Закономерности взаимодействия ДНК-полимераз с матрицами, праймерами и нуклеотидами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

НЕВИНСКИЙ Георгий Александрович

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ С МАТРИЦАМИ, ПРАЙМЕРАМИ И НУКЛЕОГИДАМИ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 1990

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии Сибирского отделения АН СССР

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Э.И. Будовский доктор химических наук С.Н. Кочетков доктор биологических наук B.C. Михайлов

Ведущее предприятие: Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Минмедпрома СССР ( пос. Кольцове Новосибирской области).

Зашита состоится iP'-^-^-^JX^ 1990 года в "/^часов

на заседании Специализированного ученого совета Д 053.05.4? по химическим наукам при Московски! государственном университете им. М.В. Ломоносова, Москва, II7234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук, доцент

Г.И. Лавренова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. ДНК-полимеразы. участвуют в репликации , репарации ДНК и поддержании. интактной структуры генетического материала. Сложность процесса* биосинтеза ДНК в. живой клетке сочетается с удивительно.высокой.степенью его надежности и воспроизводимости . Исследования структуры и механизма действия даК-полимераз составляют важное направление современных разделов« биохимии, мол. биологии и. биоорганической, химии.

За 30 лет, прошедших.со времени.открытия А.Корнбергом первой ДНК-полимеразы,. накоплен огромный, фактический материал о. свойствах этих ферментов. Для ДНК-полимеразы I из Е. со-I . (наиболее.изученный фермент)., определена первичная, структура, проведен.рентгеноструктурный-анализ.комплексов с с!ЫМР (экзонуклеазный центр) и ДНК. Однако механизм функционирования фермента на молекулярном уровне ве^многом, еше не ясен. Отсутствуют данные о. природе взаимодействия типе связей, образуемых полимеразами с. матрицами, праймерами и сШТР, химическом механизме отбора, матрицей комплементарных ей с^ЫТР, роли, кооперативных, взаимодействий между центрами узнавания отдельных.-лигандов в обеспечении, общих и чаетных закономерностей функционирования ДНК-полимераз. из. про-, эукариот,. вирусов и архебактерий.

. Сравнение, свойств ДНК-полимераз,. обладающих, различной структурной организацией*. но 1?&тализируС!йих одну и ту же реакцию полимеризации,имеет важное значение для. понимания закономерностей эволюции, белков.

ДНК-полимеразы. представляют идеальный, объект для изучения обших принципов, белково-нуклеинового узнавания и-дифференциации ферментами близких по строению, лигандов, поскольку матрицы, . праймеры и ¿ЫТР состоят из одних и тех же структурны: элементов.

Как. пишет газета "Вашингтон пост", в мину во ем 1989 году журналом "Сайенс" высокого-титула "САМАЯ КРАСИВАЯ МОЛЕКУЛА" была удостоена ДНК-подимераза, позволяющая делать копии молекул ДНК и чрезвычайно важная для развития новой технолог! "цепной реакции, полимеразы", которая может найти- широнайпее применение в различных областях науки и техники.

иссо,ллций..|

Цель и задачи исследования. Основной задачей исследования был разносторонний структурно-функциональный. анализ ДНК-шли-мераз лро-,. еукариот,-вирусов и архебактерий с, целью, выявления обших и частных закономерностей, узнавания этими.ферментами субстратов и продуктов реакции.полимеризации. В. задачи работы входила.разработка.новых подходов,. позволяющих, получать количественную.информацию о.комплексообразовании ферментов с, различными- лигандами и ..требующих для проведения, ис-следованийгМинииальных количеств анализируемых белков.

.Эти задачи решались в.процессе.комплексных.исследований, проводимых.различными методами, л первую очередь методами стационарной--кинетики и. аффинной.модификации.

Научная.левизна я практическая .ценность, работы. -Синтезирован и исследован, ряд. новых, химически. неактивных и реакционно-способных. моног- и елигонуклеотидов,. позволявших проводить направленное. изучение, взаимодействий ДНК-пояиыераз. как с отдельными,- лигандаыиЛматрица, . праймер, <ЛПР),.так и с. соединени-г вми, моделирующими. отдельные-структурные.элементы субстратов и.продуктов.реакции, полимеризации.

Впервые, исследована, роль, электростатичееких и. гидрофобных взаимодействий, а также.водородных.связей при узнавании ДНК-подимеразами. оснований, межцуклеотидных. фосфатных, груш и. сахарных остатков, матриц,. праймеров и сШТР.. Созданы модели, позволявшие проведение, таких исследований.

Сравнительный анализ. полимераз.из.клеток про-,.зукариот, вирусов и. архебактерий. позволил выявить, однотипный, характер контактов ферментов с основнымикомпоненшами полной-, системы реакции полимеризации..Впервые.найдены простые, алгоритмы оценки величин,, характеризующих, сродствослигандов к ДНК-ло-лимераеам.

Разработанные варианты метода аффинной, модификации и синтезированные реагенты могут быть использованы, для изучения большого, числа сложных, многосубстратных. и олигомерных.ферментов, в особенности, различных ДНК-зависимых белков.. Полученные, результаты создают, основу. для новых, направлений в . исследованиях, белково-нуклеинового узнавания и.молекулярных механизмов, процессов, репликации в. модельных, системах и .на уровне, живой...-. кяегки.. Они могут быть использованы в генной

инженерии, биотехнологии и других областях науки, где используются матричные ферменты.

Объем и апробация работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,.описания, материалов и методов, описания результатов исследования и их- обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 340страницах машинописного текста. Она содержит 77 рисунков и 39 таблиц. Список, литературы включает 452 цитируемых источника.

Материалы, диссертации докладывались на I, II и III Всесоюзном рабочем совещании по матричному синтезу нуклеиновых кислот ( Гатчина, 1984; Новосибирск, 1986; Тбилиси, 1988), II Международном, симпозиуме ."Химия фосфора применительно к биологии" (Лодзь, 1986), У1,симпозиуме СССР-Италия " Макромолекулы в функционирующей клетке" (Ленинград, 1988),. симпозиуме СССР-Франция "Физико-химические основы жизни" (Бордо, 1988), Всесоюзном рабочем совещании по химии дуплексов (1989,. Киев),. Международном совещании по перспективам применения производных олигонуклеотидов (Новосибирск, 1988), III Всесоюзной конференции '.'Макромолекулы клетки" (Москва, 1989), Международной конференции "Современнные проблемы- биологии и биотехнологии" (1989, Алма-Ата), II двухстороннем симпозиуме СССР-США "Структура зукариотического генома и регуляция его: экспрессии" (Тбилиси, 1989).

.Объекты исследования. Основными объектами исследования брли ДНК-полимераза d из плаценты человека (ДПЧ), фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I из Е. cob (ФК), ДНК-полимераза I из Е. cob. (ДНК-пол.I), ДНК-полимеразы <¿ HJ3 из Ph.polyoepha» Хиш(ДПФП-о6 и ДПФП-J? , соответственно), ДНК-полимераза А из s. aoidocaldari.ua (ДПСА) и ДНК-полимераза В из Th. acido-

philum (ДОТА) и РНК-зависимая ДНК-полимераза вируса миелобластоза птиц (amv-r).

СИНТЕЗ РЕАГЕНТОВ И ХИМИЧЕСКИ НЕАКТИВНЫХ АНАЛОГОВ MOHO- И ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ К началу работы не было известно ни одного из реакционно-способных аналогов матриц, праймеров или нуклеотидных субстратов, с помощью которых можно было бы оценивать сродство этих лигандов к ДНК-полимеразам. Поэтому первоочередной задачей было получение химич=ски активных производных субстратов и

исследование возможности их использования для аффинной модификации (AM) полимераз, оценка перспективности применения реагентов для количественного анализа комплексообразования. В основу конструирования реагентов - было положено выполнение основных критериев AM (AM биополимеров/ред.Кнорре Д.Г., 1983) и селективность модификации реагентами участков связывания отдельных лигандов.

Был синтезирован ряд алкилируюших производных олигонуклео-тидов: декатимидилаты, алкилированные по межнуклеотиднойтио-фосфатной группе на 3'- и на 5'-конце - d [Tp(S)(Tp)gT] , d [(Tp)8Tp(S)T]- дибромэтаном или Ы^.И'-три-^-хлорэтил)- II-i (пара-формил) пропилендиамином-1,3. Эти производные олиго-нуклеотидов инактивировали ДНК-полимеразы с очень низкими скоростями и оказались неперспективными для количественного анализа комплексообразования.

Реагентами, избирательно модифицирующими матричные участки ДНК-полиыераз, оказались Р^-содержащие олигонуклеотиды: d(pT)2pc[pt2+(HH3)20H] (рт)? - ьц(с)-реагент d(pT)2pG[Pt2+(lffi3)2OH] (рт)7 - м2(с)-реагент d(pl)2pALPt2"i"(NH3)20H] (рт)7 - ы3(А)-реагент d[pT)^pC fp-t2>(HH3)20H]p] Зт - м4(ЗС)-реагент d(pO)*[Pt2+(KH3)2OH](pT)14 - М5(С)-реагент d(p'i)^G[Pt2+(KH3)2OH](pi>2 - Mg (с)-реагент

Вез реагенты синтезированы путем обработки соответствующих олигонуклеотидов цис-аквагидроксидиамыикоплатиной 8 мягких условиях. В олигонуклеотидах остаток Pt содержится по:КЗ Cyt, Ь7 Ado и И7 Сиа.Стехиометрическое содержание платины установлено с помощью метода атомно-адсорбционной спектрометрии.

Ня, основе Lij(C)-peareHTa получены соединения, в которых ОН-грулпа внутренней координационной сферы иона платины заронена на радиоактизномеченные метиламин, метионин и'имида-гол, модулирующие соответствующие AK-остатки белков. Не обнаружено эффективного включения в реагент метанола, ацетата, ■гэнола и гуанидина.

Найдош аналоги нуклеотидов, способные избирательно модифицировать участки связывания dNTP. Синтезированы"имидазо-лиды dNTP, dNMP, эпокси-АМР, эпокси-АРР и эпокси-АТР.

Синтезирован и использован в работе ряд ранее не описанных производных моно - и олигонуклеотидов: индивидуальные диасте-реомеры декатимидилатов с этерифицированными межнуклеотидны-ми фосфатными группами: d(Tp)gTp> (Et )Т и d(Tp)gTp"(Et )Т, диасте-тереомеры ундекатимидилатов-с1(Тр)дТр' (Et )ТрТ и d(Tp)gTp"(Et)-ТрТ, декааденилат, лишенный 3'-концевого основания - d(pA)g-р( rib} где (rib) -остаток дезоксирибозилмочевины. Для создания модельных систем использованы рибо- и дезоксирибоолиго-нуклеотиды различной структуры и длины, а также их модифицированные производные ( описаны ранее).

Синтезированы ^-метиламиды dNTP, ¡(-(2-меркаптоэтиламид) dTTP, карбоксиметилфосфонил -5'-АМР. Полученные соединения охарактеризованы с помошью И0-, ОФ-хроматографий, ТСХ, УФ-спектров и ряда других физико-химических подходов.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ С МАТРИЦАМИ Избирательная модификация матричных участков полимераз

-реагентами

Показано, что инкубация~®~{ в присутствии NaP, см. ниже) и ДЕЧ с М^(С)-реагентом ( и другими М-реагентами) приводит к инактивации ферментов в реакции полимеризации и ковалент-ному присоединению реагента к белкам( реакции псевдопервого пярядка). С помошью зависимостей величин ккаж инактивации ферментов от концентрации М-реагентов (например, рис Л) найдены величины 1% обратимых комплексов полимераз с реагентами и константы скоростей инактивации белкоа(например, для Mj(C)-реагента: 0,5 мкМ и' I^'IO^m-1 для ДПЧ; 0,3 мкМ и 2-Ю-2 мин-^ для ФК). С помошью защитных эффектов различных олигонуклеотидов от инактивации ферментов М-реагентами найдена величины Kd комплексов этих лигандов с матричными участками ДНК-noлимераз(например, рис.2).

В отличие от участка связывания праймера, сродство олигонуклеотидов к матричному участку ферментов не зависит от наличия или отсутствия в олигонуклеотиде 3'-ОН концевой группы и некомплементарного матрице основания. Величины К ¿для dípT)-^ d(Tp)gT, d(pT)2pC(pT)7 и [cf(Tp)g] ddT практически не отличают-" ся ( например, 0,15 мкМ для любого олигонуклеотида в случае ДПЧ). Декатимидилат [d(Tp)g]ddT ингибирует реакцию полимеризации к онкурентно по отношению к матрице (Kd= 0,17 ыкМ)

к кем'10

-2

мин

А

ккаж'10"2-мин

•-<1(р1)10 '-б.(Тр)дТ

• [¿(тр^ат

Ю

16

0 8.. [а<Тр)2с<и2+)(рТ)7]-1, мкМ"1 [Олигонуклеотид] , мкМ Рис.1. Зависимость к инактивации ДПЧ от концентрации

-реагента в обратных координатах Рис.2. Зависимость обратных величин к инактивации ДПЧ от концентрации <*(рТ)10, <1(Тр)дТ и [<1(Тр)д]с1с1Т при постоянной концентрации (С)-реагента (I мкМ).

-1ов Кй

9-

ккал/моль

<1(рА)г (ЦрТ)

12 15

18

21 24 и

Рис.3. Зависимости отрицательных значений логарифмов величин Кй для олигонуклеотидов от их длины ( п ): ФК (1-4) и ДОЧ(5).

Сродство олкгонуклео.тидов к матричному участку полимеразы на 1-2 порядка выше, чем к участку связывания праймера. Сделан вывод о том, что М-реагенты инактивируют Ш и ДПЧ за счет избирательной модификации матричных участков, не затрагивая центров узнавания праймеров.

Алгоритмы оценки вели'чин Ка для матриц Оценка величин К¿комплексов ДПЧ и ® с различными лиган-дами проведена с помошью их зашитных эффектов от инактивации ферментов М-реагентами ( в присутствии ионов Мп2+). При переходе от Р}К ¿(рИ ) и далее а(рН ) (п= 2-20) величина свободной энергии Гиббса комплексообразования (Л6°) ферментов с ли-гандами изменяется линейно. Например, в случае Ж и а(рТ)п в соответствии с уравнением:Дб°( п) = -(6,5 + 0,35.п)ккал/моль. (рис.3). Это свидетельствует о том, что только одна из межнук-леотидных групп матрицы любой длины взаимодействует с ферментом, причем с той же эффективностью, что и ортофосфат(дС°= -6,5 ккал/моль). Отсутствие изменений Ка при п>19-20 согласуется с взаимодействием с полимеразой только 19-20 звеньев мат-рицы(фермент защищает от гидролиза 19 нуклеотидных звеньев дуплекса ДНК; диаметр молекулы0,ЩЖ-пол.1 65 длина дуплекса, состоящего из 20 звеньев ~ 68 А).

Увеличение длины олигонуклеотидов ¿(рС)п, а(рТ)п ,а(рА)п и <1(рС)п на одно звено приводит к возрастанию их сродства соответственно в 1,58, 1,78, 195 и 1,95 раза ( г-коэффициент для основания). Изменение 1% происходит в соответствии с убывающей геометрической прогрессией:

Ка.(п) = Ка(Р±М г)"п ,где КЙ(Р1) равна 26 мкМ для ® и 53 мкМ для ДПЧ. Величины Кй для различных гетероолигонукле-отидов были рассчитаны с помощью алгоритма(ФК): К4(х) = 26 мк!.К1)58)-.1(1,78)-.т(1,95)-(Р+ где 1, т,р ид- соответственно число С-, Т-, С - и А -оснований в составе гетероолигонуклеотидов. Рассчитанные и полученные в эксперименте величины К^ приведены в табл.1. Видно, что в пределах ошибки эксперимента они не отличаются, что свидетельствует об одинаковом вкладе оснований (С,Т, С и А) в сродство к ферментам соответствующих им гомо- и гетероолиго1^укле-отидов. Сродство гомоолигонуклеотидов возрастает в соответствии с увеличением относительной гидрофобности оснований: С < Т< С <А.

Таблица I

Величины Ка комплексов ФК с гетероматрицами

Олигонуклеотид

рассч.

Кй, мкМ

эксп.

Олигонуклеотид

К рас<

а(рТрАрАрТрАрСрСрА) 0,14

¿(рСрТрСрСрСрТ рТрАрС) 0,12 <1 (р АрАрТрСрАрТрСрСрТрСрАрТ) 0,013 а(рСрА)5 0,07

мкМ

а _

сч. эксп.

0,17 (1(рСрА)5 0,024 0,015

0,13 <1 (рСрА)д 0,4 0,45

0,015 ¿(рСрТ)б 0,011 0,009 0,06

Величины лС° образования контактов фермента с одним из оснований (-0,28..-О,4 ккал/моль) сопоставимы с величинамидв0 переноса оснований из воды в 4-6 М водный метанол( -0,3..-О,8 ккал/моль). Сделан вывод, что эти величины отражают выигрыш в энергии при переносе одного основания матрицы из воды в гидрофобную полость фермента.

Дополнительное возрастание сродства матриц происходит при добавлении комплементарных им праймеров ( за счет уотсон-кри-ковских взаимодействий между цепями). Возрастание сродства зависит от длины праймера. Величины Ку и для матриц не отличаются. Отношение величин К 4 для двух любых матриц различной длины в присутствии и отсутствие праймера является постоянной величиной.

Роль межнуклеотидных фосфатных групп матриц Частичное этилирование межцуклеотидных фосфатных групп олйготимидилатов не приводит к изменению их сродства к ЗК и ДДЧ (табл.2). Разница в сродстве к ферментам немодифицирован-ных и полностью этилированных олигонуклеотидов (7-9 раз) практически не отличается от соотношения величин К йдля триэтилфос-фата и ортофосфата (11,3 раза) и сопоставима с уменьшением сродства М^-реагента к ферментам при исключении из реакционной смеси ионов. марганца( 8 раз). Сделан вывод о том, что одна из межцуклеотидных фосфатных групп матрицы образует с ферментом Ме^"-зависимый электростатический контакт (дС0= -1,2 ккал/ моль) и одну водородную связь за счет атома кислорода Р=0 группы ( - 4,6..-5,0 ккал/ыоль). Образование последней объясняет высокое сродство к ферментам триэтилфосфата. Этилированные олиготимидилаты исследованы в качестве матриц в ре-

Таблица 2

Величины К а комплексов ¿матричного участка Д1Ч с различными

лигандами •

Олигонуклеотид Ка,мкМ Олигонуклеотид К(1, мкМ

(а^5<»зЕЧ) нус^ <1(Тр)7Т ¿[Тр'(Е*)Тр]3Тр'(Е^ <3[Тр"(Е^Тр]3Тр"(Е*) й[Тр(Е1;)]7Т 600 53 0,4 Т 0,33 Т 0,39 2,8 а(тР)9т а(Тр)8Тр'(Е* )т а(Тр)8Тр"(вг )т а(тр)14т а[Тр(м)] 14Т 0,15 0,12 0,13 0,0091 0,081

^Ошибка в расчете К, не превышает 20-30%

акции полимеризации. Все этилированные олиготимидилаты являются хорошими матрицами.

Анализ матричного участка ФК с помощью М-реагентов Матричный участок Ж состоит из 19-20 подцентров, каждый из которых взаимодействует с одним звеном матрицы. Сделана попытка установления АК-остатков этих подцентров, контактирующих с различными структурными элементами оснований матрицы.

Показано, что скорости модификации ФК однотипыми М|(С)-, М4(СЗ) - и М£(С)-реагентами ( модифицированы по N3 Су* ) практически не отличаются. Это может указывать на модификацию реагентами в подцентрах фермента АК-остатков одной и той же природы. Скорость инактивации Ж-*возрастает при переходе от Мд(А)-к М2(С) - и М^(С)-реагенту (рис. 4)«то может быть связано с модификацией этими реагентами различных АК-остатков, расположенных в подцентрах вблизи Ю пиримидинов и N7 пуринов.

Показано, что связи атомов азота гетероциклов с к достаточно устойчивы(100 мМ НаСН,70°С ^у^ 23-70 ч). Полная и достаточно быстрая реактивация модифицированного Мд(А)-р. под действием 5 мМ ИаСИпри 30°С(рис.4) свидетельствует об образовании в этом случае легкоразрушимых связей. В указанных условиях для МХ(С)- и М2(С)-реагентов происходит не полное восстановление активности. Приблизительно 50% Мт(С)-реагента отщепляется при 30°С, а остальная метка - при 70 С(рис.5). Полученные данные свидетельствуют о модификации М-реагентами в матричном участке Ж АК-остатков различной природы. Скорость от-

| (указан момент добавления ИаСИ )

и-

Мд(А)-реагент (С)-реагент

М^(С)-реагент

/

инкубация при 30 С

12 20 21 22 26 час

Рис.4. Кинетические кривые инактивации Ж реагентами М^(С), и Мд(А3 и восстановления активности инакти-

вированного фермента при его инкубации с 5 мМ ЫаСН .' Контрольная кривая соответствует инкубации ФК с олигонук-леотидами: а(Тр)2м(ро;)7 (ы= с, Аили в)

4 8 24 28 32 час

Рис.5 Кинетическая кривая демодификации меченного ради, (С)-реагентом ® при его инкубации с 5 мМ ИвСИ при 30°С (I) и 70°С(2). Стрелкой указан момент повышения температуры до 70°С

шепления (С)-реагента от Ж в мягких условиях(30°С) сопоставима с таковой для аддукта этого реагента с Рн]имидазолсы , а в жестких условиях(70°С) - г С]метиламином. Сделано предположение, что матричный участок Ж, близкий по своей гидрофобности с 4-6 М водным метанолом, формируется с помощью гидрофильных и гидрофобных остатков АЙ.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ С ПРАЙМЕРАМИ Минимальные праймеры Разработаны методики тестирования продуктов реакции полимеризации в случае коротких праймеров (ТСХ, микроколоночные И0- и ОФ-хроматографии, электрофорез в ПААГ). Впервые показано, что минимальными праймерами являются <тмР(иШР) и (или) <ШТР( ДНК-пол Л, Ж, ДПЧ, ДЦТА, ДПСА, ДНШ-^ и аму-л ).

Праймирование синтеза ДНК<шр происходит только в присутствии комплементарной ему матрицы. В качестве примера на рис. б приведены данные ОФ-хроматографии реакционной смеси в случае ДПЧ (поли(аТ)-матрица, [%]<ш1р-праймер, аАТР-субстрат). Во всех случаях кроме аму-й превращение коротких праймеров (1-4 звена) происходит дистрибутивно. Начиная с <1(р11)эд за цикл присоединяется 10-20 звеньев. Олигонуклеотиды занимают промежуточное положение. Образование полимеров в случае аму-л даже из (ШР происходит высокопроцессивно.

Зависимость сродства праймеров от их структуры и длины С помощью аффинных реагентов (М^СЭ-р. и эпАТР) и реакции полимеризации показано, что величины К^рдля праймеров близки соответствующим им величинам К4 и могут быть использованы для оценки сродства затравок к полимеразам. Исследованы зависимости величин Н^ и максимальных скоротей превращения ( v) гомо-и гетеронуклеотидных праймеров от их структуры и длины. На рис. 7 приведены зависимости от числа звеньев в гомонуклео-

тидных праймерах для ДПЧ. Для всех исследованных полимераз (кроме аму-л ) и всех исследованных серий гомоолигонуклеотидов эти зависимости имеют линейный характер с точкой перегиба при п = 10. В случае аму-й зависимости при а =2-10 не абсолютно линейны. Сделано предположение, что в пределах каталитических субъединиц ферментов находится только 9-10 звеньев праймера. Увеличение длины <а(рТ)п и <1(рА)п-праймеров на одно звено приводит к возрастанию 1« сродства в 1,82 раза, а <*(рС)п и <1(рС.)п-

Aggo (имп/мин)-10,

Метанол.%

2,5.2,5

0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 мл Рис.6. Данные ОФ-хроыатографии реакционных смесей (30°С, 5 мин инкубации) в присутствий • ) или отсутствие поли(<1Т) -матрицы( * ). Использован ¿АМР-праймер(140 мкМ) и йАТР-суб-страт(40 мкМ). Контрольные <1(рА)п -добавлены после остановки реакции полимеризации.

"1о8Км 8

3 6 9 12 15 18 11

Рис.7. Зависимости значений -log Ку для олигонуклеотидов от числа моноцуклеотидных звеньев(п) в их- составе в.случае ДПЧ: I - (ри)п, 2 6 - d(pG) я .

(рА^ , 3 - d(pA)n , 4- d(pT^ , 5 -dtpCl»

в 2,46 раза. Это соответствует возрастанию сродства праймеров за счет образования одной уотсон-криковской водородной связи в 1,35 раза (1,5 раза для ДПСА и ДОТА) в соответствии с прогрессией: ух) = у для dMP)-(1,35)7 3 (I) где в равно числу водородных связей матрицы со всеми звеньями кроме первого с 3'-конца. Это уравнение может быть преобразовано в алгоритм: k

К^х) = Ку( для декануклеотида)-(1,35) , (II) где к- разница в числе водородных связей образуемых матрицей с декацуклеотидом и более коротким праймером (х). Из совокупности данных для всех исследованнных ДНК-полимераз (ДНК-пол.I, SK, Д1Ч, ДПШ-ci и ДШ1-/5 ) и праймеров с n=II-20 был выведен следующий алгоритм оценки сродства:

Kj/x) = Kyi для декацуклеотида)-(1,13)п-}° (III) где 1,13 - коэффициент уменьшения сродства праймера при увеличении длины на одно звено (независимо от структуры праймера)

Величины Ку для гетероолигонуклеотидных праймеров, комплементарных ДНК- фага MI3, были получены в эксперименте и рассчитаны с помощью алгоритмов (II) и (III) с использованием экспериментально найденной величины Ку для декануклеотида(табл. 3). Видно, что эти величины практически не отличаются. Следовательно, эффективность комплементарных взаимодействий для А'Т и C'G -пар в составе гомо- и гетеродуплексов, взаимодействующих с полимеразами, одинаковая.

Величины V слабо зависят 0т длины йраймеров в случае ДЦФП-лС. и ДПФП-^З ( Удля dNMP составляет ~50% от удля d(р n)jq) и amv - R. Зависимости величин v от длины праймеров в случае Ж приведены на рис. 8. Близкие данные получены для ДДЧ. В целом, изменение v описывается прогрессией:

v(X) = v (для <шш?М j)n-1, где j-коэффициент увеличения максимальной скорости превращения при возрастании длины праймера на одно звено. Этот коэффициент варьирует в зависимости от фермента и нуклеотидного состава праймеров от 1,05 до 1,4, аУдля dNMP от 1,5 до 70$.

Проведено сравнение относительных скоростей реакции полимеризации в случае различных гомо- и гетеро-матриц и различных полимераз( использованы оптимальные условия для каждого из дуплексов). В случае ФК скорости полимеризации возрастают в

Таблица 3

Величины Ку для гетероолигонуклеотидных праймеров, комплементарных ДНК фага UI3.

Прайыер(3'-5') n «м- H"

Ж да

экспер. рассчит. экспер.. рассчит.

d(TTG) 3 I90±30 245 420±50 445

d(TTCC) 4 I05±20 100 I30±50 180

d(TTGCA) 5 60±I0 55 I00±30 99

d(TTGCAG) 6 2I±2 22 42±6 40

d(TTGCAGC) 7 8,3±2,0 9,0 20±4 16

d(TTGCA6GA) 8 4,5-1,3 5,0 10-2 9

d(TTGCiCCAC) 9 2,0-0,3 2,0 4-1 3,6

d(TTGCACCACT) 10 I,I±0,3 - 2,0-0,5 _

d(TTGCACCACTCA) 12 I,2±0,3 1,4 2,2-0,3 2,5

d(TTCCAGCACTGACC) 14 1,9*0,5 1,6 3,5-0,4 2,8

d(TTGCACCACTGACCC)15 2,1-0,4 1,8 3,8±0,5 3,2

порядке: акт. ДНК -10055, поли(йС) - 70%, поли(аА) -47%, ДНК фога MI3 - 10%, поли(аТ) - Г/%, поли(йС) - 0,35$ ( все с Mg21; для ДЦЧ: акт. ДНК -100%, поли(йС) -90%, поли(аА) - 50%, поли-(dT) - 10%, ДНК-фага MI3 - 7% , поли(аС) -0,1% ( все с Mn2t указаны только матрицы, использованы комплементарные d(p N)jq).

Роль межцуклеотидных фосфатных групп, сахарных остатков и оснований праймеров в их связывании и превращении Этилирование первой с 3'-конца межнуклеотидной фосфатной группы праймеров приводит к снижению их сродства к ФК, ДНК-пол. I, ДЦЧ и ДПСА в 5-10 раз и уменьшению величин V в 7-38 оаз. Введение зтильной группы по фосфату во втором положении с З'-конца практически не влияет на сродство затравок. Этилирование всех или половины межцуклеотидных фосфатных групп ( блокирован 3'-концевой фосфат) приводит к такому же уменьшению сродства как и при этерификации З^-концевого фосфата,но заметно большему уменьшению величин V - 37-500 раз. Тпл комплексов поли(dА) с d(Tp"(Et)Tp]3Tp"(Et)T и d[Tp' (Et )Tpl3Tp(Et )Т найдены равными соответственно 27 и 0°С. Однако величины Ку для этих праймеров в случае Ш и ДПЧ (30°С) и ДПСА(60°С)

практически не отличаются.

Показано, что эффективность комплементарных взаимодействий матриц с рибо- и дезоксирибопраймерами не отличается ( коэффициент 1,35 на I водородную связь)(рис. 7). Сродство З'-кон-цевых нуклеотидов рибопраймеров по сравнению с дезоксирибозат-равками падает примерно в 7,5-12,5 раз ( зависит от структуры), а величины V для первых выше, чем для вторых в 15-20 раз(1,5-3 раза для ДШ-Ли ДГШ-р ). В системе поли(йА)*(ри)10 оли-гонуклеотид [а(рТ)9]сНТ конкурирует за фермент с матрицей(К1= 1,7 мкМ), но не с праймером. Сделано предположение об образовании ферментом с З'-ОН группой праймера водородной связи. Уменьшение эффективности этой связи в случае рибопраймеров приводит к возрастанию информационной подвижности их концевого нуклеотида и, как следствие, увеличению скорости реакции полимеризации.. Причинами уменьшения "прочности" водородных связей в случае рибопраймеров может быть как образование внутримолекулярной водородной связи между 2»- и З'-ОН группами , так и изменение конформации фуранозного кольца концевого звена от 2'-эндо ( для дезокси) к 3'-эндо(для рибо)

Относительные величины V для полиШ'^рТ)^, поли(<*А)» ¿(рТ)10, поли(<1А)' (ри)^ и поли(А)«(ри)10 для АМУ -И были найдены равными соответственно: 100, 26, 3,9, и 1,7%. Величины К^ для праймеров и ЛИТР , оптимальные концентрации ионов Ме КС1 и оптимальные величины рН реакционных смесей для АМУ -и (как и для других ферментов) существенно зависели от структуры дуплекса. Показано, что рибо- и дезоксирибопраймеры различным образом влияют на состояние ¿ЯТР -связывающих центров исследованных полимераз.

Показано, что величины иУдля праймеров, содержащих некомплементарные матрице основания, зависят от положения некомплементарного звена в . затравке (Ж, ДЦЧ, ДПСА и аму _н ). Сродство праймеров ( и V ) определяется числом звеньев от З'-кон-ца до некомплементарного основания(например, величины Ку и для ¿(рТ)7рС(рТ)г, практически не отличаются от таковых для а. (рТ)2). Уменьшение эффективности превращения декануклеоти-дов а (рТ^ (рСНрТ^ Ь+щ = 9 ) по сравнению с а (рТ)эд за счет уменьшения, сродства (Н^(о)/И^(10)) и максимальной скорости превращения (т<Ю)/у(о)) равно произведению: Км(о)/1^1(10).

1ов v

макс

1о8 [км(о)/кЬ1(ю).у(ю)А(о)]

I.

4 " 3 -2 I

1- ДПСА

2- ДПЧ

3- аму-д

1 4- ФК

15

10 №

5 10

Рис.8.Зависимости для а(рС)п(1), а(рС)п(2), <1(рА) (3), а(р.Т)п(4) и г-етеропраймёров, комплементарных ДНК фага М13(5) от числа мононуклеотидных звеньев в их составе(п ).

Рис.9. Зависимости логарифмов произведений отношений величин Ку и V , характеризующих сродство и максимальные скорости реакций полимеризации в случае декануклеотида сКрТ)пС(рТ)т и контрольного праймера а(рТ)эд от номера положения С-основа-ния в затравке с ошибкой ( № = I при т= 0, п= 9).

^ \ Гидрофобные взаимодействия /

\ аС°(Е'20Т) ~ - 6.4 кк/м. /

®-н

Дб = - 4,7 кк/м.

Матрица Праймер

-т-т-т.

- 1,2 кк/м.

11 II » II I I II II и '

Ад-д-д-д-д-д-д-л. л-он (З'-конец) у © 1 —3

т-рт- (5'-конец)

ле°(Д.Т) = ДС° = - 4,6 кк/м.

ДС°= - 1,2 кк/м.

Рис.10.. Термодинамическая модель узнавания матриц и праймеров ДНК- полимеразами( кк/м.- ккал/ыоль)

у(10)/у (о). На рис.9 приведены зависимости логарифмов этих произведений от положения некомплементарного матрице звена в праймере (№=1 при т = 0,п =9). Видно, что во всех случаях максимальное панлжение эффективности превращения праймеров с ошибками происходит если- некомплементарное звено находится во 2-ом или 3-ем положении с 3'-конца(160-1400 раз). Вероятность синтеза ¿(рТ)^рС(рТ)^ из а(рТ)р;рС меньше таковой в случае синтеза а(рТ)10 из а(рТ)6 примерно в 1,5-Ю8- 7,3*Ю10 раз . Таким образом, коррекция ошибки в коротких праймерах(п<10) достигается за счет диссоциации этих праймеров из комплекса с ферментом(в результате уменьшения их сродства)и снижения скорости превращения ( за один цикл присоединяется в основном 2-4 звена). Результаты по коррекции ошибок в праймерах длиной порядка 15 звеньев свидетельствуют об участии в этом процессе 3'-5'-экзонуклеазной активности ферментов (И, ДНК-пол.1).

На основании полученных данных сделан вывод о взаимодействии с ДНК-полимеразами только первого с 3'-конца нуклеотида праймера. Остальные звенья затравки вступают в комплементарные взаимодействия с матрицей. Оценены величины ДС° образования различных контактов праймеров с полимеразаыи и матрицами. Термодинамическая модель узнавания полимеразаии праймер-матричных комплексов

На основании совокупности полученных данных предложена термодинамическая модель узнавания ферментами матриц и праймеров. (рис.10). Основным факторов, обуславливавшим прочность комплекса матрицы и праймера на полимеразах, являются не их комплементарные взаимодействия, а контакты матрицы и 3'-концевого звена праймера с ферментами. Это объясняет проявление свойств инициирующих субстратов этилированными аналогами олиготимиди-латов и цщр , температуры плавления комплексов которых с матрицей в растворе ниже 0°С.

Величины ДС°, характеризующие образование А-Т и С«С пар дуплексов в растворе(- 1,2...-2,5 ккал/моль) существенно превышают таковые для матрично-затравочных комплексов, связанных с полимеразами( - 0,35..-0,5 ккал/моль). Это свидетельствует в пользу "разрыхления"структуры ДНК при связывании с ферментами. Предполагается, что в случае архебактериальных

ДНК-полимераз "разрыхления" структуры ДНК при 30°С в отличие от мезофильных полимераз происходит менее эффективно и

-19-

достигается путем повышен-.я температуры до 60-70°С.

Результаты исследований свидетельствуют в пользу адаптации структуры различных праймер-матричных комплексов при связывании с ДНК-полимеразами к наиболее оптимальной для протекания реакции полимеризации конформации дуплекса. Предполагается наличие взаимосвязи между исходной структурой праймер-матрич-ного комплекса в растворе (А-, В-формы и их вариации) с уровнем адаптации к оптимальной конформации и возможностью оптимальной подгонки 3'-концевого звена праймера до состояния когда он может выполнять роль акцептора нуклеотидных звеньев .

ЭКЗОНУКЛЕАЗНЫЙ ЦЕНТР ФРАГМЕНТА КЛЕНОВА Показано,тчто скорость накопления [^аАМР за счет ЭН-гидро-лиза поли(сЛ) [%] олиго(<ЗА) в отсутствие йАТР составляет -»4$ и возрастает при добавлении <ШР до 50-60% по сравнению со скоростью реакции полимеризации(100%). В условиях протекания реакции полимеризации преимущественно гидролизуется исходная часть праймера (30%), а скорость гидролиза вновь синтезированной части цеписоставляет 12-20% от скорости РП(реакц.полим.)

При переходе от й(рТ)2 к ¿(рТ)^ величина Ку для а(рТ) дв качестве субстрата ЭН-центра ФК уменьшается примерно в 9 раз, аУ возрастает в 190 раз(табл. 4). Таблица 4

Величины к^ и максимальной скорости превращения (v ) для олигонуклеотидов, найденные в реакции ЭН-гидролиза(ФК)

Олигонуклео-тид

а(РТ)2

й(РТ)3

¿(РТ)4

а(РТ)5

*<рТ)6

а(рТ)7

й(рТ)8

а(РТ)10

а(рТ)1б

4(рС)10

а(РА)10

В отсутст. поли(аА) В присутст. поли(аА)

V мкМ V, % К„, мкМ V, %

220*20 0,52 95*5 3,7

190*20 3,2 74*10 18,1

170*40 1,6 100*10 16,8

130*20 0,78 80*20 13,8

80*10 4,7 60*10 13,7

76*20 8,7 30*20 12,1

100*20 45,2 32*5 21,5

67±Ю 81,4 30*10 34,4

25*10 100,0 65*5 13,7

120*20 631,0 - -

62*10 616,0 - -

Скорость гидролиза «НрТ^ зависит от длины и структуры оли-го- или полинуклеотида, взаимодействующего с матричным участком ФК. Насыщение матричного участка ФК d(pT)g,d(pT)jq, d(pT)jg, d(pA)jQ . d(pC)jQ и поли(сЙ) приводит к возрастанию скорости гидролиза d(pT),,(0,4 мМ) соответственно в 1,1, 1,5, 4,2, 5,1, 4,0 и 7,1 раза. В то время как величины ^ для различных де-кануклеотидов практически не отличаются (табл. 4), скорость гидролиза d(pC)jQ примерно в 1,2 и 7,8 раза выше, чем d(pA)jQ и d(pT)jq, соответственно.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ФК является информационно активным ферментом, ЭН-активность которого зависит от длины и структуры матрицы. Получены данные о влиянии на сродство праймеров Ар^А, dllT? и НТР , взаимодействующих с ЭН-центром ФК.

Селективное ингибирование ЭН-центра ФК нуклеотидами и NaP

Селективное ингибирование ЭН-активности ФК с помощью ка? было открыто Михайловым с соавт.(1989). Нами было показано, что NaP (5-10 мМ) не влияет на величины К"м для матриц, праймеров и dNTP, но увеличивает скорость РП в 1,5-3 раза. Б присутствии селективных ингибиторов ЭН-активности ИаР и AMP ингибирование накопления Рн]йАМР- за счет гидролиза праймера (различные дуплексы) примерно в 5-40 раз меньше, чем увеличение скорости РП(например,рис. II). Полученные результаты согласуются с "миграцией" 3'-конца праймера меж,пу полимери-зуюшим и ЭН-центрами ФК ."выталкиванием" затравки под действием ИаРи AMP из последнего центра и фиксацией в участке узнавания праймера. Это приводит к увеличению скорости РП. Сделано предположение о том, что только 1-20% (в зависимости от матрицы и праймера) молекул, взаимодействующих с ЭН-центром успевают подвегаться гидролизу (за t существования комп.)

Показано, что все рибо- и дезоксирибонуклеозид 5'-моно-, ди- и трифосфаты, а также Ар^А взаимодействуют с ЭН-центром ФК и являются активаторами РП. В условиях насыщения ЭН-цент-ра НаР или нуклеотидами эффект активации исчезает и c|NMP или NMP ( и другие нуклеотиды) ингибируют реакцию полимеризации конкурентно по отношению к <штр-субстрату. Сделано заключение ., что вывод А. Корнберга о неспособности d NMP взаимодействовать с dNTP-связывающим центром ДНК-пол.I является ошибочным.

5 10 15 [АМР]-,мМ

А, %

»- АМР ЫаР

90

70

50

30

\

V

■ -1 2

1- 3

4

5

40

80 мин

15 20 0

[Nai-1, мМ

Рис.11. Активация полимеризуюшей и ингибирование 3'-5'-экзонуклеазной активностей ФК под действием АМР и НаР в случае поли(аТ)»(pA)jg матрично-затравочного комплекса.

Рис.12. Кинетические кривые инактивации ДНК-полимеразы I из Е. coli имидазолидами dTTP(0,I мМ; кривые 1-4).и dCTP(I0 мМ* $) в различных условиях: I и 5 - в присутствии поли(<1АЖрТ)jg, 2 - поли(бА), 3 - d(pT)jg, 4 -отсутствие матрицы и праймера.

ккал/моль

Рис.13. Зависимости свободных энергий Гиббса комплексообра-зования $К(1) и ДПЧ(ц) с <ШО> от времени удерживания последних на обрашенно-фазовом сорбенте при изократической элю-ции ( время выхода КН^РО^ принято за 0): I -dCMP, 2 -dTMP, 3 - dGMP, 4 - АДМР

1,2 Объем элюата, мл

«

Сделано,предположение о протекании ЭН-гидролиза праймеров с участием молекулы воды,активированной в результате ее взаимодействия с двумя ионнми локализовании , согласно данным рентгеноструктурного анализа, вблизи фосфатной группы сШМР.). Ингибирующий эффект фторид-иона обусловлен замещением ОН-груп-пы, возникающей при активации 1^0.

ПОЛИМЕРИЗУПЦИЕ сШТР -СВЯЗЫВАЮЩИЕ ЦЕНТРЫ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ Аффинная модификация ферментов аналогами нуклеотидов Имидазолиды<Ш1Р оказались перспективными для исследования сродства лигандов к йЛТР -связывающему центру ДПЧ и менее интересными для изучения ФК. Универсальным реагентом в случае ФК и ДПЧ был эпоксиАТР(эпАТР). Имидазолиды сШТР инактивиро-вали как первый, так и второй фермент. Однако в случае ДПЧ кинетические кривые инактивации имели сложный характер, что усложняло анализ получаемых даннных.

Инкубация ферментов с реагентами приводила к их инактивации только при одновременном присутствии матрицы, праймера и ионов Ме*"+ (напр^ер, рис. 12). Реагенты не модифицировали полимераз в отсутствие матрицы и праймера или в присутствии только одной из этих цепей. Инактивация ДПЧ 1п-бНМР не требовала комплементарноети реагента матрице, а 1т -<Ш!Р и эпАТР инактивировали ДНК-полимеразы только в присутствии комплементарной им матрицы. В случае акт. ДНК каждый из1и-4ИТР инак-тивировал ДНК-пол.I на 25%, при одновременном добавлении трех реагентов глубина инактивации достигала 50%, а увеличение числа нуклеотидов матрицы, комплементарных одному из реа-гентов(акт. центр) за счет транслокации дуплекса( добавляли 3 других <И1ТР )приводило к увеличению инактивации до ~70%.

Полученные результаты свидетельствовали в пользу формирования (ШТР -связывающих центров полимераз под действием матрицы и праймера.

Глубина инактивации ферментов возрастала при увеличении концентрации праймер-матричных комплексов и реагентов и достигала предельного значения при их насыщающих концентрациях. Инактивация ферментов соответствовала реакции псевдопревого порядка и протекала в соответствии с известными критериями аффинности модификации биополимеров. Величины К^для реагентов и конкурентных им лигандов, найденные с помощью АМ , а

также величины К Аи Ку для некоторых лигандов( использована РП) приведены в табл. 5. Таблица 5

Величины Кд комплексов Ж и ДПЧ с цуклеотидами и Р.^ найденные с помощью аффинных реагентов

Ка(К1 или

мкМ

Лиганд дай реагент Поли(аА>а(Рт)15 Поли(<ЗТ).<1(рА)10

ДПЧ,1ш-<имр дач, зпАТР Ж, эпАТР

Реагент 150(к=2,3-10"* 90(к= 4-Ю-2 16,2( 17,5)

мин--'-) мин-*) (к= г.б-ю-^ин-1)

10,0 - 230,0

йСМР 15,0 - 100,0

аТМР 9,0(20,0) 19,0 37,0

с1АМР 3,0(7,6) 6,4(8,0) 12,0

<асш> 11,0(15,0) - 100,0

«ювр 6,0 - -

<Ш>Р _ 6,4(13,0) _

йСТР 7,0(15,0)(СТР,3,0) - 200,0(СТР,72,0)

атгр 0,06(К.=3,1)( ,0,05) 11,3 36,0( ,30,0)

¿СТР 0,3(0,64)(СГР,03) - 8,0(СТР,7,0)

аАТР 0,8(0,76)(АТР, 0,7) 2,5(1^=13,7) (АТР,

(¡( -метиламид <ШР, 03) 4,0)

(1(1 ПР 0,03 (К -метиламид

аттр, 003)

х0шибка в определении величин не превышала 20-4С%.

Близость величин Кй , полученных из данных АМ и величин К^ , оцененных с помощью реакции полимеризации, свидетельствовала о извлечении с помощью этих подходов характеристик сродства к <1№ГР -связывающим участкам полимеризующих центров ферментов. Сравнение величин Ку и для ^^-субстратов (табл.5) показало, что первые величины не могут служить характеристиками сродства ДИТР к полимеразам. Несоответствие этих величин оказалось достаточно большим (Ку/Кд = 10-50).

Роль структурных элементов Д^тр в их узнавании ферментами Согласно данным по АМ, субстратному и ингибиторному анализу, ¿шр , ¿тир и <ШТР конкурируют за полимеризушие центры

ферментов, , но только <ЗНТР вступают в комплементарные взаимодействия с матрицей :сшмр и <ШТР в управляемом матрицей отборе нуклеотидов не участвуют. Полученные данные свидетельствуют в пользу существования двух типов комплексов (двух состояний) сШТР с полимеризуюшим центром фермента. Комплекс "первичного узнавания" реализуйтся в случае всех цуклеотидов, но переход нуклеотида в "каталитически компетентное состояние" происходит только для ¿ИГР .

Образование комплекса первого типа является результатом контактов ¿-фосфатной группы нуклеотида с белком и гидрофобных взаимодействий полиыеразы с основанием нуклеотида. Зависимости аС° комплексообразования ферментов с «и^Р от относительной гидрофобности их оснований ( оценены Оф-хроматографией) линейны ( рис. 13) Основной и приблизительно одинаковый вклад в узнавание йИМР ( и др. нуклеотидов) вносит фосфатная груша. Величины дС°позволяют предположить образование между ферментом и «С-фосфатной группой нуклеотидов электростатического контакта и водородной связи.

Сравнение величин Кй дляйНМР и ¿ИГОР свидетельствует об отсутствие заметного вклада в образование комплексов _уз-фосфата нуклеотидов. На стадии комплексообразовнния не играют существенной роли фуранозное кольцо ( сродство<штр и нтр отличается незначительно) и один из отрицательных зарядов ¡{ -фосфатной группы ( величины К^ для <1нтр и ¿(-амидов сштр достаточно близки).

Реализуемые в случаесшмр и<ш)р взаимодействия, скорее всего, являются первичными и определяют последующие взаимодействия фермента с ^-фосфатом <ШТР . Предполагается, что первичные дополнительные контакты ¿(-фосфатной группы с ферментом, образование которых в случае некомплементарных матрице <1№ГР приводит к возрастанию их сродства вплоть до 27 раз, являются запускающим механизмом управляемой матрицей подгонки нуклеотида до " каталитически компетентного состояния". Переход <ш?р из комплекса первичного узнавания в каталитически компетентное состояние , по-видимому, происходит путем синхронного образования контактов фермента с К-фосфатной группой и комплемента дар с матрицей. Верхняя и нижняя границы значений Д С0 образования дополнительных контактов ферлента с ^-фосфатом компле-

ментарных матрице <ШТР на основании всего массива полученных данных оценены в пределах - 0,1..-2,7 ккал/моль.

Контакты ¡(-фосфатной группы комплементарных матрице <ШТР при использовании вместо нуклеотидов их имидазолидов реализуются в фосфорилировании сближенных с концевым фосфатом нукле-офильных групп, что в итоге приводит к инактивации ферментов имидазолидами (ШТР . Отсутствие инактивации ДНК-пол.I некомплементарными 1т-&ЫТР свидетельствует в пользу необходимости для протекания реакции модификации фермента изменения конформации трифосфатной цепи нуклеотида. Это согласуется с лит. данными о конформационной перестройке трифосфатной цепи при связывании нуклеотидов с ДНК- и РНК-полимеразами ( 2ока-tei.ii , 1985.-1982)

Сделан вывод, что стадия комплексообразования обеспечивает не более 1-2 порядков точности синтеза ДНК. Однако, отсутствие процессов подстройки в случае некомплементарных матрице (ШТР является основным фактором повышения точности синтеза ДНК еше на 2-3 порядка на стадии катализа реакции полимеризации.

На основании совокупности данных по АМ ферментов аналогами нуклеотидов и избирательной модификации остатков тирозина активных центров ФК и ДДЧ N -ацетилимидазолом (АЮ предло -жена гипотеза о химическом механизме отбора матрицей комплементарных ей ¿ИГР

АИ избирательно модифицирует в белках остатки Туг , способные ионизироваться с высокой скоростью, практически не затрагивая других остатков АК (Уа11ее, 1965 )Инкубация ФК и ДЦЧ с АИ приводит к глубокой инактивации полимеризующих активностей ферментов(рис. 14). Данные по реактивации ферментов под действием гидроксиламина свидетельствуют об избирательной модификации с помощью АИ остатков Туг . АИ не затрагивает участков связывания матрицы и праймера. Различные лиганды, имеющие достаточно высокое вродство к ¿ЮТР-связываюшим центрам полимераз: ¿ШР, <ШБР, Р± , РР1 , некомплементарные матрице

(ШТР , а также смеси сШМР или (Ш)Р с Р± и РР1 не защищают ФК и ДПЧ от инактивации с помощью АИ. Практически полная зашита ферментов достигается при добавлении комплементарных матрице <ШТР или смесей комплементарных <ШМР и <ШЭР с

Рис. 14. Гипотетическая модель селекции ДНК-полимеразами комплементарных матрице <ШТР .

или РР.^ . Сделано заключение, что модифицируемые АИ остатки Тугактивных центров полимераз не принадлежат участкам связывания трифосфатной цепи <ШТР . Отсутствие защитных эффектов в случае нуклеотидов, способных образовывать с ферментами только комплексы "первичного узнавания" и полная зашита комплементарным матрице антР согласуются с экранированием остатка туг основанием нуклеотида в результате образования стекинга между ними после перехода нуклеотида в"каталитически компетентное состояние". На основании совокупности полученных данных предложена модель отбора комплементарных матрице алтр ( рис.14). Роль карбоксильной группы (одной из кислых АК), модифицируемой 1т-<ШТР, может заключаться в образовании водородных связей с нуклеофилом, образующим контакт с ^-фосфатом аИТР, и 0Н-

группой остатка Туг и удерживания таким образом ароматического кольца тирозина в состоянии, когда оно не способно вступать в стекинг с основанием сШТР . Конкуренция ¿'-фосфата и карбоксила за взаимодействие с нуклеофилом может приводить к смешению протона к цуклеофильной группе и образованию электростатического контакта последней с концевым фосфатом (ШТР . Последующее перемещение протона ОН-группы Туг к карбоксилу должно приводить к ионизации остатка Туг и увеличению его конформационной подвижности. Это создаст условия образования стекинга Туг с основанием нуклеотида. Дополнительная стабилизация конечного состояния, достигаемого при разрушении тройки: нуклеофил-карбоксил-Туг, может происходить за счет образования комплементарной пары между матрицей и сЮТР. Такая гипотетическая модель отбора антР , предполагающая образование комплемента между матрицей и (ШТР в качестве обязательного условия для разрыва контактов нуклеофил-карбоксил-тирозин, хорошо согласуется с отсутствием защитных эффектов в случае некомплементарных (ШТР и небольшим ускорением инактивации ФК при добавлении ащр.аыВР , Р1 и РР^о отдельности. Образование замкнутой тройки представляется полезным для объяснения дальнейших этапов реакции полимеризации, поскольку после диссоциации из комплекса с ферментом РРА(диссоциирует первым) возникает движущая сила возвращения остатка Туг к исходному состоянию. Такое перемещение остатка туг может быть начальным этапом транслокации праймер-матричного комплекса, которая,в целом, по-видимому, протекает за счет энергии расщепляемой пирофосфатной связи молекулы (ШТР.

Взаимодействие ДНК-полимераз с пирофосфатом

Проведено исследование влияния РРАи его аналогов на реакцию полимеризации, катализируемую ФК и ДПЧ (поли(аТ) • (рА)до комплекс; смеси для Ж содержали 5 мМ КаР). Полученные данные приведены в табл. 6. Видно, что РР1 и РРР1 конкурируют с &А.ТР за активные центры ферментов практически с одинаковым сродством. Метилендифосфонат (МДФ) и фосфоноуксусная килота(ФУК) хорошо моделируют РР1в случае ФК. Однако, лишь одна из фосфатных групп РР1может быть заменена на карбоксил. При переходе от ФУК к метилендикарбоновой кислоте сродство падает в

Таблица 6

Величины Н^ для РР1и его аналогов, найденные с помощью реакции полимеризации, катализируемой ФК и ДПЧ

Лиганд

Пирофосфат(РР1) 0,39 Триполифосфат(РРР1) 0,36

ФК

мМ

Ортофосфат(Р±)

10,0

Метилендифосфонат(Мда)0,24 Метилфосфонилфосфонат 30,0 Симм. диэтиловый эфир 51,0

мде

Тетраэтиловый эфир

Фосфономуравьиная кислота СФМК)

§осфоноуксусная кис-лота(ФУК)

С-этиловый эфир ФУК

Триэтиловый эфир ФУК

Уксусная кислота

Ме тилендикарбоновая кислота

Диметилендикарбоно-вая кислота

Триметилендикарбоно-вая кислота

57,5

2.5

0,14

3,2 280,0 19,3

6.6

7.1

8.2

Тип ингиб,

конкур.

бесконкур конкур.

бесконкур, конкур.

бесконкур.

дач

мМ

0,49 0,64 0,76 1,2

7,0 455,0

93,0

0,047

0,022

0,6 330,0

Тип ингиб.

конкур, бесконкур.

М

конкур.

смешанн. »

конкур.

47 раз, что может указывать на различный тип контактов, образуемых Ж с разными фосфатами молекулы РР^.

И®, его ди- и триэтиловые эфиры, а также С-этиловый и триэтиловый эфиры ФУК , имеющие характерное для РР1 расстояние между двумя группами, проявляют конкурентный по отношению к сШТР тип ингибирования. Отсутствие второй фосфатной группы в случае Р1_) уменьшение или увеличение расстояния между группами в ФМК и диметилен-или триметилендикарбоновых кислотах, соответственно, приводит к изменению типа ингибирования и уменьшению сродства в 7-21 раз. Следовательно, для одновремен-

ного взаимодействия двух фосфатных или моделирующих их карбоксильных групп молекулы лиганда с ферментом необходимо строго определенное расстояние между этими группами.

Уменьшение сродства этилированных производных Мда и ФУК в 23 - 2-Ю^раз по сравнению с ^модифицированными лигандами свидетельствует о важности для взаимодействия с ферментами отрицательных зарядов обеих групп молекулы PPi .

Полностью этилированные МДО и ФУК, не способные образовывать электростатических контактов, конкурируют с dATP за ДПЧ, но с очень низким сродством. Смешанный тип ингибирования в случае ФУК и ее этилового эфира, а также ФМК, по-видимому, является следствием наложения конкурентного ингибирования, характерного для Pi, РР± и PPPi , и бесконкурентного, который выя»ляется для МДФ и его производных, имеющих "-" заряды. Скорее всего, ФУК и ФМК взаимодействуют одновременно с двумя различными центрами узнавания фосфат-содержаших лигандов .

Карбоксил хорошо моделирует не только один из фостатов PPi , но и ¡f- фосфат молекулы dNTP . Сродство АТР и карбокси-метилфосфонил-5'-АМР к Ж и ДПЧ отличается незначительно. Учитывая это можно предположить, что конкуренция РР± и ФУК с dATP за активный центр ФК является следствием взаимодействия одной из фосфатных групп РР^^и карбоксила ФУК с участком связывания ¿(-фосфата dATP.Вторая группа лигандов может об--разовывать контакты с аминокислотным остатком ФК, освобождающимся для такого взаимодействия под действием dATP в соответствии со схемой рис. 14. Такой механизм взаимодействия РР^ его аналогов с ФК согласуется с бесконкурентным ингибировани-ем в случае II, посколы$г его связывание происходит после образования комплекса с, dATP.

Конкурентное по отношению к dATP ингибирование для РА в случае ДПЧ можно объяснить возможностью одновременного взаимодействия ортофосфата с участками связывания обеих фосфатных групп молекулы PPi с образованием комплекса Е *2Pi.

На основании совокупности полученных данных сделано заключение о том, что обе фосфатные группы РЕ вносят в сродство к ферментам приблизительно одинаковый вклад (1-3-Ю"2М). Увеличение сродства при переходе от dNDP к <штр( 30-50 раз) -сравнимо с вкладом в сродство к ферментам лишь одной из фосфатных

групп РР1. Это свидетельствует в пользу того, что не взаимодействующая с ферментом -фосфатная группа <ШТР после расщепления трифосфатной цепи нуклеотида в составе свободной молекулы РР1 образует с активным центром белка дополнительные контакты в соответствии со схемой рис. 14. По-видимому, фосфатная группа РР^^ перемещается в сформированнный под действием ¡¡-фосфата шгаручасток для её связывания. Эта модель особенно хорошо согласуется с результатами полученными в случае

Следует отметить, что в целом закономерности взаимодейст-вич ® и ДПЧ с нуклеотидами , РР1 и их аналогами достаточно близкие, хотя и есть определенные различия.

Заключение ■

Одним из результатов работы является разработка метода выделения ДНК-полимеразы Л. из плаценты человека и характериза-ция этого фермента.

К началу исследования метод аффинной модификации (АМ) практически не применялся для исследования ДНК-полимераз. Согласно теории АМ величины К^ для конкурентных реагентам лигандов могут быть оценены из зависимостей инактивации ферментов от концентрации этих лигандов. Однако этот подход не получил широкого распостранения, есть всего лишь 1-2 примера. В случае полимераз впервые продемонстрирована его продуктивность. Использование аффинных реагентов позволило максимально упростить исследуемые модели и изучить взаимодействие полимераз с матрицами и праймерами как по отдельности, так и при одновременном присутствии. Особенно эффективным оказалось использование в качестве моделей гомоолигонуклеотидов и их дуплексов (различной структуры и длины), а также их аналогов , модифицированных по различным структурным элементам. Монотонный характер изменения термодинамических параметров таких систем позволил выявить однотипные взаимодействия различных структурных элементов матриц и праймеров с ферментами (и в дуплексах этих лигандов). Сравнение гомо- и гетеро-систем с помошью АМ и стационарной кинетики привело к обнаружению геометрических прогрессий, с помошью которых можно описать узнавание полимеразами любой матрицы или праймера. По существу, с нашей точки зрения,

нет ограничений по структурным характеристикам лигандов, сродство которых может быть оценено с помощью модификаторов матричных участков полимераз. Методология , разработаннная для изучения взаимодействия НК с ДНК полимеразами, не имеет литературных аналогий, но представляется достаточно общей в применении к любым ферментам, взаимодействующим с одно- и двухцепо-чечными ДНК.

В АМ ДНК-полимераз проявляется динамика взаимодействия субстратов с активными центрами, взаимная конформационная адаптация субстратов и фермента на стадиях, предшествующих каталитическому превращению.С помошью аналогов нуклеотидов, модифицирующих ферменты только при одновременном присутствии матрицы и праймера, тестируются функционально значимые состояния полимераз с лигандами. С помощью АМ, группоспецифической модификации ферментов и кинетических подходов выявлен кооперативный характер взаимодействия между центрами.

В результате проведения работы обозначились новые перспективные направления в изучении ДНК-полимераз и пути исследования других ДНК-зависимых ферментов.

ВЫВОДЫ

I. Разработан общий комплексный подход к изучению механизмов взаимодействия ДНК-полимераз с матрицами,' праймерами и <штр, включающий различные варианты кинетического анализа, использование селективных ингибиторов, модификацию полимераз группоспецифическими реагентами, субстратный и ингибиторный анализ. Основой подхода является метод аффинной модификации, использованный впервые для детального структурно-функционального анализа ДНК-полимераз, оценки сродства лигандов к различным центрам ферментов. Созданы модельные системы, позволяющие проводить при минимальных затратах ферментов раздельное исследование комплексообразования полимераз с одним, двумя или тремя компонентами полной системы: фермент-матрица, прай-мер-сштр, а также с минимальными лигандами, содержащими отдельные структурные элементы каждого из компонентов.

В процессе исследования синтезирован ряд новых алкилиру-юших и Р1;2±содержаших производных олигонуклеотидов, а также, химически неактивных аналогов моно- и олигонуклеотидов, содержащих модификации по фосфатным группам, основаниям и

-32-

сахарным остаткам. Найдены аналоги для избирательной модификации матричных и ешт? -связывающих участков ферментов.

2. Проведен детальный анализ закономерностей взаимодействия ДНК-полимеразы человека и фрагмента Кленова с матрицами. Показано, что минимальными лигандами матричных участков ферментов являются отрофосфат и триэтилфосфат. С полимеразами взаимодействуют 19-20 нуклеотидных звеньев и лишь одна из меж-нуклеотидных фосфатных групп матрицы любой длины ( образует Ме^+-зависимый электростатический контакт и водородную связь за счет атома кислорода Р=0 группы). Оценен вклад А-, С-, Ти С-оснований в сродство матриц к полимеразам. Найдены алгоритмы оценки величин 1% комплексов ферментов с матрицами на основании данных об их структуре и длине.

Показано, что сродство матриц к ферментам возрастает в присутствии комплементарных им праймеров, но отношение величин Ка для любой пары матриц в присутствии и отсутствие праймера является величиной постоянной.

Сделано заключение о природе аминокислотных остатков, формирующих матричные участки ДНК-полимераз.

3. Проведен детальный анализ взаимодействия ДНК-полимераз с праймерами( исследовано 7 ферментов: полимеразы про-, эукариот, вирусов и архебактерий). Показано, что минимальными праймерами являются <1 шр и (или) ¡ШТР ; с ферментами взаимодействует только первый с З'-конца нуклеотид праймера ( электростатический контакт и одна или две водородные связи), а остальные звенья вступают в комплементарные взаимодействия с матрицей.

Предполагается, что в пределах каталитических субъединиц полимераз находится только 9-10 звеньев праймера. Оценен вклад уотсон-криковских взаимодействий между матрицей и прай-мером в эффективность образования тройных комплексов: Е«мат-рица-праймер. Выявлены геометрические прогрессии для описания изменения величин Ку в случае гомо- и гетеропраймеров при изменении их длины.

Найдены факторы, влияющие на абсолютные и относительные скорости превращения праймеров. Показано, что увеличение максимальных скоростей превращения праймеров при возрастании их длины описывается с помошью геометрических прогрессий.

Установлено, что эффективность взаимодействия праймеров с числом звеньев й 10, содержащих некомплементарные матрице основания, определяется числом оснований от первого с 3'-конца до некомплементарного основания. Наиболее эффективная дискриминация "корректных" и Некорректных" праймеров происходит в случае, когда некомплементарное звено находится во втором или третьем положениях с 3'-конца. Показано, что механизм исправления ошибок в коротких праймерах одинаков для всех исследованных поли-мераз.

4. Проведена оценка величин свободных энергий Гиббса, характеризующих образование комплексов ДНК-полимераз с матрицами и праймерами, отдельных электростатических контактов, водородных связей и гидрофобных взаимодействий этих лигандов с полимеразами; уотсон-криковских взаимодействий матриц и праймеров. Предложена термодинамическая модель узнавания ферментами праймер-матричных комплексов, согласно которой основным фактором, обуславливающим стабильность комплекса матр'йЦы и прай-мера после связывания с полимеразой, являются не их комплементарные взаимодействия, а контакты матрицы и 3'-концевого звена праймера с ферментом. Эта модель объясняет проявление при 30-60°С инициирующих свойств праймеров, комплексы которых

с матрицей в растворе плавятся при температурах ниже 0°С. Полученные данные свидетельствуют в пользу уменьшения эффективности комплементарных взаимодействий цепей дуплекса в комплексе с ферментом и "разрыхлении" структуры ДНК по сравнению с таковой в растворе.

5. Установлены закономерности изменения величин Ку и максимальных скоростей экзонуклеазного гидролиза для олиго-нуклеотидов при изменении их длины. Показано, что первые слабо зависят от структуры и длины олигонуклеотидов. Скорости растепления изменяются в зависимости от их цуклеотидного состава и длины, аналогичных параметров матриц и концентрации сШТР вплоть до двух порядков. Добавление ЫМР иНаР приво-. дит не только к селективному ингибированию экзонуклеазного центра ФК, но и увеличению скорости реакции полимеризации в 1,5-3 раза. Результаты согласуются с активацией реакции полимеризации под действием ингибиторов в результате "выталкивания" 3'-концевой зоны затравки из ЭН-центра в учас-

ток связывания праймера. В условиях насыщения ЭН-центра Наг происходит "демаскирование "ингибирушего действия ЫМР, обусловленного конкуренцией монофосфата с (ШТР за полимеризую-ший центр ФК.

6. На примере ДНК-полимеразы человека и ДНК-полимера-зы I из Е. сой проведено детальное исследование закономерностей взаимодействия полимераз с нуклеотидами в присутствии матрицы и праймера. Показано, что сродство <ШМР к ферментам не зависит от комплементарноети матрице и коррелирует с относительной гидрофобноетью оснований монофосфатов. Выявлено отсутствие заметного вклада в эффективность комплексообразова-ния нуклеотидов с ферментами их ^-фосфата, одного из "-". зарядов ¿[-фосфатной группы и фуранозного кольца.

Предложена модель отбора на стадии комплексообразования комплементарных матрице аитр, согласно которой первичные взаимодействия с ферментом оС-фосфатной группы и основания нуклеоти-да, реализуемые на уровне сДОМР и сШВР , необходимы для последующего образования контактов фермента с ¿'-фосфатом нуклеоти-да. Последние играют ключевую роль в реализации стекинга основания с остатком Туг и комплемента <ШТР с матрицей. Предполагается, что ОН-группа Туг взаимодействует с нуклеофилсм, образующим контакт с ¿'-фосфатом <ШТР за счет мостика из карбоксильной группы. Высказана гипотеза о важной роли остатков туг активных центров полимераз в процессах транслокации прай-мер-матричных комплексов.

7. Показано, что пирофосфат и ряд его аналогов являются конкурентными по отношению к йНТР ингибиторами реакции полимеризации, катализируемой ДНК-полимеразой ¿. человека и фрагментом Кленова. Предполагается близкий вклад двух фосфатных групп молекулы РР^з его взаимодействие с ферментом. Выявлена важная роль отрицательных зарядов и строго определенного расстояния между фосфатными группами РР1 при его комплексообразования с ферментом. Результаты свидетельствуют в пользу того, что невзаимодействующая с ферментом ^-фосфатная группа аытР после расцепления трифссфатной цепи нуклеотида в составе свободной молекулы образует с ферментом дополнительные контакты.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Левина A.C., Невинский Г.А. и Лаврик О.И. ДНК-полимераза1 Е. colt. Исследование механизма связывания инициирующего субстрата с помощью аналогов олиготимидилатов с этилированными меж-нуклеотидными фосфатными группами// Биоорган, химия.-1985.-Т.П.-№ 3.-С.358-369

2. Невинский Г.А., Подуст В.Н., Левина A.C., Халабуда О.В., Лаврик О.И. ДНК-полимераза <¿ из плаценты человека. Эффективность взаимодействия олиготимидилатов различной длины с участком связывания матрицы// Биоорган, химия.-1986.-Т.12.-№ 3.-

С.357-368

3. Nevinsky G.A., Levina A.S., Doronln S.V., Podust V.U., Lavrik 0.1. Procariotic and eucariotic ENA polymerases: the mechanisms of templates, primers and dNTP interaction with enzymes, in: Biophosphates and their analogues, synthesis, structure, methabilism and activity (Brusik K.S. and Stec E.J., Eds.) Elsevier, Amsterdam.-1987.-P.391-394

4.Невинский Г.А., Доронин C.B., Лаврик О.И. ДНК-полимераза I из E.colt: зависимая от праймер-матричного комплекса инактивация фермента имидазолидами дезоксинуклеозид-5'-трифосфа-тов// Биополимеры и клетка.-1985.-T.I.-№ 5.-С.247-253

5. Невинский Г.А., Левина A.C., Фролова Е.И., Подуст В.Н. Влияние некомплементарных матрице оснований на эффективность взаимодействия праймеров с ДНК-полимеразой JL из плаценты человека// Мол. биол.- 1987.-Вып.5.- С. II93-I200.

6. Doronin S.V., Lavrik O.I., ¡Гопаку G.A. The efficiency of dNTP complex formation with human placenta DNA polymerase <L as demonstrated Ъу affinity modification//FEBS Lett.-1987.-V.216.-No.2.-P.221-224

7. Веньяминова А.Г., Левина A.C., Невинский Г.А., Подуст В.Н. Сравнение эффективности взаимодействия рибо-и дезокси-рибопраймеров с ДНК-полимеразой cl из плаценты человека// Мол. биол.- 1987.-Т.21.-Вып. 5.- С. 1378-1385

8. Невинский Г.А., Фролова Е.И., Левина A.C., Подуст В.Н., Лебедев A.B., ДНК-полимеразы прокариот и эукариот.1. Роль меж-нуклеотидных фосфатных групп затравки в ее связывании с ферментом// Биоорган, химия.-1987.-Т.13.-№ I.-С.45-57

9. Lavrik O.I., Levina A.S., Nevinsky G.A., Podust V.N. The role of nucleoside components and internucleotide phosphate groups of oligodeoxyribonucleotide template in its binding to human DMA polymerase d.// FEBS lett.-1987.-V.216.-P.225-228

10. Невинский Г.А., Доронин С.В., Подуст В.Н., Лаврик О.И. Эффективность коыплексообразования цуклеотидов с ДНК-полимера-зой Л человека по данным модификации фермента их реакционно-способными аналогами// Мол. биол.-1987.-Т.21.-Вып. 4.-C.I070-1079

11. Лаврик О.И., Невинский Г.А., Потапова И.А., Хомов В.В. Модификация кленовского фрашента ДНК-полимеразы I из Е. coli ацетилимидазолом по остаткам тирозина// Мол. биол.-1988.-Т. 22.-Вып. 2.-С.485-491

12. Лаврик О.И., Невинский Г.А. Аффинная модификация ферментов: проблемы и перспективы//Итоги науки и техники. Биоорганическая химия.-1987.-Т Л3.-С.3-172

13. Knorre D.G., Lavrik 0.1., Nevinsky G.A. Protein-nucleic acid interaction in reactions catalyzed with DNA polymerases// Biochimie.-1988.-V.70.-P.655-661

14. Лаврик 0.И., Невинский Г.А., Подуст В.Н., Халабуда О.В. Очистка и характеризация ДНК-зависимой ДНК-полимеразы об из плаценты человека// Мол. биол.-1989.-Т.23.-№ 2.- С. 388-399

15. Лаврик О.И., Невинский Г.А., Потапова И.А., Тарусова Н.Б., Халабуда О.В. Модификация ДНК-полимеразы Л человека N-ацетилимидазолом // Мол. биол.- 1989.- Т.23.- Вып. 2.- С.400-408

16. Лаврик О.И., Невинский Г.А. Белок-нуклеиновые взаимодействия в реакциях, катализируемых ДНК-полимеразами эука-риот и прокариот// Биохимия.-1989.-Т.54.- Вып.5.-С.757-764

17. Волчкова В.А.,Горн В.В., Колочева Т.И., Лаврик О.И., Левина А.С., Невинский Г.А., Хомов В.В. Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I из Е. coli III. Роль межнуклеотидных фосфатных групп матрицы в ее связывании с ферментом // Бииоган. химия.-I989.-T.I5.-№ I.-С.78-89

18. Kolocheva T.I., Nevinsky G.A., Volchkova V.A., Levina A.S., Khomov V.V., Lavrik 0.1. DNA polymerase I (Klenow fragment): role of the structure and length of a template in enzyme recognition// FEBS Lett.-1989.-V.248.-No.1/2.-P.97-100

19. Nevinsky G.A., Nemudraya A.V., Levina A.S., Khomov V.V. The algorithm of estimation of the values for primers of various structure and length in the polymerisation reaction catalyzed by Klenow fragment of DNA polymerase X from E. coli// FEBS Lett.-1989.-V.258.-No. 1.-P. 166-170

20. Doronin S.V., Nevinsky G.A., Malygina Т.О., Podust V.N., Khomov V.V., Lavrik O.I. The efficiency of interaction of de-oxyribonucleoside-5'- mono-, di- and triphosphates with the active centre of E. coli DNA polymerase I Klenow fragment// FEBS Lett.- 1989.-V.259.-N0.1.-P.83-S5

21. Bukhrashvili I.Sh., Chinchaladze D.Z., Lavrik 0.1., Levina A.S., Nevinsky G.A., Prangishvuli Di A. Comparison of initiating abilities of primers of different length in polymerization reactions catalyzed by DNA polymerases from thermoacidophi-lic archaebaoteria// Bioohim. et Biophys. Acta.-1989.-V. 1008,-No.1.-P.102-107

22. Nevinsky G.A., Veniaminova A.G., Levina A.S., Podust V.N., Lavrik 0.1., Holler E. Structure-function analysis of mononucleotides and short oligonucleotides in the priming of enzymatic DNA synthesis// Biochemistry.-1990.-V.29.-No.5.-P.1200-1207

23.Подуст B.H., Коробейничева Т.О., Невинский Г.А., Рихтер В.А., Абрамова Т.А., Лаврик О.И. Матрица-праймер зависимая инактивация ДНК-полимеразы ^ из плаценты человека аденозин-2'-3'-рибоэпоксид-5'-трифоефатом// Биоорган, химия.-1990.-Т.16.-№ 2.-С.226-235

24. Невинский Г.А., Потапова И.А., Тарусова Н.Б..Халабуда О.В., Хомов В.В. Взаимодействие dNTP-связываших участков ДНК-полимеразы «¿человека и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из Е. coll с нуклеотидами, пирофосфатом и их аналогами-Мол. биол.-1990.-Т.24.I.-C. I04-II6.

25. Бухрашвили И.Ш., Лаврик О.И., Левина А.С., Невинский Г.А., Прангиввили Д.А. Сравнение эффективности взаимодействия прайме-ров, содержащих.некомплементарные матрице основания, с ДНК-поли-мерагой из экстремально термофильной архебактерии// Мол. биол.-I990.-T.24.-» 2.-С. 370-378

26. Лохова И.А., Невинский Г.А.,.Булычев Н.В.,-Горн.В,В., Левина А.С., Руденко Н.В., Кавсан В.М., Лаврик О.И. РНК-эависжая

ДНК-полимераза из вируса миелобластоза птиц: эффективность взаимодействия с олиготимцдилатами-праймерами различной длины// Мол. биол.-1990.-Т.24.2.-С.396-407

27. Невинский Г.А., Немудрая A.B., Левина A.C., Лохова И.А., Горн В.В., Хомов В.В. Влияние некомплементарных матрице оснований на эффективность взаимодействия праймеров с фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I из Б. coll // Мол. биол.-1990.-Т.24.

I.-C. 96-103

Подписано s печать is.oe.oor. МН 08725

Объем 1,77 печ.л. Уч.-изд.л. Заказ 276 Тираж 150 экз.

Отпечатано на ротапринте Вычислительного центра СО АН СССР. 630090, Новосибирск-90, проспект кадемика Лаврентьева, 6