Комплексы кобальта и железа с макроциклическими и хелатирующими лигандами как реагенты для окислительного расщепления нуклеиновых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.08 ВАК РФ

5 ОД

•1ЛР ПП,К РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ! 1АУК

Е1 Лг ^ ,0 ИНСТИТУТ ЭЛЕМЕИТООРГАНПЧКСКНХ СОЕДИНЕНИЙ

ни. А.II. НЕСМЕЯНОВА

На пранах рукописи

УДК 541.128:542.943:547.963.32

БЕЛКОВ ВЛАДИМИР МИХАЙЛОВИЧ

Комплексы кобальта и желеча с макроцнклическими и хслатирукнцими лигандамн как реагенты для окислительного расщепления нуклеиновых кислот

02.00.03 - Химия элементоорпшичееких соединений, 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически актишшх соединений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических нпук

Москва - 15% г.

Рабата выполнена в Институте элсмснтоорганических соединений им. А.Н. Несусниоиа-РАН и на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руконодителн: доктор химических наук,

профессор З.А. Шабарона,

кандидат химических наук, Г.Н. Ноиодарова.-

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор A.M. Юркеипч,

доктор химических наук, Ю.Ф. Дрыгин.

Недуша» организация: Мисти гут молекулярной биологии км. О.Л. Энгельгардт, г.Москна

Реферат | аюслан ^ у лЯ 1996 г.

лашиы состоится 19% г. п часов на

заседании диссертационного сонета К002.9").02 и Институте •ллементооргакичееких соединений им. А Н.Нссмспнона РАИ по адресу: 117гПЗ, Москм, »-334. ГСП-1, ул. Вавилона. 2Х.

С дисссрт.пшси можно. о»икомип.ен » библиотеке ИНЭОС им. А.Н.Несмеянова РАН

Ученый секретарь

диссертационного со лета _ ' Г/JL, 0 „—

кандидат химических паук (jtpJ) Зольникоиа Г.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Интерес к проблеме испольл-чмикя комплексов переходных металле» в качестве решет он яы окислительного расщепления нуклеином,IX кислот (ПК) существенно нозрос и последние годы. Это обусловлено, в первую очередь, поиском новых подходов » создании противоопухолевыхпрепаратов, а также некоторыми аа.чачами генно-инженерных технолог ий.

Деструкци н 11К под действием металлокомплексов 1М К) непосредственно связана со способностью последних генерирован, активные формы кислорода в реакциях сопряженного о кпслсшш подходящих восстановителен (аскорбиновой кислот 1,1, тиолок и др.). Непосредственным окислителем НК выступает гидрокендьашй радикал.

К настоящему моменту получено большое колпчеспю данных о том. что многие органические комплексы переходных металлов (Со, Ре, Мп и др.) могут и определенных условиях (УФ-актииации, наличие окнелнтедыго-воестаноиительной системы) вызывать исспенифичсекое расщепление фосфодиэфирнон связи в нукдеиноиых кислотах. Все они образуют класс так называемых 'химических нуклеач". Термин "химическая нхкледза", применяется для синтетических реагентов, способных вызывать раеще.ленне сахарофосфатиого* остова НК, но аналогии с ферментами -нуклеазам». •

В Институте злемснтоорганических соединений РАН на протяжении ряда лет ведутся исследования каталитических евопеги широкого круга комплексов переходных металлов и реакциях окисления природных восстановителей с целью поиска новых комплексов, проявляющих активность в биологических системах. Эти исследования позволили выявить новые источники активных кислородных радикалов среди комплексов кобальта с макроциклическими и хслатмруюшими лигандами. Именно эти комплексы представляли интерес для исследования их н качестве "химических нуклеаз" в настоящей работе.

Целью настоящей работы* является изучение окислительной деструкции НК под действием комплексов 3-х типов:

- комплексе ") кобальта и железа с лигандами фталоииаиннопого ряда;

- комплексов органокобальта с триде.чтатными основаниями Шиффа;

- комплекса кобальта с корриновым лигандом.

Выбор этих групп комплексов для .исследования в качество "химических нуклеаз" имел цель расширить конек новых типов комплексов, обеспечивающих образование активных кислородных радикалов, и наметить пути для увеличения избирательного действия комплексов при расщеплении М К.

* В руководстве работой принимала участие к.х.н. Н.Ф. Крыиецкая.

»первые показана способность широкого круга фталоцианинопых комплексов кобальта ¡1 железа вызывать растепление МК и процессе 'сопряженного темпового окисления аскорбиновой кислоты в отличие от с wcci .кио ,;:iice фотоиндуинрусмого расщепления ПК. Изучены условия окисдшедьною растепления ГНК. и ДНК » присутствии этих метадлокомилсксоп. пыиилена зависимость эффективности расщепления НК как от структуры МК, так и от струкгуры мсталлокомплсксо». Окупалось, что аффект никое растепление 5S РНК E.coli пьпыкног фтлдоцнан'шм коГкиила и железа как с катионными, так н с анионными за мест геля ми » макролигпя^е, а ДНК-плазмиду pUC, содержащую суперс крученную ti рел а кс прова иную формы, эффективно расшспляют только фпиоиилиипи. содержащие катиопнме заместители и макролпганде. Сделан вывоз о юм. что для эффективного расшсплсння V К необходима upocipaiicniciiiian сближенность последней с МК, определяемая как гидрофобными. гак и '.»лектрослатческпин взаимодействиями.

Показана нуклелтаи амииноеть ряда комплексе» органокобальта с трндешашыми основаниями Шпффа при их гомолизе « кислых растворах (рП <: 7). Обнаружен факт режою увеличения мффскппшостп расшсплсння 1'НК :»гячл компдесами » присутствии аскорбиновой кислоты. Предложен мехашпм двухступенчатого действия комплексов орган о кобальта.

Orpaûorani.i меюли комалетною присоедииепия Со-корриноною и ряда ф.алоиилшиюных комплексов кобальта п железа к олиюнуклеотидам с нельм получения "адресованных" реагентои для направленного расщепления НК. - так называемых, сант-спеиифичсских химических нуклеа». Пиканию, что Со-корриновый комплекс при присоединена» к "адресующему" одигонукдеогиду сохраняет нуклеазную активность, при этом места растеплении СНК-.мишени определяются иуклеотидной иослелотпелыпч-гыо "адресующею" одшонуклеотнда.

ДШ&<к!1ШиЬ!С>»>гы» Отдельные результаты работы докладывались на IV Молу народной конференции по Опонсорпшнчсскон химии (Сап-Диего, США, 1993 r.i, Перкой международной конференции по биокоордина-Uiioiuioii химии (Иваново. России. 1994 t.)

flytt'lHXOJUUL По материалам диссертации опубликованы 1 статья, 2 тезисов докладов и 2 статьи находятся в печати.

ОйК^ииш^тжилг^еер-ГааНУ. Диссертация изложена на 95 СГр. машинописною текста, содержит рисунков Ю таблиц. Диссертация состоит из введения, литературного обзора lia тему "Синтетические химические нуклеазм: тлимолействг.е с нуклеиновыми кислотами, эффективность и селективность действия"., обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы из 99 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. Изучение иуклеязной актшшости фгалошс'шшоиых мсталлохомплсксов.

Фталошшншовый лиганд принадлежит, подобно порфиринам и коррмнам, к классу тетрапнррольных мпкроинклоп, но отличается оч последних иисокой стабильностью, обусловленной наличием о его структуре ааамоншшмх мостиков. Эта стабильность обеспечила испольюианпе МК фтлоцианиноиого ряда в качестве высокопрочных красителем, компонентов лазерной оптики, катализаторов окисления в органических средах. 11 последние шли они нашли применение в фотодинам и ческой тершим опухолей благодаря способности избирательно накаллишться и опухолях « кип.та п. их деструкпшо г, результате фотоиндупируемо!) генерации активных форм кислорода (АФК).

В группе биокоординационноП химии И11ЭОС РАН с»лл ¡терние исследован широки« круг водорастворимых комплексов кобальта ч железа с фтал^цианимовым лиганаем в качестве катализаторов не фотосенсибилнэированнои, а темповой генерации активных кислородных радикалов в реакции сопряженною автоскислеиия аскорбиновой кислоты. Генерация АФК в присутствии металдокомплекса описьшстся схемой:

[М(п'|)г] + Ог-► 1М(п"|>+ 02] -+ М,1+ + О'2 <но2-)

+ о-гцюг) м1>+ + но2" т2ог)

[М(п'|)+] + Н202 -> МП+ + -0Н + 01Г

Роль аскорбиновой кислоты (АН) сводится к восстановлению иона металла:

М|>+ + АН (или А-) -> М<"-'>+ + А* (или А + Н+)

Полученные данные по темновой каталитической активности фталоцианиновых комплексов кобальта и железа в реакциях образования АФК. позволили рассматривать их как перспективные системы для растепления нуклеиновых кислот. Для подобных систем показано, что истинным окислителем НК выступает ОН радикал, атакующий ее углеводный фрагмент с отрывом

атома шлорола. Последующие прекращения продуктом окисления приводят к раешеплешно c.i\;ip<>«!>ocilwTnoro секта ПК.

Ц фтатоиианинокмх комплексе»', кобальта и железа, исследованных нами в качесию химических нукде.и были сиигемрмгаиы в Государственном научном центре РФ "НИОПИК". Структуры комплексов прицелены на рис. 1.

1.1. Чибор условий расщеплешш ПК мсталлокомклсксамк.

Эффсччтииность расщепления НК-мишсиеа.

fiicuiCIlliJiii-C-tilKj И качестве РНК-мишенеи были выбраны 5S РНК рибосом F.coii и 'П».'ПчгтирШ!а.

Поиск oriTiiMiuuu.ix: условий реакции растепления РНК включал выбор буфера, подбор концентрации мепал о комплекса и аскорбиновой кислоты, (мучение кинетических j.iKoiioMepiiocreii рсакиии.

Реакцию р.кшенлепии I'll К пропилили а условиях сопряженного а is то к пелен пн аскорбиновой кислоты при 37"С к течение 30 мин, молярное соотношение МК/А11 составляло 1:10, молярное соотношение М К/11 К - 1:10, коилет рация ['ПК и расчете на мопомерное meiio (С„) составляла 10"' М Лнхнп продуктов растеплении 5'-'*Р-мечснон 5S РНК E.coh iiponmvui.ni и 12Гс ПАЛ Г с поеделуютеи раининтогрл^исП. Эффективность пиролиза определяли по соотношению радиоактивною счсы продуктов растепления и общего количества РНК.

Нами была »пучена зависимость степени расщепления РНК от концентрации аскорбиновой кисл»7Ы Цщс. 2). Найдено, что максимальное растепление наблюдается в интернате концентраций All or 2 10'1 М до 5 Ю'} М. а при дальнейшем увеличении концентрации эффективность растеплении возрастает незначительно, поэтому нее дальнейшие исследования активности свободных МК проводили при соотношении МК н аскорбиновой кислоты рапном 1:20-50.

Фталоцианин - Pc, N1 - металл: Со(П), Fc(II)

! N* Комплекс R1 r2 r' r2

МК1 IFcPctCHjCsHjN-JsICr» H _СНг~н©5 СГ r'=r2 r2=r2'

МК2 lCol'c{SOjNa)2] Л SOjNa h h

MK.J (FcPciSOjNa):) il ;so,Nn h h

МК4 (FcI'c(COONa)sl И ; COON a r3-r2 r2=r2'

МК.5 [CoPc(SOjH)2l il sojh h II

M Кб ICoNctl'liSOjNn).] Я r2=r2'

МК7 (copc(chic5h»nT+)slCr¡i H er r'=r2 r2=r2'

MKS (CoPc(CH2SC(NH2)2rs|Cr8 . H CH2SC(NH>)2+ CI" r,=r2 r2=r2'

МК9 (CoPc(COON'3)8| H coona r3=r2 r2=r2'

M К10 |CoNc(CH2CjH4N't)4]Cr4 H rî.rj- ^ ^ ci" r2—r2

MKI1 (CoPc(S02N(CH2COOH)PhOH)3| H so-in(chicooii)PliOH H r2=r2'

•Piic.t. Фгалоцпаниновыс металлокомплсксы.

Рис. 2. Степень расшеиления 55 РНК рибосом Е.соИ (С0 - Ю'3 М)

мсад.токомилекеом ?| (концентрация КИМ; 50 п\М

этилморфолинопый «у«{'ср. рН 7.5) п зависимости от концентрации аскорбиновой кислоты.

Было обнаружено, что эффективность растепления РНК существенно зависит от ¡триролы н концентрации буфера, используемого в реакции (табл.1). Так, при использовании н качестве буфера 0.05 М растнороп К-зтилморфолина и фосфат калин -биаружены максимальные значения эффективности растепления, использование же ИЕРЕЯ (4-(2-гидроксиэтил)-1-пинер.ттнзгансульфоновой кислоты), а особенно 7т-НС1, характеризуется меньшими значениями эффективности растепления РНК. Увеличение концентрации буферов до 0.5 М приводило к снижению степени расшеиления РНК. во всех буферных растворах. Исходя из этих данных, псе дальнейшие исследовании нуклеазнои активности МК проводились ь К'-эгилморфолиновом иди калий-фосфлгком буфере с концентрацией 0.05 М.

Таблица I.

Влияние природы н кониситрашш буфера на эффективность расшеиления 55 РНК ЕсоН мегаллокомплексом Рс1Ре(СН1С5Н4?<®)а]СГ8

Природ ^'Х-гот-тчли расшешепн* 55 РНК С.соЬ С? ) при ьошкитрпнинч Слфсрон-

в 5 м | о м 0 1 м п 05 М

7>,.-ИСТ <о11 7.-М 32 1 44 50

ШГ'гМгН 7 5, 5 76

Ка-щв-фм^итт«! (р(1 7 <( г> !<>

\->1И1мор!ч--П11н<"'1илН (рН ? М> 2.1 | <» . 77 Х9

Исследование зависимости степени растеплении ПК от концентрации ~ МК выявило факт потери нуклеазной активности МК при их концентрации в реакционной смеси > 10~3 М. Известно, что комплексы Ре-азапо;;финои при концентрациях 1(Н М и выше » органических растворителях способны образовывать ассоциаты их двух, трех и бодсе молекул азанорфина. Связывание между ними осуществляется путем аксиальной координации с образованием "стопкообразных" структур. .Наличие таких ассоциатов можно зафиксировать методом спектроскопии о обдасхи 440-750 мм но форме пиков. В спектрах водных растворов фталоинашшошх комплексов Со и Ре при концентрации 10 3 М наблюдаются лики, форма которых свидетельствует о наличии структур, аналогичных азапорфинопым "стопкам" (рис. 3). Так, уменьшение соотношения высот пиков при 700 и 680 нм для раствора одного комплекса говорит об образовании "стопкообразиых" структур (спектры I, 2, концентрации МК - 10-' М). При разбавлении в 10 (спектр 3, концентрация МК - Ю-4 М) и 100 раз (спектр 4, концентрация МК Ю-5 М) это соотношение увеличивается, что грворит о разрушении подобных ассоциатов.

А

640 700 ■ 750 нм

Рис. 3. Спектры соединений MKI. и МК7 в аод.чом растворе: 1 -МК7, концентрация 10"3 М; 2 - МК1, концентрация I0"3 М; 3 - МК1, концентрация 10"4 М; 4 - МКГ, коцценграиия 10"s М. i

, В таких ассоциатах происходит экранирование каталитических центр< ответственных за генерацию активных форм кислорода, что, по-вндимол вызывает снижение или полную потерю нуклеазноп активности изучаем металлокомплексои при концентрации > 1(Н М. Поэтому все дальнейш исследования нуклеазных свойств свободных МК проводили з растворах концентрацией не более 1(НМ.

Выяснив оптимальные условия проведения реакции расщепления РНК присутствии металлокомллекеов, мы изучили нуклс"чпую активность больш группы мсталлокомплекеов фталоцианниового ряда.

Было найдено, что фталоцианиновые комплексы железа и кобал! способны эффективно неспецифически расщеплять РНК в условиях темной реакции сопряженного аатоокисления аскорбиновой кислоты с образовани набора продуктов расщепления различной дчины (табл. 2).

Таблица 2.

Нуклеазная активность металлокомплексов фталоцианиновою ряда.

№ металло-кошшекса Структура комплекса Эффективность расщепления 58 РНК рибосом Е.соН, %

50 шМ 7>/г-буфер фН 7.56) 50 тМ Г^-этил-морфолиновый буфер (рН 7.51)

Без комплекса 0 0

МК 1 [Р1!Рс(СН1С<;114Ы©)81С10(( ■ 49 86

МК2 ]СОРС(80-)№)21 31-35 82

МКЗ |РеРс(50чЫа)7| 28-30 78

МК4 |РеРс(СООКа)8] 23-26 74

МК5 |СОРС(50-5Н)?| . 21-25 70

МК.6 |СОМс(Р1)50,№)4| 13-17 64

МК7 [СоРс(СН7С5И^Ф)!(1С10я 22-26 35

МК.8 |СОРС(СН78С(М1-))7Ф)Й1С|©8 20-24 27

МК.9 (СоРс<СОО№)х) 10-12 22

МК.Ю |СОКС(СН->С<Н4Ы®)4|С!©4 13-22 16

мкп |С0Рс(Я0^(С)ЬС00Н)1'110Н}1] 16-23 16

Наиболее эффекгпннмч и рлсшешенпн РНК окамлся комплекс Ре с катненнымм замоетителячII н лнглнле - хлорид октапирилнниомегнлфппо-циапииа желта <МКН (табл. 2), также актинии 11:11 рисные соли сулы])0фгал0Ш1ац|||10|1 Со и Рс (МК2, МКЗ). Эют ряд акпк'МостоП-хорошо согласуется с данными, полученными и группе бнокоорлиианпонноП химии ИПЭОС, по образованию Д.ФК этими МК.

Было показано, что фталоциашнюиые мсталлокомплскеы способны эффектным расщеплять 5Я РНК ЕхоЧ - мишеш., обладающую пюричноМ структурой и содержащую как диух-, так и оанонспочечныс участки. Хотя и целом растепление РНК происходит иеспеиифнчески, можно ныделип. несколько участкоп. которые лилякпея местами предпочтительного расщепления: это районы 100 (МК6, МК9) н I Ю-го (МК11) нуклеотидои 55 РНК 1:.соН - места переходов двухнепочечнмх участков РНК полкойсночечкме. Наиболее ярко это г эффект нрояилястся для МК6, МК9, МК11.

Дтя ряда актшшых мсталлокомилексоп (МК1, МКЗ, МК4 и МК5) были получены записи мости степени расщеплении РНК от иремени (рис. 4).

Расщепление РНК, %

t, мни

Рис. 4. Зависимость степени расщепления 5S РНК рибосом E.coli (%) фталоцианиновыми металлокомплсксамн от времени (50 niM N-этилморфолиновый буфер (pli 7.51), концентрация МК - КИМ, концентрация АН - 510^М, С„ - Ю-3 M 5S РНК рибосом E.coli).

Ока«лось, что к ирисуicruiui МК1 за 10 минуг наблюдалось практически полное растепление РНК. В случае остальных комплексов максимальное растепление досниаегси аа 31) минут. Существенно, что именно хлорид октапирид.шнометил^палонпаиипа железа является наиболее активным как в реакции окисления аскорбиновой кислоты, так и п реакции растепления РНК.

Расщеи.'1ет|ие_.ЛНК. Способность мстгллокомплсксо» фталоцпанинового ряда расщеплять ДНК была изучена на плазмидс pUC, содержанки вставку, и позгому событием нз 3?М пуклеошдных пар. Препарат был выделен удыраиешрифушрованвем в градиенте хлорида цезия и содержи как с\ перекрученную, гак и релакенрованную форму плазм иды. Реакцию раешег-ления ДИК прово шли п условиях сопряженною аптоокислепия аскорбиновой КИСЛ01Ы при 37"С и течение 30 мин, молярное соотношение МК/ЛН составляло 1:10. Лнали< продуктов растепления проводили в \% аырошом ic.ie с послед} мшей iiiiiy.vnuainieii продуктов эти дни бромидом. Полное растепление ЛИК чт.пмилы pL'C наблюдалось только в присутствии ме1.гтлок(>\'илекеов, содержащих катиоиные заместители в макролпганде (хлориды октапнрвллниохвчил- и октаизотнуропиометилфидоиианинов - МК1. МК7, MKS, МК10). Эффеипнноегь растепления ДНК этими МК была очень «ысокоб, - ни исходной ДНК-пдазмиды. ни се линейной формы после проведения редкий» не наГ>лн>татжь.

Для объяснения высокой пукдеашой активности этих металлокомплсксон следует учесть твесшын факт, что большим сродством к днучиепочечной ДНК обладают меспдокомплексы с катонными заместителями, чем анионные или незаряженные МК. Такая ыкономсриость во взаимодействии с ДНК была обнаружена для комплексов СщП), Fe(IM) с блеомншшом, содержащим положительно заряженные группировки, и для порфиринов с катиошшми заместителями п макроликшде. По-шиимому, при окислительной деструкции ДНК существенную роль могут ш рать злсктростатическис взаимодействия между молекулами МК и ДНК: отрицательно зпряженны;;. сахарофосфатный остов супсрскрученнон платили. обращенный наружу, и положительно заряженные

функциональные группы МК делают взаимодействия между МК и ПК Солее прочными. Пространственная сближенность ДНК и меьилокомпдекса позволяет образующемуся радикалу атакчвать ДНК-мишсш. более эффективно.

Таким образом, на ос ноне полученных данных можно сделать вывод о необходимости пространственной сближенности МК с диухцепочечным фратменом НК дл я его высокоэффективного растепления. Эффект предпочтительного растепления двухцепочечных фрагментов наблюдшей и в случае 55 РНК Е.соН (фрагменты 1-10/110-119 и 78-85/89-96). Главную роль в такой избирательности играют, по-видимому, гидрофобные свойства и объемность заместителей в макролиганде, наличие на них и ряда, способность МК к интеркаляцнп и дуплекс. Только мсгал.токомнлекс, способный генерировать АФК и связываться с НК-мишелыо, будет ее эффективно расщеплять. По-видимому, по этой причине комплексы МК1 - МК.\ в таких же условиях, как при расщеплении ДНК-плазмнды, не вызывают расшемлснин коротких однонепочечных олигодеэоктирибонуклеотндов (11 и 22 звеньев), не содержащих инвертированных повторов и, поэтому, не обладающих какой-либо вторичной структурой:

5'-АССАССОСССТ-3' и ' 5'-ТАССССССТССТСССАССТСЛС-3'

Необходимость связывания МК с НК для эффективного растепления НК подтвердили опыты по влиянию на эффективность расщепления ПК некоторых ловушек радикалов: л-нцтрозодиметиланилина (ПНДА) (ловушка гндроксил-радикала), а также ферментов каталазы, субстратом которой является пероксид водорода, и супсроксиддисмутазы (СОД), субстрат которой - супероксид-анион радикал. ' Следует отметить, что СОД нечувствительна к радикалам, не выходящим в объем раствора.

Показано, что в случае 5 Я ,РНК добанле.же каталазы и /;-нитрозодиметиланилина уменьшает эффективность расщепления мишени метадлокомплсксом МК1, в то время как добавление супероксиддисмутазы. не

влияет lia эффективность расщепления. D случае ДНК-илазмиды pliC данные соединения пракшчсски ne влияли на степень се расщеплении.

Такое различие но в.шпппи ловушек радикалов па аффективное™ расщепления 1'ИК и ЛПК может огралагь ci|:)Kiypnue особенности ПК-мишенеВ, определяющие ыаимодейавве с мстал.юкомпдекеами 1Ьанмоде|1сгнпе МК с "pwvioii" пространственной счрукrypr-ii РНК может быи слабее, чем с упорядоченной структурой ДНК, и радикалы, обралннпиеси но; , действием слабое тпанных с ПК мсгаллокомилексон. .aoiyr уходить в сиободньв обьем раствора, где они и iau модеме i пуки с лопушками. Изанмодсмст кие M К < упорядоченной структурой ДИК является достаточно прочным, иолом; радикалы, скорее всею, обратимся и непосредственном близости or IIK и н< вымени в об (.ем раствор;), а изаимоденстнуют непосредственно с ЛПК-цепью.

II. Расщепление нуклеиновых кислот вод действом комплексов ирглшкобадьта — рП-заьнеимых неючвикои илкильных радикален.

Интересными дчи изучение растепления нуклеиновых кислот оказал на комплекс» оринокобальта с тридешагнымн основаниями Шиффа (сгруктурь МК показаны на рис. 5). Комплексы получены в группе биокоординаинонно! химии ННЭОС РАН. Недавно было найдено, что эти комплексы обладаю' противоопухолевой активность«.

(Хчхч-ннностьн! :»1и\ мегаллокомплексов является то, что в кислой сред< (pli < 7) они способны o6| .i3oiiuiuib свободные алкнльные радикалы:

ni к- . и

|RCt»(«.Kcn)Uii)r--*• К |l_OWC,ltrni(ll20);|

которые, являясь высоко рсакивонноспособн^ми частицами, могут реашроват! с ПК, »ызывдя cv деструкцию. Механизмы uoue Ьгттм алкильных радикатов и; ПК могут быть разиымн, но основными, по-анлимому. иьляются днб<

присоединение радикала по тсртшклу, либо отрыв атома водорода ог -сахарного остатка.

|РСо(асэсеп)(еп))Вг

Рис. 5. Структуры комплексов органокобальта с тридентатными основаниями Шнффа (К - Е1, /-1'г).

Способность комплексов органокобальга и условиях их гомолиэа а кислой срок расщеплять 58 (М1К Т.ТпетюрНИа проверяли, прополи реакцию и .""Л мМ фосфатном буфере (рИ 5.0) 1 час при температуре 37"С (для облучения, если было необходимо, испотмопалась 100 Вт вольфрамовая лампа). Анализ продуктов расщепления !21'-55 РНК проводили в 12% ПААГ с последующей радиоавгографиеи.

Особенностью процесса является то, что образование свободного алкнльного радикала является не каталитическим, а .стсхиометрнчсским процессом и происходит по формуле: одна молекула комплекса - один радикал. Поэтому для достижения высокой степени расщепления ПК необходима большая концентрация МК, чем ,прн ислольговании каталитических систем, таких, например, как фгллоииани^оиые комплексы кобальта и железа. Кроме того, взаимодействие алкильних радикалов с НК может вызывать повреждения, не приводящие " расщеплению ПК-

Но с другой стороны, после акта образования алкильнот радикала, происходит освобождение аксиального координационного места кобальта и, , можно было полагать, что МК в дальнейшем будет способен в аэробных условиях образовывать активные формы кислорода по механизму, известному для других мста/локомплексов. Чтобы проверить возможность реализации лого

сн2

iii

двустуленчатого механизма, реакцию расщепления 5Б РНК проводили как в присутствии, так и в отсутствие восстановителя - аскорбиновой кислоты (ЛН). Для этой же цели процесс расщепления РНК проводили как в растворах, в которых содержание кислорода было снижено (анаэробные условия), так и п растворах с естественным содержанием кислорода (аэробные условия). Было найдено, чго комплексы органоко'бальта при рН 5.0 способны неспецифически расщеплять нуклеиновые кислоты (табл. 4). Однако эффективность растепления .была достаточно низкой - 10-20%. При проведение реакции при рН 7.5 расщепления РНК не происходило ни в аэробных, ни в анаэробных условиях.

Эффективность 'расщепления РНК сильно увеличивается при сопряжении этого процесса с автоокислсписм аскорбиновой кислоты. Этот результат, очевидно, объясняется тем, что комплексы кобальта, являющиеся продуктами гемолиза (например, [Со(11)(асас2еп)]):

Н2С-СН2

*

могут участвовать в окислительно-восстановительных реакциях, приводящих I образованию активных форм кислорода (см. схему на рис. 6). Это тем болс< вероятно, что, как было показано в ИНЭОС ранее, структурно близки! комплексы с основаниями Шиффа - Со(П)-М,М'-бкс-(салицилиден) этилендиамин (Со(П)-5а1еп) - эффективные катализаторы рсакшп автоокислешш, проявляли нуклеазную активность при расщеплении ДНК присутствии аскорбиновой кислоты.

Тот факт, что в анаэробных условиях в присутствии АН эффективност расщепления РНК была такой же низкой (15-25%), как и в аэробных условия) но без АН, также говорит в пользу предложенного выше механизма.

Таблица 4,

Эффективность растепления (%) 5$ РНК ТИ.ТИегтпрШо комплексами органокобальта с тридентатиыми основаниями Шиффа (концентрация МК. - 10"2М).

№ Структуры МК Без облучения и 5сэ All, Без облучения, с ЛН2, 5-10"гМ С облучением, без АН, С облучением и с Allj, 5-1<НМ

Аэробные условия

MKI2 |FlCo(:ic:tccn)<cn)|Hr 11-15 12-18 21-26 70-75

MKJ3 |/- PrCof.icnccn )(еп)] Иг 12-14 85-88 20-27 64-69

Анаэробные условия

МК12 1 EtCo( асассп)(еп)|Вг 13-19 10-16 10-19 19-23

МК13 i |/-PrCo(acacen)(cn)|ßr 11-15 12-17 11-17 25-29

\ I ¡1 W

Ь-N | N

-О*;4

Рслокс

[Со И ...j катализатор

[Со Ш ...]

АФК

Рис. 6. Схема двуступенчатого воздействия комплексов органокобальта с трндентатнымк оснонаниями Шиффа на НК.

Таким обратом, впервые показано, что расщепление РНК под действием новых сосдинсннй - комплексов органокобальта с тридентатными основаниями Шиффа - может быть осуществлено в мягких условиях, в том числе физиологических, как двуступснчатый процесс, скорость которого удобно регулировать с помощью рН и использования окислительно-восстановительной системы. -

И+71ЬО

III. "Адресующие" химические нуклеазы на основе комплексов Со и Ге.

III.1. Разработка методов получении.

Ранее было показано, что корриноше комплексы кобальта способны с высокой эффективностью расщеплять как ДНК, так и РНК. Так, коррннонын комплекс - е-карбокси-кобинлмпд (с-С0ОН-СЫ(О11)2) (МК14) (рис. 7) - в условиях, аналогичных подобранным для фталонианиновых комплексов, вызывал полное расщсплснне гак 55 РНК рибосом ЕхиЧ, так и штнннон плазмиды рВЮ22. Однако их использование, как и использование споболных мсталлокомплексоа фталоиилнинового ряда, как показано « данной работе, приводит к образованию олитонуклеотидных фрагментов - продуктов расщепления ПК - раалнчной длины. Увеличить селективность воздействия на НК-мишень или даже получить единичный разрыв можно, ковалентно присоединив МК к "адресующему" олнгонуклеотиду - зонду. Локализация мест разрыва полииуклеотидиой цепи в нужном участке обуславливается образованием комплекса НК с "адресующим" олигонуклеотидом, комплементарным этому участку.

НзС сНгССЖНг

Н2МСОСН2ч/^~(1 СНз

СН3 СН2СН2СООН

НзС СН2 Нг^О

Н^СН2

Н3С он

Рис. 7. е-Карбокси-кобинамид (е-СООН-СЫ(ОН)2) (МК14) - производное витамина В|2

13 настоящем работе для получения одигонукдеотдныч производим* были выбраны два типа метпллокомилексон: коорлиипнионно насыщенный - Со-корриновып .комплекс (MKI4) (рис. 7), и координационно ненасыщенные -фталоцнаимновыс \1К (рис. 1). Использование комплексов Лих типов позволяло оценить возможности методов, применяющихся и химии олнгонуклеотидов, для,.работы с координационными соедннеинями.

Хроматогрнфически ;шстый Со-корршювыи комплекс, содержащий функциональную карбоксильную группу, был получен в ipynne биокоординационной химии ЩГООС.РАН.

В настоящей работе мы .сравнили эффективность двух методов ковалентного присоединения корриноиых компчекеок кобальта к концевым фосфатным группам олигодезокенрнбонуклеотида: введение Со-коррннгшого комплекса (МК14) (см.рис. 7) в олигонуклеотид путем посг-сг.нтетнчсскон модификации последнего п водном растворе в присутствии N-гидрокеибензотриазола (N-HOB1) и (1-:лил-3,3'-диметиламинопропнл)-карбоднимнда (ЭДАК) (схема I) или введение Со-корринового комплекса и олигонуклеотид в процессе автоматического олигонукдеотидного синтеза на твердой фазе с использованием дициклогекеилкарбодиимида (ДЦК)(схе.ма 2).

Для получения коньюгатов олнгонуклеотидов с кобальт-корриновым комплексами по схеме ] использовали 14-звенный олигонуклеотид 5'-GACCACCGCGCTACp (И), содержащий З'-коицевой фосфат, и по схеме 2 - II-зпенный олигоиуклеотид S'-GGACCACCGCG (III), полностью комплементарные участкам 13-26 и 17-27 5S РНК рибосом F.xoU, соответственно, а также способные образовывать несовершенные дуплексы с различными участками 55 РНК рибосом E.coll (см. рис. 10).

В первом методе (схема 1) для получения конъюгата использовали Со-' коррин, содержащий свободную аминогруппу (I), и олигонуклеотид, содержащий в качестве сле:1ссрной группы w-аминоэнангоиую кислоту (Па). Целевой продукт - модифицировании»! олигонуклеотид (IV) - получали в результате их конденсации в ррцсутсдот ЭДАК л выделяли из реакционной, смеси путем

электрофореза в 20% ПААГ. Зону, содержащую целевой продукт, и имеющую розовую окраску за счет присутствия кобальт-корринового комплекса, вырезали и продукт (IV) элюировали. Выход кобальт-корринового производного олигон'уклеотида составлял 25-30 %.

5' - GACCACCGCGCTACp - 3' (II) 1.N-HOBT .2. ЭДАК

3. H2N(CH2)tíCOOH 5' - GACCACCGCGCTACp -HN(CH2)eQQQH (На) ■

e-COOHCb¡(OH)2 MKI4 | 1.N-HOBT, ДЦК 2. NH2(CH2)4NH2

e-NH2(C42)4NHCO-Cbi(OH)2

.(I)

ЭДАК

5'-САССАССеСвСТАСр- НМ(СН2)6СОМН(СН2)4ННСОС£|(ОН)2

(IV)

Схема 1. Схема синтеза ,Со-корринового производного олигонукдеотида (III) в водном растворе (пост-синтетическая модификация).

/М0-Рг)2

IOGACCACCGCG)-~{р] (111)

1. Me0TrNH(CH->)60-P (V)

OEtCN

2. l2 , 3. Н+

0 ¿ 3' е-СООН-СЫ(ОН)2

NH2(CH2)60—Р-О—[CGACCACCGCG1—0

(Illa)

mki4 ДЦК

OEtCN

О

II

5 3 .

Cb¡(OH)2-e-CON Н (сн2)б0-р-0 -[GGACCACCGCG]—(р] °X>EtCN

NH3aq

О 5 з

II

Cbi(0H)2-e-C0NH(CH2)60-P-0—GGACCACCGCG

(VI)

Схема 2. Схема синтеза Со-корринового производного олигонукдеотида (III) на твердофазном носителе (автоматический олиго-нуклеотидный синтез), олнгонуклеотид в квадратных скобках содержат защитные группировки в гетероциклах и в межнуклеотидных фосфатных группах, Р - полимерный носитель на основе CPG.

Во втором методе введение Со-корршюного комплекса по 5'-кониу олигонуклеотида (111) осуществляли в условиях стандартного автоматического амидофосфитного синтеза олнгодезоксирибонуклеотнлов (схема 2). К олигонук-лсотиду (III), закрепленному на носителе и содержащему защитные группировки, присоединяли амидофосфиное производное 6-мстокситритиламиногексанола (V) п качестве спейссрнои группы. c-COOH-Cbi(OH)2 (MK.I4) присоединяли к олигонуклеотиду (Illa) в ходе конденсации в присутствии ДЦК. Отделение ко.чъюгата от полимера и удаление защитных групп происходило в ходе аммиачной обработки. Целевой продукт (VI) выделяли методом гель-элстрофореза в ПААГ как описано выше, выход составлял S0-90%.

Сравнение методом введения Со-корринового комплекса в олигопуклеогнд пост-си итетнчсской модификацией последнего в водном растворе или в процессе олшонуклеотидного синтеза позволяет сделать выбор в пользу второго метода из-за существенно более высокого выхода' продукта и простоты процесса.

Используя два описанные выше метода присоединения МК к олигонуклеотидам, мы получили олнгонуклеотидные производные фталоцианинов. С помощью метода присоединения МК к олигонуклеотиду на твердой фазе были получены коиъюгаты олигонуклеотидов с фталоцианиновыми МК, прояпнвщими высокую активноегь в свободном виде и содержащими карбокси- или сульфогруппы удобные дгя ковалентного присоединения:

Fe[Pc (COOH)7j-CONH(CM2)6OpACCACCGCGCT (VII)

Со[Рс (COOH)7)-CONH(CI-l2)6OpACCACCGCGCT- (VIII)

Fc[Pc (S0iH))S0i-NHiCH2)60pACCACCGCGCT " (IX)

Co[Pc (S03H)]S02-NH(CH2)60pACCACCGCGCT (X)

С помощью пост-синтстичсской модификации олигонуклеотида в водной

фазе были получены конъюгаты олигонуклеотидов с фталоцианиновыми МК,

содержащими сульфогруппу:

ACCACCGCGCTp-ßAla-N H(CH2)2NН-S02-Fe[Pe (S03H)1 (XI) АССACCGCGCTp-ßAla-NH(CH2)2NH-S02-Co[Pc (S03H)]. (XII)

Выходи конъюгагов (Vif - X) составлял» 80-90%, конъюгатов (XI-XH) - 30-50%.

Далее Gi.ua изучена способность полученных копъюгйтой' участвовать в компдементационных взаимодействиях с НК-мишснью: В'этой связи важной является информация о стабильности образуемых ими дуплексов, которую можно получить, изучая их температуру'плавления - температуру, при которой разрушаются водородные свит. оОеснсчивающис ко.мплсмснтациопные нзаимо-дейе жни • между гетеропиклами нуклеотидов. и происходит расплетание пеней дуплекса. Данные по температурам плавления дуплексов приведены в табл. 6.

Таблица 6.

Температуры плавления дуплексов, образованных 22-тн звенным олпгоде юксирибонуклеотидом 5'-TAGCGCGGTGGTCCC.\CCTGAC (.<122) и олшонуклеотилиими производными метадлокомп.чексон (VI) и (IX).

("встав л\илско» Т.гп.. °С

|Ш>Л122 57

Л;1ьч122 61

(1Х»Л122 (о

Эти данные покатывают. что полученные конъюглги сохраняют способность к луп.тексообр.иов.шию. Более того, увеличение температуры плавтения (в случае Со-корринопото комплекса - на 4"С, в случае фгалонианинопою комплекса - на 8"С) укатывает на возможность пынмолепепши \,тн\ мегаллокомнлсксов с ПК-дуплексом либо за счет ннтеркаляпнп. либо за счет 'лтектростагичсскну; взаимодействий.

III.2. Изучение активности и селективности расщепления ПК олнтонуклеотидными производными мсгаллокомплексоа.

Нуклелкую активность Со-корринового производного олитоиуклеотида (1Д1) проверяли как на 5'-мечениой ,!Г 5Б РНК рибосом ¿'.со// (рис. Б), так и на ее З'-меченом ,?Р фрагменте 42-120 (рис. 9).

Показано, что использование коватентио связанного с "адресующим" олнтонуклеотидом Со-корриновото комплекса позволяет добиться избирательного гидролиза РНК- мишени в отличие от статистическою гидролиза, вызываемого свободным Со-корри новым комплексом. Так. в присутствии

модифицированного олигонуклеотида VI растепление полной 5Б РНК происходило в единственном месте (эффективность - 10-15%), а 42-120 фрагмента - в нескольких мостах (эффективность - 30-35%), в которых возможно образование несовершенных дуплексов (рис. 10).

12 3 4

с

хс

ВрЗ

Рис.8. Авторадиограмма разделения в 12% ПААГ продуктов гидролиза 120 зпенкои 5'-3-P-5S РНК E.coli в присутствии модифицированного олигонуклсотида (VI) (Î5 мин. 37°С). 1 - исходная РНК, 2-4 -продукты реакции в 50 мМ трис-HCI (рН 7.8): 2 - в присутствии олигонуклеотида и без аскорбиновой кислоты, 3-е аскорбиновой кислотой (5-Ю-3 М) без олигонуклсотида, 4 - в присутствии олигонуклеотида и аскорбиновой кислоты (510-3 М). Соотношение 5S РНКюлигонуклсотид - 1:1. Стрелками показано положение красителей-маркеров ксиленцианола (ХС) и бромфенэлопого синего (ВрВ).

, —80

— 60

ХС -30

ВрВ

Рнс.9. Ангорадиограмма разделения в 12% ПААГ продуктом гидролиза 3'-32Р-мечсного фрагмента 42-120 5Б РНК Е.соН в присутствии модифицированного олигонуклеотида (VI) (15 мин, 37°С). 1 - исходная РНК, 2-4 - продукты реакции в 50 мМ трис-НС1 (рН 7.8): 2 - в присутствии олигонуклеотида и без аскорбиновой кислоты, 3-е аскорбиновой кислотой (5-Ю-3 М) без олигонуклсотида, 4 - в присутствии • олигонуклсотида и аскорбиновой кислоты (510'3 N1). Соотношение 5Б РНК: олигонуклеотид 1:1. Цифры справа- • длины ■ продуктов расшеплсния РНК в сравнении с реперами длины. Стрелками показано положение красителей-маркеров ксиленцианола (ХС) и бромфенолового синего (ВрВ).

з'-илссалрссис."; „СдмйССйй. " .....

1пщ- — иШШ , -

„вАСЦ-,

X 50 ^кйС

еси Ааас;

юо Ъз

Й-50 А^У

<§3

90;С=С

5' (СССССиАСС) У з.ОССсСАсСлсо

Район "а"

55 РНК ЕСоН

5' (сдлусди) з'

С(^ССАССАСС ^ Район "Ь"

5' (GyGGGGUCy.CC) 3' 5' (Ад, СССАСуССС) 3'

ссвс

3'

,САСС-АС С 3' СССССАССА-СС

Район "с" Район "(I"

Рис.10. 1). Структура 5Б РНК. рибосом Е.соН. Прямоугольник, выделенный сплошной линией - место полной комплемептарности с од и гону клеотидом (И), пунктрднымн линиями - места образования несовершенных дуплексов между ним и 42-120 фрагментом 58 РНК.. 2). структуры несовершенных дуплексов, образование которых возможно между олигонуклеотидом (II) и 42-120 фрагментом .58 РНК Е.соН: префиксы "сГ'(дезокси) и "г"(рибо) опушены, рибоцепь заключена в скобки.

Фталоцианиновые производные олигонуклеотндов (VII - ХП) были также опробованы в реакции расщепления 58 РНК Е.соН в присутствии аскорбиновой кислоты в Ы-этилморфоди новом буфере. В этом случае расщепления РНК практически не наблюдалось. Отсутствие расщепления РНК могло быть вызвано дезактивацией координационно ненасыщенного фталоцнанииового МК реагентами, использовавшимися в процессе синтеза, например, на стадии присоединения этилендиамина в первом методе (схема I), или при аммиачной обработке после твердофазного синтеза (второй метод, 'схема 2). Действительно, и опытах со свободными фталоинанпноньши МК, подвергавшихся таким же

обработкам, как и в процессе сшуезз конъюгатов было показано, что в первом -случае практически полная потеря активности фталошшнинопогэ МК происходит на стадии присоединения этиленднамина для получения МК, содержащего аминогруппу. Попытки реактивации неактивных конъюгатов различными методами (многократное упаривание со спиртом, выдерживание в кислой среде, обессоливаг.ие с помощью обрашенно-фазовой хроматографии) не принесли существенных результатов - активность МК в ' составе олигонуклеотидного производного возрастала незначительно. Во втором случае (схема 2) дезактивация МК происходит при аммиачной обработке конъюгата МК н олигонуклеотида после синтеза при отделении его от полимера и удалении защитных групп с олнгонуклеогида. Описанные выше обработки конъюгатов с целью восстановления активности МК также не привели к успеху.

Таким образом, получшмме нами данные показывают, что получение эффективных сайт-спсцнфмчсскнх нуклеаз на основе конъюгатов различных мсталлокомплсксо» с олпгонуклсотнд,<ми возможно только при использовании мсталлокомплсксоо. которые являют:!! координационно насыщенными и не дезактивируются я процессе синтеза л при пост-синтстических обработках. Одним из подходов к решению проблемы присоединения к олнгонуклеотилам координационно ненасыщенных МК может стать использование лигандов, способных к обратимой координации по аксиальным положениям атома металла в МК, защищающих его а процессе ситеза и легко удаляющихся после него.

Выводы.

1. Изучены комплексы кобальта н железа фталоцианинового ряда в качестве ' реагентов для окислительного расщепления НК. Впервые показана

нуклеазная активности этих комплексов в условиях темпового сопряженного автоокисления аскорбиновой кислоты. Отработаны условия, при которых расщепление НК происходит наиболее эффективно.

2. Посазано, чти наибольшая эффективность расщепления РНК наблюдается в присутствии комплекса с катионным заместителем - хлорида

октапириднниомстилфталоцианина железа, а также комплексов с анионными заместителями - натриевых солей сульфофгалоцпанинов кобальта и железа. Расщепление ДНК вызывают только фталоцианиновыс комплексы кобальта и железа, содержащие катионные заместители в макролиганде. Найденные закономерности расщепления РНК и ДНК отражают специфику взаимодействия металлокомплексов с НК-мишенью.

3. Изучены комплексы органокобальта с тридентатными основаниями Шиффа в , качестве реагентов для расщепления РНК. Показано, что данные комплексы

обладают нуклеазной активностью. Обнаружено значительное увеличение эффективности расщепления РНК в присутствии аскорбиновой кислоты. Предложен механизм двуступенчатого действия комплексов органокобальта в процессе расщепления РНК.

4. Разработаны методы синтеза конъюгатов металлокомплексов с олигонуклеотцдами для создания "адресующих" (сайт-специфических) химических нуклеаз.

5. Впервые получена "адресующая" синтетическая нуклеаза на основе Со-корринового комплекса, . ковалентно связанного с JJ-звешшм. олигонуклеогидом (5'-GGACCACCGCG) и показано, что Со-корриноеый комплекс, ковалентно связанный с олигонуклеотидом, сохраняет нуклеазную активность, при этом место расщепления РНК-мишени определяется нуклалидной последовательностью "адресующего" олигонуклеотида.

Список публикаций по результатам диссертации:

1. Novodarova G.N., Krainova N.Yu., Vol'pin M.E., Belkov V.M., Krynetskaya N.F., Shabarova Z.A. New approach in design of the chemical nucleases. The oligonucleotide derivatives of the cobalt-corrin complexes. Proceeding of IV International conference on bioinorganic chemistry (San-Diego, USA). J.lnoi-g.Biochem. (1993), 51, №1-2, p. 521.

Крайнова Н.Ю., Белков D.M., Новодарова Г.Н., Вол шин М.Е., Крынецкая Н.Ф., Волков Е.М., Шабарова З.А. Кобальг-корриновые производные алигонуклеотидов как реагенты для избирательного расщепления нуклеиновых кислот. Тезисы докладов I международной конференции по эиокоординационной химии (Иваново, Россия). (1994) с.95. Белков В.М., Крынецкая Н.Ф., Волков Е.М., Шабарова З.А., Край нова Н.Ю., Новодарова Г.Н., Вольпин М.Е. Кобальт-корриновые производные элигонуклеотидов как реагенты для избирательного расщепления нуклеиновых кислот. Биоорг.химия (1995) 21, N»6, с. 446-453.

Белков В.М., Крынецкая Н.Ф., Шабарова З.А., Новодарова Г.Н., Волышн М.Е. Комплексы переходных металлов как источники активных форм кислорода в реакциях автоокислсния природных субстратов. II. Окислительное расшспление нуклеиновых кислот под действием })галоцианиновых комплексов кобальта и железа. Изв. Акад.наук. Сер. Хим. [ 1996), в печати.

Lcvitin l.Ya., Bclkov V.M., Novodarova G.N., Shabarova Z.A., Vol'pin M.E. iynthctic nucleases triggered by mild acidification: a new type of biologically active :ompounds. Mendeleev Commun. (1996) in press.