Кинетика функционирования мембранных биосенсоров тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

I и

V/ П

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРЛЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

УДК 541.127:541.135.5:547.96

СОРОЧИНСКИИ Владимир Васильевич

КИНЕТИКА ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МЕМБРАННЫХ БИОСЕНСОРОВ

02.00.15 - химическая кинетика и катализ

АВТОРЕФЕРАТ „ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

МОСКВА-1993

Работа выполнена в Научно-исследовательском учреждении Министерства обороны Российской Федерации.

Научный консультант -

доктор химических наук, профессор Б.И.Курганов

Официальные оппоненты;

доктор химических наук, профессор О.М. Полторак доктор химических наук, профессор Д. И. Метелица доктор биологических наук, ст.н.с. А. В. Максименко

Ведущая организация -

Институт физико-химической биологии им. А. Н.Белозерского при МГУ им. М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится " 2Я" сенТядру ^ддз Г0Да в 16.00 на заседании специализированного Совета Д 053.05.76 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899 ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан " ^ " 1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета

кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Завершение XX века знаменуется стремительным развитием аналитической биотехнологии - междисциплинарной науки, базирующейся на идеях я достижениях молекулярной биологии, энзимологии, химии, физики и микроэлектроники. К числу наиболее ярких и многообещающих результатов такого рода взаимопроникновения и взаимообогащения этих отраслей естествознания относится создание биологических сенсоров.

Биологические сенсоры или биосенсоры представляют собой первичные преобразователи информации, позволяющие исследователю выявлять интересующие его молекулы из бесчисленного хаоса молекулярных смесей. Биосенсоры, начиная с первых публикаций в 1962 г. , привлекают пристальное внимание ученых и практиков уникальными возможностями, открывающимися благодаря их использованию в различных сферах деятельности человека.

Так, в медицине и здравоохранении арсенал клинической биохимии пополняется высокоселективными, оперативными и экономичными методами биосенсорного определения метаболитов. Важность методов в наибольшей степени проявляется в стимулировании развития новых направлений в лечении ряда заболеваний, связанных с нарушениями метаболизма, в первую очередь, сахарного диабета. Различные отрасли промышленности - биохимическая, пищевая, фармакологическая, химическая, а также сельское хозяйство получают уникальный инструментарий для оптимизации условий проведения технологических операций и контроля качества конечных продуктов. В области охраны окружающей среды с помощью биосенсоров осуществим непрерывный, в реальном масштабе времени контроль уровня загрязнений (мониторинг) атмосферы, вод, почвы, промышленных отходов.

Важным вкладом в развитие биосенсоров является открытие советскими учеными явления биоэлектрокатализа - ускорения ферментами электрохимических реакций (Варфоломеев, Березин, 1982).

Среди известных биосенсоров к настоящему времени наис лльшее распространение получили мембранные биосенсоры - биотехнические устройства, в которых биологический компонент (рецептор) образует покрытие физико-химического преобразователя (датчика, детектора) или включен в него. Рецептор обеспечивает "опознавание" молекул интересующего вещества за счет их включения в биохими-

ческие, в первую очередь, биокаталитические процессы. Преобразователь трансформирует индуцируемые процессом "опознавания" изменения свойств рецептора в измеряемый отклик.

Физико-химически мембранные биосенсоры представляют собой открытые гетерогенные диффуэионно-биокаталитические и, как правило, электрохимические системы. Созданию и оптимизации параметров таких многофакторных систем применительно к конкретным условиям эксплуатации необходимо предшествует кинетическое исследование их функционирования, представляющее собой самостоятельное перспективное научное направление.

Цель исследования заключалась в установлении кинетических закономерностей функционирования мембранных биосенсоров, основанных на биокаталитических превращениях определяемого субстрата.

Научная новизна. В диссертационной работе на основе кинетического исследования гетерогенных диффузионно-биокаталитических процессов, протекающих обратимо или необратимо по схеме Михаэли-са-Ментен, установлены соотношения, характеризующие в широком диапазоне концентраций субстрата стационарную кинетику функционирования моноферментных электрохимических и энтальпиметрических биосенсоров, влияние на нее толщины, диффузионных, фазовых и биокаталитических характеристик трехслойного покрытия, а также характеристик преобразователя биосенсоров.

Предложены уравнения стационарной кинетики функционирования амперометрических моноферментных сенсоров, в которых фермент катализирует двухсубстратную реакцию, а детектируемым деполяризатором служит один из продуктов, либо второй субстрат Скосубст-рат). Охарактеризованы параметры глюкозооксидазных сенсоров, детектирующих перекись водорода или кислород. Найдены уравнения кинетики функционирования моноферментных сенсоров, основанных на детектируемой регенерации фермента органическим металлом индикаторного электрода.

Разработан оригинальный метод изготовления мембранных биосенсоров путем иммобилизации ферментов в латексной мембране на поверхности преобразователя. Создан уреазный рН-электрод, описаны экспериментальные зависимости величины его стационарного отклика от концентрации мочевины и трис-НС1 буфера. Исследована кинетика функционирования глюкозооксидазного рН-злектрода.

Созданы оригинальные моноферментные сенсоры, основанные на кондуктометрическом и энтальпиметрическом детектировании ферментативной реакции. С использованием разработанных математических моделей установлены кинетические закономерности функционирования <5иосенсоров в стационарном режиме работы.

Предложены уравнения предстационарной кинетики функционирования электрохимических моноферментных сенсоров, покрытие которых включает слой иммобилизованного фермента и наружную мембрану. Для относительно малых и насыщающих концентраций субстрата найдены уравнения предстационарного распределения субстрата и продукта в покрытии, а также уравнения для величины предстационарного отклика биосенсоров. Дана оценка времени развития отклика потенциометрических биосенсоров при варьировании значений диффузионного модуля и отношения толщин наружной мембраны и слоя фермента.

Найдены уравнения стационарной кинетики функционирования электрохимических мембранных сенсоров, осуществляющих последовательные полиферментные превращения субстрата и детектирующих конечный продукт. Величина отклика сенсоров с равномерно распределенными ферментами в покрытии характеризуется кинетической неразличимостью биокатализаторов. При послойном распределении ферментов большей эффективностью обладают те из них, слои которых экранированы от раствора субстрата. Оценена величина границ диапазона концентраций субстрата, удобных для биосенсорного определения.

Проведен анализ кинетики функционирования амперометрических биферментных сенсоров 6 типов. Установлена структурная общность выражений для величины стационарного отклика сенсоров, осуществляющих последовательные или параллельные превращения субстрата. Величина отклика, обусловленного образованием деполяризатора при циклических превращениях субстрата, возрастает с увеличением диффузионных модулей и больше при равномерном распределении ферментов, чем при послойном. Детектирование деполяризатора при его образовании из определяемого субстрата более эффективно, чем при образовании из интермедиата.

При высокой каталитической активности скорость генерации отклика биосенсоров, осуществляющих последовательные или параллельные превращения субстрата, близка к скорости диффузии депо-

ляриэатора в покрытии, а накопление продукта циклических превращений субстрата происходит в 3,5 раза медленнее. При малых степенях конверсии развитие отклика биосенсоров существенно замедляется. Экспериментально исследована предстационарная кинетика биосенсоров, осуществляющих последовательные и циклические превращения О-глюкозы и, соответственно, никотинамидадениндинуклео-тида.

Предложены уравнения стационарной кинетики функционирования полиферментных сенсоров с детектируемой электрохимической регенерацией фермента. Для биферментных сенсоров с достаточно малой толщиной биокаталитического слоя найдены диагностические линейные анаморфозы кинетических кривых.

Научная и практическая значимость. Работа выполнена в рамках Программы ГКНТ СССР по инженерной энзимологии (раздел 5.5 "Разработка нового поколения биоаналитических методов и устройств для целей медицины, сельского хозяйства, контроля технологических процессов и качества окружающей среды"). Результаты работы могут быть использованы для

- предсказания и оптимизации эксплуатационных параметров С"дизайна") мембранных биосенсоров: чувствительности, величины диапазона концентраций субстрата (ингибитора), удобных для биосенсорного определения, времени развития отклика, селективности;

- установления природы лимитирующих стадий в процессе формирования отклика биосенсоров;

- оценки эффективности электрохимической регенерации ферментов в биосенсорах;

- исследований гетерогенной кинетики биокаталитических систем, расчета эксплуатационных параметров биохимических реакторов (ферментеров);

- разработки и изготовления биоаналитических систем на основе оригинальных кондуктометрических и эктальпиметрических биосенсоров;

- получения фермент-содержащих пленок и покрытий биосенсоров оригинальным методом иммобилизации в латексной мембране.

Практические разработки защищены 3 авторскими свидетельствами на изобретения.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на Всесоюзной конференции по трансплантации органов и

тканей, Тбилиси, 1979 г,, Международном симпозиуме по проблемам контроля искусственных органов, Варшава, 1980 г. , V Всесоюзном симпозиуме по получению и применению биокатализаторов в .народном хозяйстве и медицине, г. Кобулети, 1985 г. , на научных семинарах в НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ СССР, на Хими-мическом факультете МГУ им. М.В.Ломоносова.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано ?9 печатных работ, в том числе одна книга, и получено 3 авторских свидетельства.

Объем и структура работы. Диссертационная работа представляв-; собой рукопись, изложенную на 333 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц, 61 рисунок , а также список цитированной литературы из 297 наименований. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и заключения.

Во введении рассматривается устройство мембранных биосенсоров, анализируются методы изготовления биорецепторных мембран, характеристики физико-химических преобразователей, обсуждается классификация биосенсоров.

В первой главе излагаются результаты теоретических и экспериментальных исследований стационарной кинетики функционирования моноферментных сенсоров. Изучены закономерности гетерогенного биокатализа в биорецепторных покрытиях для широкого диапазона концентраций субстрата. Исследовано функционирование амперомет-рических биосенсоров, детектирующих продукт или косубстрат ферментативной реакции, и биосенсоров, осуществляющих электрохимическую регенерацию фермента органическим металлом индикаторного электрода. Проведен анализ кинетики фунционирования потенциомет-рических, кондуктометрических и энталышметрических биосенсоров.

Во второй главе изучена стационарная кинетика функционирования электрохимических биосенсоров, осуществляющих полиферментные превращения субстрата. Охарактеризована чувствительность ам~ перометрических биферментных сенсоров, в которых субстрат претерпевает последовательные, параллельные или циклические превращения. Исследованы стационарные характеристики продукт-чувствительных полиферментных сенсоров с равномерным и послойным распределением ферментов в покрытии, а также сенсоров, осуществляющих детектируемую электрохимическую регенерацию фермента.

Третья глава посвящена закономерностям предстационарной ки-

нетики функционирования электрохимических моноферментных и би-ферментных сенсоров. Представлены результаты исследований глюко-зооксидазных, глюкозооксидазно-пероксидазных сенсоров 0-глюкозы и сенсора никотинамидадениндинуклеотида, основанного на циклических превращениях кофермента.

ГЛАВА I. СТАЦИОНАРНАЯ КИНЕТИКА ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ

МОНОФЕРМЕНТНЫХ СЕНСОРОВ Моноферментные сенсоры образуют наиболее обширную группу биосенсоров, в основе функционирования которых лежит гетерогенный катализ превращения субстрата ферментом, иммобилизованным (захваченным) на поверхности преобразователя. Проблемы стационарной кинетики гетерогенно-каталитических процессов рассматривались ранее для условий, ограниченных по величине концентрации субстрата CBlaede] е1 а1., 1972), соотношения скоростей биокатализа и внешнего массопереноса С2е1едпу, 1974).

1.1. Закономерности гетерогенного биокатализа в покрытии

моноферментных сенсоров Представим, что на поверхности плоского индикаторного электрода закреплены слой иммобилизованного фермента Е толщиной I и наружная мембрана толщиной <1 Мембрана контактирует с раствором субстрата Б, который диффундирует в слой фермента и претерпевает обратимое превращение в продукт Р, детектируемый на индикаторном электроде: к к

Б+Е 1 »ЕБ- ■ 2 »Е+Р. С1.1); Р1ш?( ......-»продукты. (1.2)

к к -1 - г

Диффузионно-кинетическое уравнение для концентрации субстрата [ЭЗ в слое фермента может быть представлено в безразмерных переменных - расстояния от поверхности электрода X, нормированного к величине I Сх-К/П, и концентрации й, зависящей от констант Михаэлиса для прямой КМ{ и обратной реакций Кмь, молярной концентрации субстрата в растворе [53о и коэффициента распределения Б и Р между слоем фермента и раствором К :

3=[8)(1/КмГ1/^ь)/(1^1[8]оДмь). (1.3)

Взаимосвязь между концентрациями субстрата в слое г(х) и на границе слоя со стороны электрода ё (5=5 при С5]=[5Кх=0)=[5]) выражается степенным рядом по переменной

2=5-ё-[ 1 5о/( 1 +1/Кеч) ] 1П [ (1 +5) /( 1 +5) ] , включающей константу равновесия Кд =к } к и концентрацию

субстрата в растворе г Сэ =э при [Б]Сх>1+с£/П =ЕБЗ ):

(1.4)

Здесь ^{кШ^/^й^иК^и-^з^К^^-1)]; [Е]о-общая концентрация фермента; б=С1+5)/[з-К15о(1+1/'К )1;

Соотношение между концентрациями субстрата на границе слоя и мембраны з1 =5 при [5]=[5Кх=1)> и на поверхности электрода С5) следует из выражения С1.4). Связь между величинами эо, с одной стороны, и § и , с другой, вытекает из условий непрерывности потока субстрата при х=1 и постоянства концентрации С о в растворе:

С 1.5)

где 21 =2 при 5=з1; I и Ь - коэффициенты проницаемости слоя фермента и, соответственно, мембраны для 8 и Р,

Таким образом, в общем случае распределение концентрации субстрата в слое иммобилизованного фермента в функции содержания субстрата в растворе, толщины и проницаемости покрытия биосенсора, а также кинетических параметров ферментативной реакции является решением системы уравнений С 1.4) и С1.5).

Решение для предельных случаев. Допустим, что |(5-§)/(1+5)| <1. При это неравенство справедливо для любых концентра-

ций субстрата, а при тождественно неравенству

([БЗ-г^])//^<(1+/^[Б^/К^). Соотношение, связывающее величины з и 5, имеет вид:

° К, зо =§-(1+5)(Я-1)[Я1 зо/( 1 +1 /Кв<()-5] Д 1 ^ 5о/( 1 *1/Ктц)], (1.6)

где М=сИ а1+аК11/1<|38Ь «I; Са1)*эд[1+К,во/(1+1/К )]/(1+5)".

Степень конверсии субстрата £=1-5/^ 5о, следующая из уравнения (1.6)-

1/г»с 1 ) /(1 ■-1 /ю зо * 1+кв<?)/с ) [ 1зос 1 ■-х) ], с 1.7)

максимальна при малых концентрациях субстрата, когда величиной второго слагаемого в (1.7) можно пренебречь. При этом параметр (аП2, определяющий Н, равен сумме квадратов модулей для прямого (агП и обратного процессов (с^П. Если М>1, то приэлектродные концентрации субстрата и продукта равновесны (1/^=1+Кв(?). При а1 <1 конверсия субстрата контролируется кинетикой прямого процесса: *=(аг1)*(1/2+41/1 ). В условиях субстратного насыщения фер-

мента концентрация продукта также определяется скоростью прямого процесса: tPJ=^[SJo=(af 1)%, (1/2+t,/íd).

Увеличение К при

af 1>1

ведет к существенному снижению

степени конверсии, значение которой сохраняется первоначальным в расширяющемся диапазоне концентраций субстрата (рис. 1, б). Стабилизирующий эффект более отчетливо заметен при а{1=1 Срис.1,а).

Рис. 1. Зависимости при-

[РЗ/ЙДБ!

о, в

о, в

о, *

О. г

электродной концентрации продукта [р] обратимой ферментативной реакции при различных значениях константы равновесия К Сцифры около кривых) и величины модуля afl, равной 1 (а) и 100 Сб), от __

Чувствительность степени конверсии к величине отношения констант Михаэлиса b и к величине отношения коэффициентов проницаемости ^ /td возрастает с увеличением концентрации субстрата и уменьшением активности фермента.

Установленные закономерности приемлемы для описания необратимых превращений, подчиняющихся схеме Михаэлиса-Ментен. В этом случае ^=1/^=^=0, s - концентрация субстрата, нормированная на величину константы Михаэлиса (af 1)г=(а1)г= (Ma[E3ola/KMDgJ)/Cl+s)2. Величинами D, R и L с индексом "s" будем обозначать соответствующие характеристики субстрата. Так, общее аналитическое решение задачи представляется следующей системой уравнений:

jf=[(22)lX2/«l]U^l[C22)n-V(l-C2n-l))]gnCs)}. С1.8)

исгг,у' 1 -j;® [(22, )п-1 /С 1 • • • сгп-1))JС1.ЭЭ

so=si +al(2zi) *1S1 /£sd * С1Л0)

где z=s-s-ln [Cl+s)/(l+i)]; zt=z при s=sj; giCs)=l/s; #nfs)= -(l+l/s)d[gni(s)]/ds, n>2.

Решение (1.6) для предельных случаев принимает следующий вид:

Rslso=s(l+s)[ch al+al(¿si/£sd)sh al]-52, Cl.ll)

а для концентраций субстрата на границах слоя справедливо:

sj=5(l+s)ch al-5a. Cl.12)

Анализ точности аппроксимации общего решения С1.8)-С 1.10) уравнением С 1.11) показал их удовлетворительное соответствие при любых значениях ао£=а1(1+5) и в диапазоне низких и насы-

щающих концентраций субстрата, а при ао1<1 - в диапазоне любых концентраций. В свою очередь, полученное нами общее аналитическое решение охватывает известные решения частных задач гетерогенного биокатализа СЕ,а1с!1ег 5 5ипбагаш, 1971, В1аебе1 е1,а1., 1972, Натека & ЕесЬпИг,. 1981).

1.2. Амперометрические биосенсоры Сенсоры этого типа разделяются на сенсоры, детектирующие продукт или один из субстратов Скосубстрат) ферментативной реакции, и сенсоры, осуществляющие детектируемую регенерацию фермента.

1.2.1. Сенсоры, детектирующие продукт ферментативной реакции Плотность тока биосенсора, покрытие которого включает слой иммобилизованного фермента, наружную и внутреннюю мембраны, характеризуется следующей зависимостью от концентрации субстрата, нормированной на величину константы Михазлиса, зо, параметров покрытия и константы скорости индикаторной реакции

КпГ/ГяХ 131 ЛРд)С )[«1(2^)' /2Ч1М/4Р1 )(31 -5)]. С1.13) Здесь Г-постоянная Фарадея, Г^-диффузионно-электрохимическое сопротивление сенсора, определяемое проницаемостью компонентов покрытия для продукта 1ра, 1р1, ¿рь, коэффициентом его распределения между внутренней мембраной и раствором субстрата и величиной к____:

■ н д

(1.14)

Выражение С 1.13) получено интегрированием диффузионно-кинетического уравнения для стационарной концентрации продукта С РЗ с привлечением .уравнений С1.8)-С1.10) для [Б]. Отметим, что 1= СпГ^Ки/ОСф/ЛОСх**)). где р=[Р]//См.

Иллюстрацией выражения (1.13) служат зависимости безразмерного градиента концентрации продукта (<*р/с!х)(х=0) от , рассчитанные при 1/£ =0, К. ,=1, 0 =0, А >0/С1+сй и представлен* П 1 ^ 1пД

ные на рис. 2. Варьирование толщины наружной мембраны СсО при малом значении модуля, например, при а г=0,1*Са) незначительно сказывается на чувствительности и величине диапазона концентраций субстрата, удобных для определения. Изменения более существенны при возрастании модуля до 1 С б) и 101/а С в). Величина

предельного тока с увеличением толщины наружной мембраны от 0 до t и 10L возрастает в 1,5 и 1,9 раза независимо от значения al. Эффекты варьирования величины модуля при d/l=1 показаны на рис. 2, г.

Концентрационные зависимости величины отклика при ао 1<1 описываются системой, включающей уравнение (1.11) и уравнение, связывающее íes и s -

¿=CnF/r¿) CtslЛрt)^0о )сAíp-1 )/tfs, Ci. 15D

где Afj =ch al+al( tí: /íjd)sh ai. При s<l чувствительность сенсора к субстрату i/tS3o постоянна. Ее величина, нормированная на чувствительность сенсора к продукту nf/T^, следует из (1.15):

P=Ci^S]o)/(nF/r^(ts¡/tpi)(Mp o-iyMs о, (1.16) где И g=M¡(aoL). Величина верхней границы диапазона концентраций субстрата, в котором справедливо выражение (1.16), оценена с использованием характеристик распределения субстрата в слое фермента:

Рис. 2. Зависимости градиента концентрации деполяризатора-продукта вблизи поверхности индикаторного электрода амперометри-ческого моноферментного сенсора ((¿р/сгх)(х=0)=р' от концентрации субстрата в растворе $д при различных значениях отношения Са,б,вЭ и модуля ао1 (г). сИ: 1-0; 2,6-8-1; 3-3; 4-6; 5-10; а I: а и б-КГ1'2;^ и 7-1; в и 8-10'' 2

о _'__

При достаточно высокой эффективности биокатализа

чувствительность сенсора достигает наибольшего значения и равна отношению проницаемостей наружной мембраны для субстрата и продукта а величина [Б]* пропорциональна значению модуля и отношению субстратных проницаемостей слоя фермента и наружной мембраны: Г51^(0,1X^)0,1( 181/1и).

Если активность фермента мала

аоК1 и (ао1)аС1/2+131/£8<1)<1, С1.19)

то величина р снижается и становится зависимой от значения модуля и проницаемости слоя фермента:р=(ао1)г(1д1/1р1)(1/2+£р1/{ре1);

при этом диапазон концентраций сужается: СБ]*=0,.

Электрохимическая кинетика индикаторной реакции, иё влияя на нормированную чувствительность р, может приводить к изменению абсолютной чувствительности ¿/Ей]о. Это наблюдается при 1/КрьГд, где Гд - сумма обратных проницаемостей компонентов покрытия для продукта.

К числу сенсоров обсуждаемого типа относятся оксидазные электроды, в частности, глюкозооксидазный Н^-чувств».тельный электрод. Его функционирование основано на окислении /3-аномера 0-глюкозы СБ) кислородом -

* * К.

Е...+5-—^Е.,^—2-+Е__+0-глюконолактон; Е. +0 —»Е +Н 0 ,

О К <- О* ВОС ВОС г ОК 2 2

*-» С1. 20)

и последующем детектируемом окислении образующейся перекиси водорода. Здесь Е „ и Е _ - окисленная и восстановленная формы

г ОК ВОС *

глюкозооксидазы; Е0К5 - фермент-субстратный комплекс.

Установлено, что зависимость плотности стационарного тока от концентрации /З-О-глюкозы при относительно малых ее значениях [Б] описывается уравнением С 1.16), в котором определяющий величину М1о ао1=С*В0С[Е]01*/031)''а, где ^^/СК^ ).

Величина верхней границы [Б]о определена путем анализа выражений для стационарной скорости процесса С1.20), детектируемой регенерации 02 и характеристик распределения,концентраций субстратов. При достаточно высоком содержании фермента и диффузионно-контролируемом протекании индикаторной реакции значение [Б]* пропорционально концентрации 0г в растворе, отношению коэффициентов диффузии 0г и 8 в наружной мембране и величине, включающей значения толщин компонентов покрытия и коэффициенты диффузии

НгОг - [l4(d/Dpd)/(i/Dpi +h/Dfb)]. Диапазон концентраций D-глюко-зы расширяется при использовании наружных мембран с большей толщиной. Для растворов, насыщенных атмосферным кислородом С25 °С), при DQ2^Ds =3, Dpi =D и d=l=h значения [SI* близки к 1,8 мМ.

1.2.2. Сенсоры, детектирующие косубстрат ферментативной

реакции

Характерным представителем такого рода сенсоров служит глю-козооксидазный электрод с амперометрической регистрацией восстановления 0г. Плотность стационарного тока электрода, установленная в результате диффузионно-кинетического анализа трехмембран-ной модели, линейно зависит от концентраций в растворе обоих субстратов:

iKnr/T^)CtOa]o-p[S)o), (1.21)

где Т^ - диффузионно-электрохимическое сопротивление электрода по отношению к 0jP р - отношение чувствительности электрода к (3-0-глюкозе и кислороду,

P=Cisl/t0al)CW02 o-l>/Ws о. (1.22)

Обращает на себя внимание структурная идентичность выражений для чувствительности электродов, детектирующих косубстрат и продукт ферментативной реакции [уравнения (1.22) и (1.16)]. Для глюкозо-оксидаэно-каталазных электродов при избыточной каталазной активности величина р вдвое меньше ввиду диспропорционирования перекиси водорода.

Верхняя граница диапазона концентраций D-глюкозы, в котором справедливо выражение (1.21), оценена путем анализа уравнений для стационарной скорости двухсубстратного процесса (1.20), индикаторной реакции и характеристик распределения субстратов в фермент-содержащем слое. При достаточно высоких значениях модуля [S]*=(t02d/lSd)[Oe]o/'>e, где к - доля /3-аномера в растворе D-глюкозы. В аэрированных растворах (£02d/fSd-3, 25 °С) [S]*Sl,2 мМ. Для глюкозооксидазно-каталазного электрода величина [S1* увеличена вдвое. Результаты оценки согласуются с экспериментально найденными значениями [S1* 1,1, 1,2 мМ (Mascini et al., 1983,

о

Mizutani et al., 1983) и, соответственно, 2,5 мМ (Laune et al., 1976). Расширению диапазона способствует применение наружной мембраны, более проницаемой для 0г относительно /3-0-глюкозы и менее проницаемой по сравнению со слоем ферментов.

1.2.3. Сенсоры на органических металлах Стационарная кинетика функционирования сенсоров на органических металлах интерпретировалась в рамках модели двухстадийно-го переноса электронов с помощью растворимых компонентов металла СКи1уБ е1 а1. , 1981, 1983; Иазитаз е1' а1. , 1984) и модели процесса прямого переноса, характеризующегося первым порядком по восстановленному ферменту СА1Ьегу е! а1. , 1985).

Нами проанализирована модель биосенсора, обобщающая известные опытные данные. Биосенсор состоит из индикаторного электрода с иммобилизованным органическим металлом, слоя раствора, содержащего нативный фермент, и наружной мембраны. На поверхности металла Кп+Ап" существует равновесие

Кп* А"- , д >К° +А°, С1.23)

где К0 и А0 - нейтральные компоненты металла (А1Ьегу е1 а1. , 1987). Субстрат, диффундируя из раствора через мембрану, взаимодействует с ферментом Е. В результате возникает продукт Р и восстановленный фермент ЕНа:

к к

5+Е, 1 >Е5-2—»Р+ЕН^ С 1.24)

-1

Регенерация Е осуществляется на индикаторном электроде:

ЕНП+А°-2—»Е+пН++Ап~. (1.25)

Амперометрический отклик формируется за счет окисления К0:

К0 -пе~-^->КП+. С1.26)

Диффузионно-кинетический анализ процессов С1.23)-С 1.26), выполненный в предположении отсутствия градиента концентраций субстрата в слое фермента, сохранения равновесия С 1.23) и равенства коэффициентов диффузии СО) Е, ЕБ и ЕН^ привел к параметрической зависимости плотности стационарного тока I от концентрации субстрата в растворе

СЕ] £ г 1-1/гЧЬ г I

—2 --♦—«-!-г-(1,27)

I СпП*кя пЛ)(1/2 -1/г2)

ЭЛ 12

[Б] =15)И/пГ4_, С 1.28)

о ь

где ^эл ^Л^1 ^ ~ отношение истинной и геометрической площадей (шероховатость) поверхности электрода; I - толщина раствора фермента;

< а=Кг/2®С1 ■*5) {1 ±[ 1 -45/С1 +5)•( 1 , /Ьл) ]' /я\, (1.29)

s - приэлектродная концентрация субстрата [S], нормированная на величину К^С^.,+k2)/k, ; 'g ~ коэффициент проницаемости мембраны для субстрата.

Максимальная плотность тока сенсора с достаточно малой толщиной раствора фермента I<(0Дг)'/г определяется отношением скоростей электрохимической и ферментативной реакций:

¿2/(nF)afc CEI +i /ггГМ CEI 1=1. Cl.30)

ra'4 ' эл о m' г о

Если отношение меньше 1, то, im~ fE]^2 и tm~C» что согласуется с экспериментом CAlbery et al., 1987).

Чувствительность сенсора максимальна на начальном участке концентрационной зависимости: Х=п/7(1/^+Км/&гШо I). При относительно малых значениях CSIо, когда Cz( Пг>(2г1)г=(Ма1г/0)5/ (1+5)<1, справедливо:

y=(l-p)/i=[ i/(nF)zfe CEI +l/riFk CE] í](l-pX/nfl_), Cl. 31)

Э Л О 2 0 d

где p=(i/rS]o)/X. При i<nFk3]l/kzl влияние электрохимической кинетики отсутствует, функция у(.р) линейна и уСрчО)=1 /nFk^ГЕЗо i, pCy-^3)=p*=RTíg/X. В противном случае уравнение (1.31) линеаризуется в координатах <y/¿; р>, причем (у/ОСр-Ю) = 1/(пПгМэя[Е]о и p[(y/i)-»0]=p*. Если р*=1, то скорость ферментативной конверсии субстрата выше скорости его массопереноса через мембрану; обратное характеризуется неравенством р*>1.

Уравнение (1.31) при к ( >&г справедливо в широком диапазоне концентраций субстрата. Значения so=[S]q/Km и t/im связаны соотношением

s =6<l/(l-i/L )+atl+(l-Wi/t ]>/(i /t+1-Ь). (1.32)

о ' m 'mm

включающим параметры a=M¡2CE]oí/X>í¿s CO<a<oo) и b=im/nFkz[El С0<Ь<1). С увеличением значений обоих параметров плотность тока уменьшается Срис. 3). Медленная электрохимическая кинетика приводит к быстрому насыщению С1-3). Отклик сенсора следует уравнению Михаэлиса-Ментен при отсутствии внешнедиффузионных затруднений и быстрой электрохимической кинетике С5),

Оценка диапазона концентраций субстрата, определяемых биосенсором, показала, что величина ÍS3* не зависит от параметров наиболее быстрой стадии - массопереноса, биокатализа или электрохимической реакции.

о, о

\

а

о

Рис. 3. Зависимости плотности тока моноферментного сенсора на органических металлах 1/1 от э

при различных значениях параметров а и д.

а: 1,4,5-0,1; 2,6-1; 3,7,8-10; Ь: 1-3-0,1; 4,7-0,5; 5,6,8-1

ш о

*

в

в

о

1.3. Потенциометрические биосенсоры

Функционирование потенциометрических биосенсоров основано на детектировании продукта ферментативной конверсии субстрата ионселективными, окислительно-восстановительными электродами, газовыми мембранными датчиками, ионселективными полевыми транзисторами.

Если образование продукта происходит по схеме Михаэлиса-Ментен, то на поверхности преобразователя, покрытого внутренней мембраной, слоем фермента и наружной мембраной, детектируемая концентрация С Р1 может быть выражена в безразмерной форме р = [РЗ/А^ через концентрации субстрата в! и ё, связанные соотношениями (1.9) и С1.10):

В диапазоне относительно малых концентраций субстрата варьирование величины не сказывается на функционировании сенсора при достаточно больших значениях модуля а I (рис. 4, в). (Расчеты выполнены при ( =1). При а 1<1 с ростом Ц наблюдается значительное увеличение степени конверсии (рис. 4, а и б). В области насыщающих концентраций субстрата увеличение ^ приводит к одинаковому росту р при всех значениях модуля ао1.

Диапазон концентраций субстрата, в котором расширя-

ется с увеличением при ао1>1 и с увеличением ао1 при по-

стоянном значении например, равном 1 (рис. 4, г).

Уравнение стационарного состояния С1.33) с использованием выражений (1.11) и (1.12) для 5о и 51 может быть приведено к ви-

Ир^!/<PI<S<I-

• (1.33)

Рис. 4. Зависимости концентрации продукта около поверхности потенциометрического преобразователя моноферментного сенсора р от концентрации субстрата в растворе зо при различных значениях отношения Са, б и в) и модуля ао I (г). ^0; 2,6-8-

1; 3-3; 4-6; 5-10; «о1: а,б- ОД"'2; 6,7-1; в,8- 101/г ду

~Р=*Г ¿^/^Х^^Щ-Ц/М,,. С1.34)

При ¡¡<1 и 5>1 зависимость С 1.34) упрощается до соотношений, характеризующих стационарную кинетику сенсора при первом и нулевом порядке скорости ферментативной реакции по субстрату (В1аес1е1 е1 а1., 1972; Ьа1с11ег & Бипбагаш, 1971; Бе1едпу, 1974).

Установленные закономерности обобщают результаты анализа инженерной модели биосенсора, построенной в предположении о равномерном распределении в фермент-содержащем слое субстрата и продукта (БиПЬаиН & Иаду, 1973), а также модели с дополнительным учетом внешнедиффузионного переноса СМог Г", 1980).

1.3.1. Уреазный рН-электрод Ферментные рН-электроды находят широкое применение в биохимическом анализе ряда соединений, в том числе мочевины. Нами изучена стационарная кинетика функционирования уреазного рН-электрода в растворах субстрата и трис-НС1 буфера.

Экспериментальные зависимости величины стационарного отклика ДрН от логарифма концентрации мочевины в растворе С БЗ о имеют сигмоидный характер Срис. 5). Предельное значение ДрН и крутизна кривых в точке перегиба возрастают при уменьшении концентрации буфера.

Для их описания были рассчитаны значения рН буферных растворов продукта ферментативного гидролиза субстрата - карбоната аммония. Зависимости от [Б]о/^=5о приэлектродной концентрации продукта аппроксимировались уравнением Cl.il), приве-

денным при соблюдении ряда допущений к виду

5 =( 5 -р) ¡1 +2( 1 +5 -р)зЬ а°1 _ 'а 1вЬ -^г]. с 1. 35) 0 0 0 2(1-^-р) 0 1+зо-р^

Рис. 5. Зависимости стационарного отклика уреазного рН-электрода ДрН от логарифма молярной концентрации мочевины [Б] в трис~НС1 буфере СрН 7,2; 25 8С).

Концентрация буфера, М: ^5.10"3; 2-10-2; 3-2,5.10":2; 4-5.10"г; 5-10"! Точками обозначены экспериментальные данные, линиями - расчетные кривые.

1од [Б!

Используя эти соотношения, графическим методом установлена зависимость рассчитанных на основе эксперимента значений диффузионного модуля ао1 от концентраций катионов водорода в растворе СН+1о и вблизи поверхности электрода [Я4], а также от концентрации буфера Сд:

ао1=[В(1П/ГГ]о(1+КбС01/а)],/г, 01.36)

где В и К. - постоянные, В=46 и К =40 М"'/г.

о б

Реконструирование калибровочных кривых биосенсора с'помощью уравнений С 1.35) и (1.36) показало удовлетворительную корреляцию между экспериментом и результатами расчета (рис. 5).

Исследованный уреазный рН-электрод изготовлен разработанным нами методом. Он состоит в нанесении на чувствительную поверхность электрода смеси раствора фермента и латекса натурального каучука, последующем ее выдерживании на воздухе С высушивании) и

заключительной обработке покрытия глутаровым альдегидом. Время развития 95 '/,-ного отклика не превышало 60 с. Через 2 месяца низкотемпературного хранения сенсора в буферном растворе величина его стационарного отклика снижалась менее чем на 10 У..

1.3.2. Глюкозооксидазный рН-электрод Действие сенсора основано на регистрации степени закисления среды в покрытии рН-электрода за счет последовательно протекающих в нем ферментативного окисления /З-О-глюкозы (1.20) и последующего спонтанного гидролиза возникающего при этом лактона с образованием D-глюконовой кислоты.

Теоретический анализ стационарной кинетики функционирования сенсора в буферных растворах, содержащих /3-0-глюкоэу в относительно малой концентрации [S]^, привел к неявной зависимости приэлектродной концентрации детектируемых катионов [IT] от С S3 о. Установлено, что для сенсора, содержащего ферментный слой и наружную мембрану, величина

([fn-CH4] ) Г К CKUi 1 д=>-21— 1+-2-h-«-Л*- с 1.37)

(i+tfPi/к^г1 L [й+]сн+]о (K^imxK^+tm^J

включающая ионное произведение воды и константы диссоциации D-глюконовой кислоты Кш и кислоты буфера Кнд, пропорциональна концентрации CS]o- Коэффициент пропорциональности л определяется значениями модулей для ферментативной реакции С1.20) о 1= (*t nAEll*/D)1 и для процесса гидролиза У1={Кшп1*/П)*/г, а

вое О ГIдр

также толщиной наружной мембраны d: 1

Я=1"

W-r*)

(a /fish a l+ch а I/th rd

аг_£__-2-2-—-^j, (1.38)

. ° sh rl+ch yl/th rd

I

где Н =сЬ а 1+а сЬЬ а I.

о о о о

Экспериментально установлено, что для рН-электрода с покрытием, содержащим глюкозооксидазу, соиммобилизованную глутаровым альдегидом с бычьим сывороточным альбумином, значение л в интервале концентраций 0-глюкоэы 0,1-2,2 мМ в 10"3 М ацетатном буферном растворе, рН 5,60 постоянно и составляет 0,305.

1.4. Кондуктометрические биосенсоры

Нами разработан новый тип мембранных биосенсоров, основанных на кондуктометрическом измерении концентрации ионизирующихся продуктов ферментативной реакции непосредственно в биокаталитическом слое. Сенсор содержит рабочую и сравнительную кондукто-

метрические ячейки. Один из электродов в каждой ячейке выполнен в виде сетки, другие электроды ячеек объединены в один общий электрод. Между электродами рабочей ячейки расположен препарат иммобилизованного фермента, а между электродами сравнительной ячейки - каталитически неактивный препарат.

Биосенсор мочевины изготовлен с использованием уреааы, иммобилизованной в латексной мембране. Отклик сенсора линеен в диапазоне концентраций субстрата до 25 мМ, время развития 98 '/.-ного отклика равно 120 с.

Биосенсор D-глюкозы позволяет измерять до 36 мМ субстрата при времени развития 98 v.-ного отклика 180 с. Глюкозооксидаза и каталаза также иммобилизованы в латексной мембране.

Диффузионно-кинетический анализ модели сенсора показал, что при протекании ферментативной реакции по схеме Михаэлиса-Ментен, нейтральности молекул субстрата и полной диссоциации образующегося продукта электропроводность слоя фермента составляет

p-fnPr'drT'^s ,3-si_M_P-s с 1. 39D

О О si 2Dpiarih c$pth crt/2)

где s , s - концентрации субстрата, связанные соотношением CI. 113° Мр и Hs определены в (1.153; Фр=[(Wp+13/(/fp-13]'

На начальном участке калибровочной кривой чувствительность сенсора постоянна:

M~s Са ио1Км/0о)С(Яо -13l/2/W ]/2arth (i> th а I/23, (1.403

п о о S1 « Р Р, о S, о Р, о о

где Ф„ =Ф„ при М =AL . В диффузионно-контролируемом режиме ве-

* / О г г ¡г f О

личина м не изменяется при варьировании толщины наружной мембраны, активности фермента и обратно пропорциональна толщине его слоя: если aoKi j/t )th aQl>l, то ^~so( £sd/tpd3CRpi Км/13. В кинетически контролируемом режиме отклик сенсора пропорционален активности фермента и возрастает с увеличением d и i:

(fc IE! 1/Ddi 3u/2arth 1/u , где u=Cl+2tB1 /1ЪЛУ /z. (1.413

Ы 0 2 О rl rl rQ

Величина максимального отклика сенсора, достигаемая при насыщающих концентрациях субстрата (s>13, определяется выражением (1.413, в котором RjS =1.

1.5. Энтальпиметрические биосенсоры Большинство ферментативных реакций с совокупностью сопряженных химических процессов сопровождаются изменением энтальпии. Регистирация тепловых эффектов лежит в основе известных мёмбран-

ных биосенсоров. В качестве термочувствительных элементов использовались термисторы (Tannenbaum, 1975; Weaver ei al., 1976), интегральные микросхемы (Muramatsu et al., 1987).

Анализ стационарной кинетики взаимосвязанных процессов биокатализа, диффузии и теплопереноса в покрытии биосенсора показал, что при протекании ферментативной реакции по схеме Михаэли-са-Ментен величина отклика LT следующим образом зависит от концентрации субстрата ESIо, активности фермента, теплового эффекта ДИ, коэффициентов теплопроводности слоя фермента , наружной мембраны Xd и коэффициентов диффузии субстрата D3 :

AT=4MD„, Л. ) [(X. /X .D„ ,)([S1 -[SD+tSl-fSl], С1. 42)

Sl 1 1 1 Sl d Sd о 1 •*

где tS] и tS]j - концентрации субстрата на границах слоя фермента, связанные с [S] о и величиной al уравнениями С 1.9) и С 1.10) при £gj=l- Отклик биосенсора при варьировании концентрации субстрата, значений модуля и отношения толщин мембраны и слоя фермента d/l изменяется аналогично концентрации продукта [Pi, определяемой выражением С 1.33) (рис. 4)- при Dgl =DSd, Dpj =Dp и Xt=Xd =X справедливо: ДТ/tP] =MDp/X.

В растворах субстрата с достаточно малыми концентрациями отклик биосенсора в соответствии с уравнениями (1.11), С1.12) и (1.42) пропорционален величине t S3 :

АГ=[S3 (AWD_, A,)[ch a l+a dCX./X ,)sh a t~l]/M„ . (1.43)

о Sl 1 1 о о Id о is, о

Если активность фермента достаточно велика - ch ао1>1, aodX1Ad> 1 и aodDsl/Dgd>1, то величина AT определяется скоростью диффузии и теплопереноса в мембране: ¿r=[S]oM0gdAd (Weaver ei al., 1976). При сохранении высокой активности (ch aQl>l) изменение параметров покрытия, например, уменьшение толщины мембраны до значений, отвечающих неравенствам

я dX. /X <1 и а dD .<1, (1.44)

old о ы ьа

приводит к зависимости величины отклика от параметров слоя фермента: AT=[S]oAWDsl/X1. Если значения модуля малы (аоК1) и отвечают неравенствам (1.44), то отклик биосенсора пропорционален активности фермента: ¿J=IS]оШао l)zDsldAdi.

Эксплуатация энтальпиметрического биосенсора накладывает жесткие требования к режиму термостатирования, так как величина регистрируемого отклика обычно не превышает ~10"3 °С. Для повышения точности измерений систему усложняют введением сравнительного термочувствительного элемента.

Нами сконструирован новый тип энтальпиметрических биосенсоров, который лишен указанных недостатков. Биосенсор представляет собой дифференциальную полупроводниковую термопару, на одном из спаев которой закреплен слой иммобилизованного фермента. При использовании соиммобилизованных глюкоаооксидазы и каталазы био-сенсср чувствителен к перекиси водорода с концентрацией до 6 мМ. Время развития 98 я-ного отклика составляло 30 с. Попытки воспроизводимо детектировать D-глюкозу оказались безуспешными. Это мо*ет быть обусловлено незначительной конверсией О-глюхонолакто-на в слое ферментов, вследствие чего экзотермическая нейтрализация образующейся кислоты протекает преимущественно в объеме анализируемого раствора.

Кинетика функционирования биосенсоров на основе термопары характеризуется уравнениями С1.42)-С 1.433 с дополнительным коэффициентом в их правой части, отражающим степень снижения величины отклика тепловым потоком между спаями термопары толщиной л: 1/С1+2Х d/X.ra+V t/X. m), где к - коэффициент теплопроводности

SI и 81 i №

материала термопары.

ГЛАВА II. СТАЦИОНАРНАЯ КИНЕТИКА ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ БИОСЕНСОРОВ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ ПОЛИФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ СУБСТРАТА Одним из актуальных направлений развития мембранных биосенсоров, обеспечивающих расширение их функциональных возможностей, является создание полиферментных Сбиферментных, трехферментных и т.п.) сенсоров (Hall, 1990; Кулис, Разумас, 1983).

2.1. Электрохимические полиферментные сенсоры Действие полиферментных сенсоров на основе адсорбированных биокатализаторов рассматривалось при малых концентрациях субстрата для режима внешнедиффузионного контроля (Кулис, Разумас, 1983). Нами проведен теоретический анализ стационарной кинетики функционирования электрохимических мембранных биосенсоров, детектирующих конечный продукт последовательных полиферментных превращений субстрата в покрытии с равномерно или послойно распределенными иммобилизованными ферментами.

2.1.1. Сенсоры с равномерно распределенными Ферментами В соответствии с разработанной обобщенной моделью покрытие биосенсора включает внутреннюю и наружную мембраны и слой, со-

держащий N соиымобилизованных ферментов. Предполагается, что продукт реакции, катализируемой ферментом Е1, + ( является субстратом фермента Е1+[, первая ("пусковая") реакция протекает по схеме Михаэлиса-Ментен, а все последующие представляют собой необратимые реакции первого порядка по соответствующему субстрату с константой скорости к:

к к к к

8 +Е ь1'' » Е 8 V > Б —^—, $

1 1 К 11-Ь

-1'1 к 1 . (2.1) ••Л—*— ■•Л-^—Рн-

Проницаемости слоя ферментов, наружной и внутренней мембран толщиной I, <1 и И характеризуются коэффициентами

Решением системы диффузионно-кинетических уравнений для концентраций определяемого субстрата ^ 3, интермедиатов СБ13 и детектируемого продукта СРН3, полученным в предположении отсутствия в растворе Р^ и постоянства концентрации в нем , установлено, что взаимосвязь между концентрациями субстрата в слое ферментов, на границе слоя и внутренней мембраны [¿М ив растворе [Б 3 определяется с помощью преобразованных соотношений Cl.ll) и (1.12):

[Б 3=[2 3(1+1^ Э/Кц^сК а (Х-М-12 3*/*^ ; С2.2)

[Б, 30=С[2 3^1)[(1+[2 З/К^Ж-СЗЗ/^]. (2.3)

Здесь а =(к /0,)1 /2/(1+[234/К^ ); X - расстояние от поверхности преобразователя;

* =сЬ а 1+а 1( «1/1Л)зЬ а I, ;=1,2,...//. С2.4)

Распределение концентраций интермедиатов ^3 в слое ферментов описывается функцией диффузионных модулей а^^СК 1*/й1У/*: ^Н^ 30К1+С5 ^^ЕД^'Са/а^сЬ а^Х-Ю, С2.5)

1/0^1)«]-'. к*Ь 1>2; (2.6)

Для концентрации конечного продукта при потенциометрическом детектировании справедливо:

СРМ3=<[5 ^/^Щ^г^-М-^сЪ с^СХ-Ю], С2.7)

при амперометрическом -

^/КЛнд^П-^сК с^СХ'Ю]}. (2.8)

Выражения (2.5)-(2.8) получены для различающихся значений модулей 0^1. Функции [Р{^](а11), 1еС 1 ,Ю инвариантны к перестановке

СN-V модулей с*а i.....c^l, а при [St КК^ являются симметрическими.

Стационарный отклик потенциометрического биосенсора р определяется концентрацией продукта около поверхности преобразователя tPNl и инкрементом 6, отражающим селективность преобразователя и содержание мешающих ионов:

P=Po+7jlog (СР„3+6). С2.9)

где 7) - крутизна электродной функции,

CV=CES ]о+[2 iv^^CV1-1^- С2Л0}

При амперометрическом детектировании плотность тока биосенсора i пропорциональна градиенту приэлектродной концентрации PN:

i=(nf/Tj¿(IS, lo+tS IV^^JE^,Z (1-1/ifp. C2.11)

Критерием работы биосенсоров в диффузионно-контролируемом режиме является совокупность неравенств

Jf >1. jб( 1,N). (2.12)

При их выполнении tS ]<RXСSt 1 о, а =(kt/Вх)1 /a, а в выражениях (2.10) и (2.11) для и i с учетом тождества

Ej=iZNj=£j=t n^H-ia^irrsi, Н*. k*j (2.13) нивелируются каталитические характеристики ферментов.

При невыполнении неравенства (2.12) для m-го фермента кинетика полиферментных сенсоров идентична кинетике моноферментных сенсоров [см. выражения (1.15) и С1.34)].

Если в покрытии активности двух ферментов, например, п-го и q-го достаточно малы и условия С2.12) для них не выполняются, то сенсоры чувствительны к варьированию модулей для обоих ферментов

Г 1-1/* 1-1/К 1 t=CPN3(nF/rrVR. =(nF/ry)CS ]l-Я— + -- .(2.14)

Исчезновение в кинетическом описании действия полиферментного сенсора характеристик одного из ферментов, например, W-ro, наблюдается не только при но и тогда, когда величина c^l существенно превышает величину модулей всех остальных ферментов.

С увеличением отношения tj/td плотность тока и концентрация tPMJ сохраняются постоянными в диффузионно-контролируемом режиме и возрастают пропорционально величине (l/ß+tj/ij)11, где п-количество ферментов, работающих в кинетически контролируемом режиме.

величина верхней границы диапазона концентраций субстрата,

б котором калибровочные кривые сенсоров линейны, (СБ53*) оценена, исходя из предположения о том, что максимальные концентрации

Б1 в слое не превышают ОДК^. Установлено, что СБ4 ]* равна меньшей из следующих N величин: ОЛ^М /*,сЬ « I; (0.1/^/1^)^,(2 /К Ха^У. М2,Ю.

сг.15)

В частности, для биферментных сенсоров справедливо: [Б ]*=тп{0,1/(М1 М /^сНа I; 0, ^^¡-(^/а -1/М,)}.

(2.16)

На рис. 6 представлены функции от а I, формирующие в (2.16) величину СБ,)*: пунктирной линией - ^ Г]= 0,1М/сЬ сплошной - К. СБ )*/£, =0,1[1-(а /а )г]/(1/М -1/М ). При отсутст-

1 10 П2 2 1 12

вии наружной мембраны (а) [Б для а 1<1 или для лю-

бых сочетаний значений модулей, если . и

СБ ]*=0,1КИаМг/11 1 С2.17)

при а 1>1, если ■ При ^/1^=1 и 10 (б и в) значение

СБ[ ]* с увеличением а I первоначально возрастает: СБ1 ]*=0,1^ N / ^сЬ а^I,а затем приближается к постоянной величине, с достаточной точностью определяемой выражением (2.17). 1од

+*

+ г

о

Рис. 6. Логарифмические зависимости функций, определяющих в выражении С2.16) величину ЕБ^ от а] I при различных отношениях проницаемостей (а, б и в) и значениях аа1 (цифры около кривых). ¿х: а-0; 6-1 и в-10,

V м

Величина нижней границы обсуждаемого диапазона СБ 5 для потенциометрических сенсоров установлена с помощью выражений (2.9) и (2.10) для р и СР 1. Концентрационная зависимость потенциала отклоняется от линейности на величину, равную, например,

0,1т), при

log £S l^*=0,5868+log C-log ЕД^О"!/^)]- C2.18)

Диапазон шире в диффузионно-контролируемом режиме, при использовании высокоселективных преобразователей и снижении активности мешающих веществ Сионов) в растворе.

Кинетический анализ влияния эффекторов биокатализа на эксплуатационные параметры полиферменгньгх сенсоров показал, что, например, для амперометрического биферментного сенсора обратное значение плотности тока линейно увеличивается с ростом концентрации конкурентного Снеконкурентного) инибитора при выполнении одного из следующих условий: с^Ш; для ингибируемого фермента al>l, а снижение величины i составляет более 25 % (при tt/^d=l). Бесконкурентные ингибиторы не "чувствуются" сенсором.

Степень снижения величины отклика из-за необратимого инги-бирования (термоинактивации) одного из ферментов не зависит от значений модуля для неинактивируемого фермента.

Диапазон концентраций субстрата, удобных для биосенсорного определения, сужается при неконкурентном и бесконкурентном инги-бировании ферментов и расширяется при конкурентном. Необратимое ингибирование С термоинактивация) ферментов при о^ИОД не влияет на величину диапазона, а при «jl^l - сужает его, причем скорость сужения выше в случае инактивации второго фермента.

2.1.2. Сенсоры с послойно распределенными ферментами

Покрытие сенсора имеет структуру типа сэндвича: фермент Et локализован в слое, который примыкает к наружной мембране, фермент Еа - в слое, контактирующем с предыдущим слоем; далее следуют слои ферментов Ез,...,Ej,...,EN, Толщину слоев обозначим через Да, ,...,t^.....LH, их общую толщину - через I.

Установлено, что при протекании последовательных превращений (2.1) концентрации субстрата (Sj) и интермедиата (Sj) распределены в слое соответствующего фермента следующим образом:

CSjMSjlch a^X-h-l+T^i^y.), J =1,2.....N. (2.19)

Здесь [Sj] - минимальная концентрация S в слое,

CSjM^/Ctfj-l)]!;^ n^fctS^Cl-i/fy; (3.20)

Vch V/VA/'-r1^--. Wsh Vr C2 21D

tSfc3o - концентрация Sfc в растворе; ttJ - коэффициент проницаемости слоя фермента Е^; X - расстояние от поверхности преобразователя.

Выражение (2.193 получено для относительно малых значений [3 о.

Профиль концентрации продукта в слое Н-то фермента при по-тенциометрическом детектировании найден равным

[Рн]=Г2мЦЯм-сЬ с^СХ-М], (2.22)

при амперометрическом -[Рм1=[2м]{Я„-сЬ он(Х-Ю-(Ям-1)[(1^1-Х/1)/£1+1/£<1]/Г^. С2.23)

Выражения для величины стационарного отклика биосенсоров имеют вид:

^о+т)1од у б>; (2.24)

¿КпГ/Т^)^ Пч"кГ2к]оС1-1/Яч>. (2.25)

В эквимолярных растворах SJ и значения потенциала различаются на величину, характеризующую эффективность биокатализа ,]-тым ферментом - при [Рм]>б Др=т)1од (1-1/й ). Отношение плотностей тока сенсора в этих растворах составляет (1-1/й ).

Диффузионно-контролируемый режим функционирования биосенсоров достигается при ^>1.

Диапазон концентраций , удобных для биосенсорного определения, ограничивается сверху минимальной величиной в ряду: (ОД^/К^К^-^/сЬ с^З/П^СЫ/Я,)-*?,, >1.2....N. (2.26)

где б4=0 и ./22. В отсутствие интер-

медиатов значение граничной концентрации выше и определяется параметрами одного "ключевого" фермента. При Я >1

Расширению диапазона способствует увеличение содержания "ключевого" фермента, снижение субстратофильности полиферментного сэндвича, а также использование наружных мембран с низкой проницаемостью. В режиме кинетического контроля работы нескольких ферментов значение [Б ]* равно 0,1^/^ для первого из них или меньшей величине С2.27) для одного из предшествующих ему.

Нижняя граница диапазона имеет меньшую величину в отсутствие интермедиатов и мешающих ионов в растворе, а также при использовании высокоселективных преобразователей и ферментов, работающих в диффузионно-контролируемом режиме:

Анализ влияния эффекторов биокатализа на стационарную кинетику функционирования амперометрических биферментных сенсоров показал, что плотность тока снижается при конкурентном Снеконку-

рентном) и необратимом мигрировании (термоинактивации) «ферментов, работающих в кинетически контролируемом режиме. Конкурентный ингибитор "ключевого" фермента Е^ вызывает увеличение ^ ]*, бесконкурентный (и неконкурентный при а^>1) - ее уменьшение. При необратимом ингибировании (термоинактивации) Е^ величина [Б, 1* не изменяется, если с^ ^ <1, и уменьшается, если с^ ¿J > 1, причем кинетика сужения диапазона идентична кинетике необратимой реакции первого порядка с константой скорости, уменьшенной вдвое по сравнению с эффективной константой скорости процесса ингиби-рования (термоинактивации).

Сопоставим характеристики полиферментных сенсоров, имеющих послойное и равномерное распределение ферментов. Отношение чув-ствительностей соответствующих, например, трехферментных амперо-метрических сенсоров при равных интегральных активностях каждого фермента и 1<1=11=1-1 ^/3, следуя уравнениям (2.11) (при 5<1) и (2.25), варьирует в довольно узком диапазоне - от 0,75 до 1,35. С увеличением активности отношение возрастает, Ег и Ез - снижается. При наблюдается выравнивание чувствительностей. Диапазон удобных для определения концентраций субстрата в случае лимитирования величины []* параметрами Е1 не зависит от характера распределения, если активность фермента мала: [Б З^ОЛ^ / ^, и шире для послойного распределения ферментов, если Е( работает в диффузионно-контролируемом режиме.

2.2. Амперометрические.биферментные сенсоры

Функционирование биферментных сенсоров, детектирующих конечный продукт превращений субстрата, исследовалось для случаев внутридиффузионного и кинетического режимов работы ферментов (Кулис и др., 1981, 1983; Виджюнайте и Кулис, 1985).

В зависимости от схемы взаимосвязанных процессов и природы детектируемого деполяризатора амперометрические биферментные сенсоры делятся на 6 типов. В покрытии сенсора I типа определяемый субстрат Б при участии первого фермента Е1 превращается в интермедиат Ь, который в ходе реакции, катализируемой ферментом Еа, образует деполяризатор Р. К сенсорам I типа близки сенсоры, чувствительные к деполяризатору-второму субстрату Скосу<5страту) фермента Ег - Бд (сенсоры II типа). В покрытии сенсора III типа Б потребляется вместе с косубстратом Б в ходе реакции, катали-

зируемой . Параллельно с помощью Ег косубстрат превращается в деполяризатор Р. Сенсор IV типа характеризуется двумя двухсубст-ратными реакциями с участием Б, Б„ и Е и Б , Б. и Е . Отклик

К 1 К Д 8

обусловлен детектированием Бд. В покрытии сенсоров V и VI типа субстрат претерпевает циклические превращения. Образование деполяризатора Р в ходе реакции с участием Ег свойственно сенсору V типа, с участием Е( - сенсору VI типа.

Нами разработана обобщенная модель сенсоров, учитывающая активность ферментов, проницаемость электродного покрытия и скорость индикаторной реакции. Электродное покрытие включает внутреннюю мембрану, слой иммобилизованных ферментов и наружную мембрану. Ферменты распределены в слое равномерно или по типу сэндвича (слой представлен в виде двух подслоев равной толщины. В одном из них, контактирующем с наружной мембраной, локализован Е1 , в другом - Ег).

Диффузионно-кинетический анализ модели, выполненный для относительно малых концентраций Б в растворе, показал, что при равномерном распределении ферментов чувствительность к субстрату сенсора I типа, нормированная на его чувствительность к деполяризатору Р, является функцией диффузионных модулей с^ 1= 1[Е )о)'/г и коэффициентов проницаемости слоя ферментов I ^ и наружной мембраны для Б, Ь и Р:

где 1 =сИ а11+а. 1( tJl/t^<¡)sh с^ I. Максимальная чувствительность достигается при а ¿(¿4, Д Л^Ь а, 1>1: р .. Величины р и

1 1 ,) а 1 1Ш ¡эа Ра I

р,/р1т инвариантны к перестановке модулей, если отношения ^ 1 й постоянны, и определяются, главным образом, величиной меньшего модуля С рис. 7).

Рис. 7. Логарифмические зависимости модуля а> I от модуля агI для биферментного сенсора I типа

с равномерно распределенными ферментами при ^/1=1 и различных значениях его чувствительности р( /р т С цифры около кривых).

I т

-о, в

-о,2 +о, г 1од а I

Варьирование отношения проницаемостей слоя ферментов =1{ и наружной мембраны наиболее значимо изменяет чувстви-

тельность при малых значениях модулей Срис. 8).

Рис. 8. Зависимости от 1./1.

I а

чувствительности биферментного сенсора I типа р1 /р( при различных значениях модулей аг1= аг1=а1 (цифры около кривых).

При послойном распределении ферментов чувствительность сенсора I типа установлена равной:

£31 -1>"К«. а, 1/2]

Рг

Ь2

+(а 1/2) зЬ а 1/2]

(2.29)

¿=1,2). Если

где а41/2+а, К^/^эЬ ^1/2, С^.Ь.Р,

эффективность биокатализа достаточно высока -с^1/2 >1, то чувствительность сенсора максимальна:

Се.аЭт^/^С^/^Р^а^/г^). сг.зо)

В отличие от р для равномерного распределения, величина (р,а)т при >1 восприимчива к различию параметров переноса про-

дукта и интермедиата в компонентах покрытия (при 1^/2^ <1 сопоставляемые величины равны).

Сочетания модулей, обеспечивающие фиксированные значения р1а/(р1а)т, представлены на рис. 9. При значительном различии модулей чувствительность определяется величиной меньшего из них.

Отношение нормированных чувствительностей сенсоров I типа, имеющих послойно (р1) и равномерно (р,а) распределенные ферменты, с увеличением равных интегральных активностей последних меняется незначительно и при 1/1^=0 лежит в диапазоне от 0,9 до 1,0. Величина отношения возрастает при уменьшении модуля аг1 С а 1>1) или увеличении модуля а I С агI>13. Диапазон изменений наиболее широк (0,5-1,5) в отсутствие наружной мембраны.

ü> о

+ о, а

-0,2

-О, 6

Рис. 9. Зависимости модуля а 1/2 от модуля аг1/2 для биферментно-го сенсора с послойно распределенными ферментами при I ^ и различных значениях чувствительности р /(р „) (цифры около

1 а 1а'ш

кривых).

+ 0,2

log аг1/2

Чувствительности сенсоров II, III и IV типа с равномерно и послойно распределенными ферментами (р. а ) определяются выражениями (2.28)-(2.30) с некоторыми изменениями. При замене в них коэффициентов проницаемости для продукта Р С tpi) соответствующими коэффициентами для деполяризатора-субстрата Бд получаем характеристики сенсора II типа. Если вместо параметров интермеди-ата L использовать параметры косубстрата S^, то приходим к выражениям для чувствительности сенсора III типа. Наконец, путем замены в (2.28)-(2. 30) параметров деполяризатора-продукта Р и ин-термедиата L параметрами косубстратов и, соответственно, SK получаем выражения для чувствительности сенсора IV типа.

Чувствительность сенсора V типа к субстрату при равномерном распределении ферментов установлена равной:

p0=tsliwLt2<1/2+tPi/W-iV^i/'piCV^i/0?)' С2-31) где H^ch /n+ßlCt^/tj^sh ßl-, j=S,L,P; (/3t)2=(a 1)гЧ«20г. При достаточно больших значениях суммы квадратов модулей

^¿(tjj/tj^tK /?£>1 (2.32)

кинетика сенсора, в отличие от кинетики сенсоров I-IV типа, остается зависимой от значений а, I:

Pe=tsi lu^+tpi'W1"1

Величина инвариантна const, и при их значительном различии определяется величиной меньшего модуля (рис. 10). Уменьшение проницаемости наружной мембраны вызывает значительное повышение ¡з . Так, путем использования наружной мембраны с проницаемостью, 10-кратно меньшей проницаемости слоя ферментов, может быть достигнуто 56- и 20-кратное увеличение чувствительности сенсора, если /31=1 и, соответственно, 10 (а ¿=а I).

1 2

.. 'MtU/'Jo + I)2].(2. 33)

PI Ld Sl Sd l LI Ld г

к перестановке модулей, если ^ /tJd =

о, в

Рис. 10. Логарифмические зависимости модуля а^ I от модуля агI для биферментного сенсора V типа с равномерно распределенными ферментами при-^ а=1 и различных значениях чувствительности р_ Сцифры около кривых).

log aal

В присутствии конкурентного (неконкурентного) ингибитора одного из ферментов чувствительность сенсора снижается. В двухде-кадном диапазоне уменьшения р величина 1/р при t.,/t. =1 про-

о 9 J J j а

порциональна концентрации ингибитора, лежащей в четырехдекадном диапазоне ее значений. Концентрации, при которых наблюдается снижение чувствительности, тем меньше, чем меньше значение модуля для ингибируемого фермента и больше - для неингибируемого.

Необратимое ингибирование (термоинактивация) одного из ферментов также ведет к снижению чувствительности, которое описывается экспоненциальной временной функцией в тех случаях, когда значение модуля для инактивируемого фермента меньше 1 или значения модуля для неинактивируемого фермента.

Для послойного распределения установлено, что

ЛцЖИь,-1)/*8,][Яр,-1+С«.l/2)sh «1/2]

S £si1

(2.34)

" ch «.1/2 Kajaf [l/Li-VSiCffLi-l)/ffSi]sh а, 1/2

где 1/ =a4 ¿C£J1/tJd)ch at l/2+sh c^ 1/2.

При достаточно больших значениях a l=a l=al al(£jJ/£jd)th al/2>l чувствительность сенсора пропорциональна величине модуля -

<2.36)

(2.35)

она значительно меньше величины р

'о

значениях £

pi ' (2.33).

pd'

Так, при постоянных

J1 и справедливо: р„/рва=а 1/2. Чувствительность сенсора VI типа, имеющего равномерное распределение ферментов, найдена равной

(2. 37)

При малых значениях модулей сенсор более чувствителен к субстрату по сравнению с предыдущим. Например, если ^1=0,1, то Рв/Рв=

73 "л

й Увеличение модулей до значений, отвечающих не-

15.

равенствам (2.32), ведет к нивелированию этого различия. При снижении в покрытии сенсора активности второго фермента величина Рв уменьшается и при аг1=0 становится равной чувствительности моноферментного сенсора р С1.163.

Стационарная кинетика функционирования сенсора в условиях ингибирования первого фермента идентична кинетике сенсора V типа, за исключением случаев сочетаний ^¿£10 и а^1<0,1. Необратимое ингибирование С термоинактивация) Е4 изменяет чувствительность обсуждаемого сенсора так же, как и чувствительность сенсора V типа. Ингибиторы фермента Ег не влияют на величину рв при

малых значениях одного из модулей С аЛ <1).

Временное уменьшение чувствительности описывается экспоненциальной функцией при сочетании значений модулей с^1>аг 1>1.

Для ситуации с послойным распределением ферментов установлено:

Р.

р, 1+с«г/а,аг1/2)х

-аа^/'гЛ,)^

7>

(2. 38)

сЬ аг 1/2+Са2/а1 )(2Ь аг 1/2)(Ни -1)/^ .

Сенсор теряет в чувствительности при послойном распределении. Так, если значения а[1ва1 удовлетворяют неравенствам С2.35), то р =р . Чувствительность сенсора критична к величине модуля

вЗ вэ

ог1 при достаточно больших значениях а £ С рис. 11).

Рис. 11. Зависимости чувствительности сенсора VI типа с послойным распределением ферментов от а 1/2 при равных проницаемос-тях слоя ферментов и наружной мембраны и различных значениях модуля а I (цифры около кривых).

1од а 1/2

2.3. Сенсоры с электрохимической регенерацией фермента Последовательные полиферментные превращения субстрата, протекающие по схемам Михаэлиса-Ментен в растворе ферментов, захва-

ченном на поверхности электрода с помощью наружной мембраны, приводят к образованию восстановленной формы М-го фермента ЕГ4НД, который электрохимически регенерируется на электроде с константой скорости реакции первого порядка Л „.. Кинетическим анали-

1НД

зом, выполненным для случая малой субстратной проницаемости мембраны СП относительно проницаемости раствора ферментов толщиной I, установлена взаимосвязь между плотностью тока сенсора I и концентрацией определяемого субстрата в растворе 1о:

С2.39)

Здесь [Э 1 - концентрация j-тo интермедиата в растворе ферментов, рекуррентно связанная с концентрацией С/+1)-го интермедиата

[2н1=СЕм]о) ; . (2. 41) - предельная скорость реакции, ^СЕ^]оI.

Чувствительность сенсора на начальном участке концентрационной зависимости определяется значениями модулей (Кулис, Разумас, 1983) - [~|^^/О4/^) • Предельное значение X при /^>1 пропорционально проницаемости мембраны: \т=пГ£. При насыщающих концентрациях субстрата плотность тока не превышает электрохимического эквивалента предельной скорости реакции, катализируемой Е : I =пГУ -X. Г," [5.1.

¥ 1 Ш 011 И Л г 2 4

Установлено, что плотность тока биферментного сенсора в широком диапазоне ее значений линейно связана с величиной

£/(Х[Б1 ]0/1-1)22=а-Ь£, С2. 42)

где а и Ь - коэффициенты, в общем случае определяемые значениями V ^. параметра /КщХ1**,,,1/*«*) и модулей ^ и (32~

Ь=а\(1 +сг/? +/За)ргМ 1 +/3, //?аХ1 (1+Р,) +(11» Ап/СН1.

Если значение а достаточно велико <г>(1+Ра)/Р, при /3 >/За или ог>С1^а)я//31(1+/31) при (2.43)

то сенсор не чувствителен к варьированию активности первого фермента, Ь=1+Ра, а отношение а/Ь характеризует меньшую из предельных скоростей процессов с участием Еа - п/Ута или Диапазон концентраций субстрата, в котором'наблюдается 10Х-ное снижение чувствительности сенсора, расширяется с уменьшением модуля |3 и увеличением модуля /Зг: если кг в1>*,вд. то

[S C2.44)

При kz аКЬ1яд величина IS, 3* дополнительно пропорциональна снижающему ее значение отношению k l/k .

2,2 I Н Д

Если значение параметра сг мало и удовлетворяет неравенствам, обратным (2.43), то b=1+ß , а отношение коэффициентов представляет собой нижнюю оценку величины электрохимического эквивалента V , совпадающую с ней при ß >1: a/ö=nFV /3 /(1+0 ). Гра-

Vli 2 nl 2 2

ничное значение tSt 1* не зависит от содержания Еа и возрастает с увеличением активности Е и уменьшением проницаемости мембраны: [S (l-^J'/0,9(10+^).

ГЛАВА III. ПРЕДСТАЦИОНАРНАЯ КИНЕТИКА ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МЕМБРАННЫХ БИОСЕНСОРОВ

Исследования предстационарных процессов в покрытии мембранных биосенсоров дают возможность предсказывать кинетическое поведение биосенсоров и обоснованно предлагать пути совершенствования их конструкции.

3.1. Электрохимические моноферментные сенсоры

Функционирование сенсоров рассматривалось ранее для режимов внутридиффузионного и кинетического контроля скорости ферментативной реакции в однослойном покрытии (Meli, Maloy, 1973; Carr, 1977, 1980; Schulmeister & Scheller, 1985).

В работе проведен кинетический анализ обобщенной модели биосенсоров, покрытие которых включает слой иммобилизованного фермента и наружную мембрану. Установлено, что распределение предстационарной концентрации IS1 субстрата, превращающегося в детектируемый продукт по схеме Михаэлиса-Ментен, в покрытии описывается системой двух линейных дифференциальных уравнений при соблюдении двух ограничений: в слое фермента выполняется неравенство [S]</CM; соотношение между каталитической константой ка и константой к t ферментативной реакции должно отвечать механизму Бриггса-Холдейна Скг>к i). Система уравнений решена в предположении индифферентности преобразователя к субстрату и ступенчатого увеличения концентрации последнего в растворе в начальный момент времени (IS]= tS]^ при t^O).

Пространственно-временное распределение субстрата при выборе начала линейной координаты X на поверхности преобразователя описывается выражениями

- в слое фермента толадной I

tSl=[S]o[ch aX/H-£n*iBneos ù>nX exp (-aaDst)]; (3.1)

- в наружной мембране толщиной à

[S]=rS]o{[ch aX~a(. i-X)sh аЦ/К-ЦД 0n(cos o>nl/sin and)x

sin a (l+d-X) exp (.-c£D„t)\. (3.2)

n n »>

Здесь через al обозначен диффузионный модуль, определяемый константой скорости образования фермент-субстратного комплекса Mt, концентрацией фермента t Elо, величиной I и коэффициентом диффузии субстрата D„, al=(k CE] Iг/0_),/а; M=ch al+adsh al;

!> 1 О *Ь

2cos (о I/а Isín a d

g __n n_n_ . (3 3)

n~ sin 2ь> l dfeos to П* r sin 2a dl

1+---M h--—

2a) l ILsin a dj L 2a d J

a*=a +ша; o>n~ неотрицательные последовательно возрастающие корни трансцендентного уравнения шп1д wnl-an/íg and. Распределение концентрации продукта CP] в слое фермента, начиная с момента времени t>í/kz, при достаточно мягком условии [Е]о</См описывается уравнением

dl ?)/dt=Dpâii?]/dXt*ki [Е]о [S]. (3. 4)

При насыщающих концентрациях субстрата скорость образования продукта постоянна:

а[Р]/а1=ор0г[р]/<эха+ласЕ]о. с з.5)

В наружной мембране диффузия продукта следует II закону Фика а[Р]/31=0р5*[Р]/5Х". (3.6)

3.1.1. Амперометрические биосенсоры Интегрированием уравнений СЗ.4) и (3.6) для СР1 с использованием СЗ. 1) для [S] получено выражение для распределения концентрации деполяризатора-продукта в покрытии биосенсора, дифференцированием которого по переменной X установлено выражение для плотности предстационарного тока. При d=0 и Dg=Dp=D

_ _c-13e+1r tklEI/l *)JU>

i=nFDlS) Г Г -—i—2-ES-, С3.7)

•**=«**=«(* CEI *r* V)(4r*-r* )

x t o ' зт-i Jy 'n 2П-1

где =(2m-l)n/2¿; )-n=nrr/2l; J^j -функция, стремящаяся при t—► 0D к 1

(к CEI +ya CQexp (-4)^D£)Oexp [-(h CE] D)t]

j Ci) _ i о am-i ^ r 4 ' n ' n rLNt о 'am-i ' '

nn " к CE] D-4^D

i о * zm- t * n

Выражение (3.7) описывает сигыоидную кинетическую кривую. При высокой активности фермента кинетика функционирования биосенсора идентична кинетике диффузии деполяризатора и время достижения 95 v,-Hofc величины стационарного тока минимально: вв= 0,29512/0. С уменьшением at наблюдается ~5-кратное увеличение значения I (зависимость величины t D/1аэт от at

о, ев о, ев ' о, ев

приведена ниже на рис. 14, кривая D.

В растворе субстрата с концентрациями, насыщающими фермент, плотность тока сенсора при с£=0 установлена равной:

i=nf(Ms,[E]ol/2)il-^i4[C-l),n+1+l](niir)-2expt-(n№/L)2Dpt]>.(3.8) При t>0,04la/Dp отношение любого члена ряда к последующему превышает 100 -

i =nfС t El о I /2) ■{ 1 -( 8/га) ехр [-я2(0р/1г) . С3.9) Плотность тока пропорциональна удельной поверхностной активности фермента и приближается к стационарному значению по экспоненциальному временному закону. Время развития 95 %-ного отклика составляет 0,2821г/0, 99 '/.-ного - 0,445l2/D.

Зависимость (3.7) характеризует кинетику функционирования Н.0,-чувствительного биосенсора на основе иммобилизованной глю-козооксидазы из Pénicillium vitale при следующих условиях: CS3o<0,7 мМ, [S]o/tOa]o<3 и CE3o<0,33 мМ, где CS]Q - концентрация /3-0-глюкозы. Экспериментально показано, что нормированные кинетические кривые сенсора в аэрированных растворах D-глюкозы с концентрацией до 3 мМ совпадают друг с другом и формально описываются кинетикой реакции первого порядка. Найдено, что при отсутствии наружной мембраны D/l2=0,26 мин"1, а при использовании целлофановой и купрофановой мембран D/1®=0,12 и 0,058 мин"1.

В работе приведены результаты исследования предстационарной кинетики функционирования глюкозооксидазно-каталазных сенсоров, чувствительных к кислороду. Установлено, что нормированные кинетические кривые сенсора при концентрациях D-глюкозы до 2,3 мМ совпадают друг с другом и формально описываются кинетикой реакции первого порядка с кажущейся константой скорости k^tf= 2,1 мин"1. В 1,1 M растворе субстрата отклик сенсора развивается существенно быстрее, причем к „,=18,6 мин"1. Выяснено, что в слу-

э(4

чае внутридиффуэионного контроля при использовании высокоактивных препаратов глюкозооксидазы величина определяется коэффициентом диффузии кислорода в слое и толщиной слоя: гг20/1а. Для насыщающих концентраций О-глюкозы увеличивается на величину АгокГ Е30/2. Сопоставление опытных величин двух констант позволило определить, что [Е3о=0,24 мкМ.

3.1.1. Потенциометрические сенсоры Предстационарная концентрация потенциал-определяющего продукта в двухслойном покрытии сенсора при (БК*^ установлена путем решения уравнений СЗ.4) и (3.6) при 0д=0р=0, нулевом начальном условии и граничных условиях, предполагающих отсутствие продукта в растворе С[РЗ =0 при Х>1+й и НО) и 3[р]/<?1=0 при Х=0 и 1>0. Детектируемая преобразователем концентрация продукта [р]=СРКХ=0,1) определяется выражением

[Р1/[8]в=1-1/К+Ц£Ввец) (-а'ОО-

-^[гС-П"*1 /гтСШ)]ехр (-у^О- СЗ. 10)

где ут=(2т-1)л/2С1+<1]. Анализ этого выражения показывав.', что кинетические кривые накопления продукта при различных значениях а1<0,1 смещены по оси ординат практически параллельно -

[Р]/[Р]СТ=1-Цп® [8(-1)т+1 /(2т-1>1г] [т+4/гга(2т-1)а]х

"ехр [-(2ш-1)алаг/4], (3.11)

и сливаются в кривую, характеризующую пассивную диффузию продукта из раствора, при а1>10:

£Р1/[Р]ст=1-1^™ [4(-1)п+'/С2т-1)л]ехр [-Сгт-1)ялат/4]. (3.12)

Здесь [Р]ст~ стационарная концентрация продукта; т=Ю/С1+сСг.

Если продукт реакции является однозарядным ионом, то кинетическая кривая биосенсора описывается выражением (2.9), в котором т?=±ет/Г. Оценим время отклика биосенсора при различных соотношениях значений модуля а1 и <3/1. Под временем отклика будем понимать безразмерную величину то 1 =1о (0/(1+сО*, где 1о 1 -время, в течение которого развивающийся с момента появления'субстрата в растворе потенциал достигнет значения, отличающегося от стационарного на ОД мВ. В соответствии с результатами, полученными при [Р]ст>5, Г=298 К и представленными на рис. 12, отклик сенсора с изменением отношения 6/1 от 0 до 10 развивается наиболее медленно при малых значениях модуля, например, аг=0Д (Я: т =3,0-3,2. Минимальное время отклика достигается при а1=10

(3) - то t =2,34. В случае промежуточного значения модуля Cat=l, 2) при увеличении отношения d/l наблюдается уменьшение времени отклика до то j = 2,39. Варьирование значений модуля при d/L=l ведет к изменению величины т в диапазоне от 2,34 до 3,23 С4).

О, 1

log al

-9 -« Г| ^

т 0, 1 -г - 1 1 1

3, 0 Л

2, в •\z 3 5

1 1 1 1

Рис. 12. Зависимости времени от -клика потенциометрического моноферментного сенсора то 1 от отношения й/1 (1-3,51 и модуля а1 С4) при малых (1-4) и насыщающих концентрациях субстрата (5) а1: 1-0,1; 2-1; 3-10; <3/1: 4-1

d/l

Время отклика сенсора при G/[S3o<0,l постоянно (al=d/l=1) и снижается пропорционально величине log 6/[S]o, если C/[S3o>l.

В случае насыщающих концентраций субстрата решение системы уравнений (3.5) и (З.б) с соответствующими условиями приводит к следующему выражению для концентрации продукта на поверхности преобразователя:

[Р]=(fc2[Е]оiz/Dp)[1/2+d/l-I^™ Спехр(-б*Dp t)]. (3.13)

Здесь <Jn=(2n-l)jr/2(I+<2);

2sin 6 I

- П

6 I

n

1 1 sin J d-<5 dcos <5 d

-|+2(-l) • n n-----n

I 6 Нд 6 I (5 1)г| ' " 6 1(6 1+6 О)

п 3 п п у -1 п 4 п п '

Величина отклика сенсора при [Р|,т >6 пропорциональна лога-

рифму поверхностной активности фермента. Увеличение отношения «¿/£ от 0 до 10 при С<2+П=сопз1 незначительно (на 7 Я) замедляет время отклика сенсора. Это иллюстрируется зависимостью то J от с¿/I, рассчитанной с помощью уравнений (2.9) и (3.13) и приведенной на рис. 12, 5.

В присутствии мешающих ионов в растворе субстрата, при низкой селективности преобразователя и низкой эффективности биокатализа, если 6/[Р1ст>1. время отклика сенсора снижается пропорционально логарифму этой величины.

3.2. Амперометрические биферменгные сенсоры Сопряженные процессы массопереноса и биокатализа в покрытии сенсоров описаны системами дифференциальных уравнений второго

порядка в частных производных, составленных в предположении не-лимитирующего внешнего массопероноса и первого порядка скорости реакций в покрытии сенсоров, содержащих равномерно распределенные соиммобилизованные ферменты. Уравнения решены при нулевых начальных условиях для концентраций диффузионно-подвижных веществ и граничных условиях, предполагающих скачкообразное увеличение концентрации определяемого субстрата в растворе в начальный момент времени, индифферентность индикаторного электрода к субстрату и интермедиату, а также диффузионно-контролируемый режим протекания индикаторной реакции.

3.2.1. Последовательные превращения Глюкозооксидаза и пероксидаза, соиммобилизованные в латекс-ном покрытии стеклоуглеродного электрода, в присутствии ферроци-анида калия осуществляют последовательные превращения /?-0-глюко-зы в Нг0а и детектируемый феррицианид. Типичные нормированные кинетические кривые биферментного сенсора приведены на р-с. 13.

Рис. 13. Предстационарная кинетика функционирования биферментного сенсора О-глюкозы с различной толщиной покрытия I С1-4, 5-7) при различных активностях ферментов в покрытии С 2-4, б и 7) и в случае диффузии Кз[ГеССЮв1 С1, 5).

I, ММ * 1-4 - О ДО; 5-7 - 0,14, Ферментативная активность глюкозо-

о, о

оксидазы и пероксидазы, мМ.л"'с"

О ZO 40 £ С

2- 1,8/2,0; 3- 0,33/0,50; 4- 1,7/0,50; б- 0,33/1,5 и 7- 0,07/ ОД. Концентрации, мМ: K3tFeCCH)e]-5 (i,5); K^[FeCCN)e1-5 С2-4,б,7); D-глюкозы-1 (2-4,6,7). ОД М фосфатный буфер, pH 7,0,

ОД М KCl._

Скор." сть образования продукта биферментных превращений меньше скорости его диффузии из раствора через соответствующее покрытие и существенно зависит от активности ферментов. Так, 95 %-ный уровень тока сенсора в растворе деполяризатора достигается на 36 с (/), в растворах субстратов при высокой активности ферментов -на 38 с (2), при 4-5-кратном уменьшении активностей - на 54 с (3). Кинетические кривые не меняются в интервале концентраций D-глюкозы 0,5-5,0 мМ.

В соответствии с результатами теоретического анализа кинетики предстационарных процессов в покрытии плотность тока биосенсора составляет:

8С-1)т+,г ik к /12)J(2> i=nFD[S] Г 00 Г -^—-sjs- (3.14)

4 j 'гт-i г 'гт-i 'v ri 'гв-г

где Л - константы скорости реакций псевдопервого порядка по S и L, ^ ; i , у^ определены в (3.7); J^ - временная функция, симметричная относительно ki и стремящаяся к 1 при t—* оо

СМ +Г2 Р)(Л +r2 D)exp (-4y2Dt)

J (2) v I '2П1-1 2 1 2П-1 7 r 4 ' П _

nm Uy'D-r2 D-k )(4r*D-r* D-k )

4 'n 'гп-l 'n 2Ш- 1 2

Из анализа выражения (3.14) вытекает кинетическая неразличимость констант ki и к^. При atl>l или аг1>1 [<^1= (к l2/D)1/2] кинетика биферментного сенсора идентична кинетике моноферментного сенсора (3.7). Варьирование значений меньшего модуля изменяет время достижения 95 %-ного отклика то ee =t0 eo D/i2 -5-кратно (рис. 14, i). При увеличении равных значений модулей величина т уменьшается -6-коатно (2).

Рис. 14. Зависимости времени 95%-ного отклика то ов амперометри-ческих биферментных сенсоров от значений модуля al для ферментов, осуществляющих последовательные (.1,2), циклические (3) или параллельные превращения субстрата (i). Для последовательных превращений:

al=a I (a 1>1) или al=a t (a 1>1) 12 2 1

(i); al=ail=a2l (2). Для циклических (3) и параллельных превращений (i): al=(3l.

3.2.2. Циклические и параллельные превращения Циклические превращения никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) осуществлены в алкогольдегидрогеназном сенсоре, в латекс-ном покрытии которого восстановленный NAD* (NADH) реокисляется феназинметосульфатом (ФМС). При введении NAD+ в раствор этанола и ФМС отклик биосенсора развивается существенно медленнее по

1,0-

log al

о, ев

сравнению с диффузией ФМС или NADH (рис. 15). Изменения концентрации NAD* в интервале 0,05-0,5 ыМ не влияют на нормированную кинетическую кривую 3. Время достижения 95'/»-ного отклика биосенсора составляет 180 с, тогда как при диффузии ФМС и NADH tc 18 и 24 с.

Рис. 15. Предстационарная кинетика функционирования биосенсора при протекании циклических превращений NAD+ (3) и диффузии ФМС (О и NADH С2) в ферментном покрытии.

Концентрации этанола 1 М (3), ФМС 2 мМ (Л и 1 мМ (3), NADH 2 мМ С?) и NAD+ 0,05-0,5 мМ Ш. Активность алкогольдегадрогеназы 1,5 мМ.л"1с"' Толщина покрытия 0,08 мм.

Анаэробный 0,1 М фосфатный буфер,

_pH 7.0. 0.1 М KCl_

Анализ кинетики циклических превращений субстрата привел к следующему выражению для плотности предстационарного тока сенсора:

i^Dts],!;^

СП

4C-l)m+,(k * /DL®)J

4 1 a' ' i

(3)

nm

где

J

(3)

Г С4Г* "У* )(Гг D+k +k )

1 гш-i4 'л • atn-i am-i 1 a'

4raD(r* D+k +h )exp (~r* Dt)

'n гп-i l a' r 4 'am-i

(3.15)

(k +k )(4r*D-rl U)

4 1 «' * * n 21-1 '

ra Cra D+h +k )exp (-4y*DO 4rV exp [-(j-2 D+k+k)L]

*am-iv'am-i 1 r ' * n ' ... ' n* am-i r ь 41 am-i 1 a' л

4 i a 'n а л-1 'n 'ги-i' 4 i a'4 i a 'n 'am-i '

При pi=[(Mt +ka~)lz/D]iyx>l время отклика минимально: то eo = 1,31 (рис.14, 3), т.е. при циклических превращениях даже с большими скоростями отклик биосенсора в растворе субстрата par аива-ется в 3,5 раза медленнее, чем в растворе деполяризатора. При pi <0,1 стационарное состояние достигается наиболее медленно: то во=1,99. Это условие характеризует кинетику биосенсора NAD*.

Предстационарная кинетика функционирования биферментного сенсора, осуществляющего параллельные превращения субстрата, идентична кинетике моноферментного сенсора (3.7), если al=/3l

Срис. 14, 2). Параллельной конверсией части субстрата в электрохимически пассивные продукты достигается снижение времени отклика биосенсора при одновременном уменьшении величины его стационарного отклика.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

В диссертационной работе установлены кинетические закономерности стационарного и предстационарного функционирования электрохимических и энтальпиметрических мембранных биосенсоров, основанных на биокаталитических превращениях определяемого субстрата.

1. Найдены общие и аппроксимирующие уравнения стационарной кинетики функционирования моноферментных мембранных сенсоров, конвертирующих определяемый субстрат в процессе обратимой или необратимой реакции по схеме Михаэлиса-Ментен. Применение найденных уравнений проиллюстрировано на примере уреазного рН-электрода, детектирующего мочевину в буферных средах.

2. Предложены уравнения стационарной кинетики функционирования двухсубстратных сенсоров, детектирующих продукт (косубст-рат) ферментативной реакции, и сенсоров, основанных на детектируемой регенерации фермента органическим металлом. Теоретические расчеты подтверждены результатами исследований глюкозоокси-дазных рН-, 0 - и Нг0а-чувствительных электродов.

3. Предложены новые принципы конструирования мембранных биосенсоров, основанные на использовании кондуктометрического и энтальпиметрического методов детектирования биокаталитических процессов в их покрытии. Созданы оригинальные ферментные сенсоры мочевины и Б-глюкозы.

4. Разработан новый метод изготовления мембранных биосенсоров, заключающийся в формировании из смеси раствора фермента и латекса натурального каучука покрытия на чувствительной поверхности детектора.

5. Исследована предсгационарная кинетика функционирования электрохимических моноферментных сенсоров. Найдены уравнения предстационарного распределения концентрации субстрата в наружной мембране и слое иммобилизованного фермента при первом и нулевом порядке скорости реакции по субстрату. Установлены зависимости времени развития отклика потенциометрического сенсора от толщины и диффузионно-биокаталитических характеристик компонентов его покрытия и селективности индикаторного электрода.

6. Найдены уравнения стационарной кинетики функционирования электрохимических мембранных сенсоров, осуществляющих последовательные полиферментные превращения субстрата и детектирующих конечный продукт. Уравнения позволяют установить величину отклика и величину диапазона концентраций субстрата, удобных для биосенсорного определения, их чувствительность к параметрам покрытия и процессам ингибирования Стермоинактивации) ферментов при равномерном и послойном распределении.

7. Предложены уравнения стационарной кинетики функционирования б типов амперометрических биферментных сенсоров, учитывающие схемы превращений, диффузионно-фазовые характеристики их участников и продуктов в компонентах покрытия сенсоров, вид распределения ферментов в биокаталитическом слое.

Установлена структурная общность выражений для величины отклика сенсоров, осуществляющих последовательные или параллельные превращения субстрата. Величина отклика, обусловленного де екти-рованием продукта циклических превращений субстрата, существенно возрастает с увеличением модулей для ферментов и уменьшением проницаемости наружной мембраны, максимальна при равномерном распределении ферментов и при образовании продукта непосредственно из субстрата.

8. Исследована предстационарная кинетика функционирования амперометрических сенсоров, осуществляющих последовательные превращения Б-глюкозы и циклические превращения никотинамидаде-ниндинуклеотида. Установлено, что при высокой каталитической ак-. тивности скорость генерации отклика сенсоров в растворе субстрата при его последовательных (или параллельных) превращениях близка к скорости диффузии деполяризатора через покрытие, а скорость образования продукта циклических превращений - в 3,5 раза медленнее. При малых степенях конверсии субстрата развитие отклика сенсоров существенно замедляется.

9. Предложены уравнения стационарной кинетики функционирования полиферментных мембранных сенсоров, основанных на детектируемой электрохимической регенерации фермента. Для биферментных сенсоров с малой толщиной биокаталитического слоя найдены диагностические линейные анаморфозы кинетических кривых.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях: •

1. Сорочлнский В.В., Курганов Б. И. Ферментные электроды.// Итоги науки и техники. Серия Биотехнология. Т. 13. М. , ВИНИТИ. 1988. 208 с.

2. Курганов Б.И., Сорочинский В.В., Балугян Р.Ш., Янина М.М. Способ изготовления ферментного электрода. // Авт. свид. N 1176250 СССР. Бюл. изобр. N 32. 1985.

3. Курганов Б. И. , Сорочинский В. В. , Балугян Р. Ш. , Янина М. М. , Чирков Ю.В. Устройство для определения концентрации мочевины. // Авт. свид. СССР N 1174857. Бюл. изобр. N 31. 1985.

4. Сорочинский В.В. Устройство для измерения концентрации субстрата ферментативной реакции. // Авт. свид. СССР N 1255643. Бюл. изобр. N 33. 1986.

5. Сорочинский В.В., Курганов Б.И. Теоретический анализ стационарных режимов работы амперометрических ферментных электродов. // Журн. анал. химии. 1985. Т. 40. N 4. С. 643-647.

6. Сорочинский В.В., Курганов Б.И. Аыперометрический глюкозоок-сидазный Н 0 -чувствительный электрод.// Журн. анал. химии.

1985. Т. 40.2И 8. С. 1417-1422.

7. Сорочинский В.В., Курганов Б. И. Диффузионно-кинетическая теория стационарного поведения моноферментных электрохимических и энтальпиметрических датчиков. // Журн. анал. химии.

1986. Т. 41. N11. С. 2055-2063.

8. Сорочинский В.В., Курганов Б. И. Нестационарная кинетика процессов в потенциометрических моноферментных электродах. // Кинетика и катализ. 1988. Т. 29. N 2. С. 344-351.

9. Сорочинский В.В., Курганов Б. И. Биосенсоры.// Новости науки и техники. Биотехнология. М. , ВИНИТИ. 1988. N 5. С. 3-16.

10. Сорочинский В.В., Курганов Б. И. Стационарная кинетика функционирования электрохимических мембранных биосенсоров, осуществляющих полиферментные превращения определяемого субстрата. // Кинетика и катализ. 1991. Т. 32. N 2. С. 312-321.

11. Сорочинский В.В., Курганов Б.И. Диффузионно-кинетическая теория функционирования полиферментных мембранных сенсоров при послойном распределении активностей в их покрытии. // Кинетика и катализ. 1992. Т. 33. N 1. С. 211-220.

12. Сорочинский В.В., Курганов Б.И. Теоретический анализ функционирования мембранных амперометрических биосенсоров на органических металлах.// Электрохимия. 1992. Т. 28. N 2. С.

195-200.

13. Сорочинский ВВ., Курганов Б.И. Стационарная кинетика функционирования полиферментных мембранных сенсоров с электрохимической регенерацией фермента.// Биохимия. 1992. Т. 57. N 11. С. 1603-1609.

14. Янина M. М. , Сорочинский В. В., Курганов Б. И., Балугян P. III. Уреазный рН-электрод.// Журн. анал. химии. 1987. Т. 42. N 8. С. 1512-1517.

15. Kulys J. J. , Sorochinskii V. V., Vidziunaite R. A. Transient response of bienzyme electrodes.// Biosensors. 1986. V. 2. P. 135-146.

16. Sorochinskii V.V. , Kurganov B.I. Polyenzyme sensors performing consecutive transformations of the substrate. Theoretical analysis of their functioning under steady-state conditions. // J. Nonlinear Biology. 1990-1991. V. 1. N2. P. 167179.

17. Sorochinskii V. V. , Kurganov B.I. Steady-state kinetics of . the functioning of organometal-based amperomelric membrane

biosensors.// J. Chen. Biochem. Kinetics. 1991. V. 1. N 4. P. 299-303.

18. Sorochinskii V.V., Kurganov B.I. Steady-state kinetics of reversible heterogeneous-biocatalytic transformation of substrate in membrane biosensors. // J. Chem. Biochem. Kinetics. 1992. V. 2. N 2. P. 119-124.

19. Sorochinskii V. V. , Kurganov B.I. Diffusion-kinetic theory • of the stationary behaviour of .amperometric bienzyme electrodes.// J. Chem. Biochem. Kinetics. 1992. V. 2. N 3. P. 160-171.

20. Sorochinskii V.V. , Kurganov B.I. Steady-state kinetics of consecutive processes in membrane biosensors for laminate distribution of enzymes in their coâting. // J. Chem. Biochem. Kinetics. 1992. V. 2. M 3. P. 172-183.

21. Sorochinskii V.V. , Kurganov B.I. Steady-state kinetics of polyenzymic membrane sensors with electrochemical enzyme regeneration.//J. Chem. Biochem. Kinetics. 1992. V. 2. N4. P. 202-211.

22. Сорочинский В. В., Балугян P. EL , Кальянова E. A. Теоретические и экспериментальные особенности поведения ферментных рН-

электродов.// В сб. Актуальные вопросы трансплантологии и искусственных органов. Ред. .Шумаков В. И. М., НИИТиИО, 1979. С. 218-221.

23. Сорочинский В.В., Сеид-Гусейнов А.А. Ферментный электрохимический датчик глюкозы.// В сб. Актуальные вопросы трансплантологии и искусственных органов. Ред. Шумаков В. И. М., НИИТиИО, 1979. С. 213-217.

24. Сорочинский В. В., Сеид-Гусейнов А.А. Математическое моделирование действия открытых энтальпиметрических ферментных систем.// В сб. Актуальные вопросы трансплантологии и искус-искусственных органов. Ред. Шумаков В.И. М. , НИИТиИО, 1980. С. 176- 178.

25. Сорочинский В.В., Балугян Р.Ш., Сеид-Гусейнов А.А. Метод определения мочевины в крови с помощью потенциометрического датчика на основе иммобилизованной уреазы. // В сб. Актуальные вопросы трансплантологии и искусственных органов. Ред. Шумаков В. И. М.. НЖГиИО, 1980. С. 181-183.

26. Sorochinskii V.V. , Kurganov B.I. Polyenzyme sensors performing consecutive transformations of the substrate. Theoretical analysis of their functioning under steady-state conditions.// In Biophysical approach to complex biological phenomena. Proceedings of the Lebedev-physics institute. Vol. 194. Ed. VolkovE.I. New York, Nova Science Publ. 1992. P. 169-182.

Подл, в печать 26.07.93. Уч.-изд.д.2,0 Тира* 75.