Молукулярная организация и структурно-функциональная характеристика природного и рекомбинантного цитохрома Р-450с21 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

п Н

Л

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

ИНСТИТУТ БИООРГЛИИЧЕСКОЙ химии

УДК 577.152.1.03:577.112.4:577.217:543.42

ЗЕЛЬКО Игорь Николаевич

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИРОДНОГО И РЕКОМБИНАНТНОГО ЦИТОХРОА1А Р-450с21.

02.00.10 - Бноорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МИНСК-1995 г.

Работа выполнена в Институте биооргаинческой химии Академии наук Беларуси

Научный руководитель: доктор химических наук Усанов С.А.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Метелица Д.И.

доктор биологических наук, член-корр. БИА Шкуматов В.М.

Оппонирующая организация:

Белорусский государственный университет

Защита состоится """ •ХАер»^* г. в«£.ч. па заседании совета по защите диссертаций Д 006.22.01 в Институте биооргаинческой химии Академии наук Беларуси но адресу: 220141, Минск, ул. Жодннская 5/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биооргаинческой химии АН Беларуси

Автореферат разослан 1995 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертации,

/Л»

"сг-иЦ

кандидат химических наук

Н.М. Литвинко

Институт биоорганической химии АН Беларуси

Актуальность тн-»-' днсусртдинн. Цитохром Р-450 (Р-450) является терминальной оксндазой в моноокснгенаэнон системе, которая широко распространена в природе и участвует d детокснкации ксенобиотиков, биосинтезе стероидных гормонов, простагландннов, лейкотрненоп, желчных кислот и витаминов группы D3 Значимость процессов трансформации этих соединений ставит его в один ряд с такими гемопротендамн, как гемоглобин н многлобнн, каталаза и пероксидаза.

Развитие в последние годы микробиологического способа получения белка с использованием в качестве продуцента клеток дрожжей и бактерий позволяет нарабатывать п больших масштабах ферменты монооксигеназной системы. В связи с этим большие надежды возлагаются также на использование Р-450 для контроля за загрязнением окружающей среды, окисления химических соединений, используемых в производстве пищевых продуктов, и синтеза новых лекарств.

Особенный интерес представляет исследование P-450-зависимых ферментов, участвующих в биосинтезе стероидных гормонов, поскольку это позволяет выяснить молекулярные основы ряда тяжелых наследственных заболеваний, связанных с нарушением гормонального гомеостаза н открывает перспективу их пренатальной диагностики. К настоящему времени имеется информация о взаимосвязи структуры н функций Р-450: определены С-концевон гем-связывагаший пептид, установлены предположительные области связывания стероидных субстратов, а также N-концевой фрагмент, выполняющий роль "якоря" в лнпндной мембране (Nelson D.R., 1988; Gotoli О., 1992). Однако, до сих пор остается дискуссионным ряд вопросов: какова общая схема организации цптохромов Р-450 в мембране, какова природа взаимодействия между белками-партнерами вовлеченными в стероидогенез, чем обусловлена субстратная специфичность?

СляJ ь_работы с к ручными научными п рограммами. темами.

Диссертационная работа выполнялась в- рамках плановой темы Института биоорганической химии ЛИ Беларуси "Исследование молекулярных механизмов и структурных основ функционирования моноокенгенззных систем с участием Р-450" (№ гос. регистрации 19941428) н'в рамках Международного сотрудничества с Институтом Молекулярной Биологин в Тайване, а также представляет собой логическое продолжение структурно-функциональных 'исследований

стероидгидроксилирующих ферментных систем, проводимых в ИБОХ АНБ.

Мель н задачи исследования. Основная задача работы - изученис'молекулярнон организации цитохрома Р-150с21 (Р-450с21) в растворе и п составе лнпндной мембраны, а также установление структурно-функциональных взаимоотношений между отдельными компонентами мнтохонлриальной и микросомальной монооксигеназннх систем клеток коры надпочечников.

Впервые показано, что адреиодоксинредуктаза стимулирует как 17а-, так и 21-гндроксилаэние активности микросом коры надпочечников быка, в то время как цитохром Ь5 ннгибирует их как в присутствии адреиодоксннредуктазы, так и в ее отсутствие. Установлено, что ограниченный трипсннолнз Р-450с21 как в мембране, так и d растворе приводит к образованию двух полипептидных фрагментов с молекулярными массами 25 и 29 кДа, которые жестко связаны с мембраной. Зарегистрировано уменьшение ферментативной активности и частичный переход Р-450с21 в форму с максимумом поглощении при 420 им после проведения ограниченного трипсннолиза. Осуществлена гетерологнческая экспрессия Р-450с21 человека в клетках бактерий Escherichia coli (Е. coli) к разработан метод выделения и очистки 21-гидроксилазы из бактериальных мембран с помощью металло-аффинной хроматографии.

структурно-функциональные взаимоотношения в ряду P-450-зависимих монооксигеназ являются основой для понимания действия сложных, многокомпонентных систем на молекулярном уровне, а также тонких механизмов регуляции процессов биосинтеза стероидных гормонов. Создание на базе полученных результатов простых шунтированных систем, содержащих митохондриальные и мнкросомальные моиооксигеназы и их вспомогательные белки, открывает возможность их практического использования для биосинтеза физиологически активных соединений.

для гетерологической экспрессии и очистки Р-450с21, могут быть также использованы при выделении других лабильных белков нз биомассы различных микроорганизмов и тканей. Полученные стероидгидроксилирующие ферменты могут использоваться при создании биокатализаторов для получения стероидных гормонов и их аналогов.

1, Изучение взаимоотношений микросомальных и митохондриалькых систем гндроксилировання стероидов локализованных в коре надпочечников быка.

2, Разработка высокоэффективного метода выделения и очистки до гомогенного состояния Р-450с21 из коры надпочечников быка.

3, Установление физико-химических, спектральных и каталитических характеристик Р-450с21 из надпочечников быка.

4 Исследование иммунохимических свойств 21-гидроксилазы.

5 Определение топологии Р-450с21 в липидной мембране с использованием ограниченного прйтеолнза и иммунохимических подходов.

G Осуществление гетерологической экспрессии Р-450с21 человека в клетках Е. coli.

7. Разработка метода очистки Р-450с21, экспресснропаипого n Е. coli с

использованием металло-аффннной хроматографии, н изучение физико-химических свойств очищенного белка.

Личный пклад соискателя. Результаты по исследованию взаимоотношений мнкросомальных и ннтохондрнальных систем гидроксилирования стероидов и очистке Р-450с21 получены лично автором диссертации. В изучении влияния ограниченного трипсннолнза на ферментативные н спектральные свойства Р-450с21 принимала участие инженер С.А. Былинская. В разработке метода гетерологнческой экспрессии 21-гндрокснлазы и ее очистки из бактериальных мембран оказывал помощь научный сотрудник, кандидат химических наук В.М. Гузов. Кроме того, в постановке темы диссертационного исследования и обсуждении полученных результатов принимал участие главный научный сотрудник, доктор химических наук С.А. Усанов.

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации доложены на 7-ой Международной конференции "Цнтохром Р-450: биохимия и биофизика", Москва (¡991 г.), 8-ой Международной конференции "Цнтохром Р-450: биохимия, биофизика и молекулярная биология", Португалия (1993 г.), 9-ом Международном симпозиуме "Мнкросомы и окисление лекарств", Израиль, Иерусалим, (1992 г.). .

Опублнковлгшость результатов. Основные результаты диссертационной работы изложены в 3-х статьях, 1 сборнике, 3-х тезисах конференций.

Структура н объем диссертации, Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, экспериментальной части, материалов и методов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 15G страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 11 таблиц. Библиография включает 254 наименования.

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ МНКРОСОМАЛЬНЫХ И МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ СИСТЕМ ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ СТЕРОИДОВ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ БЫКА.

Для анализа возможности взаимодействия компонентов митохондрнальных и мнкросомальных монооксигеназ на первом этапе предпочтительно использовать митохондриалышй или микросомальный компонент в составе природной мембраны. В настоящее время попыток изучения гибридных ферментных систем биосинтеза кортикостероидов в литературе не описано. В связи с этим нс-лью данного раздела исследования является изучение стероидогенеза в микросомах коры надпочечников в присутствии электронтранспортных белков митохондриалыюй монооксигеназной

системы - адренодокснна (АД), адренодокспнредуктазы (АР) и цитохрома Р- 450йсс (Р-450$сс).

Для изучения влияния мнтохондрнальных электронтранспортних белков на моноокснгенаэние реакции о эндонлазматическом регнкулуме каталитическая активность 21- и 17а-гидроксилаз в микросомах коры надпочечников быка анализировалась в присутствии АД и АР. Как следует из таблицы 1, добавление АД к микросомам коры надпочечников не оказывает заметного влияния ни на 21-, ни на 17а-гидроксилазную активности. С другой стороны, присутствие в инкубационной среде АР существенно увеличивает обе мнкросомальные активности. Одновременное добавление АД и АР в инкубационную среду приводит к ослаблению стимулирующего эффекта АР на 21-гидроксилазу, что можно объяснить автоокнслением адренодокснна с образованием суперокснд-радикала и инактивацией Р-450.

Кроме того, было установлено, что эффект АР носит дозо-завнсимый характер, причем насыщение наступает при 2-х кратном мольном избытке АР по отношению к Р-450.

Для. выяснения возможных механизмов эффекта АР на млкросомалыюе гидрокснлирование стероидов была исследована роль цитохрома 65 в обнаруженном феномене. Цнтохром 1>5 - электрон-транспортный белок - дополнительный компонент микросомальпой монооксигеназной системы, роль которого заключается в передаче второго электрона от микросомальпой ЫАОРН-зависимой цнтохром Р-450-редуктазы на Р-450 и стимулировании за счет этого мнкросомального окисления. Из рис. 1 следует, что в отсутствие АР цнтохром Ь5 ннгибнрует как 21-, так и 17а-гндроксилироиание

Таблица I.

21- и 17а-гидроксилирующая активность мнкросом кори надпочечников Лыка (пиши, продунта/мип па 1 мг белка мнкросом) в присутствии

электронгрансноршых компонентов митохондрнальной монооксигеназной системы

Фермент Контроль +АД (4 моль/моль Р-450) +АР (2 ыоль/моль Р-450) +АД+АР

21-гидрокснлаза 1,68±0,14 1,4210,09 2,0810,12 1,8910,11

(17аоксипрогестерон)

21-гидроксилаза 3,17±0,22 3,15±0,20 4,9910,35 4,0710,26

(17аоксипрогестерон)

17а-гидроксилаза 0,75±0,15 0,62±0,14 1,1010,13 1,3110,11

(прогестерон)

прогестерона. В то же время, в присутствии АР ингибирующий эффект цитохрома 1)5 на гидрокснлнрование стероидов мнкросомами коры надпочечников менее выражен, а в

случае 21-гидрокснлазы наблюдается даже некоторое стимулирование активности при низком мольном соотношении цктохром Ь5:цитохром Р-450. Поскольку эксперименты с экзогенным цитохромом Ь5 показали, что этот белок модулирует эффект ЛР на гидрокснлнрование стероидов мнкросомами коры надпочечников, далее эффект ЛР был исследован в присутствии антител к цитохрому 1>5 (ант|!-Ь5), которые должны иммобилизовать антиген на поверхности мнкросомалыюн мембраны и, тем самым, исключить его из мнкросомалыюн монооксигеназной системы. Результаты экспериментов приведены на рис. 2 из которого следует, что антн-Ь5 незначительно стимулируют 17а-гндрокснлнрованне прогестерона, тогда как в случае 21-гидроксилирования, анти-Ь5 не влияют на активность, но уменьшают стимулирующий эффект ЛР при мольном соотношении АР:Р-450 больше 2.

Таким образом представленные результаты указывают на то, что ЛР обладает способностью встраиваться в микросомальную монооксигеназную систему надпочечников и воздействовать на 21- и 17а-гидроксилазные активности.

Относительная активность, % Актткость, нмсш. в мин на 1 мг белка

Рис. 1 Эффект цитохромэ Ь5 . на Рис. 2. Стимуляция гидроксилировання гилроксилирование прогестерона Р-450с21 в прогестерона АР: активность Р-450с17 (2) присутствии 5 моль АР на моль Р-450 (1). ив» Р-450с21 (3) в присутствии антител к отсутствие АР (2), а так же Р-450с17 в иитохрому Ь5 (2,6 мг/мг мнкросомального присутствии АР (3) и в ее отсутствие (4) белка); активность Р-450Ы7." (1) и Р-

450с21 (4) в присутствии такого же . количества ненммуннои сыворотки

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЦИТОХРОМА Р-450с21 ИЗ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ БЫКА.

Изучение молекулярного механизма действия стероидгидроксилазных систем, а также возможность их практического применения делают необходимой разработку

надежных методов вЦделення отдельных компонентов систем в гомогенном виде. В связи с отсутствием приемлемой процедуры выделения Р-450с21 целью этого этапа являлась разработка метода, позволяющего получать гомогенный препарат фермента с высокой каталитической активностью, не содержащий примеси других молекулярных форм Р-450.

Для выделения Р-450с21 использованы надпочечные железы крупного рогатого скота. Фракцию мембран эндоллазыатпческого ретикулума получали путем дифференциального центрифугирования, а затем солюбнлнзнровали мембранные белки холатом натрия. Последующая хроматография на колонке с холат-сефарозой обеспечивала значительную очистку белка (таблица 2). Р-450с2! начинал элюироваться с колонки только после добавления эмульгена 913 до 0.2%. При хроматографии на данном сорбенте Р-450с21 отделялся от липидов и основной массы сопутствующих белков, а также гем-содержэщих примесей.

Хромаюграфнп на аминогексил-агарозе позволяла отделить присутствующий в больших количествах в микросомах коры падпочечников белок флавопротеидной природы с максимумом поглощения в видимой области спектра при 450 им. В процессе промывания колонки ненонпым детергентом эмульгеном 913 данный флавопротеид элюировался, а Р-450с21 начинал десорбнроваться только после добавления ионного детергента холата №. lia заключительном этапе использовалась хроматография на гндроксиапатите, в основном, для удаления неионного детергента эмульген 913.

Таблица 2.

Очистка цитохрома Р-450с21 из микросом поры надпочечников быка

Стадия очистки Ьелок, Р-450, Р-450с21, Р-450с21, Степень Выход

м г нмоль нмоль нмоль на 1 мг белка ОЧИСТКИ %

Микросоыы 3285 540 247 0,075 1 100

Холаговый экстракт 1426 331 223 0,16 2,13 90

Холаг-сефароза 3,73 57,8 50,3 13,5 180 20,4

Аминшексил агароза 2,42 35,3 35,2 14,5 193,3 14,3

Гндрсжснапатнг 2,23 34,1 34 15,2 202,7 13,8

Полученный белок при электрофорезе в присутствии ОЭ-Ыа давал одну основную полосу с молекулярной массой 55 кДа и слабые по интенсивности дополнительные ньлыи при значительном увеличении нагрузки.

11 окисленном состоянии гемопротеид имеет максимумы поглощения при 358 им ( 8-нинла), 119 им (полоса Соре), 533 им (р - полоса), 568 им (а - полоса), характерные а ы ни..вин формы Карбонильный комплекс восстановленного Р-450с21

характеризуется интенсивным пиком поглощения при 450 нм. Таким образом, спектральные характеристики Р-450с21 из микросом надпочечников быка совпадают или близки литературным данным, полученным ранее (Когтнпат! е1. а1., 1980; Витриэ е(.а1., 1982). Добавление 17а-оксипрогестерона приводит к спектральным изменениям I типа с максимумом при 390 нм и минимумом при 420 нм.

Эксперименты по кнлетике гидрокснлирования 17о-окснпрогестерона и прогестерона 21-гидроксилазой проводили в присутствии МОРН-зависимой цитохром Р-450-редуктазы и ЫАОРМ. Гмдрокснлированне по 21-положению приводило к образованию 11-дезоксикортикостерона в случае использования в качестве субстрата прогестерона, и 11-дезокснкортизола при гидроксилировании 17а-оксипрогестерона, которые идентифицировались методом ВЭЖХ. Зависимость скорости 21-гндроксилазной активности от концентрации субстрата носит гиперболический характер; линеаризация в координатах Лайнуивера-Берка позволяет рассчитать кажущиеся значения Кш и каталитической константы Ушах, равные соответственно 1.29 мкМ и 18.5 мин'1 для 17а-окснпрогестерона и 2.73 мкМ и 9.65 мин'1 для прогестерона, соответственно. Значения Ушах приведены для 20-ти кратного избытка цитохром Р-450-редуктазы.

ПОЛУЧЕНИЕ И ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИТЕЛ К ЦИТОХРОМУ Р-450с21.

Принимая во внимание способность иммуноглобулинов специфически узнавать индивидуальные формы Р-450, иммунохиМическне методы часто используются для изучения молекулярной организации Р-450-зависимых монооксигеназ. Наша работа

■ • J

предполагала получение специфичных антител и исследование их аитиген-связывающих свойств, а также перекрестных реакций с родственными белками.

Для иммунохимнческой характеристики и идентификации Р-450с21 и его протеолитических фрагментов нами были получены антитела против высокоочнщенного белка. Специфичность антител проверяли методом двойной радиальной иммунодиффузин по Ухтерлони, на результатов которого следует, что антитела образуют интенсивную полосу преципитации только с Р-450с21 и не взаимодействуют ни с цитохромом Ь5,. ни с Р-4505СС. Для определения перекрестной реактивности полученной антисыворотки с другими гемопротеинами был использован более чувствительный метод дот-иммуноблоттннга. Результаты этого эксперимента указывают на то, что антитела против Р-450с21 обладают кросс-реактивностью с Р-450гсс так же, как антитела против Р-450$сс из митохондрий взаимодействуют с микросомальным Р-450с21, хотя и образуют значительно менее интенсивно окрашенные полосы.

Результаты иммунохимического анализа позволяют судить о наличии общих антигенных детерминант у Р-450с21 н Р-450зсс, несмотря на различную субстратную специфичность и локализацию в гормон-сннтезнрующнх клетках. Доля общих антигенных эгштопов, однако, невелика по сравнению со специфическими эпитопами, характерными для каждого белка в отдельности.

Специфичность полученных антител оценивалась также по их влиянию на каталитическую активность Р-450с21. Результаты, представленные на рис. 3, показывают, что специфичные иммуноглобулины ингибируют активность 21-

гндроксилазы в микросомах коры

1211

10) ^».

СхвосЕпелыиис мтазноотгь, Ч

N3

1.2

надпочечников на 90% при соотношении 1 мг анти-Р45Ос21-10О на 1 мг микросомального белка, в то время как неиммунной " сыворотки

кролика, так же, как и аити-Р450зсс-в соответствующих концентрациях, не оказывают заметного влияния на активность Р-450с21. Это

свидетельствует и пользу того, что микросомалышн Р-450с21, хотя и имеет сходные антигенные

детерминанты с митохопдриалышм Р-450зсс, однако связывание с ними анти-пе влияет на

0.2 0,4 0,6 0,8 1 иг Тдй/ш? ныхроо&шшхого бнлхя

Рис 3. Ферментативная активность 1М50с21 в Р450зсс-1ц0

иикросомах в присутствии 1цО из неиымушюй функциональные свойства фермента, сыворотки (1), анти [ЧЬСЪсс-^С (2), анги-Р-150с21- р 1

(3). За 100% принта активность Р-450с21 в Вопрос о том, па какой стадии

отсутствие .

происходит ингионрование анги-

1'45(1с21 1^0 21-гидрокснлазной активности, остается открытым и требует проведения

дальнейших исследовании.

ОГРАНИЧЕННЫЙ ПРОТЕОЛИЗ ЦИТОХРОМА Р-450с21.

Дли установления структурно-функциональных взаимосвязей и молекулярной ор|¿низании мембранных белков применяют непрямые подходы, такие как химическая модификация, направленный мутагенез, иимунохимнческнй анализ,' компьютерный анализ на основе сопоставления с известной структурой бактериалы го Р-450сат. (Лшпи и* эффективных подходов является также протеолнтнческий анализ. Ранее,

х

2

применение ограниченного протеолиза позволило установить доменную структуру митохондрналыюго Р-450бсс, который расщепляется трипсином с образованием Ы- и С-концевых фрагментов без потери ферментативной активности (СМазЬсЬш е1. а!., 1985). Данный подход использовался в сочетании с нммупохнмнческнм анализом для структурно-функциональной характеристики мнкросомального Р-450с21 и установления

на этой основе сходства и различий в молекулярной организации

мнтохондрнальных и мнкросомальных стерондогенных мопоокснгеназ.

При проведении трипсинолиза Р-450с21 в растворе образовывались два фрагмента с Мг 29 и 25 кДа (рис. 4). Мг фрагментов определяли по результатам 05-№-электрофореза. Как следует из рис. 4, Р-450с21 оказался более устойчив к трипсинолнзу, чем Р-4505СС, что указывает на меньшую доступность сайта трипсинолиза у микросомального Р-450.

При проведении ограниченного трипсинолиза Р-450с21 в микросомах образовывались аналогичные фрагменты, которые идентифицировались, после переноса на нитроцеллюлозу, с помощью специфичных антител. В процессе более продолжительного трипсинолиза образующиеся фрагменты подвергаются дальнейшему расщеплению, с образованием небольших пептидов, не определяемых методом нммуноблоттинга.

Для того, чтобы установить, насколько прочно связаны эти фрагменты Р-450с21 с липидной мембраной, мнкросомы после трипсинолиза обрабатывали раствором 500 мМ №01 и 500 мМ N32003, содержащим ' 5% 2-меркаптоэтанол, который удаляет все не связанные с мембраной белки. Однако данная процедура не приводит к переходу полипептидных фрагментов Р-450с21 в раствор, что говорит об их жестком связывании с микросомальпой мембраной.

Таким образом, результаты нашего исследования позволяют высказать предположение о присутствии связанных с мембраной участков не только в Ы-. но и в С-концевой области молекулы Р-450с21. Эти данные указывают на то, что молекулярная организация в мембране Р-450с21 и мнкросомальных Р-450 печени, по-видимому, существенно различается.

12 3 4 5 6 7 0

Мг, кДа

-45

- 25.7

- 17.2

- 11.7

Рис • 4. Электрофорез фрагментов, образующихся в результате ограниченного протеолиза Р-450зсс (1-4) и Р-450с21 (5-8) в растворе. Время трипсинолиза: 10 мин (2 и 6), 30 мни (3 и 7). СО мин (4 и 8)

Для предсказании наиболее вероятных фрагментов, образующихся при трнпсинолизе P-450c21, нами разработана компьютерная программа, аранжирующая сайты полипептидной цепи атакуемые трипсином по степени их гидрофильностн и относительной подвижности. D компьютерной программе использовались теоретические подходи, описанные ранее (Норр, 1989; Van Regenmortel, 1988). Как следует из результатов расчета (таблица 3), трипсинолиз Р-450с21 по положению 26G должен приводить к образованию фрагментов с молекулярными массами, соответствующими якснериментально полученным данным. Принимая во внимание высокий коэффициент гидрофильностн и относительной подвижности полипептидной цепи в области Arg266, этот участок с наибольшей вероятностью должен подвергаться трипсннолизу.

Таблица 3.

Компьютерный анализ вероятных участков расщепления полипептидной

цепи Р-150с21 трипсином.

№ Коэффициент Мол. масса фрагмента 1, Мол. масса фрагмента 2,

АМК ншрофилыюсти Да Да

Г86 1,91 20877 35030

266 1,53 30879 25028

321 1,20 37010 18897

181 1.10 • 20635 35273

406 1,10 46555 9352

337 1,06 38730 17177

152 1,06 17507 38400

76 1,01 8581 47323

Дли изучении влияния трнпсннолиза на спектральные н каталитические свойства Р-1Ь0с2| ыикросоми подвергались трипсннолизу, а затем анализировались на содержание Р 150 и спи«оСиость образовывать I тип спектрального ответа при добавлении с>6с1 ^аIа (Г/и-оксинрсиестерона). Р|1С- 5 следует, что ограниченный трипсинолиз сыцшьиждаеии переходом Р -150 в его неактивную форму с'максимумом поглощения в (.Оспемре при 420 им, и уменьшением амплитуды спектрального ответа при дьбаапсшы субирага Кроме тою, в результате трипсннолнза снижается и 21-Iндроксилааная акпшность Р 450с*21 как в реконструированной системе, так и в иньрны1м*.!М1и|| мембране, что хорошо коррелирует с долей расщепленного белка, и с ушнышииси лыплшуди специальных изменений при добавлении субст[ га.

Изменение спектральных характеристик Р-450с21 в результате трипсинолнза (переход в Р-420 и уменьшение амплитуды спектральных изменений при связывании

субстрата) может свидетельствовать о том, что расщепление полнпептидной цепи затрагивает непосредственно гем-связывающий участок белка, либо в целом изменяет его кокформацню таким образом, что пространственная организация гем-связывающего участка становится неблагоприятной для "правильной" ориентации гема. Такое нарушение структурной организации гем-связывающей области приводит к соответствующему снижению

ферментативной активности.

Таким образом, молекулярная организация мнкросомального Р-450с21

Длина вални. им

Рис. 5. Влияние ограниченного трипсинолнза па спектральные свойства 1М50с21 в мнкросомах. А -СО спсктр. Б - разностный спектр связывания субстрата (17а-оксипрогестероиа). 1 - до трипсинолнза, 2 • после триишюлиза.

из коры надпочечников имеет черты сходства как с мнтохондриальнымн Р-450 (более чем одни участок связывания с мембраной), так и с некоторыми мнкросомальными Р-450 из печени.

ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ II КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЦИТОХРОМА Р-450с21, ЭКСПРЕССИРОВАПНОГО В Escherichia coli.

Недостаточность по Р-450с21 приводит к ряду клинических симптомов, объединяемых под общим названием "врожденная гиперплазия надпочечников". Несмотря на то, что известны природные мутации, приводящие к развитию гиперплазии коры надпочечников, структурно-функционалышс изменения Р-450, вызываемые ими, до сих пор не изучены. Одной из причин этого является очень низкое содержание фермента в стерондогенных тканях и сложность его выделения из природных источников. Некоторые Р-450 были экспрессированы в Е. coli посредством модификации N-концевой области фермента, что значительно увеличивало уровень экспрессии н не сказывалось на их каталитических свойствах. Однако, до настоящего времени, не существует эффективной системы экспрессии Р-450с21 человека в Е. coli с последующей его очисткой до гомогенного состояния.

Значительный прогресс в гетерологической экспрессии некоторых форм Р-450 в Е. coli был достигнут благодаря использованию методического подхода, примененного Barnes H.J..11 др., заключающегося в изменении N-концевой последовательности кДНК, кодирующей Р-450Ы7 Marnes et. al, 1991). Поскольку считается, что гндрофобность N-концевой области микросомальпых Р-450 является принципиальной для правильного встраивания фермента в лнпидную мембрану, была предпринята попытка оптимизировать условия экспрессии Р-450с21 без значительной модификации этого фрагмента Р-450. С этой целью заменены первые 8 кодонов кДНК Р-450с21 на мутированную, согласно Barnes H.J. 11 др., последовательность Р-450с17. Результатом этого явилась плазннда pTacTacC21-17mod, несущая 5 мутации в N-концевой последовательности Р-450с2|. Принимая во внимание довольно существенные изменения в аминокислотной последовательности Р-450с21, била сконструирована

А

"Дихии" тип ATG CTG СТС CTG GGC CTG CTG CTG ...

Met Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu ...

pTacC21mo<l ATG СТА СТА СТА GGA CTG CTG CTG___

Met Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu ...

pTacTacC21- ATG GCÎ СТС TTA ТТЛ GCA GTT TTT ...

17motl Met Ala Leu Leu Leu Ala Val Pho ...

pTucTacC21- ATG G CT CTC TTA ТТЛ TTA ТТЛ ТТЛ ...

21 mod Me t Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu . .

Б

pTacTacC21 - ---CAG CAT CAT CAT CAT TGA TCT AGA..

21niodHis ...Gin His Hio His His Cxon. ..

Рис. б. Модифицированные нуклеотидная и аминокислотная последовательности Р-450с21 человека в N-концевой (Л) и С-концевой области (Б). Введенные мутации показаны "жирным" шрифтом, замененные аминокислоты подчеркнуты.

другая плазмнда pTacTacC21-21mod, несущая кДНК Р-450с21 с модифицированной N-концевой последовательностью, которая, однако, кодировала Р-450с21 только с двумя аминокислотными заменами (рис. б). В плазмнде рТасТасС21-21 modi Iis полннуклеотндная последовательность гена Р-450с21 была модифицирована также путем присоединения кластера из 4-х гистидинов к С-концевой области фермента с целью упрощения процедуры выделения и очистки экспрессированного белка при помощи металло-аффннной хроматографии. Все конструкции были экспрессированы в Н. coli линии JMI09. Эффективность экспрессии была определена нммуноблоттингом и по 21-гидрокснлазной активности in vivo. После выделения бактериальных мембран уровень экспрессии Р-450с21 определялся из дифференциальных спектров,

наблюдаемых при титровании 17а-оксипрогестероном и равнялся 40-50 нмоль на 1 л культуры.

Очистка микросомалышх Р-450 представляет собой довольно длительный и сложный процесс, включающий ряд хроматографий и характеризуются очень низким выходом фермента. Предложенная нами схема выделения высокоочищенного Р-450с21, экспресснрованного в Е. coli, позволяет получать в достаточно большом количестве (510 нмоль) гомогенный белок в течение 1 дня с 30-40 % выходом.

Процесс выделения и очистки рекомбинантного Р-450с21 включает две стадии. IIa первой из'них мембранные белки солюбнлизируются ненонным детергентом эмулыен 913, что приводит к частичной очистке Р-450с21. Вторая, самая эффектньная, стадия представляет собой металло-аффшшую хроматографию, разработанную на основе хелатировання ионов металлов аминокислотными остатками гнстнднна. Как видно из таблицы 4, степень очистки при использовании этого сорбента увеличивается в 260 раз, при 33% выходе.

Таблица /1

Очистка Р-450с21 человека экспрссснроааиного а Ii. coli.

Стадия очистки Белок, мг Р450с21, нмоль Р450с21 нмоль на 1 мг белка Степень очистки Выход, %

Бактерии 440 15,7 0,036 1 ИХ)

Солюбилнзат 96,7 8,8 0,91 2,53 56

UMAX 5,5 5,22 ' 9,5 263,9 33,3

Высокоочищенчий Р-450с21 мигрирует п полнакриламидном геле в присутствии 0.1 % DS-Na одной полосой. Путем сравнения его электрофоретнческой подвижности с подвижностью маркерных белков была определена молекулярная масса Р-450с21, которая равнялась 54 кДа.

Абсолютные спектры очищенного Р-450с21 приведены [¡а рис. 7. Окисленная, ннэкостшовая форма Р-1Б0с21 имела в абсолютном спектре максимумы при 422 им (полоса Соре), 360 им ( 6- полоса), 540 им (р -полоса) и плечо при 570 им (а -полоса). Добавление NajSjO-i приводило к восстановлению P-15Q, сопровождаемому сдвигом максимума в области полосы Соре на 412 им, а в области |5 - и а - полосы - на 536 и 555 им, соответственно. Пропускание СО через раствор восстановленного Р-450 приводило к типичному сдвигу максимума поглощения на 450 нм с незначительным плечом при 420 нм, что указывает на отсутствие неактивной формы Р-420.

При добавлении субстратов к Р-450с21 наблюдался спектральный ответ I типа, с изобестическои точкой при 407 нм для 17а-оксипрогестерона и при 412 нм для

прогестерона. Эти субстрат-индуцированные спектры использовались при определении Kd для каждого субстрата путем преобразования в обратные координаты зависимости разности поглощения при 390 и '120 им от концентрации субстрата. Константы диссоциации для прогестерона и 17а-окснпрогестерона равнялись 14,73 мкМ и 31,1 мкМ, соответственно»

Очищенный Р-450с21 обладает 21-гидрокснлаэной активность при добавлении в реакционную смесь NADPH-цитохром P-450-редуктазы, субстрата и NADPH-

регенернрующей системы. Для того, чтобы установить влияние модификаций N- и С-концевых последовательностей на

ферментативную активность

экспрессированного Р-450с21, мы определили значения Km к Vmax

V4l «Ш 4W .4« !ИО АШ № - ИИ „ „ ,

дпши kviiim. im для дикого типа фермента

Рис. 7. Абсолютные спектры очищенного P-450c2l, (pTacC21mod) н для его экспрессированного в Е. coli. 1 ■ нмэкоспиновая,

окисленная форма: 2 • высокоспиновая окисленная мутированных форм Как видно из

форма; 3 • днтионит-восстаиовлеиная форма; 4 - СО- _„* . с . м

11 . . г г ■ таблицы 5, мутации как N-концевои

комплекс восстановленной формы. ' ' }

(pTacTacC21-21mod), так и С-концевой последовательностей (pTacTacC21-2lmodH¡s) не приводят к значительным изменениям в значениях'Km и Vmax.

Таблица 5

Кинетические параметры Р-450с21 дикого типа н его мутантных форм в мембранах Е. coli.

Экспрессирущая плазмида 17а-оксипрЬгестерон Прогестерон

Km*, мкМ Vmax, мин 1 Km, мкМ Vmax, мин'1

pTacC2lmod pTacTacC21-2lmod рТасТзсС21 -21 modl lis 0.7510,29 0.81Ю.32 .0.910,36 51,210,1 74.114,9 53,510,5 0,1310.01 0,1810,11 0,1910,14 32.9Ю.5 45,411,8 33,011,5

* Значения представляются средним арифметическим трех определений со

стандартным отклонением.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что дополнительные четыре остатка гистидина, введенные в С-концевую область Р-450с21, не влияют на функциональные проявления фермента и, при экспонированности наружу, не мешают взаимодействию пи с редуктазой, ни со стероидной молекулой. В то же время использование этих гистиднновых остатков позволяет достаточно быстро (в течение 10 ч) очистить фермент до гомогенного состояния с помощью металло-аффишюй хроматографии. Такой подход может оказаться полезным как для выделения других Р-450, так и для очистки и последующего анализа их мутиросанпых форм.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что адренодоксииредуктаза, митохондриальный электроитранспортиый белок, оказывает стимулирующее влияние на 17а- и 21-гидроксилазные активности микросом коры надпочечников быка. Эффект алреиодокспнредуктазы сходен со стимулирующим влиянием микросомальной NADPH-завнсиыой цитохром P-450-редуктазы.

2. Установлено, что цитохром bs иигибирует 17а- и 21-пщроксилазные активности микросом надпочечников быка. Добавление адренодоксинредуктазы приводит к уменьшению ингнбнрующего эффекта цитохрома bs.

3. Разработана эффективная процедура выделения и очистки цитохрома Р-450с21 из надпочечников быка. Для гомогенного белка определены молекулярная масса мономерной формы, удельное содержание гема, ряд спектральных и каталитических характеристик с использованием основных субстратов 21-гидроксилироваиия.

4. Получены антитела специфичные к цитохрому Р-450с21 быка ингибирующие 21-гидроксилазную активность фермента на 00%. Полученные антитела использованы для определения протеолитических фрагментов 21-гидроксилазы в микросомальной мембране, а также исследована их способность взаимодействовать с другими компонентами моноокснгеназных систем.

5. Показано, что ограниченный трнпсинолиз цитохрома Р-450с21 п растворе приводит к образованию двух полипептндних'фрагментоа с молекулярной массой 25 и 29 кДа, которые соответствуют N- н С-концевыи областям белк. ■ На основании результатов ограниченного трипсинолиза мембранно-связанной формы фермента предложена модель молекулярной организации 21-гндрокснлазы в липидной мембране.

0. Осуществлена гетерологнческая экспрессия цитохрома Р-450с21 человека в клетках бактерий Е. coli, и разработан метод его очистки до гомогенного

состояния с помощью металло-аффнннон хроматографии. 7. В результате детальной физико-химической н спектральной характеристики очищенного цнтохпома Р-450с21 определены кинетические константы его модифицированных форм, сделан вывод о том, что модификация Ы-концевой области 21-гндрокснлазы и включение 4-х дополнительных остатков гистидина в С-концевую последовательность не ока~ь°вает влияния на каталитические характеристики фермента.

1. Guzov V.M., Zelko IN., Chernogolov A.A.. Usanov S.A. "Catalytic and immunochemical features of mitochondria! and microsomal monooxygenase systems ol the steroid oxidation." - In: 7-th Int. Conf. on Cytochrome P-450, Moscow. -1991. -P. 67.

2. Guzov V.M.. Zelko I.N., Chernogolov A.A., Usanov S.A. "The effect of adrenodoxin reductase on the steroid hydroxylation in adrenocortical microsomes." In: 9-th International Symposium on microsomes and drug oxidation. Jerusalem, Israel, -1992. -P. 195.

3. Guzov V.M., Zelko I.N., Chernogolov A.A., Usanov S.A. "Catalytic and immunochemical features of mitochondrial and microsomal monooxygenase systems of the steroid oxidation." - In: Proceeding of the 7-th Int. Conf. on Cytochrome P450, Moscow.-1992.-P. 285-287.

4. Guzov V.M.. Zelko I.N., Chernogolov A.A., Usanov S.A. "The effect ol adrenodoxin reductase on the steroid hydroxylation in adrenocortical microsomes." - J. Basic and Clinical Physiol, and Pharmac.. -1992. Vol. 3. -P. 200.

5. Zelko I.N., Bylinskaya S.A., Usanov S.A. "Limited trypsinolysis of cytochrome P450c21 from adrenal cortex microsomes." In: 8th Int. Conf. on Cyt. P450, Portugal. -1993. -P. 186.

6 Гузов B.M., Зелько H.H., Черноголов A.A . Усанов C A. Взаимоотношения микросомальных и мнтохондриальных стероидгидроксилирующнх систем коры надпочечников быка: влияние высокоочищенных компонентов митохондриальной монооксигеназной системы на гндроксилированне стероидов микросомамн // Биохимия. - 1993. - Т. 58. N. 11. -С. 1761-1770.

7. Гузов В.М., Зелько H.H., Былннская С.А., Усанов CA. Структурно-функциональная характеристика цитохрома Р-450с21. Иммунохимические подходы н ограниченный трипсинолиз. / / Биохимия, 1994. Т 59. N 8 -С 11-49

17

РЕЗЮМЕ

Зелько Игорь Николаевич. Молекулярная организация н структурно-функциональная характеристика природного н рекомбииантного цитохрома Р-'150с21.

Ключепие слова: цитохром Р-450с21, стероиды, адренодоксинредуктаза. антитела, ограниченный трипсинолиз, очистка, экспрессия в Escherichia coli, металло-зффинная хроматография.

Изучена молекулярная организация цитохрома Р-450с21 (Р-150с21) в растворе и п составе липидной мембраны, а также установлены структурмо-функциоиальмью взаимоотношения между отдельными компонентами мнтохондриальной к микросомальной монооксигеназных систем.

При выполнении работы ' использовались спектрофотометрическне, электрофоретнческие, хроматографические и молекулярно-биологическне методы исследования.

Обнаружено, что адренодоксинредуктаза (АД) стимулирует как 21-, так и 17а-стероидгидроксилазную активности микросом кори надпочечников, не менее эффективно, чем NADPH-зависнмая цитохром P-450-редуктазз. С помощью цитохрома bs и антител к данному белку изучены возможные механизмы стимулирующего эффекта АД.

Выполнено сравнительное исследование молекулярной организации мнкросомального Р-450с21 и митохондриального P-450scc из коры надпочечников с помощью шлмунохнмнческих подходов и ограниченного протеолиза. Разработан эффективный метод выделения и очистки Р-450с21, а также получены и охарактеризованы антитела против гемопротенна. Установлено, что ограниченный трипсинолиз Р-450с21 в микросомальной мембране приводит к образованию двух фрагментов, жестко связанных с мембраной.

Ферментативно активный Р-450с2! человека был экспрессирован в Escherichia coli н очищен до гомогенного состояния. С целью увеличения уровня экспрессии, осуществлены замены в N-концевой области белка и введены четыре гнетидиновых кодона - для эффективной и быстрой очистки фермента с помощью метэлло-аффнннон хроматографии,.

Установленные структурно-функциональные взаимоотношения в ряду Р-150-зависнмых монооксигеназ дополняют существующие представления о действии. стероидгидроксилирующнх систем и могут быть использованы при создании биокаталнзаторов для получения стероидных гормонов и их аналогов.

РЭЗЮМЭ

Зяльно Irap Л1|"аласв!<1. Малекулярная аргашзацыя i структурпа-функцыяпальнаи характеристика прыродиага и рэкамбшантнага цытахрома Р-450с21.

Ключавын словы: цытахром Р-450с21, стэрощы, адрэнадаксшрэдуктаза, антыцелы, обмежаваны трыпсшолЬ, ачыстка, экспрэсст у Escherichia coli, метала-афшная храматаграфм.

Даследавана малекулярная аргашзацыя цытахрома Р-450с21 (Р-450с21) у раствори i у складзе лшщнай мембраны, а таксама установлены структурна-функцыянальныя уэаемаадносшы пакпж асобним! кампанентам! м1тахандрыяльнай i мжрасамальнан монаакагеназных астэм. S

Пры выканашп работы ужывалкя спектрафатаметрычныя, электрафарэтычныя, храматаграф!чныя i малекулярна-бшлапчныя метады даследвання.

Знойдзена, што адрэнадаксшрэдуктаза (ЛД) стымулфуе як 21- так i 17а-пдракалазную актыунасш мжрасом кары иаднырачшкау быка не меньш эфекты^на, чым NADPH-залежная цытахром P-450-рэдуктаза. 3 дапамогай цытахрома bs i антыцел да гэтага бялка вивучаны магчымыя механизмы стымул1руючага эфекта АД.

Зроблена параУнальнае даследванне малекулярнай аргашзацьн мжра£амальнага Р-450c2l i м^тахандрыяльнага P-450scc з кары надиырачшкау з дапамогай ¡муиахинчиих падыходау i абмежавапага пратэол1зу. Распрацаваны эфектыуны метад иыдзялепня i ачыстк1 Р-450с21, а таксама атрыманы i ахарактарызаваны антыцелы супраць гемапратэшу. Абмежаваны трыпсшол|'з Р-450с21 у мшрасамальнай мембране пядзе да утварзння двух фрагменгау, якш жорстка звязаны з мембранай.

Ферментатыунз актыуны Р-450с21 чалавека быу экспрэсфаваны у Escherichia coli i ачыщаны да гамагсннага стану. 3 мэтай павял1чэння узроуня экспрэсп, зроблены замены у N-канцавой вобласш бплку i уведзены чатыры пстыдынавых кадона - для эфектыунай i хуткай ачыстк! ферменту з дапамогай метала-афпшай храматаграфн.

Устаноуленыя структурна-функцыянальныя узаемаадносшы у шэрагу Р-450-залежных монаашгеназ дапауняюць ¡снуючыя уяуленш аб . дзеяшп стэроипдраксшруючых астэм i могуць бынь выкарысто^ваны пры стварэшп б1якатал|°затарау з мэтай атрынання стэрощних гармонау i ix аналагау.

SUMMARY

Zelko Igor Nikolaevicli. The molecular organization and structure-function characterization of natural and recombinant cytochromc P- t50c21

Key words: cytochrome P450c2l, steroids, adrenodoxin reductase, antibody, limited trypsinolysis, purification, expression in Escherichia coli, metal-affinity chromatography.

The molecular organization of cytochrome P-450c21(P-450c21) in solution and in the phospholipid membrane was Investigated. The structure-function relationships between components mitochondrial and microsomal monooxygenase systems were studied.

The spectral methods, electrophoresis, chromatography and methods of molecular biology were used.

It was detected tiiat adrenodoxin reductase (AR) stimulates both 21- and 17a-sterolii-hydroxylating activities of microsomes in the adrenal cortex, no less effective than NADPli-dependent cytochrome P-450-reductase. The possible mechanisms of stimulating effcct ol AR was investigated using cytochrome bs and specific antibody.

A comparative study on molecular organization of microsomal cytochrome P450c2l and mitochondrial P450scc from adrenal cortex has been performed using Immunochemical approaches and limited proteolysis. An efficient method to isolate and purify cytochrome P450c21 has been developed and the antibodies against the hemeprotein have been raised and characterized. Limited trypsinolysis of cytochrome P450c21 leads to the formation of two fragments which are tightly bound to microsomal membrane.

The active human P-450c21 was expressed in Escherichia coli and purified to an apparent homogeneity state. To increase the expression level, N-termlnal region of protein was altered and four codons coding hlstidine were introduced for effective and fast enzyme purification using metal-affinity chromatography.

The discovered structure-functional relationships in a number of P-150-related monooxygenases give new knowledge on the action of sterold-hydroxylating systems which may be used for development of the effective biocatalysts for synthesis of steroid hormones and Its analogies.

Подписано п г.ечато /.12.95. Формат ¿0x84,1/16.

Бумага типографская 1Я Печать Офсетная

Усл.печ.л..1,25 Учет.изд.л. 1,16

Тира:к 65 Зак ЮЗ Бесплатно.

Отпечатано па ротапринте Ал ?.э. ¿20601. !,'.;шск, ул. Сурганова, 15