Закономерности взаимодействия ДНК-полимераз с матрицами на примере фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из Е. coli. тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 547.963.32

КОЛОЧЕВА Татьяна Ивановна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ С МАТРИЦАМИ НА ПРИМЕРЕ ФРАГМЕНТА КЛЕНОВА ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ I ИЗ E.coli.

02.00.10 — биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕ PAT

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирк 1990

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР.

Научные руководители: доктор химических наук Лаврик О.И.

кандидат химических наук Невинский Г.А.

Официальные оппоненты:

доктор химических-наук Малыгин Э.Г. кандидат химических наук Бунева В.Н.

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии и биологической физики

АН ГССР, г. Тбилиси.

.1 < ) 1 .. Зашита состоится НС. ХЦ/^-Л' 1990 года

часов на заседании Специализированного совета

К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической

химии по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект ак.

Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии.

Автореферат разослан

Учений секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук

ОЕЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы являются ферментами, ответственньми за точный синтез ДНК в живых клетках. К настоящему времени ДНК-полимеразы выделены из различных источников и биохимически достаточно хорошо охарактеризованы. Однако, несмотря на значительный прогресс в изучении этих ферментов, информация о природе взаимодействия, т.е. типе связей с матрицами и праймерами, в литературе практически отсутствует. До недавнего времени для исследования участков связывания матриц ДНК-зависимых полимераз в основном использовались классические методы, типа: центрифугирование ферментов с различными ДНК в градиенте плотности сахарозы или глицерина и анализ ингибирования реакций полимеризации модифицированными ДНК. Причем исследования первого рода носят в основном качественный характер, а интерпретация результатов ин-гибиторного анализа не всегда однозначна ввиду сложности анализируемой системы. Это требует развития для изучения полимераз новых подходов, адекватных рассматриваемым проблемам и требующих для проведения экспериментов минимальных количеств 5елка. Одним из достаточно перспективных методов исследования ферментов является аффинная модификация. С помощью этого под-:ода количественные характеристики комплексообразования фер-ентов с различными лигандами могут быть получены из зависи-остей скоростей инактивации фермента от концентрации аффин-ьк реагентов и конкурентных им лигандов. Этот метод практи-ески не применялся для исследования ДНК-полимераз и пока не элучил широкого распространения для исследования других фер-энтов.

Цель работы. Основной задачей исследования было изучение ;ханизма узнавания матриц ДНК-полшераэой I из E.coli, роли 'дельных структурных элементов матриц в их комплексообразо-.нии с ферментами. В задачу работы входил поиск (синтез) аф-нных реагентов для избирательной модификации матричного участка ДНК-полимеразы I.

Научная новизна и практическая ценность работы. Синтезирован ряд неописанных ранее Pt -содержащих олигонуклеотидов, избирательно модифицирующих матричные участки фермента. С по-

мошыо этих реагентов оценено сродство матричного участка фрагмента Кленова .НЩ-полимеразы I (SK) к различным лигандам, включая олигонуклеотиды различной структуры и длины. Выявлена роль межнуклеотидных фосфатных групп и оснований матрицы в ее взаимодействии с ферментом, а также типы связей, образуемых этими структурными компонентами матриц с полимеразой. Найдены простые алгоритмы оценки сродства матриц на основании данных об их структуре и длине. Предложена термодинамическая модель узнавания ДНК-полимеразой I матрично-затравочного комплекса. Результаты работы представляются важными для понимания механизмов репликации и белково-нуклеиновых взаимодействий.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на YI симпозиуме СССР-Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Ленинград, 1988), Международном совещании по перспективам применения производных олигонуклеотидов (Новосибирск, 1988), III Всесоюзном совещании "Матричный синтез нуклеиновых кислот" (Тбилиси, 1988), Двухстороннем симпозиуме СССР-Франция "Физико-химические основы жизни" (Бордо,

1988), II Двухстороннем симпозиуме СССР-США "Структура эука-риотического генома и регуляция его экспрессии" (Тбилиси,

1989), III Всесоюзной конференции "Макромолекулы клетки" (Москва, 1989), Конференции "Современные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989).

Публикации. По теме диссертации опубликовано б научных работ.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов работы и их обсуждения и выводов. Работа изложена на 133 страницах, включая 4 таблицы и 13 рисунков. Список цитируемой литературы включает 151 работу.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. Синтез аффинных Р-Ь^-содержаших реагентов.

Одним из наиболее универсальных подходов в исследовании ДНК-полимераз независимо от их доступности и структурной организации представляется метод аффинной модификации (AM). Этот метод позволяет оценивать величины констант диссоциации (KJ

комплексов фермента с лигандами по инактивации специфической активности в процессе его модификации аффинным реагентом (АР) в отсутствие или присутствии конкурентного ему лиганда.

Одним из важных факторов при выборе АР является возможность селективной модификации белка. Перспективными являются также такие АР, ковалентная связь которых с белками может быть разрушена с помощью каких-либо реагентов. Этим условиям вполне удовлетворяют производные цис- Р^^ЫНд^С^ •

Ранее (Невинский и др., 1986) для АМ матричного участка ДНК-полимеразы << из плаценты человека (ДПЧ) был использован реагент Ь(Тр)2С[Р12+(ЫН3)20Н](рТ)7 (М|-реагент). В данной работе методика синтеза этого реагента была усовершенствована, а также синтезирован ряд ранее не описанных реагентов, которые были применены для изучения механизма функционирования ДНК-по-лимераз: <з(Тр)2е[Р12+(ын3)2он](рТ)7 (М2-реагент), сКТр)2А[Р12+(Ш3)20Н](рТ)7 (Мд-реагент), с/[(Тр)2С(Р12+(ЫН3)2 0Н)р13Т (М4-реагент), с1(рС)[Р12+СШ3)20Н] (рТ) и (М5-реагент). При инкубации с цис-аквагидроксидиамминоплатиной в мягких условиях (0,02 М НЕРЕБ/КОН буфер, рН 6,5; 4-6 час при 20°С) соответствующие олигонуклеотиды превращались на 90-95% в продукты с зарядом на единицу меньшим, чем у исходного олигонуклео-тида. При обработке цис-аквагидроксидиамминоплатиной сЦ(Тр)2Ср]3Т образовались продукты с зарядами на 2 и 3 единицы меньшими, чем у исходного декануклеотида.

Гомогенные по данным микроколоночных ионообменной и обра-шенно-фазовой хроматографий целевые продукты были получены препаративной хроматографией на БЕАЕ-целлюлозе в градиенте КС1 (2($ этанол) с последующей гель-фильтрацией. Выход продуктов составил 40-50%.

Полученные соединения были охарактеризованы с помощью УФ-спектров и анализа на содержание остатков платины. УФ-спектры М^-М^-реагентов практически не отличались от таковых для исходных олигонуклеотидов. Доказательство включения платины в А, С и С-содержашие олиготимидилаты получено с помощью двух методов: колориметрическим анализом сожженных образцов платиновых реагентов с помощьюЗг£!12 по стандартной методике и методом атомно-адсорбционной спектрометрии с электротермической ато-мизацией. Показано, что М -М - и М -реагенты содержат 1,05±

0,15 моль платины на моль реагента, а Мд-реагент - 3,15-0,15 молей платины на моль олигонуклеотида. Полученные данные свидетельствовали о преимущественной модификации остатков А, С и С в использованных для синтеза М^М^-реагентов олигонуклеоти-дах и отсутствии заметных количеств молекул с двумя остатками

II. Модификация фрагмента Кленова Р42"*"-реагентами.

Известно, что фрагмент Кленова (ФК) обладает 3'-5>-экзонук-леазной активностью, и, следовательно, Р^+-реагенты подвергаются зкзонуклеазному гидролизу ферментом. Для подавления деградирующей олигонуклеотиды активности фермента использовали ее селективный ингибитор - ЫаЕ (Михайлов к др., 1989). Показано, что в присутствии ЫаР и МпС^ или в их отсутствие ФК инактивируется М|-М^-реагентами. Показано отсутствие влияния ЫаР на параметры, характеризующие сродство матриц, праймеров и ЫТР к ФК. Сделано предположение, что ингибирование экзонук-леазного центра ФК происходит в результате замены 0Н~-группы активированной двумя ионами молекулы вода на ион

Показано, что модификация ФК М^М^-реагентами протекает как в присутствии, так и в отсутствие ионов Мп?+. Однако сродство реагентов к матричному участку фермента в присутствии ионов металла примерно на порядок выше, чем без них. Анализ данных по инактивации И различными реагентами в присутствии и отсутствие ионов

показал, что наиболее удобным для исследования детальных характеристик АМ фермента является ¡^-реагент.

Как видно из рис.1, зависимость логарифма остаточной активности ФК от времени при его модификации (^-реагентом имеет линейный характер. Это указывает на псевдопервый порядок реакции модификации ФК и позволяет оценивать кажущиеся константы скоростей инактивации (*каж) полимеразы при фиксированных концентрациях М^-реагента. С помощью зависимостей величин 1<каж инактивации полимеразы от концентрации реагента (в обратных координатах) найдены величины К^ комплекса ФК с М^-реагентом в присутствии ионов (К^=0,3 мкМ) и в их отсутствие (К^=4,3 ыкМ). Олигоцуклеотиды сКрТ) и сКТр^ССрТ^ защищали ФК от инактивации М^реагентом. Из зависимостей величин 1<хаж

Рис.1. Зависимость логарифма остаточной активности фрагчента Кленова от времени его инкубации с Мт-реагентоы в концентрации: Ш - 0,7 мкМ;

(2) - б ыкМ;

(3) - 30 мкМ.

Активность фермента (А) в начальный момент времени принимали за единицу.

0,4 0,8

сКрГ)10 ,мкМ

Рис.2. Зависимость обратных величин йкаж скорости инактивации фрагмента Кленова от концентрации сКр'Пэд при фиксированной концентрации М ^реагента (2 мкМ).

инактивации ФК от концентрации d(pT)jQ в присутствии ионов Мл2+ (рис.2) и концентрации сИТр^ССрТ)^ в отсутствие ионов металла при фиксированной концентрации Mj-реагента были найдены величины К^ комплексов фермента с этими декануклеотидами. Они оказались равньши соответственно 0,07 и 4,5 мкМ. Таким образом, введение Pt^"-содержащей группы в состав олигонуклеоти-да не приводит к существенному изменению его сродства к ферменту по сравнению с ^модифицированными декануклеотидами.

В принципе, ДНК-подимвразы имеют два центра, способные связывать олиго- и полинуклеотиды: участки связывания матрицы и праймера. Эти центры взаимозависимы. Из литературы ( Fisher et al. , 1979) известно, что сначала ДНК-полимераза связывает одноцепочечную нуклеиновую кислоту (матрицу) и только после этого способна узнать и связать праймер. Нами исследовано влияние праймеров на сродство Mj-реагента к ФК. Показано, что в присутствии комплементарного реагенту праймера его сродство возрастает. Однако соотношение величин К^ для двух матриц различной длины в присутствии и отсутствие праймера является величиной постоянной. На основании совокупности полученных в работе результатов и литературных данных по исследованию праймеров различной структуры и длины (Невинский и др., 1987-1989) сделано заключение о селективной модификации Р12+-реагентами матричного участка ФК.

III. Роль природы оснований и длины матрицы в ее взаимодействии с фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I.

С помощью Mj- и М^-реагентов были получены величины Kd комплексов матричного участка, ФК с различными олигонуклеотидными матрицами. Используя гомоолигонуклеотиды сКрТ^, оКрО^, d(pG)a> d(pA)a, а также гетероолигонуклеотиды различного состава и длины, было проведено исследование роли природы оснований и длины матрицы. Сродство этих олигонуклеотидов к матричному участку фермента определяли с помощью защитных эффектов данных матриц от инактивации ФК Mj- и М^-реагентами.

На рис.3 приведены зависимости -IgKj от числа мононуклео-тидных звеньев в составе сКрС)п, d(pT)a, й(рС)„, и d(pA)a- При переходе от минимального лиганда, ортофосфата, к d(pN) и далее к олигоцуклеотидам d(pH)n. (а=19-20) величина ¿С0 компле-

Рис.З. Зависимость отрицательных значений логарифмов К^ комплексов фрагмента Кленова с гомоолигонуклеотидами от числа мононуклеотидных звеньев в их составе (п): (I) - ¿(рС)п; (2) - сКрТ)п; (3) - сКрА)п; (4) - с1(рС)п.

ксообразования фермента с лигандаыи изменяется линейно. При увеличении длины сКрО^., сКрТ)а, сКрС)„., с1(рА)п на одно звено происходит возрастание сродства в 1,58, 1,78, 1,95 и 1,95 раза

- коэффициент для основания), что соответствует изменению дС° на -0,28, -0,35, -0,40 и -0,40 ккал/моль. Изменение К^ для любой из рассматриваемых серий гомоолигонуклеотидов происходит в соответствии с убывающей геометрической прогрессией:

К^=26 мкМ-а/Я"-, где 26 мкМ - величина К^ для ортофосфата, коэффициент увеличения сродства олигонуклеотида при удлинении на одно звено, п - число мононуклеотидных звеньев в олигонуклеотиде.

Как видно из рис.3, при п.=19-20 величины К^ для олигонуклео-тидов перестают изменяться. Это может быть объяснено взаимодействием с активным центром фермента только 19-20 мононуклеотидных звеньев матрицы, что согласуется с предположением А.Корн-берга (Корнберг А., 1977) о наличии контактов 20 нуклеотидных звеньев матрицы с ДНК-полимеразой I, сделанном на основе оцен-

ки диаметра молекулы (65 X) фермента и размера одной комплементарной пары дуплекса ДНК, а также с данными по защите ферментом от нуклеазного растепления сКрЮ^д олигонуклеотида ( Рвгг1п ег а1., 1986).

Было сделано предположение, что вклад различных оснований в сродство соответствующих им гомоолигонуклеотидов и гетеро-олигоцуклеотидов не отличаются. Учитывая это, величины К^ комплексов фермента с различными гетероолигонуклеотидами были рассчитаны по формуле:

К,=26 мкМ'(1/1,58) -(1/1.78Г'(1/1,95)Р-(1/1,95)^, где I, пг, р, с^ - соответственно число оснований С, Т, С, А в составе олигонуклеотида.

Эти величины, а также экспериментально полученные для оли-гонуклеотидов величины Ка приведены в таблице I. Видно, что в пределах точности эксперимента они практически не отличаются.

Таблица I. Величины констант диссоциации комплексов фрагмента Кленова с олигонуклеотидами различной структуры и длины.

к<1» мкМ

Олигонуклеотид

пяссчитаннмр полученные рассчитанные экспериментально

д(рТрАрАрТрАрСрУрА) и, 14 и, 17

д(рСрТрСрСрСрТрТрАрС) 0,12 0,13

а (рАрАрТрСрАрТрСрСрТрСрАрТ) 0,013 0,015

с1(рСрА)5 0,07 0,06

с1(р6рА)5 0,024 0,015

с!(рСрА)3 0,40 0,45

с1(рСрТ)б 0,011 0,009

Ошибка в определении констант не превышает 20-30%.

Совокупность полученных данных может свидетельствовать в пользу того, что нуклеотидный состав матрицы определяет эффективность ее взаимодействия с ДНК-полимеразами. Однако независимо от длины олигонуклеотида его сродство к ферменту не должно превышать сродства сКрА^д (К^ примерно 0,1 нМ). Дополнительное увеличение сродства матрицы происходит за счет ее комплементарных взаимодействий с праймером.

1У. Роль межнуклеотидных фосфатных групп матрицы в ее

взаимодействии с фрагментом Нленова ДНК-полиыеразы I.

Роль межнуклеотидных фосфатных групп матриц в их связывании с ФК исследована с помощью аналогов олиготиыидилатов, частично или полностью этилированных по межнуклеотидным фосфатным группам. Известно, что присутствие фосфотриэфирных узлов в матрице не сказывается на специфичности полимеразной реакции (Поздняков, 1988). Было показано, что частичное эти-лирование межнуклеотидных фосфатных групп незначительно уменьшает эффективность комплексообразования (в 1,5-2 раза). В то же время сродство полностью этилированных олигонуклеоти-дов примерно в 16-20 раз меньше, чем неэтилированных той же длины.

Известно, что, если молекула лиганда взаимодействует с биополимером несколькими типами связей, то величина ¿6° образования комплекса белка с лигандом равна сумме величин аС°, относящихся к отдельным типам взаимодействий. Большой вклад в сродство к ферменту ортофосфата (дС°=-6,5 ккал/моль) и линейное изменение ¿5° при переходе от а(рТ) к с!(рГ) ^9_20 свидетельствует о том, что только одна из межнуклеотидных фосфатных групп матрицы взаимодействует с ферментом.

Комплекс полимеразы с триэтилфосфатом имел ^=290 мкМ, что в 11,2 раза больше величины К^ для ортофосфата. Аналогичное уменьшение сродства М^-реагента к ферменту (в 14,3 раза) наблюдается при исключении из инкубационной смеси ионов марганца. На основании этих данных величину образования Независимого электростатического контакта между матрицей и ФК можно оценить близкой -1,1...-1,7 ккал/моль.

Из сравнения величин К^ для неэтилированных, частично и полностью этилированных олиготиыидилатов (табл. 2) видно, что алкильные группы, связанные с межнуклеотидными фосфатными группами матриц (за исключением одной из них, блокирующей атом кислорода, образующего с ферментом Ме^+-зависимый электростатический контакт), существенного вклада в сродство к ФК не вносят. В связи с этим эффективное связывание триэтил-фосфата может происходить, вероятно, только за счет образования связи меж^у белком и атомом кислорода Р=0 группы. Величи-

на лС образования комплекса с триэтилфосфатом сопоставима с величинами ¿0° образования I лигандами (Фершт Э., 1980).

величинами ¿0° образования водородных связей с белками и их

Таблица 2. Величины К^ комплексов ФК и ДПЧ с различными лигандами, найденные с помощью М^-реагента.

К^.мнМ К^мкМ Лиганд ---зд Лиганд

с|(тР)7т

фк дпч

КН2Р04 26 53 с1[Тр' (Е1)Тр]дТр1 (ЕОТ 0,48 0,33

(^ОдРО 290 600 о1 [Тр"(ЕI)Тр]дТр"(Е$Т 0,48 0,39

с1(Тр) - 25 сЦТрСЕО] 17Т 4,8 2,3

с!(рТ) 10,4 15 с«(Тр)9Т 0,065 0,15

с1(рТ)2 6,5 8,3 а(Тр)8Тр' (ЕОТ"" - 0,12

^(рТ)3 - 5,3 сКТр^Тр'ЧЕОТ"' - 0,13

с1(рТ)4 2,1 - а(Тр)10Т 0,045 0,077

с1(рТ)5 - 2,2 с1(Тр)14Т 0,004 0,0091

с1(рТ)7 - 0,73 с11Тр(ЕО! и1'" - 0,081

»Ошибка в определении величин К^ не превышала 20-40$. «»Приведены данные (Невинский и др., 1987) »«• Обозначения р' (Е-1) и р"(Е1) соответствуют индивидуальным диастереомерам этилированных олигонуклеотидов, обозначение р(Е4.) - смеси диастереомеров.

Таким образом, можно сделать вывод, что только одна из меж-нуклеотидных фосфатных групп матрицы образует с ферментом водородную связь и электростатический контакт.

Совокупность результатов, полученных в данной работе по исследованию взаимодействия матриц и праймеров с ФК, а также литературных данных по механизмам связывания праймеров с ДНК-по-лимеразами (Невинский и др., 1987-1989) можно описать с помощью термодинамической модели образования комплексов ФК с матрицей и праймером (рис.4). Анализ термодинамических характеристик образования контактов фермента с матрицей и 3'-концевым звеном праймера, а также комплементарных взаимодействий

Н Ме2+—@

/£=-4,7—

ккал/моль ^ дС=-1,2 ккал/моль - 6 4 ккал/моль _Р_ / ^ ^СГ

-Т-Т-Т- Т-Т-Т-Т Т-Т-|-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т- Т-Т-Т- (5'конец)

-ОН (3'-конец)

0__ Ме2+-""0 Оу • Н _(Е) ^(А-Т)10=-3'5ккал^моль^=-1,2 ккал/моль

^ 43=-4,6 ккал/моль

Рис.4. Гипотетическая схема образования комплекса фрагаента Кленова с матрицей сКрТ)^ и праймером сКрА)^.

между цепями дуплекса показывает, что основным фактором, определяющим стабильность дуплекса на ферменте, являются не комплементарные взаимодействия матрицы и праймера, а их контакты с ферментом. Пониженная стабильность дуплекса комплементарных цепей в комплексе с ДНК-полимеразами может быть необходимой для облегчения "диссоциации" продукта реакции в раствор или в корректирующий экзонуклеазный центр фермента при включении в праймер некомплементарного матрице звена.

У. Исследование устойчивости связей Р12+-реагентов с нуклеофильными группами аминокислотных остатков матричного участка ФК.

Как было показано выше, матричный участосФК взаимодействует с олигонуклеотидами длиной 19-20 1фгклеотидных звеньев. Иначе говоря, он состоит из 19-20 подцентров, каждый из которых взаимодействует с одним нуклеотидныы звене»! матрицы. Эти под-центры взаимодействуют как с пуриновыми, так и с пириыидино-выми основаниями матрицы. Причем основный вклад в узнавание отдельных нуклеотидов матрицы вносят гидрофобные взаимодействия. Однако модификация матричного участка $К М^-Мд-реагента-ми свидетельствует о наличии в рассматриваемых подцентрах аминокислотных остатков, несущих нуклеофильные группы, способ-

ные взаимодействовать с ионом платины этих реагентов. Различная скорость инактивации $К Мj-Mj-peareH так и (рис.5) может указывать либо на модификацию этими реагентами аминокислотных остатков, отличающихся по реакционной способности по отношению к платине, либо на модификацикиаминокислотных остатков одной и той же природы, но в различной степени сближенных с ионом Pt2+.

О природе модифицируемых платиной аминокислотных остатков можно судить по устойчивости связей иона платины с этими остатками. Как известно, коордкнацимацнонные связи иона платины с двумя цепями модифицированной цис-дихлордиамминоплатиной ДНК могут быть разрушены цианид-ионами или тиомочевиной (Bauer et al., 1978, Filipeki et al., 1979).

Шло показано, что координационные связи с атомами азота гетероциклов Ado, Cyd и Cuo достаточно стабильны. Реакция отшепления при использовании ЫаСЫ в концентрации 100 мМ и температуры реакции 70°С протекает наполовину за времена равные 30, 22,5 и 70 час соответственно для Mj-, Mg- и Мд-реагентов, содержащих модифицированные платиной С, С и А осно-

Рис.5. Кинетические кривые инактивации фрагмента Кленова реагентами Мт (I), Мр (2), Мо (3) в присутствии ЫаР и и восстановления активности°инактивированного фермента при его

инкубации с ЫаСЫ (5мМ). (4) - соответствует инкубации фермента с сКТр^ЫСрТ)^ (Ы=С,6,А). Стрелкой показан момент добавления ЫаСЫ.

вания.

На следующем этапе была исследована устойчивость связей иона платины с различимая нухлеофильныыи группами, модифицируемыми реагентом в матричном участке $К.

Как было показано выше, в использованных для восстановления активности условиях разрушения связей Р4. с атомами азота гетероциклов ¡^-Ид-реагентов не происходит. Следовательно, реактивация модифицированных реагентами препаратов ФК при инкубации с цианидом, вероятнее всего, обусловлена разрушением связи между ионом платины и нуклеофильной группой фермента, а не ионом платины и основаниями реагентов (рис.5).

Из рис.5 видно, что практически полное восстановление активности для Ж, инахтивированного Мд-реагентом, достигается за 5 час. Для препаратов фермента, модифицированных М2- и реагентами, реактивация с учетом .глубины инактивации за это же время составляет приблизительно 70 и 50$, что может свидетельствовать в пользу модификации этими реагентами аминокислотных остатков различной природы. В параллельном эксперименте был синтезирован {^-реагент, содержащий на 5'-■конце фосфатную группу. После проведения инактивации £К этим реагентом на 60-805 в реакционную смесь добавляли ЫаСЫ и подвергали дополнительной инхубации. На рис.6 представлены кинетические кривые отщепления метки в процессе инкубации с ЫаСЫ. Видно, что в условиях восстановления активности фермента на 50% происходит отшепление приблизительно 45-5С^ радиоактиной метки. Практически полное отшепление оставшегося количества метки происходит только прн .более аестких условиях.

Эти данные свидетельствуют о том, что М|-реагент модифицирует в матричном участке $К аминокислотные остатки, образующие с ионом платины координационные связи с различной устойчивостью. По-видимому, и в случае Н^-реагента неполное восстановление активности модифицированного фермента при инкубации с ЫаСЫ является следствием модификации этим реагентом нук-леофильных групп аминокислотных остатков различной природы. Полученные результаты слузлт хорошим аргументом в пользу предположения о формировании матричного участка ШК с помощью различных гидрофильных аминокислотных остатков. Это предположение согласуется с относительно невысокой гидрофобностью мат-

Рис.6. Кинетическая кривая демодификации меченного [^P]-Mj-реагентом фрагмента Кленова при его инкубации с NaCN (5 ыМ) при 30°С (I) и 70°С (2). Стрелкой показан момент увеличения температуры до 70°С.

ричного участка фермента.

Выигрьш в свободной энергии при переносе одного звена матрицы из йодного окружения на фермент составляет приблизительно -0,28...-0,40 ккал/моль. Эта величина сопоставима с &G0 переноса цуклеозидов из воды в 4-6 M водный метанол (-0,47 ккал/моль) (Хинц, 1982). Это сопоставление свидетельствует в пользу таличия в подцентрах матричного участка ДНК-полимёразы наряду с аминокислотными остатками, обеспечивающими их гидрофобность, также и гидрофильных остатков. Иначе говоря, матричный участок фермента, скорее всего, имеет гидро-фобно-гидрофильную природу.

Одним из подходов установления модифицированных в белках АР аминокислотных остатков без применения пептидной химии является установление стабильности связей, образуемых этими реагентами, с соединениями, моделирующими аминокислотные остатки. В качестве модельных соединений использовали [^С]-метанол (моделирует ОН-группу Ser и Тге), [^С]-уксусную кислоту (карбоксил Asp или Glu), [%]-имидазол (имидазольное кольцо His), 114С]-фенол (ОН-группу Туг), [14С]-метиламин (NHg-rpynny lys), [ ^С ] -м е тилгуанидин ( гуанидиниевую группу A[ Н]-

2-меркаптозтиламид dTTP (SH-группу Qys) И [14С]-ыетионин. На основании совокупности полученных данных исследованные нуклео-фильные группы в составе соединений, моделирующих таковые в составе аминокислот, можно разделить на три группы. К первой группе относятся гуанидиниевая группа Arty, гидроксильные группы Туг», Sei* и Тге и карбоксильные группы Asp и GIu, которые не дают устойчивых комплексов с ионом платины. Ко второй группе относится имидазол. Отшепление ]-имидазола от реагента происходит достаточно быстро, также как и образование связи. Третья группа, которую образуют алифатическая аминогруппа и сера-содержашие группы, легко вступают в реакцию с платиной и образуют устойчивые связи, которые можно разрушить лишь при повышенных температуре и концентрациях ЫаСЫ.

Проведенное исследование по образованию комплексов Mj-pea-гента с меченными соединениями и устойчивости этих комплексов в присутствии ЫаСЫ пока не позволило установить конкретные аминокислотные остатки матричного участка ФК. Определенно можно лишь сказать, что в матричном участке фермента есть аминокислоты, образующие как менее, так и более прочные связи с ионом платины.

На основании полученных результатов могут быть сделаны сле-датошие выводы. Очевидно, что матричный участок ФК содержит гидрофильные аминокислотные остатки, способные образовывать координационные связи с ионом платины. Гидрофобные структурные элементы этих же аминокислот непосредственно или ь совокупности с полностью гидрофобными аминокислотами формируют матричный участок фермента, близкий по своей гидрофобности к 4-6 М водному метанолу. Матричный участок фермента включает гидрофильные аминокислотные остатки различной структуры. Одни из них образуют достаточно устойчивые координационные связи с ионом платины, а другие менее устойчивые. Модификация фермента Mj-Mg-peareHTaMH, содержалшми ионы платины по атомам азота в различных структурных элементах пуриновых и пиримидиновых оснований свидетельствует в пользу расположения гидрофильных аминокислотных остатков подцентров матричного участка фермента вблизи различных структурных элементов оснований матрицы.

Кроме того, учитывая данные по восстановлению активности инактивированного ФК (рис.5) и результаты по демодификации

фермента, меченного [^Р]-М |-реагентом (рис.6), необходимо отаетить, что М^реагент взаимодействует, как минимум, с двумя типами аминокислотных остатков в матричном участке ФК. Модификация различных нуклеофильных групп одним и тем же М^ реагентом может быть следствием двух причин. С одной стороны, после образования комплекса реагента с матричным участком фермента он может свободно скользить по этому участку, и таким образом модифицированное платиной основание вступает в контакты с различными подцентрами ОС. В результате образование в большей или меньшей степени устойчивых координационных связей Р12+ может быть следствием модификации реагентом различных подцентров матричного участка. С другой стороны, не исключено, что две нуклеофильные группы различных аминокислот сближены в одном и том же подцентре. После образования комп-декса с ферментом 1^-реагента ион платины может быть расположен вблизи этих нуклеофильных групп. В результате альтернативного протекания реакции может произойти образование координационной связи как с одной, так и с другой группой.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые исследована возможность модификации ФК реакци-онноспособными аналогами матриц: ¿(Тр)2С[Р12+ШН3)20Н] (рТ)7, сКТр)2б1Р12+(ЫН3)20Н](рТ)7, сКТр)2АГР12+(ЫН3)г0Н](рТ)7,

а[(Тр)2с(Р12+шн3)2он)ЗзТ, а(рс)[рь2+(ын3)2он](рТ)14 шг

М^-реагенты, соответственно). Показано, что все они являются аффинными реагентами, избирательно модифицирующими участок связывания матрицы. Наиболее эффективным модификатором фермента является Ь^-реагент.

2. Впервые определены величины К^ и характеризующие эффективность комплексообразования различных гомо- и гетеро-олигонуклеотидов с матричным участком ФК. Показано, что минимальным лигандом матричного участка является ортофосфат (Кд=26 мкМ). Сродство гомоолигонуклеотидов при увеличении длины на одно звено от п=1 до 19-20 возрастает монотонно для сКрОц., <3(рТ)п., (КрОгх и сКрА)г<. соответственно в 1,58, 1,78, 1,95 и 1,95 раза. Величины К^ гетероолигонуклеотидов различного состава и длины, найденные экспериментально и вычислен-

ные с учетом вклада каждого из оснований в сродство соответствующих гомоолигоцуклеотидов, практически совпадают.

3. Впервые оценена роль межнуклеогидных фосфатных групп матрицы в ее связывания с 5К. На основании совокупности данных предполагается, что одна из межцухлеотцшвдс фосфатных групп матрицы образует с ферментом Ме^+-завис»шй электростатический контакт (дС°=-1,1...-1,7 ккал/моль) и водородную связь за счет атома кислорода Р=0 группы этого фосфата (аС°=-4,4...-4,9 ккал/моль). Остальные межнуклеотидные фосфатные группы с ферментом не взаимодействуют, а ее нуклеозидные компоненты вступают с ферментом в гидрофобные взаимодействия.

4. Показано, что Mj-Mj-peareHra инактивируют ФК с различной эффективностью. Исследована реактивация модифицированного Р12+-содержашими реагентами ФК под действием НаСЫ. Показано, что реагенты модифицируют в матричном участке фермента аминокислотные остатки, образующие с ионом платины связи с различной устойчивостью. Предполагается возможность расположения гидрофильных остатков аминокислот вблизи различных структурных элементов пирииидиновых и пуриновых оснований матрицы. Данные свидетельствуют в пользу гидрофильно-гидрофобной природы матричного участка фермента.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Nevinsby G.A., levina А.5., Doronin S.V., Kolooheva T.I., Lavrik 0.1. Structural baaia of the interaction of ША poly-inerasea with templates, primers end aubetrates// 6th symposium, USSR-Italy "Macronioleoules in the functioning cell", abstracts. Leningrad. 1988. P.79.

2. Волчкова В.А., Горн B.B., Колочева Т.И., Лаврюс О.И., Левина A.C., Невинский Г.А., Хомов В.В. фрагаент Кленова ДНК-полимеразы I из E.coli. III. Роль ыежцуклеотидаых фосфатных групп матрицы в ее связывании с ферментом // Биоорган, химия. 1989. Т.15. »I. С.78-89.

3. Kolocheva T.I., Nevinsky G.A., Volohkova V.A., bevina A.S., Lavrik O.I. DHA polymerase I (Klenov» fragment)» role of the struoture and length of a template in enzyme recognition// FL'BS Lett. 1989. V.248. №l,2. P.97-100.

4. Lavrik O.I., Nevinsky G.A., Kolooheva T.I., Podust V.N., Doronin S.V. DMA polymerases of eucaryotes and prooaryotesi mechanism of interaction with templates, primers and deoxy-nuoleoside triphosphates // Conference "Modern problems of physioo-chemical biology and biotechnology", abstracts. Alma-Ata. 1989. P.68.

5. Nevinsky G.A., Kolooheva T.I. Levina A.5., Lavrik O.I. Structural basis of the interaction of DlfA polymerases with templates and primers according to'affinity modification data// 2nd symposium USSR-USA "Structure of eucaryotic.genome and regulation- of its expression", abstracts. Tbilisi. 1939. P.50-61.

6. Hevinsky G.A., Kolooheva T.I., Levina A.3., Lavrik 0.1. Structural basis of the interaction of UNA polymerases with templates and primers // in: "Kacrornolecules in the functioning cell", Proceedings of the 5-th Soviet-Italian Symposium, Leningrad, 1928. Puschino, 1$90. ./0-'5.