Исследование взаимодействия нуклеотидов с ДНК-полимеразами методом Аффинной модификации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

ДОРОНИН Сергей Викторович

На правах рукописи УДК 547.963.32

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НУКЛЕОТИДОВ С ДНК-ПОЛИМЕРАЗАМИ МЕТОДОМ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ

02.00.10 — биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск 1990

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН ССОР.

Научные руководители: доктор химических наук Лаврик О.И.

кандидат химических наук Невинский Г.А.

официальные оппоненты: д.О.н. Дегтярев Сергей Харитонович

к.х.н. Кобец Нина Дмитревна

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии АН СССР

Защита состоится " гШ*? _1990 года

в часов на заседании Специализированного соЕе'та

К 003.b2.Ul в Новосибирском институте биоорганической химии по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект ак. Лаврентьва, И.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института Сиоорганической химии.

Автореферат разослан

'¡9 " Щи 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совега,кандидат химических наук

Федорова 0.0.

Характеристика работы.

Актуальность проблемы. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы (К.Ф.2.7.7.7.) одни из ключевых ферментов репликации ДНК. Они обеспечивают передачу генетической информации в ряду поколений живых организмов. Поэтому, изучение механизма действия ДНК-полимераз дает один из ключей к пониманию основ стабильности генома. Знание механизма действия этих ферментов может быть использовано для создания высоко эффективных противораковых, противовирусных и антибактериальных лекарственных средств.

Лель работы. Целью работы является I) исследование взаимодействия ДНК-полимераз с нуклеотидами 2) оценка вклада этапа связывания ферментами dKTP в наблюдаемую In vitro точность синтеза ДНК 3) сопоставление механизма действия ДНК-полимераз про- и эукариатического происхождения, ДНК-полимеразы а человека и ДНК-полимеразы I Е. coll 4) создание новых аффинных реагентов на основе нуклеотидов для необратимого подавления активности ДНК-полимераз.

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе описаны новые аффинные реагенты ДНК-полимераз, фосфо-рилирунцие аналоги нуклеотидов - имидазолиды dNTP и сШМР. Проведено исследование взаимодействия ДНК-полимеразы а п ДНК-полимеразы I с нуклеотидами. Впервые изучено влияние матрично-затравочного комплекса на это взаимодействие. Впервые проведена оценка вклада связывания ДНК-полимеразами dNTP в точность репликации ДНК в системе In vitro. Показаны общность и различие во взаимодействии ДНК-полимеразы а и ДНК-полимеразы I с нуклеотидами. Предложена оригинальная модель узнавания нуклеотидов ДНК-полимеразами.

Полученные данные по механизму действия ДНК-полимераз могут оказаться полезными при создании новых ингибиторов репликации ДНК.

Объем работы. Диссертация изложена на 124 страницах, включая 22 рисунка, 4 таблицы и список цитированной литературы (135 ссылок). Работа состоит из шести глав: Глава I -Введение, Глава II - Обзор литературы. Глава III - Материалы и метода, Глава IV - Результаты и обсуждение, Глава V -Выводы, Глава IV - Список литературы.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано § печатных работ. Результаты работы докладывались на I (Гатчина, 1984), II (Новосибирск, 1986), III (Тбилиси, 1988), IV (Пущино, 1990) Всесоюзных совещаниях "Энзимология матричного синтеза нуклеиновых кислот", International Symposium on Phosphorus Chemistry Directed Towards Biology (Poland, Lodz, 1987).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. Аффинная модификация ДНК-полимеразы I Im-dNTP.

Инкубация полимеразы с любым из Im-dNTP в отсутствие матрицы-затравки не приводит к изменению начальной активности фермента. Аналогичный результат был получен при добавлении к смеси полимеразы с одним из аналогов dATP или dTTP только poly(dA), poly (А) или poly(dT). Одинаковым образом фермент инактивировали Im-dATP и Im-dITP в присутствии дуплексов poly(A)»poly(dl), poly(dA)*poly(dT); Im-dCTP - в присутствии poly(dG)*poly(dC) (рис.1).

Для оценки сродства Im-dATP к ДНН-полимеразе I была исследована зависимость скорости инактивации фермента от концентрации реагента. Кажущаяся константа скорости реакции инактивации фермента (Ц^) равна к^^к/Ц+Кд/Н), где к -константа скорости модификации фермента в комплексе с аффинным реагентом, R - концентрация реагента, К^ - константа диссоциации комплекса реагента с ферментом. Величина К^ ком-

Рис.1 Кинетические кривые инактивации ДНК-полимеразы I. Кривые серии а): 3 мМ Im-dATP в отсутствие матрицы-затравки

(1), присутствии poly(А)

(2), poly((IT) - (3); б) - I мМ Im-dATP (1), 1 мМ Im-dITP (2) в присутствии poly(dG)« poly(dC); 0,1 мМ Tm-dATP (1), 1 мМ Im-dTTP (2), 1 мМ Im-dCTP (3) в присутствии активированной ДНК; г) - 0,1 мМ Im-dATP (1), 0,1 мМ Im-dTTP (2) в присутствии poly(dT)* poly(А), 0,1 мМ Im-dCTP (3) в присутствии poly(dG)*poly(dC).

Рис.2 Кинетические кривые инактивации ДНК-полимеразы I Im-dATP (0,1 мМ) в комплексе с poly(dT)»poly(А) в отсутствие (I) и присутствии dNTP: (2) - 1 мМ dCTP, (3) -1 мМ dGTP, (4) - 0,1 мМ dATP.

плокса ДНК-полимеразы I с Ira-dATP в присутствии poly(A)*poly(dT) была найдена равной 13 мкМ. Эта величина сопоставима с величиной Кт для dATP (14 мкМ). Можно предполагать, что введение заместителей по 7-фосфату dNTP не приводит к существенному уменьшению сродства аналогов dNTP к полимеразе по сравнению с исходными нуклеотидами.

Глубина инактивации фермента любым из Im-dNTP в присутствии дуплекса гомополимерных цепей, одна из которых комплементарна используемому аналогу нуклеотида, не превышает 50%. В присутствии активированной ДНК каждый из Im-dNTP инактиви-рует фермент только на 25% (рис.1). Такая ситуация объяснима, если предположить, что инактивация фермента Im-dNTP протекает в строго комплементарных комплексах матрицы и используемых аналогов. В пользу сделанного предположения указывает то, что Im-dATP и Im-dTTP в присутствии poly(dG)*poly(dC) не инактивируют фермент, тогда как, Im-dATP в присутствии poly(dT)*d(pT)10 инактивирует ДНК-полимеразу на 80-85%

Одновременное добавление dATP и Im-dATP в равных концентрациях в инкубационную смесь с ферментом и poly(A)*poly(dT) приводит к полной защите полимеразы от инактивации. При сравнимых концентрациях Im-dATP и любого из трех других dNTP защитного эффекта этих нуклеотидов не обнаружено. В то же время, добавление некомплементарных матрице dNTP в концентрациях, на порядок превышающих концентрацию Im-dATP, приводит к уменьшению скорости инактивации фермента в два раза (рис.2).Таким образом, центр связывания нуклеотидов ДНК-полимеразы I, модифицируемый Im-dNTP, узнает комплементарный матрице dNTP.

2. Аффинное мечение фрагмента Кленова и ДНК-полимеразы I [32Р1-Im-dNTP.

В отличии от ДНК-полимеразы I, фрагмент Кленова не

rt ~ I ~

инактивируется под действием реагента. Тем не менее, инкубация как ДНК-полимеразы I, так и фрагмента Кленова с [32Р]-Im-dATP приводит к ковалентному мечению ферментов.

то

Уровень ковалентного присоединения а-С Pl-Im-dATP или 7-[32Р]-Im-dATP к фрагменту Кленова или ДНК-полимеразе I не превышал 0,01 моля реагента на моль белка.

Образующаяся ковалентная связь остатка dATP с фрагментом Кленова устойчива в широком интервале величины рН (4-12) и температур (20-50°С) в течение 3 ч. Это свидетельствовует в пользу того, что мечение фермента обусловлено фосфорилирова-нием его ОН- или SH-rpynn.

Эффективность ковалентного мечения ДНК-полимеразы I и ее фрагмента Кленова не зависит от присутствия в инкубационной смеси полинуклеотидов и комплементарности реагента матричной цепи ДНК. Таким образом закономерности аффинного мечения ДНК-полимеразы I не соответсвуют закономерностям инактивации фермента под действием реагента. Можно предполагать, что инактивация ДНК-полимеразы I Im-dNTP не сопровождается кова-лентным присоединением остатка &NTP к ферменту.

Механизм удаления аффинного реагента из центра модификации может заключаться во внутримолекулярной реакции мезду активированной в результате фосфорилирования карбоксильной группы бежа со сближенным с ней нуклеофилом и образования внутримолекулярного эфира или амида. В пользу того, что этот механизм реализуется свидетельствует изменение pl модифицированного белка (pl 5,8) по сравнению с нативным (pl 5,3), при инкубации ДНК-полимеразы с Im-dATP в присутствии poly(dT)*d(pA)10. Форма ДНК-полимеразы I с возросшей величиной pl появляется при инкубации фермента в условиях его инактивации Im-dATP. В присутствии poly(dG)*poly(dC) или в отсутствие полинуклеотидов, появления формы белка с pl 5,8 не наблюдается. Неинактивируемый аналогом фрагмент Кленова не изменяет величины pl. Таким образом, инактивация фермента сопровождается образованием внутримолекулярного эфира. По-

видшаому, образование внутримолекулярной сшивки является причиной инактивации ДНК-полимеразы I при инкубации фермента с Im-dNTP.

Добавление в инкубационную смесь dATP приводит к защите фрагмента Кленова от мечения Im-dATP. Защитный эффект dATP проявляется в отсутствие голинуклеотидов, в присутствии poly(dl) шш poly(dG)*poly(dC). В присутствии poly(dI)*d(pA)10 dATP не защищает фермент от мечения. Добавление в инкубационную смесь dAMP такие не приводит к защите фермента от модификации Im-dATP. Аналогичные данные были получены в случае ДНК-полимеразы I. Эти результаты позволяют предполагать, что в присутствии матричво-затравочного комплекса существует центр, с которым образуют комплексы некомплементарные матрице dNTP, но не dNHP или комплементарный dNTP. В то же время, как следует из данных по инактивации фермента Im-dNTP, ДНК-полимераза обладает центром для преимущественного связывания комплементарного матрице dNTP. Таким образом, у ДНК-полимеразы I в присутствии матрицы-затравки имеется два центра связывания dHTP, либо два состояния комплекса фермента с нуклеотидом.

По-видимому, взаимодействие dNTP с ДНК-полимеразой протекает следующим образом. Как в присутствии, так и в отсутствие матрицы-затравки, происходит формирование комплекса "передварительного" узнавания нуклеотида ферментом. Компле-ментарность dNTP матрице обуславливает переход данного комплекса в каталитически компетентное состояние. То, что инактивация ДНК-полимеразы I Im-dNTP определяется комплементарностью аналога матрице отражает факт образования Уотсон-Криковских связей основания реагента с основанием матричной цепи ДНК. Следствием этого является сближение 7-фосфата реагента с карбоксильной группой белка. Это сближение, по-видимому, происходит в результате конформационного перехода аналога из состояния комплекса "предварительного узнавания" в "каталитически компетентный" комплекс фермента

с 1т-(ШТР. Совокушость излаженных выше данных позволяет так ке предполагать, что каталитически компетентный комплекс фермента с нуклеотидом образуется в присутствии матрица и праймера. В отсутствие ДНК или в присутствии одноцэпочечного полинуклеотида образования данного комплекса не происходит.

3. Аффинная модификация фрагмента Кленова 1т-сШР.

Инкубация фрагмента Кленова с Ьп-йТМР не приводит к заметной инактивации 3', 5' -экзонуклеазной активности фермента. В то ке время, аналог инактивирует полимеризупцую функцию фермента как в отсутствие ДНК, так и в присутствии матрицы или матрично-затравочного комплекса (рис.3). Аналогичные данные были получены и в случае ДНК-полимеразы I. Моано полагать, что модификация ферментов 1т-<ШР протекает вне 3',5'-экзонуклеазного центра . Поскольку инактивация ферлен-тов 1т-с11НР не зависит от присутствия ДНК следовательно, центры связывания матрицы и праймера не модифицируются данными реагентагли.

о?

Инкубация фрагмента Кленова с СолР]-1т-йТЫР приводит к его ковалентному меченив. Закономерности инактивации и мече-вия ферментов 1т-<ИШ? совпадают. Уровень ковалентного присоединения составлял 0,3-0,4 молей реагента на моль белка, при выделении модифицированного фермента гельфильтрацией, что приблизительно соответсвует наблюдаемой глубине инактивации фермента (50-60%). Ковалентное присоединение моано было бы считать близким к стехиометряческому. В то ее время, после разделения инкубационной смеси с помощью электрофореза уровень ковалентного присоединения был найден близким к 0,03-0,05 молям реагента на моль белка.

Ковалентная связь остатка йКМР с фрагментом Кленова оказалась кислотолабильной. Для фермента, меченного ЬгмЗТНР в отсутствие ДНК, константа скорости демодафакации составляет 0,02 мин-1(рН 5,50°С). В случае мечения фрагмента Кленова в

Рис.З Кинетические кривые инактивации фрагмента Клено-ва 1т-сИЫР (0,5 мМ) в реакциях 3',5'-экзонуклеаз-ного гидролиза (7) и синтеза ДНК: (I) - в отсутствие полинуклеотидов и в присутствии (2) - ро1у((1А)»е1(рТ)10 (3) - ро1у(<Ш, (4) -ро1у(<Ш*й(рТ)10 и (ШТ (0,1 мМ), (5) - ро1у(йА)#с1(рТ)10 И сИГТР (0,1 мМ), (6) -ро1у(е1А)*сЦрТ)дС1(рС), (8) -ро1у(с1А)*й(рГ)10 и РР1 (0,1 мМ).

присутствии poly(dA)*d(pT).|Q , данная величина соответствует 0.03 мин-1. Полученные величины близки между собой и сопоставимы с константами скоростей гидролиза имидазолидов монофосфатов ( 0,04 мин-1), найденными в аналогичных условиях (Godovikova T.S. at al.,1987). Можно полагать, что модификация фрагмента Кленова и ДНК-полимеразы I заключается в фос-форилировании имидазольного кольца остатка His. Таким образом несоответствие уровней ковалентного присоединения реагента, найденных с помощью электрофореза и гель-фильтрации, обусловлено демодификацией белка в ходе электрофореза ( 2-3 ч), в результате переноса остатка dNMP на нуклеофильные компоненты буфера.

Добавление в инкубационную смесь dNTP при водит к защите фрагмента Кленова от модификации реагентом (рис.4). Использование ОАТР ( К1=0,1 мМ) или dTTP ( Km=3 мкМ) в концентрациях 0,1 мМ приводит к частичной защите фрагмента Кленова от модификации аналогом в присутствии polydMi'dinT^Q. Полная защита фермента от инактивации наблюдается при более высоких

концентрациях dNTP (I мМ). Защита фермента от модификации с помощью некомплементарного матрично-затравочному комплексу нуклеотида ( dATP ) достигается при концентрации, сопоставимой с величиной Kj. В то ке время, для проявления защитного аффекта комплементарного нуклеотида ( dlTP ) его концентрация должна существенным образом превышать величину Кш. Кроме dNTP, защитный эффект оказывает РР^ и праймер имеющий на 3'-конце звено, некомплементарное матричной цепи ДНК (d(pT)gd(pG)). Цо-видимому,комплементарный матрице субстрат способен адаптироваться к каталитически компетентному состоянию, в то время как, "неправильный" субстрат оказывается "замороженным" в состоянии "предварительного" узнавания нуклеотида.

4. Эффективность взаимодействия нуклеотидов с активным центром фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I.

Величины К^ комплексов фрагмента Кленова с нуклеотидами были найдены их по конкуренции с 2',3'-рибоэпокси-АТР (эпокси-АТР). При добавлении этого реагента к ферменту происходит его полная инактивация ,в присутствии комплементарной аналогу матрицы с праймером. Зависимая от времени инактивация фрагмента Кленова не сопровождается ковалентным присоединением остатка эпокси-АТР к ферменту, а обусловлена образованием прочного комплекса фермента с матрицей и праймером, терминированным остатком зпокси-АМР (Catalano С.Е. and Benkovic S.J.,1989).

Добавление в инкубационную смесь нуклеотидов приводит к защите фрагмента Кленова от ингибирования эпокси-АТР. Используя зависимость величины k^g скорости инактивации фермента от концентрации защищающего лиганда были найдены величины сродства нуклеотидов к ферменту.

WI/(I+V(I+S/K3>/R>

где S - концентрация защищающего лиганда, а Кя - константа

Таблица I. Величины К^ комплексов фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I с нуклеотидами в присутствии ро!у(<1Т) - матрицы и с1(рА)^д - праймера.

Нуклеотид кй' ДС, ккал/моль

мкМ

йСМР 100 -5 ,7

(ЗТМР 37 -6 ,3

сЮМР 30 -6 .4

сЗАМР 12 -7 ,0

йСБР 100 -5 ,7

(ЗАПР 14 -6 ,9

(ЗСТР 200 -5 .3

сЗТТР 36 -6 ,3

сЮТР 8 ** -7 ,2

сЗАТР 2,5 ( 14 )** -7 .9

Ошибка в определении величин сродства нуклеотидов к ферм менту не превышает 30-50%.

В скобка! величина для (ЗАТР.

***Величины К^ для орто- и пирофосфата 230 ( ДС=-5,2 ккал/моль ) и 130 мкМ, соответственно.

диссоциации комплекса фермента с защищающим лигандом. Данные по величинам сродства нуклеотидов к фрагменту Кленова приведены в таблице I. За связывание с активным центром фермента помимо (ШТР конкурируют сДОМР, <Ш)Р, орто- и пирофосфат.

Найденная величина сродства (ЗАТР к ферменту (2,5 мкМ) практически не отличается от величины К^ (5 мкМ) комплекса фермента с <1АТР» найденной при исследовании кинетики синтеза ДНК фрагментом Кленова в нестационарном режиме (М1ггаМ V. ег а1., 1985).

Величины констант диссоциации комплексов фрагмента Кленова с <ШР возрастают в порядке: ¿СМР<йТМР<сЮМР<с1АМР. Зависимость АО связывания фрагментом Кленова сШМР от АС сорбции соответствующего нуклеозида на обраЩеннофазовом сорбенте КРС-18 носит линейный характер (рис.4). Таким образом,

Рис.4 Зависимость AG образования комплексов ДНГС-полимеразы а человека (I) и фрагмента Кленова ДНК-гголимеразы I E.coli (2) с dNMP от величины AG_ сорбции

а

соответствующих нуклеозидов на обращеннофазовом сорбенте RPG-18.

Ч» 12 iß

-ДОд, ккдл/моль

сродство dNMP к ДНК-полимеразе определяется гидрофобностью их оснований. Комплементарность нуклеотида не играет существенной роли. Прямая отсекает на оси ординат величину AG (5,2 ккал/моль), соответствующую величине Kd для ортофосфата. Можно предполагать, что ортофосфат является минимальным лигандом, связывающимся с активным центром фермента. Можно так же полагать, что величина AG, отсекаемая на оси ординат, является величиной AG связывания а-фосфатной группы нуклеотида на ферменте. Эта величина сопоставима с величиной энергии одной электростатической связи. По-видимому, при формировании комплекса нуклеотида с активным центром фермента образуется электростатический контакт с его а-фюсфатом. Тангенс угла наклона получающейся прямой (1,9) близок к 2 . Согласно ( Клесов A.A., Березин И.В. в кн. Ферментативный

катализ, М., Изд-во Моск. ун-та. ,1980,ТЛ.) это может означать, что при образовании комплекса фермента с нуклеотвдом происходит вытеснение кластера молекул воды из центра связывания лиганда.

Переход от сШМР к (ЖОР не увеличивает сродства к ферменту как комплементарного (<ШЭР), так и некомплементарного матрице нуклеотида (сЗОР). Можно полагать, что р-фосфатная группа нуклеотида не вносит заметного вклада в связывание с ферментом. При переходе от (ШМР к сШТР происходит усиление связывания только в случае комплементарного матрице <ЗАТР. Скорее всего, это отражает образование дополнительных контактов 7-фосфата нуклеотида с ферментом.

Для (ШТР величины констант возрастают в порядке: йСТР«1ТТР<(1СТР«1АТР.Величины К^ комплексов некомплементарных сЮТР близки к величинам К^ комплексов, найденных в экспериментах по равновесному диализу (Еп§1шс1 Р.Т. еХ а1., 1969). В случае с1АТР, комплементарного матрице субстрата, наблюдается уменьшение К^ нуклеотида примерно в 13 раз, что соответствует возрастанию свободной энергии связывания на 2,2 ккал/моль. Известно, что свободная энергия образования А-Т пары ДНК дуплекса на ферменте составляет 0,35 ккал/моль (Невинский с соавт., 1988). Следовательно, помимо образования Уотсон-Криковских связей с матрицей, комплементарный нуклео-тид формирует дополнительные контакты с белком с величиной Ав порядка 1,85 ккал/моль. В формировании этого контакта, по-видимому, участвует 7-фосфатная группа сШТР.

В целом,комплементарный матрице сШТР связывается ДНК-полимеразой от 3 до 80 раз более эффективно, чем некомплементарные субстраты.

5. Аффинная модификация ДНК-полимеразы а 1т-(ЗЖР.

Заметная инактивация ДНК-полимеразы а 1т-йТМР наблюдается в присутствии матрично-з а траво чного комплекса ро1у(4А)*

20

Рис.5 Кине тиче ские кривые инактивации .ДНК-полимеразы а человека 1т-йТМР (0.2 мМ) в присутствии: (1)

ро1у(<1А)*й(рТ)15, (2) ро!у((1А)»с1(рТ)15 и <ИТР (0,6 мкМ), (3) - ро1у(си)»с1(рТ)15 и ЙТТР (60 мкМ), (4) -ро1у(с1А) и (5) - отсутствие полинуклеотидов. Инактивация фермента Ьп-йСМР (0,2 мМ) в ¡ГГ^н присутствии ро1у(<Ы)*с1(рТ)15 (6).

d(pT)1g. В отсутствие затравки, или полинуклеотидов добавление аналога не приводит к заметному изменению активности ДНК-полимеразы. В присутствии poly(dA)*d(pT)15 как Im-dTMP, гак и Im-dCMP инактивируют фермент с одинаковой эффективностью (рис.5). Таким образом, инактивация фермента практически не зависит от комплементарности реагента матричной цепи ДНК. По-видимому, как и в случае ДНК-полимеразы I, образование комплекса фермента с матрицей и праймером существенным образом изменяет его взаимодействие с нуклеотидом.

С помощью зависимости kj^ скорости инактивации фермента от концентрации реагента была оценена величина К^ комплекса фермента с Im-dTMP (150 мкМ).

Добавление в инкубационную смесь dNTF приводит к защите фермена от инактивации Im-dNMP. Следовательно, Im-dNMP модифицируют <ЖГР-узнающий участок фермента. Кроме dNTP, защитный эффект проявляют dNDP, diMP, NTP, а так же ортофосфат. Из зависимостей kj^ инактивации ДНК-полимеразы а от концентрации защищающих лигандов били оценены их величины сродства к ферменту.Beличины сродства лигандов к ферменту приведены в таблице 2. ■

ТаСлица 2. Величины Kd комплексов ДНК-полимеразы а с

нуклеотидами в присутствии poly(dl) -матрицы и d(pA)1п - праймера.

Нуклеотэд К^ (К^ или Km)* AG, ккал/ыоль

мкМ

dCMP 15 -6,8

<ЗШР 9 (S3) -7,2

dGMP 7(6) -7,3

dAMP 3 -7,8

dCDP II -7,0

dTDP 7 -7,3

dGDP Ь -7,4

dCTP 7(15) -7,3

dTTP 0,06(3,1) -10,2

dGTP 0,3(0,64) -9,3

ClATP 0,8 -8,7

7~ме тиламид-dTTP 0,03 -10,7

7~ме тиламид-dATP 0,3 -9,3

Ошибка в определении величин сродства нуклеотидов к ферменту не превышает 30-5056.

Б скобках величина Kffl для dITP, в остальных случаях в скобках приведены величины К^.

Величины сродства для cLNMP (dl'MP и dGMP) и некомплементарных матрице CLNTP ( йСТР и dGTP ) соответствуют значениям Kj. Это свидетельствует в пользу того, что найденные величины сродства для dNHP и некомплементарных матрице ciNTP близки к величинам К^ комплексов этих нуклеотидов с ферментом. В то же время, величина для для OTP приблизительно в 50 раз больше найденной величины его сродства к ферменту. Поскольку в данном случае возможен вклад защитного эффекта праймэра, удлиненного на одно мононуклеогидное звено и находящегося в нетранслоцированном состоянии, то необходимо было оценить величину Кд комплекса фермента с сИЧР с помощью его аналога, не являющегося субстратом. В качестве такого аналога был использован т-ме тиламид-dITP. Было установлено,что 7~мегиламид-dITF не является субстратом в реакции синтеза

* **

ДНК.

Величины К^ для dTTP и dATP и их 7-метиламидных производных практически не отличаются. Можно сделать вывод, что величина сродства dTTP соответствует величине К^ его комплекса с ДНК-полимеразой а.

Как и в случае фрагмента Кленова, зависимость величин AG образования комплексов ДНК-полимеразы а с dNMP от величин AG сорбции соответствующих нуклеозидов имеет линейный характер. Порядок увеличения сродства к ферменту в ряду dNMP (dCMP<dTI£P<dGMP<dAMP) определяется относительной гидрофоб-ностью их оснований. Тангенс угла наклона этой зависимости равен 1,2, что позволяет предполагать, что при образовании комплекса фермента, с нуклеотидом из центра связывания не происходит вытеснения кластера молекул вода. При экстраполяции полученной зависимости к нулевому значению AG сорбции лиганда на оси ординат отсекается величина, равная 6,6 ккал/мсл»\ Эта величина превышает аналогичную для фрагмента Кленова ( 5,2 ккал/моль ) на 1,4 ккал/моль. По-видимому, можно предполагать, что в случае ДНК-полимеразы а электростатический контакт ос-фосфата нуклеотида с ферментом более эффективен, чем у ДНК-полимеразы I. Нельзя так же исключить возможность того, что в случае ДНК-полимеразы а, образуется дополнительная, водородная связь а-фосфатной группы нуклеотида с ферментом.

Переход от dNMP к соответствующим dNDP не приводит к увеличению сродства нуклеотидов к ферменту, что указывает на отсутствие заметного вклада (3-фосфата dNDP во взаимодействие с ДНК-полимеразой а.

При переходе от некомплементарных матрице dNMP к соответствующим (ГОР происходит увеличение сродства нуклеотидов к ДНК-полимеразе а от 2 до 27 раз.В случае dTTP, сродство возрастает в 150 раз. Разница в AG связывания dTMP и dTTP составляет 3,1 ккал/моль, что существенно превышает абсолютную величину AG образования одной А-Т пары ДНК дуплекса в раст-

воре (1,35 ккал/моль, Долинная Н.Г., Громова Е.С., 1983.). Можно предполагать, что связывание комплементарного матрице нуклеотида усиливается не только образованием комплементарной пары мевду основанием dNTP и основанием в матричной цепи ДНК, но и за счет дополнительных контактов т-фосфатной группы нуклеотида с активным центром фермента. Не исключено, что образование дополнительных контактов нуклеотида с ферментом, как и в случае ДНК-полимеразы I, является в результатом кон-формационного перехода комплекса нуклеотида с ферментом из состояния "предварительного" узнавания в каталитически компетентное состояние. В целом, комплементарный матрице dITP связывается ферментом от 13 до 116 раз более эффективно, чем некомплементарные субстраты.

ВЫВОДЫ.

1. Исследована аффинная модификация ДНК-полимеразы I и ее фрагмента Кленова Im-dNTP. Показано, что инактивация ДНК-полимеразы I Im-dNTP происходит в присутствии комплементарной реагенту матрицы с праймером, по-видимому, в результате образования внутримолекулярного эфира на ферменте. Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I не инактивируется под действием данных реагентов. Незначительный уровень ковалентного присоединения остатка dNTP к ДНК-полимеразе I или фрагменту Кленова при их модификации Im-dNTP обусловлен фосфорилирова-нием ОН- или SH-групп ферментов и не зависит от присутствия ДНК.

2. Исследована аффинная модификация ДНК-полимеразы I и ее фрагмента Кленова Im-dNMP. Показано, что происходит модификация dNTP-связывающего участка ферментов не являющегося активным центром, в результате фосфорилирования остатка His.

3. Исследована аффинная модификация ДНК-полимеразы а из плаценты человека Im-dNMP. Показано, что эти реагенты модифицируют dNTP-узнакщий участок активного центра фермента.

Инактивация ДНК-полимеразы a Im-dNMP не зависит от комплементарное™ реагента матрице, однако, протекает исключительно в присутствии дуплекса комплементарных цепей ДНК. 4. Впервые проведен развернутый анализ взаимодействия фрагмента Кленова и ДНК-полимеразы а с нуклеотидами в присутствии матрицы с затравкой. Установлено, что с активным центром ферментов образуют комплексы dNMP, dNDP, dNTP и ортофосфат. Комплементарные матрице dNTP образуют комплексы с фрагментом Кленова от 3 до 80 раз более прочные , чем некомплементарные субстраты. В случае ДНК-полимеразы а, связывание правильного субстрата происходит от 13 до 116 раз эффективнее. Отбор комплементарных матрице нуклеотидов осуществляется ДНК-полимеразой в случае dNTP, но не dNMP или dNDP, в результате образования Уотсон-Криковских связей основания субстрата с основанием матричной цепи ДНК и дополнительных контактов с ферментом у-фосфатной группы нуклеотида. Образование комплексов dNMP, dNDP и некомплементарными матрице dNTP происходит за счет гидрофобных взаимодействий и электростатического контакта их a-фосфатной группы с активным центром фермента.

По материалам диссертации опубликованы работы:

1. Г.А. Невинский.С.В. Доронин, Лаврик О.М. ДНК-полимераза I E.coll: зависимая от праймер-матричного комплекса инактивация фермента имидазолидами дезоксинуклеозид-5'-трифосфа-тов.// Биополимеры и клетка - 1985 - T.I - С.247-253.

2. Г.А. Невинский, C.B. Доронин, В.Н. Подуст, О.И. Лаврик Эффективность комплексообразования нуклеотидов с ДНК-полимеразой а человека по данным модификации фермента их реакционноспособными аналогами.// Молекуляр. биология - 1987 - Т.21 - C.I070-I079.

3. S.V. Doronin, 0.1. lavrik, G.A. Nevinsky, V.N. Poduat The efficiency of dNTP complex formation with human placenta DNA polymerase a as demonstrated by affinity modification.//

FEBS Lett. - 1987 - V.216 - P.221-224.

4.G.A. Nevinsky, A.S. levlna, S.V. Doronln, V.N. Podust, 0.1. Lavrlk Procaryotlc and eucaryotic DNA polymerase: the mechanisms of templates, primers and Interaction with the enzymes.// Proceedings oi the 2nd International Symposium on Phosphorus Chemistry Directed Towards Biology, Lodz, Poland - 1987 - P.391-394.

5. S.V. Doronln, G.A. Nevinsky, T.O. Malyglna, V.N. Podust, V.V Khomov, 0.1. Lavrlk The efficiency of interaction of deoxyribonucleoside-5'-Diono-, di- and triphosphates with the active centre of E.coli DNA polymerase I Klenow fragment.// FEBS Lett. - 1989 - V.259 - P.83-85.

Подписано к печати з.ю.эог.

Формат бумаги 60x84/16 Объем М печ.л.

Уч. изд. л. 1, э Заказ695 Тираж 100 экз.

УД СО АН СССР