.C. Pharmaceutical and biomedical applications of electroanalysis// Anal. Chim. Acta.-1997.- V. 347, № 1-2.- P. 1-8.
7. Anderson C.F., Record M.T., Hart P.A. Sodium-23 NMR studies of cation-DNA interaction// Biophys. Chem.-1978.-V. 7, № 4,- P. 301-316.
8. Касьяненко H.A., Дьяконова H.E., Фрисман Э.В. Исследование молекулярного механизма взаимодействия ДНК с двухвалентными ионами// Молекуляр. биология. -1989.-Т. 23, № 4.-С. 835-841.
9. Неорганическая биохимия/ Под ред. Эйхгорна Г. Т. 2.- М.: Мир, 1978.736 с.
10. Яцимирский К.Б., Крисс Е.Е., Ахрамева Т.И. Изучение комплексообразования ионов меди с дезоксирибонуклеиновой кислотой// Докл. АН СССР. 1966.- Т. 168, № 4.-С. 840-843.
11. Effect of metal ions on DNA conformationand their biologicalaction on genetic structures of cells/ S.V. Kornilova, Yu.P. Blagoy, I.P. Moskalenko e.a.// Stud. Biphys.-1988.-V. 123, № 2.-P. 77-84.
12. Zimmer Ch. Interaction of zinc(II) ions with native DNA// Ibid.-1973.-V. 35, №2.-P. 115-121.
13. Брегадзе В.Г. Интерпретация ультрафиолетовых дифференциальных спектров ДНК в комплексе с некоторыми ионами первого переходного ряда// Биофизика.-1974.-Т. 19, № 1.-С. 179-181.
14. Petri I., Forster W., Lober G. Application of matrix rank analysis to the binding of copper(H) ions with DNA and acridine orange with a polyphosphate// Stud. Biophys.-l974.-V. 45, № l.-P. 61-74.
15. Fritzsche H. New results about the copper(II)-DNA complex// Ibid.-1970.-V. 21/22, №5.-P. 315-320.
16. Sissoeff J., Grisvaid J., Guite E. Studies of metal ions-DNA interactions: Specific behaviour of reiteractive DNA sequences// Progr. Biophys. and Mol. Boil.-1976.-V. 31, № 2.-P. 165-199.
17. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых ксилот. Пер. с англ. Л.В. Малининой и др., под. ред. Вайнштейна.-М.: Мир.-1987.-584 с.
18. Kantz G.P.P., Kotowyez G.A. A nuclear magnetic resonance relaxation time studyof the manganese(II) mosine-5'-triphosphate complex in solution// Biochemistry.-1975. V. 14, P. 4144-4150.
19. Андроникашвили Э.Л. Малигнизация и изменение некоторых физико-химических свойств биомолекул и надмолекулярных структур// Биофизика.-1987.-Т. 32, № 5.-С. 782-799.
20. Eichgorn G.L., Shin Y. A. Interaction of metal ions with polynucleotides and related compounds. The relative effect of various metal ions on DNA helity// J. Amer. Chem. Soc.-1968.-V. 90, № 26.-P. 7323-7328.
21. Studies of formation of bivalent copper complexes with native and denatured DNA/ V.A. Sorokin, Yu.P. Blagoi, V.A. Valeev e.a.// J. Inorg. Biochem.-1987.-V. 30, №2.- 87-101.
22. Venner H., Zimmer Ch. Studies on nucleic acids changesin the stability of DNA secondary structure by interaction with divalent metal ions// Biopolymers.- 1966.-V. 4, № 2.-P. 321-335.
23. Eichhorn G.L., Clark P., Becker E.D. Interactions of metal ions with polynucleotides and related compounds. The binding of соррег(П) to nucleosides, nucleotides and deoxyribonucleic acids// Biochemistry.- 1966.-V. 5, № 2,- P. 246-253.
24. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия: в 3 т. Т. 3. Пер. с англ. под ред. А. А. Богданова, Ю.С. Лазуркина, М.Д. Франк-Каменецкого. М.: Мир, 1985.-536 с.
25. Venner H., Zimmer Ch. Studies on nucleic acids changesin the stability of DNA secondary structure by interaction with divalent metal ions// Biopolymers.- 1966.-V. 4, № 2.- P. 321-335.
26. Magnesium ion effect on the helix-coil transition of DNA/ Yu.P. Blagoi, V.A. Sorokin, V.A. Valeev e.a. // Biopolymers.- 1978.-V. 17, № 5.- P. 1103-1118.
27. Schreiber J.P., Daune M. Interaction des ions métalliques avec de DNA. Fixation de l'ion cuivrique sur le DNA// Biopolimers.-1969.-V. 8, № 1.-P. 139-152.
28. DNA-copper(II) complex and the DNA-conformation/Ch. Zimmer, G. Luck, H. Fritzsche e.a.// J. Mol. Biol.-1983.-V. 169, № l.-P. 217-234.
29. Howard F.B., Miles H.T. Poly(inosinic acid) helices: essential chelation of alkali metalions// Biochemistry.- 1982.-V. 21, № 26,- P. 6736-6745.
30. Fiol J.J., Terron A., Moreno V. Some new derivatives of Ni(D) witn uracil, uridine and nucleotides// Inorg. Chem. Acta.-1986.-V. 125, № 3.- P. 159-166.
31. Fiol J.J., Tenon A., Moreno V. Some new derivatives of Ni(H) witn uracil, uridine and nucleotides// Inorg. Chem, Acta.-1986.-V. 125, № 3.- P. 159-166.
32. Kim S.-H., Martin R.B. Binding sites and stabilities of transition metal ions with nucleosides and related ligands// Inorg. Chem. Acta.-1981 .-V. 91, № 1 P. 19-21.
33. Мартин Р.Б., Мариам Я.Х. Взаимодействие между ионами металлов и нуклеиновыми основаниями, нуклеозидами и нуклеотидами в растворах// Ионы металлов в биологических системах.-М.: Мир, 1982.-Т. 3.1. С. 53-103.
34. Pecorato V.L., Hermes J.D., Cleland W.W. Stability constants of Mg2+ and Cd2+ complexes of adenine nucleotiges and thionucleotides and rate constants for formation and dissociation of Mg-ATP and Mg-ADP// Biochemistry.-1984.-V. 23, № 22.- P. 5262-5271.
35. Osipov A.N., Sypin V.D., Polsky O.G. DNA-protein cross-links in leukocytes of mice induced by Zn(II), Cd(II) and Pb(II)//Biochemistry.-1997.-V.62, N.6.-P. 681-683.
36. Clement R.M., Sturn J., Daune M.P. Interaction of metallic cations with DNA. Specific binding of Mg2+ and Mn2+// Biopolymers.- 1973.-V. 12, № 2.-P. 405-421.
37. Fritzsche H., Arnold K., Krusche R. Interaction of DNA and metal ions. A13C-NMR study of some nucleobides and nucleotides adding Cu(II) and Mn(II) ions// Stud. Biophys.-1974.-V. 45, № l.-P. 131-143.
38. Chen M.S. Complexes of divalent metal ions with nucleosides and nucleotides// Inorg. Perspect. Biol. Med.-1983.-V. 1, № 3.-P. 217-222.
39. Guanine complexes with first row transition metal perchlorates/Ch. M.Mikulski, L. Matucci, Y. Smich e.a.// Inorg. Chem. Acta.-1983.-V. 80, № 3.-P. 127-133.
40. Granol J., Keams D.R., Feigon J. Interactions of DNA with divalent metal ions// Biopolymers.- 1982.-V. 21, № 1P. 203-232.
41. Nucleoside complexing. A raman and 13-C NMR spectroscopic study of the binding of hard and soft metal species// J. Amer. Chem. Soc.-1980.-V. 102, №3.- P. 916-924.
42. Shirotake S. Complexes between nucleic acid bases and bivalent metal ions. Synthesis and spectroscopic analysis of adenine zinc chloride and calcium chloride complexes// Chem. Pharm. Bull.-1980.-V. 28, № 6.-P. 1673-1682.
43. Sander C., Tso P.O.P. Interaction of nucleic acids. Binding of magnesium ions by nucleic acid//J. Mol.Bioi. -1971.-V. 55, № 1- P. 1-21.
44. Крисс E.E., Яцимирский К.Б. Взаимодействие нуклеиновых кислот с металлами// Успехи химии.- 1966.- Т. 35, № 2.- С. 349-365.
45. Bregadze V.G., Berhiashvili G.N., Gelagutashvili E.S. RF inductivity coupled plasma spectrometry of DNA-metal complexes': Binding constants and water desorptionkinetics// Stud. Biophys.-1984.-V. 101, № l.-P. 151-152.
46. Касьяненко H.A., Дьяконова H.E., Фрисман Э.В. Исследование молекулярного механизма взаимодействия ДНК с двухвалентными ионами// Молекуляр. биология. 1989.-Т. 23, № 4.-С. 835-841.
47. Double helical DNA: Conformations, physical properties and interactions with ligands/M.T. Record, S.I. Mazur, P. Melanson e.a.// Ann. Rev. Bichem.-1981 V. 50.-P. 997-1024.
48. Clement R.M., Sturn J., Daune M.P. Interaction of metallic cations with DNA.a . /у ,
49. Specific binding of Mg and Mn // Biopolymers.- 1973.-V. 12, № 2.-P. 405-421.
50. Magnesium ion effect on the helix-coil transition of DNA/ Yu.P. Blagoi, V.A. Sorokin, V.A. Valeeve.a. //Biopolymers.- 1978.-V. 17,№ 5.-P. 1103-1118.
51. Shin Y. A. Interaction of metal ions with polynucleotides and related compounds. Effect of divalent metal ions on the conformational change of polyribonucleotides// Biopolymers.- 1973.-V. 12, № 11.- P. 2459-2475.
52. Thermodynamics and kinetics of the interaction of соррег(П) ions with native DNA/ W. Forster, E. Bauer, H. Schutz// Biopolymers.- 1979.-V. 18, № 3.- P. 625-661.
53. Krakauer H. A thermodynamic analysis of the influence of simple mono-and divalent cations on the conformational transitions of polynucleotide complexes// Biochemistiy.-1974.-V. 13, № 12.-P. 2579-2589.
54. Благой Ю.П., Сорокин B.A., Валеев B.A. Спектральное исследование связывания оснований ДНК с ионами магния и кальция// Молекуляр. биология. 1980.-Т. 14, № З.-С. 595-605.
55. Яцимирский К.Б., Крисс Е.Е., Ахрамева Т.И. Изучение комплексообразования ионов меди с дезоксирибонуклеиновой кислотой// Докл. АН СССР. 1966.- Т. 168, № 4.-С. 840-843.
56. Willemsen A.M. Van Os G.A.J. Interaction of magnesium ions with poly A and poly U// Biopolymers.-1971.-V. 10, № 6.-P. 945-960.
57. Studnikova M., Klukomova H., Kovar J. Interaction of poly A with the cations of alkaline earth metals// Stud. Biophys.-1982.-V. 92, № 2.-P. 97-98.
58. Porschke D. Thermodynamic and kinetic parameters of ion condensation to polynucleotides. Outer sphere complex formed by Mg(II) ions// Biophys. Chem.-1976.-V. 4, № 4.-P. 383-394.
59. Яцимирский К.Б., E.E. Крисс, В.Л.Гвяздовская Константы устойчивости комплексов металлов с биолигандами.-Киев: Наукова думка.-1979.-228 с.
60. Tagui Khan, Martell А.Е.Thermodynamic quantities associated with the interaction of adenosinediphosphoric and adenosinemonophosphoric acids// J. Amer. Chem. Soc.-1964.-V. 86, № 19.-P. 4325-4329.
61. Cooperative disordering of singlestranded polynucleotides thruugh copper crosslinking/J.M. Rifkind, Y.A. Shin, J.M. Heim e.a.// Biopolymers.-1976.-V. 15, № 9.-P. 1879-1902.
62. Тихонова Л.И., Русак А.Ф. Изучение взаимодействия дезоксирибонуклеиновой кислоты с некоторыми ионами металлов методом кругового дихроизма// Ж физ. химии.-1978.-Т. 52, № 10.-С. 2683-2685.
63. Cohn М., Danchin A., Grunberg-Manago М. Proton magnetic relaxation studies of manganous complexes of transfer RNA and related compounds// J. Mol. Biol.-1969.-V. 39, № l.-P, 199-217.
64. Cohn M., Danchin A., Grunberg-Manago M. Proton magnetic relaxation studies of manganous complexes of transfer RNA and related compounds// J. Mol. Biol.-1969.-V. 39, № l.-P. 199-217.
65. Enmanji K. Proton, phosphorus and cation nuclear magnetic relaxation studies on the interaction of polyriboadenylic acid with Mn(II)// J. Polym. Sci.-1987.-V. 22. № 3.-P. 883-895.
66. Крисс E.E., Яцимирский К.Б. Исследование' взаимодействия ионов меди с компонентами нуклеиновых кислот// Ж. неорг. химии.-1968.-Т. 13, № 9.-С. 2370-2376.
67. Jordan F., MeFarguhar B.Y. Evidence for of guanosine calcium(II) complex. A specific nucleoside metal interaction// J. Amer. Chem. Soc.-1972.-V. 94, № 18,- P. 6557-6558.
68. Захаренко E.T., Мошковский Ю.Ш. Связывание ионов меди и кадмия дезоксирибонуклеиновой кислотой и продуктами ее деградации// Биофизика,- 1966.- Т.9, № 6,- С. 945-950.
69. Исследование влияния ионов двухвалентной меди на конформацию полирибоадениловой кислоты/В.А. Сорокин, Ю.П. Благой, В.А. Валеев и др.// Молек. биол.-1982.- Т. 16, № 2.-С. 369-378.
70. Франк-Каменецкий М.Д. Флуктуационная подвижность ДНК// Мол. Биол.-1983.-Т. 17, № З.-С. 639-652.
71. Baxter-Gabbard К., Freser D. The effects of cations and diamines on the viscosity of T-2 DNA// Biopolimers.-1974.-V. 13, № l.-P. 207-216.
72. Влияние ионной силы на термодинамическую жесткость молекулы нативной ДНК в водных и водно-органических растворителях/Слоницкий С.В., Фрисман Э.В., Валеев А.К., Ельяшевич A.M.// Мол. биол.-1983.-Т. 14, № З.-С. 496-506.
73. Interaction of aluminium species with deoxyribonucleic acid/ Karlik S J., Eichhorn G.L., Lewis P.N., Crapper D.R. // Biochemistry.- 1980.-V. 19, № 26.-P. 5992-5998.
74. Благой Ю.П., Сорокин B.A., Валеев B.A. Спектральное исследование связывания оснований ДНК с ионами магния и кальция// Молекуляр. биология. 1980.-Т. 14, № З.-С. 595-605.
75. Lopez-Grtal P., Souza V., Bucio L. DNA damage produced by Cd(II) in a human fetal hepatic cell line// Mutat. Res.-1999.-V. 439, № 2.-P. 301-306.
76. Cai Y., Zhuang Z. DNA damage in human peripheral blood lymphocyte caused by Ni(II) and Cd(II)// Mutat. Res.-1999.-V.33/№ 2.-P.75-77.
77. Devaux A., Flammarion P., Bernardon V. Monitoring of the chemical pollution of the river Rhone through measurement of DNA damage and cytochrome P4501A induction in chub// Mar. Environ. Res.-1998.-V.46, № 1-5.-P.257-262.
78. Rosenberg В., VanCamp L., Trosko J. E., Mansour V.H. Platinum compounds: a new class of potent antitumor agents// Nature.-1969.-V. 222,- P. 385-386.
79. Antitumor activity of 1,2-diaminocyclohexane platinum complexes against Sarcoma-180 ascites form/ Y. Kidani, K. Inagakijigo M e.a.// J. Med Chem-1978.-V.21.-P. 1315-1318.
80. Elder R.C., Eidsness M.K. Synchrotron X-ray studies of metal-based drugs and metabolites// Chem. Rev.-1987.-V. 87, № 5.-P. 1035-1046.
81. Noji M., Okamoto K., Kidani Y. Relation of conformation to antitumor activity of platinum(II) complexes of 1,2-cyclohexanediamine and 2-(ami№ethyl)cyclohexylamine isomers against Leukemia P 388// J. Med. Chem.-1981.-V. 24.-P. 508-515.
82. Sunthesis and antitumor activity of new platinum complexes/ D.B. Brown, A.R.Khokhar, M.P. Hacker e.a.// J. Med Chem.-1982.- V. 25.- P. 952-956.
83. Ring-opened adducts of the anticancer drug carboplatin with sulfur amino acids/K. J. Barnham, M.J. Djuran, P.S. Murdoch e.a.// Inorg. Chem.-1996.-V. 35, № 4.-P. 1065-1072.
84. Kopf-mater P., Kopf H. Non-platinum group metal antitumor agents: history, current status, and perspectives// Chem. Rev.-1987.-V.87, № 5.-P.1137-1152.
85. Gzols R.F., Young R.C. Chemotherapy of ovarian cancer// Semin. Oncol. -1984.-V. 11,-P. 251-263.
86. Scovell W.M., O'Connor T. Interaction of aquated cis-(NH3)2Ptn. with nucleic acid constituents. 1. Ribonucleosides//J. Amer. Chem. Soc.-1977.-V. 9, № 1.-P. 120-126.
87. Lin X.J., Kim H.K., Howell S.B. The role of DNA mismatch repair in cisplatin mutagenicity//J. Inorg. Biochem. -1999.-V.77, № 1-2.-P. 89-93.
88. Jamieson E.R., Lippard S.J. Structure, recognition, and processing of cisplatin-DNA adducts// Chem. Rev. -1999.-V. 99, № 9.-P. 2467-2498.
89. Bowler B.E., Hollis S., Lippard S.J. Synthesis and DNA binding and photonicking properties of acridine orange linked by a polymethylene tether to (1,2-diaminoethane)dichloroplatinum(II)// J. Amer. Chem. Soc.-1984.-V.106, № 20.-P. 6102-6104.
90. Kim D.K., Kim G., Gam J. Synthesis and antitumor Activity of a series of 2-substitoted-4,5-bis(aminoethyl)-l,3-dioxolane.platinum(II) Complexes// J. Med. Chem.-1994.-V. 37, № 10.- P. 1471-1485.
91. Стеценко А.И., Преснов M.A., Коновалова A.H. Химия противоопухолевых комплексных соединений платины// Успехи химии.-1981.-Т. 50, №4. С.665-669.
92. Platinum(II) complexes of dipyridophenazine as metallointercalators for DNA and potent cytotoxic agents against carcinoma cell lines/C.M. Che, M.S. Yang, K.H. Wong e.a.// Chem.Eur. J.-1999.-V. 5, № 8.-P. 3350-3356.
93. Wakelin L.P.G., Waring M.J. Kinetics of drug-DNA interaction. Dependence of the binding mechanism on structure of the ligand// J. Mol. Biol.-1980.-V. 144,-P. 183-214.
94. Enantiomeric ruthenium(II) complexes binding to DNA: binding modes and enantioselectivity/ J.D. Liu, B.H.Ye, O.L. Zhang e.a.// J. Biol. Inorg. Chem.-2000.-V. 5, № 1.-P. 119-128.
95. The structure of drug-deoxydinucleotide phosphate complex. Generalised conformational behavior of intercalation complexes with RNA and DNA fragments. Nucl. Acids. Res.-1980.-V. 8, № l.-P. 85-97.
96. Millard M.M., Maquuet J.P., Theophanides T. X-ray photoelectron spectroscopy of DNA Pt complex. Evidence of 0(6) (Gua) • N(7) (Gua) chelation of DNA with cis-dichlorodiammine platinum (II)// Biochim. Biophys. Acta.-1975.-V. 402, № 1,- P. 166-170.
97. Keinwachter V. Interaction of platinum (II) coordination complexes with deoxyribonucleic acid// Stud. Biophys.-l 978.-V. 73, № 1.- P. 1-17.
98. Mansy S., Rosenberg В., Thomson A.J. Binding of cis- and trans-dichlordiamineplatinum to nucleotides. I. Location of the Binding Sites//!. Am. Chem. Soc.-1973.-V. 95, № 5.- P. 1633-1640.
99. Lippard S.J. Platinum complexes: probes of polynucleotide structure and antitumor drugs// Acc. Chem. Res.-1978.-V. 11,- P. 211-217.
100. Chu C.Y.H., Duncan R.E., Tobias R.S. Heavy metal nucleotide interactions// Inorg. Chem.-1977.-V. 16. -P. 2625-2636.
101. Sherman S.E., Lippard S.J. Structural aspects of platinum anticarcer drug interactions with DNA//Chem. Rev.-1987.-V. 87,№5.-P. 1163-1181.
102. Стеценко А.И., Яковлев К.И., Дьяченко C.A. Комплексные соединения платины(П) с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями и их нуклеозидами// Успехи химии.-1987.-Т. 56, № 9.- С. 1533-1563.
103. ИЗ. Моноядерные катионные комплексы платины(П) с производными цитозина и изоцитозина/ Яковлев К.Й., Лапина С.Ф., Стеценко А.И., Алексеева Г.М.// Изв. вузов. Химия и химич. технол.-1996.-Т. 39, № 3,-С. 75-78.
104. Zaludova R., Kleinwachter V., Brabec V. The effect of ionic strength on melting of DNA modified by platinum(II) coplexes// Biophys. Chem.-1996.-V. 60, № 3. P. 135-142.
105. Исследование парамагнитного олигомера платины с гуанином масс-спектрометрическим методом бомбардировки быстрыми атомами/ И.И. Волченскова, С.А. Шалимов, Л.В. Кейсевич и др.// Ж. структур, химии.-1994.-Т. 35, № 4.-С. 117-122.
106. Crystal and molecular structure of cis-Pt(NH3)2(Gua)2.Cl3/2(C104)i/2x7H20 and anticancer activity of cis-[Pt(NH3)2(PyO)2jCl2 comlexes/R.E. Cramer, P.L. Dahlstrom, M.J.T. Seu e.a.//Inorg. Chem.-1980.-V. 19, № l.-P. 148-154.
107. Marcelis A.T.M., Kralingen C.G., Redijk J. The interaction of eis- and trans-diammineplatinumcompounds with 5-guanosine monophosphate and 5-deoxyguanosine monophosphate. A proton NMR investigation// J. Inorg. Biochem.-1980.-V. 13, № 1-2.-P. 213-222.
108. Solid state structure, susceptibility, and single crystal ESR properties of cis-diammineplatinum a-pyridine blue/ J.K. Borton, DJ. Szalda, H.N. Rabinotitz e.a.// J. Am. Chem. Soc.-1979.-V.101, № 6.- P. 1434-1441.
109. Физико-химические свойства и строение неэлектролитных комплексов платины (П) с аденином и аденозином/ А. И. Стеценко, И.И. Волченкова, Е.С. Дмитриева и др.// Коорд. химия.-1980.-Т. 6, № 9.- С. 1455-1462.
110. Физико-химические свойства и строение неэлектролитных комплексов платины (II) с аденином и аденозином/ А. И. Стеценко, И.И. Волченкова, Е.С. Дмитриева и др.// Коорд. химия.-1980.-Т. 6, № 9.- С. 1455-1462.
111. Scovell W.M., O'Connor Т. Interaction of aquated cis-(NH3)2Ptn. with nucleic acid constituents. I. Ribonucleosides// J. Am. Chem. Soc.-1977.-V. 99, № l.-P. 120-126.
112. Исследование противоопухолевой активности комплексных соединений платины(1У)/ М.А. Преснов, Н.Н. Желиговская, А.В. Бабков и др.//ДАН CCCP.-1976.~T. 229, № 4.-С. 226-229.
113. DNA interactions of antitumor platinum(IV) complexes/ Novakova O, Vrana O, Kiseleva V.I., Brabec V.// Eur. J. Biochem.-1995.-V. 228, № 3.-P. 616-624.
114. Unusual Four-membered chelate rings of Pt™ with a cytosine nucleobase/ Schollhorn H., Reyerle-Pfiiur R., Thewalt U., Lippert B. // J. Am. Chem. Soc.-1969.-V.91, № 11,- P. 2895-2902.
115. Young T.S., Kim S.H., Modrich P. Preliminary X-ray diffraction studies of ecory restriction endonuclease-DNA complex//J. Mol. Biol.-1981.-V. 145, № 2.-P. 607-610.
116. Meperson A., Jurnak F., Wang A. The structure of the gene 5 DNA unwinding protein and its complexes with oligodeoxynucleotides by X-ray diffraction//! Biophys.-1980.-V. 32, № l.-P. 155-173.
117. Hyppel P.H., Meghee J.D. DNA-protein interactions//Rev. Biochem.-1972.-V.41.-P.231-245.
118. Lancelot G., Mayer R., Helene C. Conformational study of the dipeptidearginylglutamic acid and of its complexwithnucleic bases// J. Amer. Chem. Soc.-1979.-V. 101.-P. 1560-1576.
119. Gresh N., Pullman B. A theoretical study of the intercalationof guanine and cytosine with specific amino acid chains// Biochem. Biophys. Acta.-1980.-V. 608, № l-P. 47-63.
120. Брусков В.И. Об узнавании оснований нуклеиновых кислот аминокислотами и пептидами с помощью водородных связей// Мол. биол.-1975, Т. 9, № 1 .-С. 34-39.
121. Narayanan P., Bennan Н, Rousseau R. Model compounds for protein nucleic acid interactions//J. Amer. Chem. Soc.-1976.-V. 98.-P. 8472-8475.
122. Herriott J.R., Camerman A., Deranleau D.D., Crystal structure of l-(2-indol-3-yletyl)-3-carbamidepyridinium chloride, an intramolecular model of the nicotinamide adenino dinucleotide-tryptophan charge-transfer complex//
123. J. Amer. Chem. Soc.-1974.-V. 96.-P. 1585-1589.
124. Palecek E. Electrochemical behaviour of biological macromolecules// Bioelectrochem.- 1986.- V. 15, № 1-2.- P. 275-295.
125. Barker G. Electron exchange between mercuiy and denatured DNA strands //J. Electroanal. Chem.- 1986.- V. 214.- P. 373-390.
126. Palecek E. New trends in electrochemical analysis of nucleic acids//J. Ellectroanal. Chem.- 1988.- V. 254.- P. 179-193.
127. Palecek E., Jelen F., Teijeiro C. Biopolymer-modified electrodes in the voltammetric determination of nucleic acids and proteins at the submicrogram level//AnalyticaChimica Acta.- 1993.-V.273.-P. 175-186.
128. Sistare M.F., Holmberg R. Electrochemical studies of polynucleotide binding and oxidation by metal complexes: effects of scan rate, concentration and sequence// J. Phys. Chem.-1999.-V. 103, № 48.-P.10718-10728.
129. Ontko А. С., Armistead P., Kircus S. Electrochemical detection of single-stranded DNA using polymer-modified electrodes// Inorg. Chem.-1999.-V.38, №8,-P. 1842-1846.
130. Jelen F., Karlovsky P., Palecek E. Osmium tetroxide reactivity of DNA bases— in nucleotide sequencing and probing of DNA structure// Gen. Physiol. Biophys.-1991.-V.10 P. 461-473.
131. Езерская H.A., Киселева Й.Н. Каталитические полярографические токи в растворах комплексов платиновых металлов и их применение для определения микроконцентраций этих элементов// Ж. аналит. химии. 1984.- Т. 39, № 9,- С. 1541-1549.
132. Езерская Н.А. Вольтамперометрическое определение платины в лекарственных препаратах, биоактивных соединениях и биообъектах(обзор)// Хим. фарм. ж.-1996.-Т. 30, № 6.- С. 57-61.
133. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Т. Биодатчики на основе нуклеиновых кислот// ВИНИТИ Итоги науки и техники. Биотехнология.-1990,-Т. 26. -С. 134-161.
134. Биосенсоры: основы и приложения/ под ред. Тернера Э. и др.-М.: Мир, 1991.-615 с.
135. Скуридин С.Г. Биодатчики на основе жидкокристаллических дисперсий ДНК//Изв. АН СССР. Сер. физ.-1991,- Т. 55, Ш 9.- С. 1817-1824.
136. Pandey Р.С., Wectall Н.Н. Evanescent fluorobiosensor for the detection of polyaromatic hydrocarbon based on DNA intercalation// Appl. Biochem. and Biotechnol А.-1995,- V. 55, № 2.- P. 87-94.
137. Morgan C.I., Nowman D.J., Pric Ch.R. Immunosensors: Technology and opportunities in laboratory medicine// Clin. Chem.-1996.- V. 42, № 2.- P. 193-209.
138. Marco M.P., Bareclo D. Enviromental applications of analytical biosensors// Meas. Sci. and Tachnol.-1996.- V. 7, № 11.- P. 1547-1562.
139. Weetall H.H., Kishore R., Heimerson K. Optical trap for the detection and quantification of subzaptomolar quantities of analytes// NATO ARW Smolenice.-1997.-P. 18-20.
140. Krull U., Piunno P., Henke L. Towards a fiber-optic DNA biosensor for detection E. Coli// NATO ARW Smolenice.-1997.-P. 25-26.
141. Danielson B., Mecklenburg M. Application of a nucleic acid based optical bioprobe for environmental and pharmaceutical analysis// Biosensor for direct monitoring on environmental pollutants in field, kluwer academicpublishers. -1998.-P. 87-95.
142. Takagi M., Maeda M., Nakano K. DNA as electrochemical analyte and as electrochemical sensory material// Asianalysis III the third Asion Conference on Analytical Scienes.-1997.-P. 21.
143. Wang J., Palecek E., Nielsen P.E. Peptide nucleic acid probes for sequence-specific DNA biosensors// J. Amer. Chem. Soc.-1996.- V. 33, № 21.- P. 76677670.
144. Detection of point mutation in the p53 gene using a peptide nucleic acid biosensor/ J. Wang, G. Rivas, X.H. Cai, E.Palecek// Anal. Chim. Acta.-1997.-V. 344, №1-2.-P. 111-118.
145. Fojta M., Dofikova R., Palecek E. Determination of traces of RNA in submicrogram amouns of single- or double stranded DNAs by means of nucleic acid-modified electrodes// Electroanalysis.-1996.- V. 8, № 5.-P. 420-426.
146. Jelen F., Tomschik M., Palecek E. Adsorptive stripping square-wave voltammetry of DNA// J. Electroanal. Chem.-1997.-V. 423, № 1-2,-P. 141-148.
147. Electrochemical analysis of formation of polynucleotide complexes in solution and at electrode surfaces/ X.H. Cai, G. Rivas, H. Shirashi, E.Palecek/7 Anal. Chim. Acta.-1997.- V. 344, № 1-2,- P. 65-76.
148. New variants of enzyme immunoassay of antibodies to DNA/ S.S. Babkina, E.P. Medyantseva, H.C. Budnikov, M.P. Tyshlek// Anal. Chem.-1996.- V. 68, № 21.-P. 3827-3831.
149. Palecek E. From polarography of DNA to microanalysis with nucleic acid-modified electrodes// Electroanalysis.-1996.- V. 8, № 1.- P. 7-14.
150. Palecek E., Fojta M., Tomschik M. DNA-modofied electrodes: new tools in molecular recognition, detection of DNA damace and analysis of environmental pollutants// NATO ARW Smolenice.-1997.-P. 82-83.
151. DNA electrochemical biosensor for environmental monitoring/ J. Wang, G. Rivas, X.H. Cai, E.Palecek// Anal. Chim. Acta.-1997.- V. 347, № 1-2.- P. 1-8.
152. Adsorption and detection of peptide nucleic acide at carbon paste electrodes/ J. Wang, G. Rivas, X.H. Cai, E.Palecek // Electroanalysis.-1996.- V. 9, № 2.1. P. 120-124.
153. Wang J. DNA electrochemical biosensor for environmental monitoring// NATO ARW Smolenice.-1997.-P. 27.
154. Brett A.M.O., Serrano S.H.R., La-Saalea M.A. Applications of an electrochemical DNA-biosensor// NATO ARW Smolenice.-1997.-P. 28.
155. Brett A.M.O., Serrano S.H.R., La-Saalea M.A. Applications of an electrochemical DNA-biosensor to environmental problems// Biosensor for direct monitoring on environmental pollutants in field, kluwer academicpublishers.-1998.-P. 78-86.
156. Fojta M., Palecek E. Supercoiled DNA modified mercury electrode: A highly sensitive tool for the detection of DNA damage// Anal. Chim. Acta.-1997,- V. 342, №1.-P. 1-12.
157. Jelen F., Fojta M., Palecek E. Voltammetry of native doublestranded, denatured and degraded DNAs// J. Electroanal. Chem.-1997.-V. 427, № 1-2.-P. 49-56.
158. Wang J., Cai X., Jonsson C. Trace measurements of RNA by potenciometric stripping analysis at carbon paste electrodes// Anal. Chem.-1995.- V. 67, P. 4065-4070.
159. Некоторые вопросы токсичности ионов металлов/Ред Зигель X., Зигель А.- М.: Мир, 1993.-С. 222-227.
160. Гольдфарб Д.М., Замчук Л.А. Антитела к нуклеиновым кислотам. М.: Наука, 1975.-С.5-249.
161. Smith D. I., Elving P. J. Electrochemical Reductions of purine, adenine and related compounds: polyarograhpy and macroscale electrolusis// J. Amer. Chem Soc.-1962.-V.84, № 4.-P. 1412-1419.
162. Smith D. I., Elving P. J. Electrochemical Reductions of pirtimidine, cytosine and related compounds: polyarograhpy and macroscale electrolusis// J. Amer. Chem Soc.-1962.-V.84, № 7.-P. 2441-2447.
163. Эткинс П. Физическая химия. Том 2. М.: Мир.-1980.-С. 492-521.
164. Машковский В.Б. Лекарственные средства.- М.: Медицина, 1993.-С. 221-230.
165. Дятлова Н.М., Темкина В.Я., Колпакова И.Д. Комплексоны М.: Химия, 1970,-416 с.
166. Зуев В.А. Медленные вирусные инфекции человека и животных.- М.: Медицина, 1988. 256 с.
167. Теория и практика иммуноферментного анализа/Егоров A.M., Осипов А.Н., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М.-М.: Высшая школа.-1991.-288с.
168. Варфоломеев С. Д. Биокинетика. М.: ФАИР-Пресс, 1999. 720 с.
169. Чарыков А.К. Селективность методик химического анализа и способы ее численной оценки// Ж. аналиг. химии.-1984. -Т. 39, № 9.-С.1708-1714.
170. Вербов В.Н. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа/ЛГвердофазный иммуноферментный анализ: Труды ин-та им. Пастера.-Л.: Изд-во ин-та им. Пастера, 1988.-Т. 64.-С. 3-27.
