Изучение структурно-функциональной организации ДНК-зависимой РНК-полимеразы E. coli методами аффинной модификации и направленного Fe2+-зависимого расщепления тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ

И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

КОЗЛОВ МАКСИМ ВИКТОРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ДНК-ЗАВИСИМОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ Е. coli МЕТОДАМИ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ И НАПРАВЛЕННОГО Яе2+-ЗАВИСИМОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор В. Г. Никифоров

кандидат химических наук,

профессор А. А. Мустаев

Москва 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................6

1.1. ДНК-полимераза I Е. coli..........................................................7

1.1.1. Кристаллическая структура фрагмента Клёнова...........................7

1. 1.2. Мутационно-генетические исследования

полимеразного домена ДНК-полимеразы I Е. coli..........................9

1.1.3. Аффинная модификация ДНК-полимеразы I Е. coli......................12

1. 2. Обратная транскриптаза HIV-1.................................................15

1.2.1. Кристаллическая структура обратной транскриптазы HIV-1..........16

1.2.2. Мутационно-генетические исследования

полимеразного домена обратной транскриптазы HIV-1.................20

1.2.3. Аффинная модификация обратной транскриптазы HIV-1...............24

1. 3. РНК-полимераза бактериофага 77.........................................27

1.3. 1. Кристаллическая структура РНК-полимеразы

бактериофага 77.......................................................................27

1.3.2. Мутационно-генетические исследования РНК-полимеразы бактериофага 77.......................................................................29

1.3.3. Аффинная модификация РНК-полимеразы

бактериофага 77.......................................................................33

1. 4. РНК-полимераза Е. coli...........................................................36

1.4. 1. Кристаллическая структура РНК-полимеразы Е. coli...................36

1. 4. 2. Мутационно-генетические исследования

РНК-полимеразы Е. coli.............................................................38

1. 4. 3. Аффинная модификация РНК-полимеразы Е. coli........................42

Заключение..............................................................................45

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................47

2. Т. Бактериальные штаммы............................................................47

2. 2. Плазмиды и олигонуклеотиды....................................................47

2.3. Питательные среды..................................................................47

2. 4. Компетентные клетки и трансформация бактерий......................47

2. 5. Модифицирующие реагенты......................................................48

2. 6. Выделение плазмидной ДНК......................................................52

2. 7. Неденатурирующий электрофорез ДНК

и выделение ДНК из гелей.........................................................52

2. 8. Денатурирующий электрофорез РНК и ДНК................................53

2. 9. Денатурирующий электрофорез белков......................................53

2. 10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).........................................54

2. 11. Выделение РНК-полимеразы.....................................................55

2. 12. Определение активности РНК-полимеразы................................56

2. 13. Модификация РНК-полимеразы в инициационных комплексах

рифам ицин-связанными нуклеотидами.....................................57

2. 14. ЯЕГ-индуцированное расщепление промоторной ДНК

в составе открытого комплекса.................................................58

2. 15. /?ЕГ-индуцированное расщепление РНК-полимеразы

в составе инициационного комплекса........................................59

2. 16. Модификация РНК-полимеразы в инициационных комплексах

5'-(А/-метилимидазол)-нуклеотидами.........................................59

2. 17. Модификация РНК-полимеразы в инициационных комплексах

5'-фотоактивными нуклеотидами..............................................60

2. 18. Модификация РНК-полимеразы в ранних элонгационных

комплексах 5'-фотоактивной РНК.............................................60

2. 19. Модификация РНК-полимеразы в элонгационных

комплексах 5'-фотоактивной РНК..............................................61

2. 20. Модификация РНК-полимеразы в элонгационных

комплексах фотоактивными транскриптами...............................62

2. 21. Модификация РНК-полимеразы в элонгационных

комплексах фотоактивной ДНК.................................................63

2. 22. Химические способы расщепления

субъединиц РНК-полимеразы....................................................63

2. 22. 1. Частичное расщепление по остаткам метионина.......................64

2. 22. 2. Частичное расщепление по остаткам цистеина..........................64

2. 22. 3. Частичное расщепление по связи N-G.......................................64

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..................................................65

3. 1. Структура активного центра РНК-полимеразы Е. coli

в инициационном комплексе.................................................65

3. 1. 1. Схема модификации РНК-полимеразы......................................65

3.1.2. Локализация районов модификации...........................................68

3.1.3. Структура активного центра......................................................73

3. 2. Изучение центра связывания РНК-полимеразы E.coli

с рифамицином В..................................................................75

3. 2. 1. Синтез коньюгата рифамицин-ЕДТА(Ге2+)..................................75

3. 2. 2. Расщепление промоторной ДНК в открытом комплексе.............77

3. 2. 3. Расщепление РНК-полимеразы в инициационном комплексе......78

3. 3. Изучение "коридора выхода " 5'-конца РНК-продукта

в инициационных и ранних элонгационных комплексах........82

3.3. 1. Модификация РНК-полимеразы на стадии инициации................82

3. 3. 2. Модификация РНК-полимеразы на стадии элонгации.................87

3. 4. Пространственная организация тройного

элонгационного комплекса...................................................90

3

3. 4. 1. Модификация РНК-полимеразы

фотоактивными транскриптами.................................................90

3. 4. 2. Картирование центра связывания транскрипта..........................91

3. 4. 3. Модификация РНК-полимеразы фотоактивной ДНК...................92

3. 4. 4. Картирование центра связывания ДНК......................................94

3. 4. 5. Структурно-функциональная характеристика

элонгационных комплексов......................................................95

ВЫВОДЫ...............................................................................................97

ЛИТЕРАТУРА..........................................................................................99

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.....................................................................114

ВВЕДЕНИЕ

Установление взаимосвязи структуры и функции ферментов имеет принципиальное значение для понимания молекулярных механизмов, обеспечивающих каталитическую активность.

ДНК-зависимая РНК-полимераза E.coli, состоящая из пяти субъединиц, в строгой очерёдности осуществляет множественные, часто фактор-регулируемые, взаимодействия, результатом которых является высокопроцессивное и точное считывание генетической информации в ходе транскрипционного цикла: инициация, элонгация и терминация. В настоящее время имеется обширная феноменология для каждой стадии этого цикла, опирающаяся, прежде всего, на данные мутационного анализа. Развитие методов аффинной модификации РНК-полимеразы в инициационных и в остановленных элонгационных комплексах позволило обрисовать в общих чертах строение активного центра фермента.

Понимание механизмов функционирования РНК-полимеразы осложнено трудностью интерпретации имеющихся данных в терминах пространственной структуры. На сегодняшний день уже получены

трёхмерные структуры с разрешением ~ЗА° для фрагментов а и а-

субъединиц. К сожалению, степень разрешения ~15А°, достигнутая для

двухмерных кристаллов фермента, позволяет делать только первые предположения о взаимном расположении субъединиц. Таким образом, аффинная модификация ДНК-зависимой РНК-полимеразы E.coli по-прежнему остаётся высокоинформативным методом изучения принципов структурно-функциональной организации фермента.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Структурно-функциональная организация полимераз нуклеиновых кислот.

Различные ДНК и РНК-полимеразы обеспечивают функционирование генетического аппарата в живых организмах, отвечая за точное воспроизведение наследственной информации и её трансляцию на язык аминокислотных последовательностей белков. Размеры и сложность организации полимераз также разнообразны, от моносубъединичной весом 39 кДа репарационной полимеразы ß у млекопитающих и до ДНК-полимеразы II! холофермента из Е. coli, содержащего по меньшей мере 20 субъединиц общим весом около 900 кДа. В последнее десятилетие наши знания о пространственно-функциональной организации нескольких представителей этого класса ферментов значительно расширились, прежде всего, благодаря кристаллографическим данным, а также методам генетического и мутационного анализа, аффинной модификации и некоторых других. Каждый из методов имеет свои ограничения, и только совокупность их даёт наиболее общую и достоверную картину. Именно такое, взаимодополняющее использование нескольких методов в сопоставлении результатов, полученных на различных объектах, и будет рассмотрено в данном обзоре на примерах ДНК-полимеразы I Е. coli, обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека HIV-I, РНК-полимеразы бактериофага Т7 и РНК-полимеразы Е. coli.

1.1. ДНК-полимераза I Е. coli.

Две основные функции ДНК-полимеразы I Е. coli состоят в репарации повреждённой геномной ДНК и синтезе репликационных фрагментов Оказаки. Молекула фермента состоит из одной субъединицы весом 103 кДа и обладает 5'-3' полимеразной активностью, 3'-5' экзонуклеазной, корректирующей ошибки элонгации, и 5'-3' экзонуклеазной для удаления РНК-праймера в ходе репликации. Ограниченным протеолизом ДНК-полимеразы I Е. coli был получен С-концевой домен фермента, или фрагмент Клёнова (ФК), с молекулярным весом 68 кДа, обладающий ДНК-полимеразной и 3'-5' экзонуклеазной активностью (Klenow and Henningsen, 1970).

1. 1. 1. Кристаллическая структура фрагмента Клёнова.

Фрагмент Клёнова оказался удобной моделью для изучения многих свойств ДНК-полимеразы I. Экспрессия ДНК, кодирующей С-концевой домен (Joyce and Grindley, 1983), позволила получить белок в количествах, достаточных для кристаллизации. Трёхмерная структура с разрешением ~ЗА° была определена в комплексах с дезокситимидин-5'-монофосфатом (Ollis et al., 1985), с дезокситимидинтетрануклеотидом (Beese and Steitz, 1991), с фрагментом ДНК длиной 11 пар оснований (Beese et al., 1993а) и с дезокситимидин-5'-трифосфатом (Beese et al., 1993b).

В результате этой серии работ было установлено, что фрагмент Клёнова состоит из большего С-концевого домена и меньшего глобулярного N-концевого домена. С-Концевой домен напоминает по форме "клешню" или кисть правой руки, поверхность "ладони" которой образована

антипараллельной р-складкой, "пальцы" - несколькими а-спиралями и "большой палец" - двумя протяжёнными антипараллельными а-спиралями, контактирующими друг с другом, и двумя короткими а-спиралями (рис. 1).

Продукт экзонуклеазного отщепления, дезокситимидин-5'-монофосфат, образует комплекс с Л/-концевым доменом, отвечающим, следовательно, за экзонуклеазную активность. Этот вывод согласуется с данными о том, что в результате экспрессии ДНК, кодирующей С-концевой домен фрагмента Клёнова (аминокислоты 515-928), образуется полипептид, проявляющий исключительно полимеразную активность (РгеетоШ е£а/., 1986).

FINGERS

THUMB

PALM

Рисунок 1. Схематическое представление полимеразного домена фрагмена Клёнова (Joyce and Steitz, 1994).

Наоборот, субстраты полимеразной реакции, дезокситимидин-5'-трифосфат и дезоксицитозин-5'-трифосфат, или её продукт, пирофосфат, связываются с С-концевым доменом. Гетероциклическая и углеводная части субстрата располагаются над поверхностью "ладони" в районе триады Asp705, Asp882 и Glu883, |3- и у-фосфаты контактируют с Arg754 и Lys758 "пальцев" и с Arg682 "большого пальца", в то время как пирофосфат удерживается за счёт двух остатков Arg682 и Lys758. В кристаллических комплексах остатки Сахаров и оснований имеют две различных ориентации, так что тимин взаимодействует с Phe762 и Туг766, а цитидин с His881.

Фрагмент ДНК (11 пар оснований) располагается в углублении между "большим пальцем" и А/-концевым доменом, а дополнительный неспаренный тринуклеотид на З'-конце цепи праймера связывается с экзонуклеазным активным центром, аналогично дезокситимидин-тетрануклеотиду. Оси дуплекса и тринуклеотида образуют угол близкий к прямому. Комплекс стабилизируется взаимодействием а-спиралей Н и / "большого пальца" с малой бороздкой ДНК.

1.1.2. Мутационно-генетические исследования полимеразного домена

ДНК-полимеразы IE. coli.

Высокая степень гомологии аминокислотных (АК) последовательностей

была обнаружена в С-концевой части 27 ДНК-зависимых ДНК-полимераз,

принадлежащих двум основным семействам: (a) Escherichia coli ДНК-

полимераза I (Pol I) - прокариотические ДНК-полимеразы и (б) ДНК-

полимераза а (Pol А) - прокариотические и эукариотические (вирусные и

клеточные) ДНК-полимеразы. Для семейства Pol I были идентифицированы

шесть наиболее консервативных районов, общей длиной -340 АК, в

9

шесть наиболее консервативных районов, общей длиной -340 АК, в одинаковой линейной последовательности (1, 2а и 2Ь, 3, 4 и 5). Соотнесение консервативных районов с трёхмерной структурой фрагмента Клёнова позволило выявить тот факт, что все они сконцентрированы вокруг "клешни". Была высказана подтвердившаяся в дальнейшем гипотеза, что ими сформирован активный центр или, так называемое, "ДНК-полимеразное ядро" (Blanco et al., 1991).

Данные о структуре ФК в комплексе с dTMP (Ollis et al., 1985) и о положении аналога субстрата 8-азидо-с/АГР рядом с Tyr766 {Rush and Königsberg, 1990) указывали на район предполагаемого активного центра, в котором и был начат поиск аминокислотных остатков, существенных для полимеразной активности (Polesky et al., 1990). Направленным мутагенезом авторы варьировали 7 аминокислотных остатков, в результате чего были выделены 12 мутантных белков, свойства которых были изучены in vitro.

Полученные результаты позволили функционально разграничить в предполагаемом активном центре два района, разделённых также и пространственно. Замены в Туг766 (инвариантная аминокислота (инв. АК) района 4, С-конец О-спирали), Arg841 и Asn845 (N-конец О-спирали) проявились в увеличении Кт (dNTP), что подтвердило взаимодействие этого

района с привходящим субстратом. Мутации в Gln849 (центральная часть Q-спирали), Arg668 (инв. АК района 2Ь, соединение между 7 и 8 цепью ß-складки), Asp882 (инв. АК района 5, контакт 12 и13 цепи) и привели к 1001000 кратному уменьшению kcat. В то время, как остаток Asp882 входит в

состав каталитической триады, координирующей Ме2+, и непосредственно участвует в катализе, роль Gln849 и Arg668 можно объяснить

взаимодействием с ДНК-праймером, поскольку замены в этих положениях

10

увеличивали К^ (ДНК) в 10-15 раз.

С целью идентификации других карбоксилсодержащих АК остатков, непосредственно участвующих в образовании фосфодиэфирной связи, был сделан набор замен в положениях Аэр705 (инв. АК района 3, С-конец 9 цепи), С1и710 (инв. АК района 3, Л/-конец /.-спирали) и 01и883 (консервативная АК района 5, Л/-конец 13 цепи) (Ро1еБку е? а/., 1992). Увеличение Кт (сУЛ/ГР) у ферментов, мутантных по Аэр705 и С1и710, которые

расположены в трёхмерной структуре между Туг766 и Аэр882, обозначило пространственную близость центра связывания субстрата и каталитического центра. Одновременно с этим замены Р705А и 0705Э уменьшали в 1000 раз, что было объяснено прямым участием Азр705 в

катализе. Замена Е883А привела к менее резким изменениям значений Кт

{бЫТР) и кса^ Вариации АК в трёх положениях 705, 710 и 883 увеличивали К^

(ДНК) в 5-30 раз. Попытки отличить в мутантных ферментах конформационные эффекты от каталитических, используя с этой целью а-тиотрифосфатные аналоги субстратов, не дали однозначных результатов.

После того, как была определена кристаллическая структура комплексов ФК с с1ТТР и РР/ (ВееБе et а!., 1993Ь), внутри субдомена

"пальцы" были сделаны замены АК остатков, которыми сформировано ближайшее окружение бЫТР, и изучены кинетические харктеристики для мутантных ферментов, в частности Кт (бЫТР, РР/). Оказалось, что

наибольший вклад в связывание с!ТТР вносит взаимодействие с Агд754 и РЬе762 (центральная часть О-спирали), а для РР/ - взаимодействие с

Агд754. Это доказывало, что именно Агд754 контактирует с (3- или у-фосфатом привходящего субстрата. Некоторые результаты подтвердили

предположение о том, что контакты dNTP в двойном и тройном комплексе могут значительно отличаться между собой. Так, мутации в Arg682 (соединение спиралей J и К), His734 (0/-спираль) и Туг766 в большей мере

для ДНК, чем для dNTP, ослабляли комплексообразование с ФК. Таким образом, данные АК могут влиять на связывание dNTP в тройном комплексе через позицию в нём ДНК матрица-праймер (Astatke M. et al., 1995). Замена Lys758 (инв. AK района 4, центральная часть О-спирали), который в кристалле контактирует су-фосфатом dNTP, приводила к 400-500 кратному уменьшению kcat реакции полимеризации или пирофосфоролиза, почти не

влияя при этом на Кт (dNTP, PPj) и Kçj (ДНК). На основании этих

результатов авторы сделали предположение об участии Lys758 в переориентации dNTP и PPj в тройном комплексе, которая предшествует

акту катализа (Kaushik N. et al., 1996).

1.1.3. Аффинная модификация ДНК-полимеразы IE. coli.

Начало работ по аффинной модификации ДНК-полимеразы I Е. coli было положено наблюдением, что пиридоксаль-5'-фосфат ингибирует образование фосфодиэфирной связи, конкурируя с dNTP �