Молекулярная организация и структурно-функциональная характеристика природного и рекомбинантного цитохрома Р-450с21 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

г»

о

п п

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

ИНСТИТУТ БИООРГЛПИЧЕСКОЙ химии

УДК 577.152.1.03:577.112.4:577.217:543.-12

ЗЕЛЬКО Игорь Николаевич

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИРОДНОГО И РЕКОМБИНАНТНОГО ЦИТОХРОМА Р-450с21.

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

МИНСК-1995 г.

Работа выполнена в Институте биоорганнческой химии Академии наук Беларуси

Научный руководитель: доктор химических наук Усанов С.А.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Метелица Д.И.

доктор биологических наук, член-корр. БИА Шкуматов В.М.

Оппонирующая организация:

Белорусский государственный университет

Защита состоится I ПАК г. на заседании совета по защите

диссертаций А 006.22.01 в Институте биоорганнческой химии Академии наук Беларуси но адресу: 220141, Минск, ул. Жодннская 5/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганичгской химии АН Беларуси

Автореферат разослан 1995 г.

Учений секретарь совета по защите диссертаций,

кандидат химических наук "•"'иви,|к0

Институт биоорганической химии АН Беларуси

Актуальность теми_диссертант». Цитохром Р-450 (Р-450) является

терминальной окснлазой п монооксигеназной системе, которая широко распространена п природе и участвует в детоксикашш ксенобиотиков, биосинтезе стероидных гормонов, простагландннов, ленкотриенов, желчных кислот и витаминов группы D3 Значимость процессов трансформации этих соединений ставит его в один ряд с такими гемопротендами, как гемоглобин и многлобнн, каталаза и пероксидаза.

Развитие в последние годы микробиологического способа получения белка с использованием в качестве продуцента клеток дрожжей и бактерии позволяет нарабатывать в больших масштабах ферменты монооксигеназиой системы. D связи с . этим большие надежды возлагаются также па использование Р-450 для контроля за загрязнением окружающей среды, окисления химических соединений, используемых в производстве пищевых продуктов, и синтеза новых лекарств.

Особенный интерес представляет исследование P-450-зависимых ферментов, участвующих в биосинтезе стероидных гормонов, поскольку это позволяет выяснить молекулярные основы ряда тяжелых наследственных заболеваний, связанных с нарушением гормонального гомеостаза и открывает перспективу их' пренаталыюй диагностики. К настоящему времени имеется информация о взаимосвязи структуры и функций Р-450: определены С-концевон гем-связываюшин пептид, установлены предположительные области связывания стероидных субстратов, а также N-концевой фрагмент, выполняющий роль "якоря" в лнпидной мембране (Nelson D.R., 1988; Gotoh О., 1992). Однако, до сих пор остается дискуссионным ряд вопросов: какова общая схема организации цитохромов Р-450 в мембране, какова природа взаимодействия между белками-партнерами вовлеченными п стерондогенез, чем обусловлена субстратная специфичность?

Диссертационная работа выполнялась в- рамках плановой темы Института биоорганической химии ЛИ Беларуси "Исследование молекулярных механизмов и структурных основ функционирования моиооксигеназных систем с участием Р-450" (№ гос. регистрации 19941428) и в рамках Международного сотрудничества с Институтом Молекулярной Биологии п Тайване, а также представляет собой логическое продолжение структурно-функциональных 'исследований

стероидгидроксилируюших ферментных систем, проводимых в ИБОХ АНБ.

Нель и задачи исследования. Основная задача работы - изучение'молекулпрной организации цитохрома Р-150с21 (Р-450с2!) в растворе и в составе лнпидной мембраны, а также установление структурно-функциональных взаимоотношений между отдельными компонентами митохондриальной и микросомальнсй моиооксигеназных систем клеток коры надпочечников.

Впервые показано, что адренодоксинредуктаза стимулирует как 17а-, так н 21-гидроксилазные активности ммкросом коры надпочечников быка, в то время как цитохром Ь5 ингибирует их как о присутствии адренодоксинредуктазы, так и в ее отсутствие. Установлено, что ограниченный трипсинолиз Р-450с21 как в мембране, так и в растворе приводит к образованию двух полнпептндных фрагментов с молекулярными массами 25 и 29 кДа, которые жестко связаны с мембраной. Зарегистрировано уменьшение ферментативной активности и частичный переход Р-450с21 в форму с максимумом поглощения при 420 им после проведения ограниченного трипсинолнза. Осуществлена гетерологнческая экспрессия Р-450с21 человека в клетках бактерии Escherichia coli (Е. coli) к разработан метод выделения и очистки 21-гидроксилазы из бактериальных мембран с помощью металло-аффинной хроматографии.

структурно-функциональные взаимоотношения в ряду P-450-завнснмих монооксигеназ являются основой для понимания действия сложных, многокомпонентных систем на молекулярном уровне, а также тонких механизмов регуляции процессов биосинтеза стероидных гормонов. Создание на базе полученных результатов простых шунтированных систем, содержащих митохондриальмые н микросомальные монооксигеназы и их вспомогательные белки, открывает возможность их практического использования для биосинтеза физиологически активных соединений.

для гетерологической экспрессии и очистки Р-450с21, могут быть также использованы при выделении других лабильных белков из биомассы различных микроорганизмов и тканей. Полученные стерондгндроксилирующие ферменты могут использоваться при создании биокатализаторов для получения стероидных гормонов и их аналогов. Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Изучение взаимоотношений микросомальных и митохондриальных систем гидрокенлирования стероидов локализованных в коре надпочечников быка.

2. Разработка высокоэффективного метода выделения и очистки до гомогенного состояния Р-450с21 из коры надпочечников быка.

3. Установление физико-химических, спектральных и каталитических характеристик Р-450с21 из надпочечников быка.

4 Исследование иммунохимических свойств 21-гндроксмлазы.

5 Определение топологии Р-450с21 в липидной мембране с использованием ограниченного прйтеолнза и иммунохимических подходов.

6 Осуществление гетерологической экспрессии Р-450с21 человека в клетках Е. coli.

7. Разработка метода очистки Р-450с21, экспрессированного о Е. coll с

использованием металло-аффннной хроматографии, и изучение физико-химических свойств очищенного белка.

Личный вклад соискателя. Результаты по исследованию взаимоотношений микросомальных и мигохондриальных систем гпдрокснлировзння стероидов и очистке Р-450с21 получены лично автором диссертации. В изучении влияния ограниченного трнпсинолнза па ферментативные и спектральные свойства Р-450с21 принимала участие инженер С.А. Былинская. В разработке метода гетерологической экспрессии 21-гидроксилазы и ее очистки из бактериальных мембран оказывал помощь научный сотрудник, кандидат химических наук В.М. Гузов. Кроме того, в постановке темы диссертационного исследования и обсуждении полученных результатов принимал участие главный научный сотрудник, доктор химических наук С.Л. Усаиов.

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации доложены на 7-ой Международной конференции "Цитохром Р-450: биохимия и биофизика", Москва (1991 г.), 8-ой Международной конференции "Цитохром Р-450: биохимия, биофизика и молекулярная биология", Португалия (1993 г.), 9-ом Международном симпозиуме "Микросомы и окисление лекарств", Израиль, Иерусалим, (1992 г.). .

Опубликов.чнность результатов. Основные результаты диссертационной работы изложены в 3-х статьях, 1 сборнике, 3-х тезисах конференций.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, экспериментальной части, материалов и методов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 11 таблиц. Библиография включает 25-1 наименования.

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ МИКРОСОМАЛЬНЫХ И МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ СИСТЕМ ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ СТЕРОИДОВ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ БЫКА.

Для анализа возможности взаимодействия компонентов митохондриальных и микросомальных моноокснгеиаз на первом этапе предпочтительно использовать митохондрналышн или микросомальный компонент в составе природной мембраны. В настоящее время попыток изучения гибридных ферментных систем биосинтеза кортикостероидов в литературе не описано. В связи с этим целью данного раздела исследования является изучение стероидогенеза в микросомах коры надпочечников в присутствии электроитрапспортных белков митохондриалыюй монооксигеиазной

системы - адренодоксина (АД), адренодоксннредуктазы (АР) и цитохрома Р- 4508сс (Р-450зсс).

Для изучения влияния мнтохондриальных электронтранспортных белков на моноокснгеназние реакции в эндонлазматическом ретнкулуме каталитическая активность 21- н 17а-гидрокснлаз в микросомах коры надпочечников быка анализировалась в присутствии АД и АР. Как следует из таблицы 1, добавление АД к микросомам коры надпочечников не оказывает заметного влияния ни на 21-, ни на 17а-гидроксилазную активности. С другой стороны, присутствие в инкубационной среде АР существенно увеличивает обе мнкросомальные активности. Одновременное добавление АД и АР в инкубационную среду приводит к ослаблению стимулирующего эффекта АР на 21-гидрокснлазу, что можно объяснить автоокисленнем адренодоксина с образованием супероксид-радикала и инактивацией Р-450.

Кроме того, было установлено, что эффект АР носит дозо-зависнмый характер, причем насыщение наступает при 2-х кратном мольном избытке АР по отношению к Р-450.

Для. выяснения возможных механизмов эффекта АР на мнкросомалыюе гндроксилирооаиие стероидов била исследована роль цитохрома 1)5 в обнаруженном феномене. Цнтохром 1>5 - электрон-транспортный белок - дополнительный компонент микросомалыгон монооксигеназной системы, роль которого заключается в передаче второго электрона от мнкросомальной ЫАОРН-завнсиыой цнтохром Р-450-редуктази на Р-450 и стимулировании за счет этого мпкросомалышго окисления. Ил рис. 1 следует, что в отсутствие АР цнтохром Ь5 ннгнбирует как 21-, так и 17сх-гидрокснлирование

Таблица 1.

21- н 17а-гндроксилнрующая активность микросом коры надпочечшжои быка (пмоль продукта/мнн па 1 мг белка микросом) в присутствии

электротранспорты* компонентов митохондриальной монооксигеназной системы

Фермент Контроль +АД (4 моль/моль Р-450) +АР (2 ноль/моль Р-450) +АД+АР

21-гидрокснлаза 1,68±0,14 1,42±0,09 2,0810,12 1,89±0,11

(17ос-оксипрогестерон)

21-гндроксилаза 3,17±0,22 3,15±0,20 4,99±0,35 4,07±0,26

(17аоксипрогестерон)

17а-гидроксилаза 0,75±0,15 0,62±0,14 1.10±0,13 1,31±0,11

(прогестерон)

прогестерона. В то же время, в присутствии АР ингнбирующий эффект цитохрома Ь5 на гидроксилнроваиие стероидов микросомами коры надпочечников менее выражен, а ь

случае 21-гпдрокснлазы наблюдается даже некоторое стимулирование активности при низком мольном соотношении цнтохром Ь5:цнтохром Р-450. Поскольку эксперименты с экзогенным цнтохромом Ь5 показали, что этот белок модулирует эффект ЛР на гидроксилнрованне стероидов микросомамн коры надпочечников, далее эффект ЛР был исследован в присутствии антител к цитохрому Ь5 (анти-Ьз), которые должны иммобилизовать антиген па поверхности мнкросомалыюй мембраны и, тем самым, исключить его нз мнкросомалыюй моноокснгеназной системы. Результаты экспериментов приведены на рис. 2 нз которого следует, что анти-Ь$ незначительно стимулируют 17а-гндрокснлированис прогестерона, тогда как в случае 21-гидроксилировання, антн-Ь5 не влияют на активность, но уменьшают стимулирующий эффект ЛР при мольном соотношении АР.Р--450 больше 2.

Таким образом представленные результаты указывают на то, что ЛР обладает способностью встраиваться в микросомальную монооксигеназную систему надпочечников и воздействовать на 21- и 17а-гидроксилазные активности.

Относительная ахтивность, % Ахтивность, нмога, в мин на 1 мг бел*а

Рис. 1 Эффект цитохрома Ь5 . на Рис. 2. Стимуляция гидроксилнрования гидроксилнрованне прогестерона Р-450с21 в прогестерона АР: активность Р-150с 17 (2) присутствии 5 моль АР на моль Р-450 (I), и в " Р"450с21 (3) в присутствии антител к отсутствие АР (2). а так же Р-450С17 в ннтохрому Ь5 (2,6 мг/мг мкк|юсомалыгого присутствии АР (3) и в ее отсутствие (4) белка); активность Р-450с17'(1) и Р-

450с21 (4) в присутствии такого же количества ненммунной'сыворотки

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИТОХРОМА Р-450с21 ИЗ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ БЫКА.

Изучение молекулярного механизма действия стерондгидроксилазных систем, а также возможность их практического применения делают необходимой разработку

падежных методов выделения отдельных компонентов систем в гомогенном виде. В связи с отсутствием приемлемой процедуры выделения Р-450с21 целью этого этапа являлась разработка метода, позволяющего получать гомогенный препарат фермента с высокой каталитической активностью, не содержащий примеси других молекулярных форм Р-450.

Для выделения Р-450с21 использованы надпочечные железы крупного рогатого скота. Фракцию мембран эндоплазматнческого регикулума получали путем дифференциального центрифугирования, а затем солюбнлпзнровалн мембранные белки холатом натрия. Последующая хроматография на колонке с холат-сефарозой обеспечивала значительную очистку белка (таблица 2). Р-450с21 начинал элюнроваться с колонки только после добавления эмульгена 913 до 0.2%. При хроматографии на данном сорбенте Р-450с21 отделялся от липидов и основной массы сопутствующих белков, а также гем содержащих примесей.

Хрома юграфип на аминогекснл-агарозе позволяла отделить присутствующий в больших количествах в ыикросомах коры надпочечников белок флавопротеидной природы с максимумом поглощения в видимой области спектра при 450 им. В процессе промывания колонки неношшм детергентом эмульгеном 913 данный флавопротоид элюировался, а Р-450с21 начинал десорбироваться только после добавления ионного детергента холата Ыа. На заключительном этапе использовалась хроматография на гндроксналатнте, в основном, для удаления неношюго детергента эмульген 913.

Таблица 2.

Очистка цитохрома Р-450с21 из микросом норы надпочечников быка

Стадия очистки Белок, Р-450, Р-450с21, Р-450с21, Степень Выход

мг нмоль нмоль нмоль на 1 мг белка очистки %

Микросомы 3285 510 247 0,075 1 100

Холйгсиыи экстракт 1426 33! 223 0,16 2,13 90

Холагсефароза 3,73 57,8 50,3 13,5 180 20,4

Аыинслексил агароза 2,42 35,3 35,2 14,5 193,3 14,3

Гнлрокснапатнт 2,23 34,1 34 15,2 202,7 13,8

Полученный белок при электрофорезе в присутствии DS-Na давал одну основную полосу с молекулярной массой 55 кДа и слабые но интенсивности дополнительные iiuju u при значительном увеличении нагрузки.

II окисленном состоянии гемипрогеид имеет максимумы поглощения при 358 нм ( й-hnH.ii), 119 нм (полоса Соре), 533 нм (ß ■ полоса), 568 нм (а - полоса), характерные дн iiiMKuci.iiiixBOH формы Карбонильный комплекс восстановленного Р-450с21

характеризуется интенсивным пиком поглощения при 450 им. Таким образом, спектральные характеристики Р-450с21 из мнкросом надпочечников быка совпадают или близки литературным данным, полученным ранее (Коттат! е1. а1., 1980; Витриэ е1.а1., 1982). Добавление 17а-оксипрогестерона приводит к спектральным изменениям I типа с максимумом при 390 им и минимумом при 420 нм.

Эксперименты по кинетике гидрокснлироваиня 17а-оксипрогестерона и прогестерона 21-гидроксилазой проводили в присутствии ЫАОРН-завнснмои цитохром Р-450-редуктазы и МАОРИ. Гидрокснлирование по 21-положению приводило к образованию П-дезоксикортикостерона в случае использования в качестве субстрата прогестерона, и 11-дезокснкортизола при шдрокснлированнн 17а-оксипрогестерона, которые идентифицировались методом ВЭЖХ. Зависимость скорости 21-гидрокснлазной активности от концентрации субстрата носит гиперболический характер; линеаризация в координатах Лайнунвера-Бсрка позволяет рассчитать кажущиеся значения Кт и каталитической константы Углах, равные соответственно 1.29 мкМ и 18.5 мшг1 для !7а-оксипрогестероиа и 2.73 мкМ и 9.65 мин'1 для прогестерона, соответственно. Значения Углах приведены для 20-ти кратного избытка цитохром.Р-450 редуктазы.

ПОЛУЧЕНИЕ И ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИТЕЛ К ЦИТОХРОМУ Р-450С21.

Принимая во внимание способность иммуноглобулинов специфически узнавать индивидуальные формы Р-450, нммунохимнческие методы часто используются для

изучения молекулярной организации Р-450-зависимых моиооксигеназ. Наша работа

■ ^

предполагала получение специфичных антител и исследование их аитиген-связывающнх свойств, а также перекрестных реакций с родственными белками.

Для нммунохнмическои характеристики и идентификации Р-450с21 и его лротеолнгическнх фрагментов нами были получены антитела против высокоочнщеккого белка. Специфичность антител проверяли методом двойной радиальной нммунодиффузин по Ухтерлони, из результатов которого следует, что антитела образуют интенсивную полосу преципитации только с Р-450с21 и не взаимодействуют ни с цитохромом 1>5,. ни с Р-450$сс. Для определения перекрестной реактивности полученной антисыворотки с другими гемопротеииами был использован более чувствительный метод дот-иммуноблоттинга. Результаты этого эксперимента указывают на то, что антнтела против Р-450с21 обладают кросс-реактнвностыо с Р-450йсс так же, как антитела против Р-450$сс из митохондрий взаимодействуют с микросомалышм Р-450с21, хотя и образуют значительно менее интенсивно окрашенные полосы.

Результаты нммунохимического анализа позволяют судить о наличии общих антигенных детерминант у Р-450с21 и Р-4505СС, несмотря на различную субстратную специфичность и локализацию в гормон-сннтезирующих клетках. Доля общих антигенных эгштопов, однако, невелика по сравнению со специфическими эпнтопамн, характерными для каждого белка в отдельности.

Специфичность полученных антител оценивалась также по их влиянию па каталитическую активность Р-450с21. Результаты, представленные на рис. 3, показывают, что специфичные иммуноглобулины ингибнруют активность 21-

гндроксилазы в микросомах коры

120

100 (

Ссвоснталышя «тианооть, %

60

надпочечников на 90% при

соотношении 1 uraiiTii-P450c21-IgG.ua

1 мг микросомальпого белка, в то время

как неиммунпой ' сыворотки

кролика, так же, как и анти-Р450зсс-

в соответствующих концентрациях,

не оказывают заметного влияния на

активность Р-450с21. Это

.свидетельствует в пользу того, что

микросоиальиын Р-450с21, хогя и

имеет сходные антигенные

___________детерминанты с митохоидрнальным Р-

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 " 1,2 ._,,

их* 180/«. шхсооомшого б««. 450хс- од,шю связывание с ними антн-

Рш 3. Ферментативная активность 'Р-450с21 в Р450зсс-1еа не влияет на

м,(«росомах в присутствии 1цО из ■ иеиммушюй ф свойства фермента,

сыворотки (I), анти-1Ч505сс-|еС (2). анти-Р450с21- ^ к 1

1^0 (3). За 10(1% принята активность Р-450с21 в Вопрос о том, на какой стадии

отсутствие 1гО ,

происходит ингнбирование анги-

1'450с21 21-гшфокснлазиой активности, остается открытым и требует проведения

дальнейших исследований.

ОГРАНИЧЕННЫЙ ПРОТЕОЛИЗ ЦИТОХРОМА Р-450с21.

Для установления структурно-функциональных взаимосвязей и молекулярной цианизации мембранных белкой применяют непрямые подходи, такие как химическая модификация, направленный мутагенез, нммунохимнческнй анализ," компьютерный шилиз на основе сопоставления с известной структурой бактерналы ;о Р-450сат. (Лппш п) я(|ф(;ктийны< подходов является также протеолитнческни анализ. Ранее,

о

применение ограниченного протеолнза позволило установить доменную структуру мнтохондрналыюго P-450scc, который расщепляется трипсином с образованием N- и С-концевых фрагментов без потерн ферментативной активности (Chashchin et. al., 1985). Данный подход использовался в сочетании с нммунохимическим анализом для структурно-функциональной характеристики микросомальиого Р-450с21 и установления

на этой основе сходства и различий в молекулярной организации

митохондриальных и мнкросомальннх стерондогенных монооксигеназ.

При проведении трипсинолиза Р-450с21 в растворе образовывались два фрагмента с Мг 29 и 25 кДа (рис. 4). Мг фрагментов определяли по результатам DS-Na-электрофореза. Как следует из рис. 4, Р-450с21 оказался более устойчив к трипснполнзу, чем P-450scc, что указывает на меньшую доступность сайта трипсинолиза у микросомальиого Р-450.

При проведении ограниченного трипсинолиза Р-450с21 в микросомах образовывались аналогичные фрагменты, которые идентифицировались, после переноса на нитроцеллюлозу, с помощью специфичных антител. В процессе более продолжительного трипсинолиза образующиеся фрагменты подвергаются дальнейшему расщеплению, с образованием небольших пептидов, не определяемых методом нммуноблоттинга.

Для того, чтобы установить, насколько прочно связаны этн фрагменты Р-450с21 с лнпиднон мембраной, мнкросомы после трипсинолиза обрабатывали раствором 500 мМ NaCI и 500 мМ Na2C03, содержащим 5% 2-меркаптоэтанол, который удаляет все Fie связанные с мембраной белки. Однако данная процедура не приводит к переходу полнпептидных фрагментов Р-450с21 в раствор, что говорит об их жестком связывании с мнкросомальнои мембраной.

Таким образом, результаты нашего исследования позволяют высказать предположение о присутствии связанных с мембраной участков не только в N-, но и в С-концевой области молекулы Р-450с21. Этн данные указывают на то, что молекулярная организация в мембране Р-450с21 и микросомальных Р-450 печени, по-видимому, существенно различается.

Для предсказания наиболее вероятных фрагментов, образующихся при трнпсиполизе Р-450с21, нами разработана компьютерная программа, аранжирующая сайты полипептндной цепи атакуемые трипсином по степени их гидрофильности и относительной подвижности. В компьютерной программе использовались теоретические подходи, описанные ранее (Норр, 1989; Van Regenmortel, 1988). Как следует из результатов расчета (таблица 3), трипсинолиэ Р-450с21 по положению 260 должен приводить к образованию фрагментов с молекулярными массами, соответствующими экспериментально полученным данным. Принимая во внимание высокий коэффициент гидрофильности и относительной подвижности полнпептиднон цепи в области Arg266, »юг участок с наибольшей вероятностью должен подвергаться трипсинолизу.

Таблица 3.

Комныйгерний анализ вероятных участков расщепления полнпептиднон цепи Р-<150с21 трипсином.

N" АМК

Ж 266 321 181 406 337 162 76

Коэффициент шдрофилыюстн

Мол. масса фрагмента 1, Да

Мол. масса фрагмента 2, Да

1,91 1.53 1,20 1,10 1,10 1,06 1,06 1,01

20877 30879 37010 20635 46555 38730 17507 8584

35030 25028 18897 35273 9352 17177 38400 47323

Для изучении влияния трнпеииолнза на спектральные и каталитические свойства Р--1Ь0с21 ыикрисоми подвергались трипсинолизу, а затем анализировались на содержание Р-150 и сно<обность образовывать I тип спектрального ответа при добавлении еубараи (Г/и оы:1шрслесгерона). Из рис. 5 следует, что ограниченный трипсинолиз юнроьожиаеюи переходом Р 150 в его неактнаную форму с'максимумом поглощения в (.О снекгре при- 420 им, и уменьшением амплитуды спектрального ответа при дьбаалешы субпрага Кроме того, в результате .трнпеииолнза снижается и 21-шлриксилашая акишность Р450с21 как в реконструированной системе, так и в шп.рчишальиии мембране, чю хорошо коррелирует с долен расщепленного белка, и с уш иышниси ашытуды спек!ральных изменений при добавлении субст[ га.

it

Изменение спектральных характеристик Р-450с21 в результате трипсннолиза (переход в Р-420 н уменьшение амплитуды спектральных изменении при связывании

субстрата) может свидетельствовать о том, что расщепление полипептидной цепи затрагивает непосредственно гем-связывающнй участок белка, либо в целом изменяет его конформацню таким образом, что пространственная организация гем-связывающего участка становится неблагоприятной для "правильной" ориентации тема. Такое нарушение структурной организации гем-связывающеи области приводит к соответствующему снижению

ферментативной активности.

Таким образом, молекулярная организация микросомалыюго Р-450с21 из коры надпочечников имеет черти сходства как с митохоидриалышми Р-450 (более чем один участок связывания с мембраной), так и с некоторыми микросомальными Р-450 из печени.

ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ И КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЦИТОХРОМА Р-450с21, ЭКСПРПССИРОВАННОГО В Escherichia colt.

Недостаточность no Р-450с21 приводит к ряду клшшческмх симптойоа, объединяемых под общим названием "врожденная гиперплазия надпочечников". Несмотря на то, что известии природные мутации, приводящие к развитию гиперплазии коры надпочечников, структурно-функцноналыше изменения Р-450, вызываемые ими, до сих пор не изучены. Одной из причин этого является очень низкое содержание фермента в стероидогенных тканях н сложность его выделения из природных источников. Некоторые Р-450 были экспрессироваиы в Е. coil посредством модификации N-кониевой области фермента, что значительно увеличивало уровень экспрессии н не сказивзлось на их каталитических свойствах. Однако, до настоящего времени, не существует эффективной системы экспрессии Р-450с21 человека в Е. coll с последующей его очисткой до гомогенного состояния.

Рис. 5. Влияние ограниченного трипсннолиза на спектральные свойства Р-450с21 в микросомах. А -СО-спектр. Б - разностный спектр связывания субстрата (17а-оксипрогестерона). 1 - до трипсннолиза, 2 - после трипсннолиза.

Значительный прогресс в гетерологнческон экспрессии некоторых форм Р-450 в Е. coli был достигнут благодаря использованию методического подхода, примененного Barnes H.J. .и др., заключающегося в изменении N-концевой последовательности кДНК, кодирующей Р-450с17 vBarnes et. al, 1091). Поскольку считается, что гндрофобность N-концевон области микросомальных Р-450 является принципиальной для правильного встраивания фермента в липидную мембрану, была предпринята попытка оптимизировать условия экспрессии Р-450с21 без значительной модификации этого фрагмента Р-450. С этой целью заменены первые 8 кодонов кДНК Р-450с21 на мутированную, согласно Barnes H.J. и др., последовательность Р-450с17. Результатом этого явилась плазмнда pTacTacC21-17mod, несущая 5 мутаций в N-концевои последовательности Р-450с21. Принимая во внимание довольно существенные изменения в аминокислотной- последовательности Р-450с21, была сконструирована

А

"Днхни" тип ATG CTG СТС CTG GGC CTG CTG CTG___

Met Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu ...

pTacC21mod ATG СТА СТА СТА GGA CTG CTG CTG___

Met Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu ...

рТлсТасС21 - ATG GCT СТС ITA ITA GCA GTT TTT ____

17mod Met Ala. Leu Leu Leu Ala Val Pho___

pTacTacC21 - ATG GCT CT С ТТЛ ТТЛ ТТЛ ТТА ТТЛ ...

21 mod Me t Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu . .

рТасТлсС21 - ---CAG CAT CAT CAT CAT TG A TCT AGA..

2lmoiiHis - . .Gin Hia Hip His Ois Стоп...

Рис. G. Модифицированные нуклеогшшая и аминокислотная последовательности Р-450с21 человека в N-концевой (Л) и С-концевой области (Б). Введенные мутации показаны "жирным" шрифтом, замененные аминокислоты подчеркнуты.

другая плазмнда рТасТасС21-21 mod, несущая кДНК Р-450с21 с модифицированной N-концевой последовательностью, которая, однако, кодировала Р-450с21 только с двумя аминокислотными заменами (рис. С). В плазмиде рТасТасС21-21modHis полинуклеотидная последовательность гена Р-450с21 была модифицирована также путем присоединения кластера из 4-х гистидинов к С-концевой области фермента с целью упрощения процедуры выделения н очистки экспрессированного белка при помощи металло-аффинной хроматографии. Все конструкции были экспресснрованы в Е. coli линии JMI09. Эффективность экспрессии была определена иммуноблоттингом и по 21-гидрокснлазной активности in vivo. После выделения бактериальных мембран уровень экспрессии Р-<!50с21 определялся из дифференциальных спектров,

наблюдаемых при титровании 17сс-окснпрогестероном и равнялся 40-50 нмоль на 1 л культуры.

Очистка микросомальиых Р-450 представляет собой довольно длительный и сложный процесс, включающий ряд хроматографии и характеризуются очень низким выходом фермента. Предложенная нами схема выделения высокоочшцешюго Р-450с21, экспресснрованного в Е. coli, позволяет получать в достаточно большом количестве (510 нмоль) гомогенный белок в течение 1 дня с 30-40 % выходом.

Процесс выделения и очистки рекомбннантного Р-450с21 включает дне стадии. На первой из них мембранные белки солюбнлнзируются ненонным детергентом эмульген 913, что приводит к частичной очистке Р-450с21. Вторая, самая эффектньная, стадия предстаиляет собой металло-аффинную хроматографию, разработанную' на основе хелатиропания ионов металлов аминокислотными остатками гнстиднна. Как видно из таблицы 4, степень очистки при использовании этого сорбента увеличивается в 260 раз, при 33% выходе.

Таблица 4

Очистка Р-450с21 человека экспресснрованного в Е. coli.

Стадия очистки Белок, мг Р450с21, Р450с21 Степень Выход,

нмоль нмоль на 1 мг белка очистки %

Бактерии 4-10 15,7 0,036 1 100

Солюбнлнзат 96.7 8,8 0,91 2,53 5G

ИМАХ 5,5 5,22 ' 9,5 263,9 33,3

Высокоочнщенпмй Р-450с21 мигрирует в полнакрилзмндном геле в присутствии 0.1 % ОБ-Иа одной полосой. Путем сравнения его электрофоретнческой подвижности с подвижностью маркерных белков была определена молекулярная масса Р-450с21, которая равнялась 54 кДа.

Абсолютные спектры очищенного Р-450с21 приведены на рис. 7. Окисленная, низкоспиновая форма Р-!50с21 имела в абсолютном спектре максимумы при 422 им (полоса Соре), 360 им ( 5- полоса), 540 им (|) -полоса) и плечо при 570 нм (а -полоса). Добавление Ма25204 приводило к восстановлению Р-450, сопровождаемому сдвигом максимума в области полосы Соре на 412 им, а в области |? - и « - полосы - на 536 и 555 нм, соответственно. Пропускание СО через раствор восстановленного Р-450 приводило к типичному сдвигу максимума поглощения иа 450 нм с незначительным плечом при 420 им, что указывает на отсутствие неактивной формы Р-420.

При добавлении субстратов к Р-450с21 наблюдался спектральный ответ I типа, с нзобесгнческой точкой при 407 нм для 17а-оксипрогестерона н при 412 нм для

прогестерона. Эти субстрат-индуцироваиные спектры использовались при определении 1М для каждого субстрата путем преобразования в обратные координаты зависимости разности поглощения при 390 и 420 им от концентрации субстрата. Константы диссоциации для прогестерона и 17а-оксипрогестерона равнялись 14,73 мкМ и 31,1 мкМ, соответственно^

Очищенный Р-450с21 обладает 21-гндроксилазиой активность при добавлении в реакционную смесь ЫАОРН-цитохром Р-450-редуктазы, субстрата и МОРИ-

регенерирующей системы. Для того, чтобы установить влияние модификаций Ы- и С-концевых последовательностей па

ферментативную активность

экспрессироваиного Р-450с21, мы определили значения Кш и Ушах для "дикого" типа фермента и для его

4M .4W s.w «w

Д11И1М »(VIIIU, IM

Рис. 7. Абсолютные спектры очищенного Р-450с21, (pTacC21mod) экспрессироваиного в Е. coli. 1 • ннзкоспиновая, .

окисленная форма; 2 • высокоспиновая окисленная мутированных форм Как видно из

форма; 3 • дитнонит-восстановлепная форма; 4 - СО-__, с .. ' .

комплекс восстановленной формы. - таолицы а, мутации как м-концевои

(pTacTacC21-21mod), так и С-концевой последовательностей (pTacTacC21-21modMis) не приводят к значительным изменениям в значениях'Km и Vtnax.

Таблица Б

Кинетические параметры Р-4Б0с21 дикого типа п его мутаитных форм в мембранах П. coli.

Экспрессирушая плазмида 17а-оксипр0гестерон Прогестерон

Km*, мкМ Vinax, мин' Km, мкМ Vrnax, мин 1

pTacC2lmod pTacTacC2l-21mod рТасТзсС21 -21 modl Iis 0.7510,29 0,81±0.32 . 0.9±0,36 51,210,1 74.114,9 53,510.5 0,1310.01 0,1810,11 0.19Ю.14 32.9Ю.5 45,411,8 33,011,5

Значения представляются средним арифметическим трех определений со стандартным отклонением.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что дополнительные четыре остатка гистидина, введенные в С-концевую область Р-450с21, не влияют на функциональные проявления фермента и, при экспоннрованности наружу, не мешают взаимодействию ни с редуктазой, ни со стероидной молекулой. В то же время использование этих гистидиновых остатков позволяет достаточно быстро (в течение 10 ч) очистить фермент до гомогенного состояния с помощью металло-аффинной хроматографии. Такой подход может оказаться полезным как для выделения других Р-450, так и для очистки и последующего анализа их мутиросанпых форм.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что адренодоксипредуктаза, митохондриальный электронтранспортный белок, оказывает стимулирующее влияние на 17а- и 21-гндроксилазиые активности микросом кори надпочечников быка. Эффект адренодоксинредуктазы сходен со стимулирующим влиянием микросомалыюй NADPH-зависимой цитохром P-450-редуктазы.

2. Установлено, что цнгохром bs ингибирует 17а- и 21-гидроксилазные активности микросом надпочечников быка. Добавление адренодоксинредуктазы приводит к уменьшению ингнбнрующего эффекта цитохрома bg.

3. Разработана эффективна!! процедура выделения и очистки цитохрома Р-450с21 из надпочечников быка. Для гомогенного белка определены молекулярная масса мономерной формы, удельное содержание гема, ряд спектральных и каталитических характеристик с использованием основных субстратов 21-гидроксилироваиип.

4. Получены антитела специфичные к шпохрому Р-450с21 быка ингибнрующие 21-гндрокснлазную активность фермента на 90%. Полученные антитела использованы для определения протеолитических фрагментов 21-гилроксилазы в микросомалыюй мембране, а также исследована их способность взаимодействовать с другими компонентами моноокснгеназных систем.

5. Показано, что ограниченный трипсинолиз цитохрома Р-450с21 п растворе приводит к образованию двух полнпептидных'фрагментов с молекулярной массой 25 и 29 кДа, которые соответствуют N- и С-концевыи областям бед*.. ■ На основании результатов ограниченного трипсинолиза мембранно-связанной формы фермента предложена модель молекулярной организации 21-гндроксилазы в липидной мембране.

6. Осуществлена гетерологнческая экспрессия цитохрома Р-450с21 человека в метках бактерий Е. coli, и разработан метод его очистки до гомогенного

состояния с помощью металло-аффшшой хроматографии. 7. В результате детальной физико-химической и спектральной характеристики очищенного дитохрома Р-450с21 определены кинетические константы его модифицированных форм, сделан вывод о том, что модификация Ы-концевой области 21-гидроксилазы и.включение 4-х дополнительных остатков гистидина в С-концевую последовательность не оказывает влияния на каталитические характеристики фермента.

1. Guzov V.M., Zelko IN., Chernogolov A.A.. Usanov S.A. "Catalytic and immunochemical features of mitochondrial and microsomal monooxygenase systems of the steroid oxidation." • In: 7-lh Int. Conf. on Cytochrome P-450, Moscow. -1991. -P. 67.

2. Guzov V.M;, Zelko I.N., Chernogolov A.A., Usanov S.A. "The effect of adrenodoxin reductase on the steroid hydroxylation in adrenocortical microsomes." In: 9-th International Symposium on microsomes and drug oxidation. Jerusalem, Israel, -1992. •P. 195.

3. Guzov V.M.. Zelko I.N., Chernogolov A.A., Usanov S.A. "Catalytic and immunochemical features of mitochondrial and microsomal monooxygenase systems of the steroid oxidation." - In: Proceeding ol the 7-th Int. Conf. on Cytochrome P450, Moscow.-1992.-P. 285-287.

4. Guzov V.M.. Zelko I.N., Chernogolov A.A., Usanov S.A. "The eiiect ol adrenodoxin reductase on the steroid hydroxylation in adrenocortical microsomes." - J. Basic and Clinical Physiol, and Pharmac.. -1992. Vol. 3. -P. 200.

5. Zelko I.N., Bylinskaya S.A., Usanov S.A. "Limited trypsinolysis ol cytochrome P450c21 from adrenal cortex microsomes." In: 8th Int. Conl. on Cyt. P450, Portugal. -1993. -P. 186.

6 Гузов B.M., Зелько И.П., Черноголов A.A. Усанов С.А. Взаимоотношения мнкросомальных и митохондриальных стероидгндрокснлирующнх систем коры надпочечников быка: влияние высокоочнщенных компонентов мнтохондриальной моноокенгеназнон системы на гидрокенлированне стероидов микросомами. / / Биохимия. - 1993. - Т. 58. N. 11. -С. 1761-1770.

7. Гузов В.М.. Зелько И.Н, Былннская С.А., Усанов С.А. Структурно-функциональная характеристика цнтохрома Р-450с21. Иммунохнмичсские подходы и ограниченный трипеинолнз. // Биохимия. 1994. Т 59. N 8 -С 11-49

17

РЕЗЮМЕ

Зелько Игорь Николаевич. Молекулярная организация и структурно-функциональная характеристика природного к рекомбинантного цнтохрома Р-450с21.

1Слючевие слова: цитохром Р-<150с21, стероиды, адреиодоксинредуктаза антитела, ограниченный трипсинолнз, очистка, экспрессия в Escherichia coli, металло-аффинная хроматография.

Изучена молекулярная организация цитохрома Р-450с21 (Р-150с21) в растворе и в составе липндной мембраны, а также установлены структурно-функциональные взаимоотношения между отдельными компонентами мнтохондрнальнои и микросомальной монооксигеназных систем.

При выполнении работы ' использовались спектрофотометркческие, электрофоретические, хроматографнческне и молекулярно-биологическне методы исследования.

Обнаружено, что адреиодоксинредуктаза (АД) стимулирует как 21-, так и 17а-стероидгндроксилазную активности микросом коры надпочечников, не менее эффективно, чем NADPH-зависнмал цитохром P-450-редуктазз. С помощью цитохрома Ь5 н антител к данному белку изучены возможные механизмы стимулирующего эффекта АД.

Выполнено сравнительное исследование молекулярной организации микросомального Р-450с21 и мнтохондриального P-450scc из коры нздпочечннкоп с помощью иммунохпмпческих подходоп и ограниченного протсолиэа. Разработан эффективный метод выделения и очистки Р-450с21, а также получены и охарактеризованы антитела против гемопротенна. Установлено, что ограниченный трипсинолнз Р--150с21 в микросомальной мембране приводит к образованию двух фрагментов, жестко связанных с мембраной,

Ферментативно активный Р-450с21 человека был экспресснрован в Escherichia coli и очищен до гомогенного состояния. С целью увеличения уровня экспрессии, осуществлены замены в N-концевой области белка и введены четыре гнетндиновых кодона - для эффективной и быстрой очистки фермента с помощью метзлло-аффнннон хроматографии,.

Установленные структурно-функциональные взаимоотношения в ряду Р--150-зависимых монооксигеназ дополняют существующие представления о действии. стероидгидроксилирующих систем н могут быть использованы при создании биокатализаторов для получения стероидных гормонов и их аналогов.

РЭЗЮМЭ

Знлько Irap Мгаласвш. Малекулярная аргашзацыя i структурпа-функцылнальная характеристика прыроднага и рэкамбшаптнага цытахрома Р-450с21.

Ключавыя словы: цытахром Р-450с21, стэрощы, адрэнадаксшрэдуктаза, антыцелы, обмежаваны трыпсшол|3, ачыстка, экспрэссш у Escherichia ccü, метала-афпшая храматаграфт.

Даследавана малекулярная аргашзацыя цытахрома Р-450с21 (Р-450с21) у растворы i у складзе л>'ш'днай мембраны, а таксама установлены структурна-фуикццянальныя узаемаадносшы пам|'ж асобным! кампанентам! м!тахаидрыялы<ай i «¡красамальплй монааксксназных астэм. !

Пры выкананш работы ужывал'юя спектрафатаметрычныя, электрафарэтычныя, храматаграф1чныя i малекулярнабшлапчныя метады даследвання.

Знойдзена, што адрэнадаксшрэдуктаза (ЛД) стымулфуе як 21- так i 17а-пдракалазную актыунасщ мжрасом кары ладнырачшкаУ быка не меньш эфекты^на, чым NADPH-залежпая цытахром P-450-рэдуктаза. 3 дапамогай цытахрома bs i антыцел да гэтага бялка вывучаны магчымыя механизмы стымулфуючага эфекта АД.

Зроблена параунальнае даследванне малекулярнай аргашзацьп мжрасамальнага Р-450c2l i штахандрыяльнага P-'150scc з кары наднырачшкау з дапамогай ¡мунахМчных падыходау i абмежаванага пратэолЬу. Распрацаваны эфектыуны метад иыдзялепня i ачыстк! Р-450с21, а таксама атрыманы i ахарактаризавани аитыцелы супраць гемапратэшу. Абмежавапи трыпсшол!з Р-450с21 у мшрасамальнай мембране пядзе да утварэння двух фрагментау, ямя жорстка звязаны з мембрана».

Фсрментатыупа актыуны Р-450с21 чалавека быу вкспрэа'раваны у Escherichia coli i ачыщаны да гамагеинага стану. 3 мэгай павил^чзння узроуня экспрзсИ, зроблепи замены у N-канцавой вобласщ бнлку i уведзены чатыры пстыдьшавых кадопа - для эфектыунай i хуткай ачысти ферменту з дапамогай метала-афшнай храматаграфп.

Установления структурна-функцыянальныя узаемаадносшы у шэрагу Р-450-залсжных монааксненаз дапауняюць ¡снуючыя уяулешп аб . дзеяшн стэроишдраксшруючых с!стэм i могуць бит» викарыстоуваны при стварэнш б|икатал1затарау з мэтай атрымання стэродашх гармопауi ix аналагау.

SUMMARY

Zelko Igor Nikolaevicli. The molecular organization and structure-function characterization of natural and recombinant cytochrome I'- t50c21

Key words: cytochrome P450c2l, steroids, adrenodoxin reductase, antibody, limited trypsinolysis, purification, expression in Escherichia coli, metal-affinity chromatography.

The molecular organization of cytochrome P-450c21(P-450c21) in solution and in the phospholipid membrane was investigated. The structure-function relationships between components mitochondrial and microsomal monooxygenase systems were studied.

The spectral methods, electrophoresis, chromatography and methods of molecular biology were used.

It was detected that adrenodoxin reductase (AR) stimulates both 21- and 17a-steroid-hydroxylating activities of microsomes in the adrenal cortex, no less effective than NADPH-dependent cytochrome P-450-reouctase. The possible mechanisms of stimulating effect of AR was investigated using cytochrome bsand specific antibody.

A comparative study on molecular organization of microsomal cytochrome P450c21 and mitochondria! P450scc from adrenal cortex has been performed using immunochemical approaches and limited proteolysis. An efficient method to isolate and purify cytochrome P450c21 has been developed and the antibodies against the hemeprotein have been raised and characterized. Limited trypsinolysis of cytochrome P450c2i leads to the formaiion of two fragments which are tightly bound to microsomal membrane.

The active human P-450c21 was expressed in Escherichia coli and purified to an apparent homogeneity state. To increase the expression level, N-termlnal region of protein was altered and four codons coding histidine were introduced for effective and fast enzyme purification using metal-affinity chromatography.

The discovered structure-functional relationships in a number of P-450-related monooxygenases give new knowledge on the action of sterold-hydroxylating systems which may be used for development of the effective biocatalysts for synthesis of steroid hormones and its analogies.

Подписано п печать /".12.95. Бумага типографская J»I Усл.печ.л., I,¿5 Тирах 65 За к 108

Сормат 60x34,1./IG. Печать Офсетная Учет.лзд.л. 1,16 Бесплатно.

Отпечатано «а ротапринт» Ц.'1> .l'í ?J. ¿20601. l'.imcF, ул. Сурганова, 15