Нуклеоаминокислоты и нуклеопептиды: дизайн ферментоустойчивых аналогов нейропептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

""

цт*®

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

КОРШУНОВА ГАЛИНА АНАТОЛЬЕВНА

НУКЛЕОАМИНОКИСЛОТЫ И НУКЛЕОПЕПТИДЧ: ДИЗАЙН ФЕРМЕНТОУСТОИЧИВЫХ АНАЛОГОВ НЕТ ПЕПТИДОВ

(02.00.10 - биоорганическая хими химия природных и физиологически активы. ь ¿еществ)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора химических наук в форме научного доклада

МОСКВА - 1993

( !

^У

Работа выполнена в лаборатории химии белка и аминокислот Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ

Научный консультант: доктор химических наук, профессор Ю.П.Швачкин

Официальные оппоненты: чл.-корр. РАН, профессор Р.П.Евстигнеева

доктор химических наук, профессор Э.И.Будовский

доктор химических наук, профессор В.А.Шибнев

Ведущая организация - Институт биоорганической химии

им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится "9 "марта 1993 г.в 16 час на заседании Специализированного совета Д.053.05.76 в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу :П9899,ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", ауд.501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Диссертация разослана "9"февраля 1993 года

Ученый секретарь Специализированного совета

И.Г.Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди непротеиногенных аминокислот особое место занимают различные нуклеоаминокислоты, сочетающие в себе структурные элементы двух важнейших классов биополимеров -белков и нуклеиновых кислот.

В настоящей работе под этим термином подразумеваются а-аминокарбоновые кислоты, несущие в боковой цепи пиримидиновое или пуриновое нуклеиновое основание, присоединенное к аминокислотному фрагменту по атому яг(пиримидин) и Ng (пурин). На рис.1.показаны некоторые представители нуклеоаминокислот, а именно, 3-(урацилил-1)аланин (1, иэх), 3-(тиминил-1)аланин (2, Tai) и 3-(аденинил-9)алашш (з, Aal).

Рис.1

NHa

I

Ос*

1 1 1

сн, сна сн,

I I I

иам-сн-соон н,№-а+-сосн Н2Ы-СН-СССН

(1) (2) (3)

Пептида, в состав которых входят нуклеоаминокислоты, получили название нуклеопептидов.

Нуклеопептида можно разделить на 3 . основных типа: I) гомонуклеопептиды (построенные из остатков одной и той же нуклеоаминокислоты); 2) гетеронуклеопептидо (построенные из остатков различных нуклеоаминокислот); 3) нуклеопептида смешанного типа, содержащие наряду с остатками нуклеоаминокислот, остатки других, в частности белковых аминокислот.

Гомо- и гетеронуклеопептиды можно рассматривать как аналоги олигонуклеотидов, в которых сахарофосфатный остов заменен на пептидную цепь, что делает их неуязвимыми для ферментов нуклеинового обмена. Обладая всеми необходимыми структурными элементами для

участия в комплементарных взаимодействиях, эти соединения могут найти широкое применение в молекулярной биологии для регуляции экспрессии генов.

Предметом данного исследования являются , главным образом, яуклеопептиды смешанного типа, а именно, аналоги природных пептидов, содержащие в своем составе остатки нуклеоаминокислот.

Интерес к аналогам биологически активных пептидов особенно возрос в связи с обнаружением в 70-х годах нового класса природных биорегуляторов - нейропептидов.т.е. пептидов, влияющих на центральную нервную систему. Эти вещества, действующие высокоспецифично и в низких концентрациях, оказались весьма перспективными прототипами для целенаправленного создания лекарственных средств. Дело в том, что эндогенные нейропептида имеют ряд недостатков, в частности таких, как быстрая деградация под действием протеаз организма, а также, в некоторых случаях, широкий спектр биологических эффектов. Поэтому актуальной задачей является создание фермен-тостабильных аналогов нейропептидов, обладаадих селективностью действия и высокой биологической активностью.

Объектами данного исследования явились такие нейропептида, как киоторфнн, энкефалины, дерморфин (т) и дельторфин, проявляющие опиоиднув активность,гистидинсодержащие пептиды карнозин и циклогистидилпролин (ЦГП), обладающие антиоксидантной активностью, а также С-концевые фрагменты желудочно-кишечного гормона гастри-на.

Для синтеза ферментоустойчивых аналогов нейропептидов использован подход, основанный на замене определенных аминокислотных остатков природного биорегулятора остатками непротеиногенных аминокислот.

В настоящее время насчитывается несколько сотен небелковых аминокислот, природного или синтетического происхождения,которые широко используются в мировой практике с целью создания аналогов эндогенных пептидов. Введение в структуру пептида остатков небелковых аминокислот преследует также такие цели, как улучшение ли-ганд-рецепторного связывания за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий, формирование биологически активной конфор-мации, улучшение фармакокинетических свойств аналога, влияние на его транспорт, метаболизм и другие. Использование описанного под-

хода при синтезе аналогов приводит во многих случаях к соединениям с высокой биологической активностью.

Хотя нуклеоаминокислоты ранее не применялись в пептидном синтезе, они имеют ряд преимуществ перед другими непротеиногенными аминокислотами. Во-первых, это гибридные молекулы с уникальной структурой, сочетающие в себе структурные фрагменты белков и нуклеиновых кислот. Во-вторых, нуклеоаминокислоты и родственные им соединения широко распространены в природе, в том числе в составе пептидов, что делает их особенно привлекательными для модификации эндогенных нейропептидов. В-третьих, нуклеоаминокислоты являются нетоксичными веществами, продукты метаболизма нуклеопептидов также нетоксичны, что имеет решающее значение для потенциальных лекарственных средств. Кроме того, нуклеоаминокислоты и их проиводные обладают рядом интересных биологических свойств.

В структурном отношении нуклеиновое основание, выступающее в роли бокового радикала аминокислоты, способно благоприятно влиять на связывание с рецептором, на формирование биологически активной конформации за счет гидрофобных и электронных факторов, за счет наличия дополнительных донорно-акцепторных центров гетероаромати-ческого цикла.

Все вышеуказанное делает нуклеоаминокислоты довольно перспективными структурами для целенаправленного конструирования аналогов олигонуклеотидов и пептидов, необходимых для фундаментальных и прикладных исследований.

Цель работы. Целью настоящей работы является препаративное получение оптически активных нуклеоаминокислот и разработка оптимальных методов синтеза и анализа нуклеопептидов; дизайн и синтез неизвестных ранее ферментостабильных аналогов нейропептидов, содержащих остатки непротеиногеншх аминокислот, в частности нуклеоаминокислот; изучение структурно-функциональных отношений в ряду этих соединений, а также поиск высокоактивных и селективных аго-нистов и антагонистов, представляющих интерес в качестве потенциальных лекарственных средств.

Научная новизна работа. В диссертационной работе впервые разработан метод препаративного разделения рацемических нуклеоаминокислот на оптические антиподы. Метод основан на стереоизбиратель-ном ферментативном расщеплении фенацетильных производных

DL-нуклеоашнокислот под действием пенициллинамидазы из Е.сои. Предложен эффективный метод одновременного определения абсолютной конфигурации и количественного содержания стереоизомеров нуклеоаминокислот .Разработаны методики нуклеопептидного синтеза в растворе, на твердом носителе, а также с использованием ферментов. Впервые осуществлен химический синтез природных нуклеопептидов, выделенных из Fagus siivatica L., а также их аналогов, содержащих остатки тиминил- и аденинилаланинов. Получен новый класс аналогов нейропептидов - киоторфина, энкефалинов, дерморфина, дельторфина, циклогистидилпролина, каряозинз и фрагмента гастрина, устойчивость которых к пептидазам обеспечивается введением в структуру пептидов остатков непротеиногенных нуклеоаминокислот. Исследована их биологическая активность в тестах in vitro и in vivo. Синтезированы нуклеопептиды, обладающие высокой селективностью в отношении опиоидных рецепторов, а также сильным анальгетическим действием. Показано, что ряд аналогов циклогистидилпролина и кзрнозина проявляют высокую антиоксидантную активность, причем для циклогистидилпролина эта активность обнаружена впервые. Получены аналоги фрагмента гастрина, проявляющие свойства антагонистов природного гормона.

Практическая ценность работы. Результаты настоящего исследования имеют общий характер и могут быть использованы в исследованиях по синтезу пептидных биорегуляторов и их аналогов, а также при изучении закономерностей связи между структурой и функцией в ряду этих соединений. Предложенный в работе метод разделения рацематов нуклеоаминокислот на оптические антиподы с применением пени-циллинамидазы из E.coii может быть рекомендован в качестве препаративного метода получения стереоизомеров различных нуклеоаминокислот и родственных соединений. Использованный в работе метод определения абсолютной конфигурации и количественного содержания энан-тиомеров нуклеоаминокислот в реакционных смесях может быть применен также для определения скорости и стереоспецифичности ферментативного гидролиза N-ацилированных производных белковых аминокислот. Использование нуклеоаминокислотных остатков для модификации пептидов с целью повышения их ферментостабильности является достаточно общим и перспективным подходом в решении подобных проблем. Результаты биологических испытаний позволяют рассматри-

взть ряд соединений в качестве потенциальных лекарственных препаратов .

Апробация работа. О результатах настоящей работы сообщалось на ряде всесоюзных и международных симпозиумов: XI Менделеевском с'езде ( Алма-Ата, 1975 ), iv Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов ( Минск, 1977 ), i Всесоюзной конференции по химии нуклеозидов и нуклеотидов ( Рига, 1978 ), v Советско-индийском симпозиуме по химии природных соединений ( Ереван, 1978), ш СССР-ФРГ симпозиуме по химии пептидов и белков ( Махачкала, 1980), v Всесоюзном симпозиуме по химии и физике белков и пептидов (Баку, 1980), Всесоюзном совещании "Аминокислоты для сельского хозяйства, пищевой промышленности, здравоохранения и научных исследований" (Фрунзе, 1981 ), Всесоюзном симпозиуме "Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов" (Рига,1982 ), vix Советско-индийском симпозиуме по химии природных соединений ( Тбилиси , 1983 ), vi Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов ( Рига, 1983 ), иг Всесоюзном совещании по аминокислотам ( Ереван, Г984 ), i Всесоюзной конференции по нейропеп-тидам ( Томск, 1985 ), v Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзи-мологии ( Олайне, 1985 ), vn Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов ( Таллинн, 1987 .), iv с'езде физиологов Узбекистана ( Ташкент, 1988 ), Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов ( Рига, 1990 ).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТУ I. Синтез оптически активных нуклеоаминокислот и их производных

Синтез рацемических нуклеоаминокислот - 3-(урацилил-1)аланина (1), 3-(тиминил-1)алашша (2) и 3-(аденинил-9)аланина (з) был осуществлен с помощью методов, предусматривающих введение соответствующих заместителей в пиримидиновое или пуриновое кольцо. Схема синтеза, которая является общей для нуклеоаминокислот i-з, представлена ниже на примере получения 3-(урацилил-1)аланина.

Для синтеза нукяеопептидов необходимо было иметь в распоряжении оптически активные нуклеоаминокислоты (иаа).

В литературе не было описано препаративного метода получения

оптически активных нуклеоаминокислот. В связи с этим наш была предпринята попытка разработки такого метода с помощью ферментативного гидролиза соответствующих субстратов.

Схема I

ВгСНдСНС OEL н Н*/ НаО

KaCOa,OMF

I

СНа-СНСОЕ1Эа

о

1-NHuCI /ННиОН/KCN

г.н*/нао

I I

сна-сно сна

I

HaN—СВ—CQOH

Б качестве ферментов были использованы химотрипсин, ацилаза из почек свиньи, растительная ацилаза из Aspergillus oryzae и пе-нициллинамидаза из е.coli .

Для этой цели были синтезированы соответствующие производные рацемических нуклеоаминокислот, которые служили субстратами для ферментативного гидролиза. В таблице I приведены структуры синтезированных соединений и некоторые сведения об этих производных.

В случае использования химотрипсина было показано, что наряду со стереоспецифическим ферментативным гидролизом сложнозфирной связи, протекают также реакции неспецифического гидролиза сложных эфиров. Таким образом, практическая ценность этого метода, особенно при работе в препаративном масштабе, оказалась сниженной.

Значительно лучше результаты были получены при использовании для ферментативного гидролиза растительной ацилазы из Aspergillus orysae. Этот метод позволил нам впервые с хорошими выходами и в препаративных количествах получить ь- и D-нуклеоаминокислоты.

Сведения о константах полученных оптически активных нуклео-аминокислог приведены в таблице 2.

Таблица I

Некоторые производные рацемических нуклеоаминокислот

Соединение Т.пл.,°с, ( разл.) в системе: Выход,%

I 2 3 4

Н-иа1-ОМе-НС1 4) 206 0,25 0,07 55

Н-иа1-0Е1:-НС1 5) 201 0,52 0,10 68

Н—Та1-ОМе■НСI б) 0,31 -

Н—Та1-ОЕ t•НСI 7) - 0,12 -

Н-иа1-ЫН'2-ТРА 8) 126-129 0,45 0,46 88

Н-Та1-ЫН2-ТРА 9) 137 0,42 0,47 76

Н-Аа1-ЫН2-ТРА ю) 240 0,62 0,23 80

Н-Аа1-ОМе•2НС1 11) 178 0,47 0,06 76

Н-Аа1-ОЕ^2нс1 12) 161 0,55 0,10 72

Ас-Оа1-ОН 13) 227-229 0,45 0,50 94

Ас-Та1-ОН 14) 255-257 0,55 0,55 66

Ас-Аа1—ОН 15) 236-238 0,60 0,35 65

Ас-иа1-0Ме 16) 219-220 0,60 0,80 90

Ас-Та1-0Ме 17) 220-222 0,65 0,90 82

Ас-Аа1-ОМе 18) 190-191 0,65 0,90 71

Р11ас~иа1-ОН 19) 212 0,58 0,84 78

Р11ас-Та1-ОН 20) 219 0,60 0,87 72

РЪас-АаХ-ОН 21) 228 0,63 0,61 80

Вос-иа1-ОМе 22) 186 0,76 0,55 70

Вос-Аа1-ОМе 23) 178 0,76 0,50 60

*

Здесь и далее ТСХ на пластинках "зи1и£о1";состав хроматогра-фических систем: изопропиловый спирт-25$-ный раствор аммиака-вода, 14:1:5(система I), изопропиловый спирт-вода, 7:3(система 2), хло-рофэрм-25%-ный раствор аммиака-метанол, 2:1:2 (система 3), н-бутанол-вода-уксусная кислота, 4.:5:1 (система 4).

Таблица 2

Характеристики оптических изомеров нуклеоаминокислот

Соединение

Т.Ш1.,°С

(разл.)

[«1

20

(cl.0; IH.HCI)

Спектры УФ в воде

-1 -1 М 'см

-1 -1

М 'см

H-L-Ual-OH H-D-üal-OH H-L-Tal-OH H-D-Tal-OH H-L-Aal-OH H-D-Aal-OH

197-199 197-199 224-225 224-225 250-252 250-252

-23 +23 -15 +15 -14 +14

262 262 267 267 260 260

10400 10400 9100 9100 I4I00 14100

229 229 236 236 225 225

£

По всем характеристикам, кроме знака оптического вращения, ь-изомеры полностью идентичны D-изомерам.

Выходы антиподов аденинилаланина были однако значительно ниже, чем для аминокислот пиримидинового ряда. Кроме того, при работе с растительной ацилазой не всегда удавалось получать воспроизводимые результаты, т. к. препараты фермента, приобретенные из разных источников, сильно различались по активности, степени очистки и другим характеристикам.

Наиболее перспективным ферментом для разделения рацематов нуклеоаминокислот оказалась пенициллинамидаза из Е.coli(РА). Этот фермент обладает высокой специфичностью к N-фенацетильному остатку аминокислоты, поэтому в качестве субстратов наш были получены фенацетильные производные нуклеоаминокислот ( 19-21, табл.1).

Реакция протекала при действии хлорангидрида фенилуксусной кислоты на нуклеоаминокислоту в присутствии триэтиламина в водно-даоксановой среде, как показано на примере тиминилаланина на схеме 2.

Под действием фермента фенацетильное производное нуклеоаминокислоты претерпевает стереоспецифическое .расщепление амидной связи; в результате образуется ь-тиминилаланин и

фенацетшыэ-тиминилаланин, которые могут быть легко разделены благодаря их различной растворимости. Дальнейший кислотный гидролиз фенацешл-в-амшюкислоти приводит к получению о-антипода.

Схема 2

С помощью этого метода нам удалось с хорошими выходами и в препаративных количествах получить изомеры всех нуклеоаминокислот, совпадающие по своим свойствам с ранее выделенными антиподами (см. табл.2). Для получения максимального выхода ь-изомеров мы подвергали фзнацетил-о-нуклеоаминокислоту рацемизации в присутствии уксусного ангидрида и образовавшийся рацемат вторично расщепляли на антиподы с помощью пенидаллинамидазы.

Разработанный нами препаративный метод■ разделения имеет ряд достоинств. Он быстр и прост в обращении, пенициллинамидаза обладает широкой субстратной специфичностью и высокой стереоспецифич-ностыо. Метод одинаково хорошо подходит для нуклеоаминокислот пи-римидинового и пу'ринового рядов.

Для контроля стереоспецифичности ферментативного расщепления производных рацемических нуклеоаминокислот наш был предложен метод -определения абсолютной конфигурации и количественного содержания стереоизомеров в смесях. Метод заключается в обработке анализируемой смеси о-фталевым альдегидом в присутствии 2-меркаптоэтанола и в последующем измерении спектров КД и спектров УФ-поглощения образующихся хромофорных производных. При этом абсолютная конфигурация стереоизомеров определяется по величине и знаку полосы КД при 334нм, а количественное содержание стереоизомеров определяется по величине оптической плотности УФ-поглощения в той же области. Чувствительность метода составляет 2хЮ~5М. Важным достоинством метода является возможность измерений без предварительного выделения хромофорных производных из реакционных смесей.

2. Разработка методов синтеза нуклеопептидов.

Синтез пептидов, включающих остатки нуклеоаминокислот, требовал предварительных исследований, обусловленных спецификой химической структуры нуклеоаминокислот. Во-первых, нуклеоаминокислоты содержат в боковом радикале функциональные группы," способные к ацилированию в процессе пептидного синтеза. Во-вторых, реакционная способность нуклеоаминокислот в большинстве случаев ниже, чем таковая обычных белковых аминокислот, поскольку нуклеоаминокислоты содержат объемистые гетероциклические боковые радикалы. В-третьих, производные нуклеоаминокислот, как правило, ограниченно растворимы

в большинстве органических растворителей, применяющихся в пептидном синтезе, что создает дополнительные трудности при подборе условий пептидообрэзования.

Разработка метода синтеза нуклеопептидов предполагала синтез активированных и защищенных производных нуклеоаминокислот, а также выбор оптимального способа их конденсации.

После предварительных исследований было показано, что для нуклеопептидаого синтеза наиболее подходящей в качестве ы-защитной является трет.-бутилоксикарбонильная (ВОС) груша, а для защиты карбоксильной группы с успехом могут быть использованы метиловые или этиловые эфиры нуклеоаминокислот. Некоторые сведения о синтезированных производных содержатся в таблице 3.

В качестве метода пептидного синтеза наш были изучены реакции поликонденсащш, твердофазный пептидный синтез (тфс), классический синтез в растворе, а также синтез с использованием ферментов.

Таблица 3

Некоторые производные оптически активных нуклеоаминокислот

Т.пл., 20 в системе: Выход,

Соединение °с %

(СО,6-1) I 2 5*

Вос-ь-иа1-0Н (24) 183-185 -136 (ОМР) 0,67 0,70 0,60 75

Вос-ь-Та1-ОН (25) 200 -91 (ИМР) 0,69 0,60 71 ■

Вос-ь-Аа1-ОН (26) 155-156 -45 (ОМР) 0,69 0,35 82

Н-ь-иа1-0Ме (27) 186-188 - 0,25 0,50 93

(НС1)

Н-ь-Та1-0Ме (28) 172-173 -3 0,69 0,17 89

(НС1) (МеОН)

Н-ь-Аа1-0Ме (29). 190-193 -3 '0,72 0,11 62

(2НС1) (МеОН)

^Система 5: бутанол-вода-уксусная кислота, 4:1:1

Для активации реакций пептидообразования использовали дицик-логексилкарбодаимид (осс), дициклогексилкарбодапшид с добавками 1-гидроксибензотриазола (H0Bt) или ы-гидроксисукцинимида (нози), активированные эфиры с выделением и без выделения из реакционной смеси: пентахлорфениловые (ОРср), пентафторфениловые (ОРЕр) и ы-оксисукцинимидные (оэи).

Был осуществлен синтез серж нуклеопептидов смешанного типа, большая часть которых была далее использована в синтезе аналогов нейропептидов. В таблице 4 приведены синтезированные нуклеопепти-ды с указанием метода их получения, способа образования пептидной связи 2 некоторых других характеристик.

Монотонные нуклеопептиды, содержащие остатки урацилилаланина и аденинилаланина, были получены поликонденсацией с помощью пента-хлорфениловых■ зфаров (зо), ступенчатым синтезом в растворе (зг-41), а также на твердой фазе с использованием хлорметилирован-ного сополимера стирола с 1% давинилбензола (42-46); при этом в качестве С-концевой аминокислоты использовали аланин, который служил внутренним стандартом при расчете данных аминокислотного анализа. Для удаления Вос-группы применяли обработку 4н. раствором хлористого водорода в диоксане. Реакцию конденсации проводили с помощью исс. В ходе синтеза было проведено сравнительное изучение различных способов отделения пептида от полимера в условиях ацидо-лиза, гидразинолиза и переэтерификавди.

В результате было установлено, что наиболее предпочтительным способом отделения нуклеопептида от нерастворимого полимерного носителя является гидразинолиз, при котором не наблюдается заметного расщепления нуклеопептида и достигается наиболее полное его отделение от носителя.

Нуклеодипептидные аналоги 47-50 были синтезированы с помощью химотрипсина с использованием в качестве субстратов алкиловых зфи-ров защищенных нуклеоаминокислот и амидов лейцина и метионина.

В ходе синтеза аналогов 51-вз, в которых остаток нуклеоамино-кислоты является как и-, так и С-концевым, было показано, что оптимальным является метод активированных эфиров (пентафторфениловые и гидроксисукцинимидные),а также карбодиимидный метод с добавкой 1-гидроксибензотриазола.

Таблица 4

Нуклеопептид(эдесь и далее, если особо не указано, все аминокислоты - ь-ряда) Т.пл. °С Метод пепт. синтеза и активации карбоксила г«г20 [«10 ШАР с I Г СИСТ.1

Н-иа1 -ОН п=12-14 30) - поликонд,ОРср -

Вос-иа14-0Ме 33) 214 клас., ОРгр 0,65

Вос-иа15~ОМе 34) 246 0,60

Н-иа].4-ОМе 37) 214 0, 30

Н~иа15~ОМе 38 ) 236 и 0,30

Н-Ца1б-ОМе 39) 246 « 0,25

Вос-ОЬ-Аа^ОЕЪ 40) 180 клас..БСС.ОБи 0,68

H-DL-AalJOEt 41) 158 0,44

Н- (Щ,-иа1) 2-А1а-ОН 42) 220 тфе, йСС 0,28*

Бос-(ОЬ-иа1)2-А1а-ОМе 43) 205 0, 70*

ВОС- (ОЬ-Ца1) 2-А1а-ШИН2 44) 220 _<1 0,63*

Вос-(ОЬ-иа1)9-Д1а-ЫННН2 45) 225 Тфс БСС -

Вое-(ОЬ-Аа1)9~А1а-ЫКШ2 46) 246 п » -

Вос-иа1-Ьеи-ЫН2 47) 172 ХИМОТРИПСИН -52 0,87

Вос-Иа1-Ме^Ш2 48) 157 -56 0, 85

Вос-Да1-Ьеи-ЫН2 49) 177 -30 0,75

Вос-Аа1-Ме(:-Ш2 50) - -24 0, 76

Н-Аа1-Ьеи-ОМе 51) 117 клас., ОРгр -32 0,77

Н-ТаХ-Ьеи-ОМе 52) 125 ** -44 0,82

Н-иа1-Ьеи-ОМе 53) 80 « 1* -23 0,81

Н-иа1-Ме^0Ме 54) - »» »г * * -24 0, 70

Н-РЬе—Аа1-ОН 55) 174 " ОЭи ** +6 0,56

Н-РЬе-иа1-0Н 56) 158-160 »» п ** +9 0,52

Н-РЬе-Аа1-ЫН2 57) 193-196 » ** + 4 0,58

Н-РЬе-иа1-Ш2 58) 132 ** + 9 -

Н-Р11е-Аа1~ОМе 59) 192-195 * * -4 0, 79

Н-РЬе-0~Аа1-0Н 60) 199-201 * * + 30 0,58

Н-Ца1-Туг-№!2 61) 239-240 новъ,осс -4 0,56

Н-Аа1~Туг-ЛН2 62) 163-165 + 18 0,55

Н-Та1-Туг-Ш2 63) 199-201 " " -10 0,45

* А*

Хроматография на бумаге; Метанол

Индивидуальность всех полученных нуклвопептидов доказана с помощью хроматографических и аналитических методов.

В заключение этой части работы нами был осуществлен синтез природных нуклеопептидов и их аналогов.

В 1973 году из семян лесного бука (иадиз эПуа^са) были выделены два неизвестных ранее соединения пептидной природы, для которых на основании изучения химических и спектральных свойств была предложена структура нуклеопептидов: т-ь-глутамил-ь-3-(урацюшл-1)аланина и г-ь-глутамил-ь-фенилаланил-З-(урацилил-1)аланина. Однако не была установлена стереохимическая конфигурация аминокислотных остатков, входящих в трипептид, и не был выполнен их синтез. В связи с изложенным, мы предприняли синтез обоих природных нуклеопептидов, в котором были использованы все аминокислоты ь-конфигурации. В результате были получены синтетические нуклео-пептиды, полностью идентичные природным образцам. Таким образом, был однозначно решен вопрос о стереохимической конфигурации асимметрических центров в природном нуклеотрииептиде. Наряду с этим был проведен синтез аналогов этих нуклеопептидов с заменой остатка урацилилаланина на остатки аминокислот, несущих в боковом радикале тимин и аденин. Синтез был выполнен по следующей общей схеме :

Схема 3

ТРА

Вос-рие-оргр + н-иаа-ОА1к —-> вос-РЬе-ыаа-ОА1к ->

БOC-Glu-(OPfp)-OAlk ЫаОН -> Н-РЬе-ЫаЭ-ОА1к--» Вос-С1и-0А1к -

РЬе-Та1-ОА1к

НС1/диоксан

-» Вое—С1и-ОН -> НС1-С1и-ОН

1- РЬе-Та1-ОН 1-р|1е-та1-0Н

Некоторые константы и выхода синтезированных нуклеопептидов приведены в таблице 5.

Таблица 5

Природные нуклеопептиды и их аналоги

Нуклеопептид Т.пл.°С 1< Выход,%

Н-у-С1и-Оа1-ОН (64) 196 -53(1Ы НС1) 86

Н-у С1и-Та1-ОН (65) 191-192 -18(Н20) 88

Н-г-С1и-Аа1~ОН (66) 204-207 -8 (МеОН) 75

Н-у-С1и-РЪе-иа1 -ОН (67) 201 -70(Н20) 81

Н-г-С1и-РЬе-Та1 -ОН (68) 195-196 -47(МеОН) 85

Н-г-С1и-РЬе-Аа1 -ОН (69) 201-203 +16(МеОН) 80

Выводы, сделанные в этой части работы, были использованы нами в дальнейшем при синтезе нуклеоаминокислотных аналогов нейропепти-дов.

3. Синтез нуклеоаминокислотных аналогов киоторфина.

Киоторфин выделен в 1979 году из мозга быка й представляет собой простейший опиоидный пептид строения Н-ь-Туг-ь-Агд-ОН.

В настоящей работе синтезирована серия аналогов киоторфина, в которых ы-концевой аминокислотой является ь-нуклеоаминокислота (1, 2 и з ), а С-концевым остатком служат остатки аргинина или лизина в ь- и о-конфигуращш:

Н-иа1-Агд-ОН (70) Н-иа1 -Ьуэ-ОН (76)

Н-Та1-Агд-ОН (71) Н-Та1 -Був-ОН (77)

Н-Аа1-Агд-ОН (72) Н-Аа1- -Ьуэ-ОН (78)

Н-иа1-Б-Агд—ОН (73) Н-иа1' -О-Ьув-ОН (79)

Н-Та1-0-Агд-0Н (74) Н-Та1' -Р-Ьуэ-ОН (80)

Н-Аа1-0-Ахд-0Н (75) Н-Аа1- -О-Ьуэ-ОН (81)

Для синтеза аналогов 7о~гх применяли метод активированных эфиров (сукцинимидных или пентафторфениловых), для защиты карбоксильной функции на С-конце "использовали метиловый эфир. Общая схема синтеза нуклеодипептидов показана на примере получения ура-цилиллизина:

Схема 4

НОР£р Н-Ьуз{г)-ОМе Бос-Оа1-ОН -> Вос-иа1-ОРЕр ->

ОН

-► Вос-иа1-Ьуз(2)-ОМе -> Вос-иа1-Ьуз(г)-ОН -»

НВг/АсОН

-» гнвг'н-иаг-ьуз-он

структура синтезированных нуклеопептидов подтверждена данными элементного и аминокислотного анализов. Индивидуальность соединений контролировали с помощью электрофореза на бумаге, ТСХ на си-ликагеле и целлюлозе в различных системах растворителей. Некоторые характеристики и сведения о выходе полученных соединений представлены в таблице 6, -

Таблица 6

нуклеоаминокислотные аналоги киоторфина

Соединение Т.пл.,°С • (разл.) (с 0,7-1) Rf.TCX, (целл. сист.I) Выход, %

2НС1 Н -иа1-Агд-0Н (70) 198-200 "5 <Н20) 0,14 82

2НС1 Н- -Та1-Агд-ОН (71) 184-186 -19(Н20) 0,20 79

ЗНС1 Н -Аа1-Агд-ОН (72) 193-194 -3 (Н20) 0,12 73

2НС1 Н- -иа^П-Агд-ОН (73) 204-205 +28(Н20) 0,14 83

2НС1 в -Та1-Б-Агд~ОН (74) 180-182 +1Э(Н20) 0,20 72

ЗНС1 н -Аа1-С-Агд-ОН (75) 195-196 +6 (Н20) 0,12 32

2Н0Г н -иа1-Ьув-ОН (76) 193-195 -ЗО(ИеОН) 0,20 74

2НВг н -Та1-ЬуБ-ОН (77) 198-200 -34(МеОН) 0,33 83

ЗНВг н- -Аа1-1<у з-ОН (78) 200 -и(МеОН) 0,27 85

2НВГ н- -иа1-0-ЬуЕ-0Н (79) 203-205 +2б(МеОН) 0,20 84

2НВГ н- -Та1-П-Ьуз-0Н (80) 198-200 +28(МеОН) 0,33 90

ЗНВг н -Аа1-П-Ьуз-ОН (81) 200 +5 (МеОН) 0,27 80

4. Синтез нуклеоаминокислотных аналогов энкефзлинов.

Первыми и наиболее хорошо изученными опиоидными пептидами являются лейцин- и мегиония-энкефалинн, представляющие собой пентапептиды строения: н-ь-туг-с1у-с1у-ь-РПе-1.-г,еи(Мв1;)-он.

Известно, что при внутримозговом введении энкефалины проявляют слабый и непродолжительный анальгетический эффект и совсем неактивны при внутривенном введении. Это объясняется, в первую очередь, быстрой биодегрздацией энкефзлинов под действием тканевых ферментов. Исследования продуктов распада энкефалинов показали, что для получения устойчивых к действии протеаз аналогов необходима защита пептидных связей между остатками Туг1 и в1у2 и связи С1у3-рье4. Ранее было установлено, что первая связь может быть успешно стабилизирована заменой остатка глицина-2 на остатки и-аминокислот. Для защиты С-концевой части молекулы от действия пептидаз нами предложено заменять остатки аминокислот в положении 4 и 5 на остатки непротеиногенных нуклеоаминокислот.

С целью изучения биологической активности были синтезированы следующие нуклеоаминокислотные аналоги:

H-Tyr-G.ly-Gly-Aa.l-OH (82)

Н-Туг-0-А1а-С1у-Аа1-0Н (83)

Н-Туг-И-А1а—Б1у-Аа1-Ьеи-ОМе (84)

Н-Туг-0-А1а-С1у-Та1-Ьеи-0Ме (85)

Н-Туг-0-А1а-С1у-Ца1-Ьеи-0Ме (86)

Н-Туг-0-А1а-С1у-иа1-МеЪ-0Ме (87)

Н-Туг-Б~Р1ге-С1у-Та1-Ьеи-0Ме (88)

Н-Туг-Б-Р11е-С1у-иа1-Ъеи-0Ме (89)

Н-Туг-0-РЬе-С1у-иа1-Ме^0Ме (90)

Н-Туг-0-А1а-С1у-РЬе-01.-Аа1-0Н (91)

Н-Туг-0-А1а-С1у-РЬе-ОЬ-иа1-ОН (92)

Н-Туг-П-А1а-С1у-РЬе-0Ь-Аа1-ЫН2 (93)

Н-Туг-Е-А1а-С1у-РЬе-РЬ-иа1-КН2 (94)

Н-Туг-Р-А1а~С1у-РЬе-Аа1-ОМе (95)

Н-Туг-Р-А1а-С1у-РЬе-Аа1-0Н (96)

Н-Туг-О~А1а-С1у-Р1ю-Р-Аа1-0Н (97)

Укороченные нуклеотетрэпептиды получали конденсацией по схеме 3+1, пентапептидные аналоги - фрагментной конденсацией по схеме 3+2, с применением метода активированных эфиров и карбодиимид-ного с добавкой 1-гидроксиОензотриазола. -аминогруппу защищали с помощью трет.-Сутилоксикарбонильной группировки, а концевые карбоксильные группы блокировали этерификацией или амидированием.

Пути синтеза показаны на примере получения соединений 83 и 94 на схемах 5 и 6.

Схема 5

Туг

Ю-А1Э

Иу

Аа1

Вое

Вое ■

Вое

Вое

Вое -

Вое ■

ОН н •

новы вес

он

НОВ!

всс

I»*

он

0Е1

•ОЕЪ

•ОЕ1

•ОН

Н0Р5Р|ССС

1.Н

2. ОН

•ОМе

■ОМе

■ОН (83)

синтезированные нуклеопептиды очищали перекристаллизацией, переосаждением и с помощью препаративной ТСХ. Гомогенность их подтверждена хроматографически и данными аминокислотного анализа. В таблице 7 приведены некоторые константы этих соединений.

Схема 6

Туг

1>-А1 а

в1у

РЬе

оь-иа!

Вое ■

Бое-

вое ■

Вое ■

ОР£р

ТРА

■ОБи

■ПН-

■

■N11

2(94)

5.Синтез укороченных нуклеоаминокислотшх аналогов дерморфина.

Дерморфин представляет собой природный гептапептид строения Н-Туг-0-А1а-РЬе-С1у-Тух-Рго-Зег-ЫН2. В СТРУКТУРНОМ ОТНОШвНИИ ЭТОТ нейропептид интересен тем, что в положении 2 пептидной цепи аминокислотный остаток аланина имеет о-конфигурацию. Присутствие этой аминокислоты в и-концевой части молекулы дерморфина, а также последовательности Рго-Бег-иН2 на ее С-конце повышает устойчивость пептида к действию протеолитических ферментов, что, в частности обусловливает исключительно высокую анальгетическую активность дерморфина. Исследование метаболизма этого пептида показало, что существуют два пути энзиматического расщепления активной молекулы, как показано на схеме 7.

Схема 7

1 2 3 4 5 6 7

Н_Туг_0_АХа_рЬе_С1у_Туг_Рго_3вг_МН

Н-Туг-П-А1а-РЬе-С1у-ОН

Н-Туг-Р-А1а-РЬе-0Н

В мозгу и в печени образуется и-концевой тетрапептид, у которого сохраняется 10-20% опиоидной активности дерморфина (путь I), в плазме реализуется путь 2 с образованием неактивного три-пептида. Таким образом, было установлено, что наиболее уязвимыми по отношению к действию протеолитических ферментов являются связи рие3-с1у4 и С1у4-туг5 дерморфина.

Учитывая изложенное, а также принимая во внимание литературные данные о том, что укороченные с С-конца аналоги дерморфина сохраняют 20-50% его активности, был предпринят синтез ферменто-стабильных аналогов дерморфина, в которых остатки аминокислот в положениях 4 и 5 были заменены на остатки нуклеоаминокислот:9 8-и2

Таблица 7

Нуклеоаминокислотные аналоги энкефалинов

Соединение (в виде трифторацетата) Т.пл.°С (разл.) 20 [«!„ (С 1.0 МеОН) К£ В СИСТ.1 Выход, %

К-Туг-С1у-С1у-Аа1-0Н 220 - 0, 53 45

Н-Туг-0-А1а-С1у-Аа1-0Ме 148-150 -8 0, 70 93

Н-Туг-0~А1а-С1у-Аа1-Ьеи-0Ме 200 - 0,83 82

Н-Туг-В-А1а-С1у-Та1-Ьеи-0Ме 161-163 -17 0,77 90

Н-Туг-0-А1а-С1у-иа1-Ьеи-0Ме 157-158 -32 0,77 94

Н-Туг-О-А1 а-й 1 у-иа 1 -Ме 1:-ОМе 172-173 -16 0,55 33

Н-Туг-0-РЬе-Б1у-ТаХ-Ьеи-0Ме 146-147 -32 0,97 82

Н-Туг-Б-РЬе-С1у-иа1-Ьеи-0Ме 154-155 -36 0, 85 89

Н-Туг-0-Р11е-С1у-иа1-МеЪ-'0Ме 155-156 -38 0, 77 33

Н-Туг-В-А1а-С1у-Р1)е-ВЬ-Аа1-ОН 178-189 - 0, 80 60

Н-Туг-0-А1а-С1у-РЬе-0Ь-иа1-0Н 191 - 0,62 30

Н-Туг-0-АХа-С1у-РЬе-01.-Аа1-КН2 170-171 - 0,65 63

Н-Туг-0-А1а-С1у-РЬе-Ш,-иа1-Ш2 169-171 - 0, 77 35

Н-Туг-П-А1а-С1у-РЬе-Аа1-0Ме 157-159 + 16 0, 84 67

Н-Туг-0-А1а-С1у-РЬе-Аа1-0Н 189-190 + 18 0, 77 80

Н-Туг-П-А1а-С1у-Р1)е-П-Аа1-ОН 188-190 + 30 0, 77 76

*ЭМР

н- -ТуГ-Б-АЬа-РЬе -С1у~Ш,-иа1-Г1Н2 (98)

н -Туг-0-А1а-Р1ге -С1у-Ш,-Та1-1Ш2 (99)

н -Туг-0-А1а-РЬе -51у-Ш,-Аа1-Ш2 (100)

н -Туг-0-А1а-РЬе -С1у-0Ь-иа1-0Н (101)

н -Туг-0-А1а-РЬе -С1у-0Ь-Та1-0Н (102)

н -Туг-0-А1а-РЬе -С1у-ОЬ-Аа1-ОН (103)

н -Туг-П-А1а-Рйе -иа1-Туг-ЫН2 (104 )

н -Туг-Б-А1а-РЬе -ла1-туг-;;Нт (105)

н -Туг-В-А1а-РЬе -Та1-Туг-1Ш2 (106)

н -Туг-П-Аха-Рйе -Та1-Ш2 (107)

н -Туг~В-А1а-РЬе -Та1-ША<1 (108)

н -Туг-0-А1а-Р11е -ТаХ-КНСН(РЬ)СН3 (109)

н -Туг-О-Мей(О)- Р1ге-Та1-Ш2 (110)

н -Туг-О-МеС(О)- РЬе-Та1-ШАс1 (111)

н -Туг-О-Мей(О)- РЬе-Та1-КНСН(РЬ)СН3 (112)

соединения 98-юз получали фрагментной конденсацией по схеме 4+1, а аналоги 104-106 по схеме 3+2 с применением метода активированных эфиров и карбодшшидного метода с добавкой I-гидроксибензотриазола. Для защиты аминогрупп и гидроксильной функции тирозина использовали трет.-бутилоксикзрбоняльную группировку, концевые карбоксильные группы защищали этерификацией или со-леобразованием. Схемы синтеза показаны на примере получения соединений 98 и юб (схемы 8 и 9).

Нуклеопептиды 107-109 и 110-112 были синтезированы методом фрагментной конденсации по схеме 3+1. Предварительно были получены амид з-(тиминил-1)аланина и его замещенные производные ада-мантил(Аа)- и фенэтиламиды. Для этого пентафторфениловый эфир Вос-зэщищенной нуклеоаминокислоты вводили в реакцию с аммиаком или соответствующим амином и образовавшийся эмид далее деблокировали трифторуксусной кислотой, я-концевой защищенный трипептидный фрагмент дерморфина в виде пентафторфенилового эфира конденсировали с производными тиминилаланина с последующим удалением защитной группировки.

Для очистки целевых соединений были использованы различные метода, включающие экстракцию, перекристализацию, переосаждение, препаративную тонкослойную и высокоэффективную жидкостную хрома-

Туг

Вое ■

•ОН

О-АХа

Вое-

Вое ■

Рйе Вое 4-ОН

-ОН

Вое ■ Н-

пСС

НС1

диокс.

НС1

НОВ!

Й1у

Н4-ОЕЪ

Схема 8

ВЬ-иа!

РСС

НС1

диокс.

он

диоксан

•ОЕЪ •OEt • ОЕй ■ОЕЪ ■ОЕЪ

■ он псс

н

рОН

■ т.

Туг

(Вое);

он

0-А1а Вое Вое

РЬе

I н

он н-

новъ| осс

нс!|даокс.

0Е1 Вое• ■ОЕ1 Вое

он

■ОЕг •ОЕ!

Та1

■ОН I

Н0В1:| всс

НС1 диокс,

■ он

Схема 9

Туг

-■мн„

не1]диокс.

ин.

лн,,

лн.

тографшо в различных органических растворителях. Индивидуальность пептидов доказывалась данными ГСХ, ВЭЖХ и аминокислотного анализа. Некоторые характеристики синтезированных аналогов представлены в таблице 8.

Таблица 8

Укороченные нуклеоаминокислотные аналоги дерморфина

o т.пл. С t„120 ía)D тех Ef Выход

Соединение (разл.) (Cl, Me OH) сист. 5 %

H-Tyr-D-Ala~Phe-Gly-DL-Ual-NK2 222-223 +39 0,26 45

Н-Туr-D-Ala—Phe-Gly-DL-Tal—NHj 199-200 +19 0, 50 50

H-Tyr-D-Ala—Phe-Gly-DL-Aal-NHj 239-240 + 10 0,39 85

H-Tyr-D-Ala-Phe—Gly-DL-Ual-OH 187-188 +34 0, 24 78

H—Tyr-D-Ala-Phe-Gly-DL-Tal-OH 175-177 +32 0,70 31

H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-DL-Aal-OH 192-194 +26 ■ 0,25 22

H-Tyr-D-Ala-Phe-UaI-Tyr-NH2 209-211 + 13 0,35* 33

H-Tyr-D-Ala-Phe-Tal-Tyr-NH2 200-201 + 16 0,46* 32

H-Tyr-D-Ala-Phe-Aal-Tyr-NH2 240 + 14 0, 34* 24

H-Tyr-D-Ala-Phe-TaX-NH2 198-200 +21 0,34 41

H-Tyr-D-Ala-Phe-Tal-NHAd 201-202 +27 0,64 67

H-Tyr-D-Ala-Phe-TaX-NHCH(Ph)CH3 185-187 +6 0,60 68

^Система 6:1-бутанол-уксусная кислота-вода (14:1,5:4)

6. Синтез гептапептидных аналогов дерморфина и дельторфина.

Наиболее важным для проявления биологической активности дерморфина является ы-концевой остаток тирозина. Модификация этого остатка в большинстве случаен приводит к полной утрате биологической активности пептида. Исключение составляют немногие случаи, в которых остаток тирозина-I был заменен на остатки основных аминокислот, что в результате приводило к высокой анальгетической активности в опытах in vivo. С целью дальнейшей проверки гипотезы о

решающей роли остатка тирозина в проявлении биологической активности нами были синтезированы аналоги с заменой этого тирозина на остатки непротеиногенных аминокислот и нуклеоаминокислот пирими-дшювого ряда, сходных по структуре с тирозином

Н-Х-С-А1а-Р1ге-С1у-Туг-Рго-5ег-КН2/ где Х=туг; Туг(ЗМН2); Туг(ЗЖ)2); РЬе(4Ш2); иа1;та1; Миа*

Указанные аналоги были получены твердофазным пептидным синтезом с использованием бензгидриламинной смолы с 2% сшивки. Конденсацию осуществляли с помощью предварительно приготовленных I-гидроксибензотриазоловых активированных эфиров Вос-защищенных аминокислот. Гидроксильные группы тирозина и серина защищали бен-зильной группировкой. Для отщепления пептидов от носителя использовали смесь трифторметансульфокислогы, диметилсульфида и три-фторуксусной кислоты.

Все гептапептиды были очищены с помощью- гельфильтрации на сефадексах в-10 и Ш-20. Чистота полученных соединений подтверждена данными аминокислотного анализа, ТСХ и ВЭЖХ. Сведения о некоторых константах синтезированных аналогов представлены в таблице 9.

Таблица 9

Аналоги дерморфина по положенюо-1

Соединение Т.ПЛ., °С ТСХ, в системе: (01, МеОН) Выход, %

(в виде ацетата) (разл.) I 5

Дерморфин (ом) (113) 151-153 0,79 0, 22 -0, 2 38

[Туг (ЗыН2 )1)-Е»М (114) 172-173 0,88 0, 18 ,+1,3 62

[Туг(ЗЮ2)1)-ВМ (115) 173-175 0, 76 0,28 -6,1 55

[РЬе(4ЫН2)1]-0М (Иб) 159-161 0,90 0, 14 +1,8 52

[иа11]-ОМ (117) 193-195 0, 88 0,25 -4,9 33

[Та11]-ОМ (118) 1В0-181 0,86 0,29 -8,8 30

[Миа1]-БМ (119) 189-191 0, 87 0,30 -6,0 31

Миа - 3-(6-метилурацилил-1)аланин

В ходе выполнения этой работы был предсказан и затем выделен пептид-дельторфин (120), родственный дерморфину. С целью изучения взаимосвязи меаду структурой и функцией нового опиоидного пептида , а также сравнения его с дерморфином, мы осуществили синтез дельторфинэ и ряда его гептапептидных аналогов с заменами аминокислотных остатков в положениях 2,4,5 и 6, а именно:

н- -Туг- -0- -меь -РЬе- -Н1Б- -Ьеи- -МеЬ- -Аэр- -ян2 (120)

н- -Туг- -ь- -МеЪ -РЬе- -ШБ- -Ьеи- -Мег- -АБр- -ЫН2 (121)

н- -Туг- -ъ- -А1а- -РЬе- -ЩБ- -Ьеи- -МеЪ -АБр- -ин2 (122)

н- -Туг- -о- -МеЪ- -РЬе- -Ьеи- -Ъеи- -Азр- -Ш2 (123)

н- -Туг- -0- -МеЪ- -РЬе- -ЩБ- -Туг- -Ме1:- -АБр- -ын2 (124)

н- -Туг- -э- -Мс^ -РЬе- -Н1 Б- -Туг- -Ьеи- -АБр- (125)

н- -Туг- -Б- -Мег- -РЬе- -РЬе- -Тус- -Ьеи- -Азр- -ян2 (126)

н- -Туг- ■В- -А1а- -РЬе- -Иу- -Туг- -МеЪ- -Авр- -ЫН2 (127)

соединения 120-127 получали в растворе способом фрагментной конденсацией по схеме 10. Для защиты аминогрупп использовали Вос-группу. С-концевые карбоксильные группы защищали с помощью зтери-фикации. Гидроксильную группу тирозина и имидазольное кольцо гис-тидина не защищали. Защищенный м-концевой тетрапептид получали способом фрагментной конденсации по схеме 3+1 методом пента-фторфенилових эфиров . Защищенный С-концевой трипептид получали последовательным наращиванием цепи с С-конца карбодиимидшш методом. Заключительную конденсацию 4+3 проводили с помощью осс с добавкой 1-гидроксибензотриазола.

Все целевые пептиды били очищены гель фильтрацией, на Сефа-дексе в-Ю и перекристаллизацией. В таблице 10 представлены константы и выход аналогов дельторфина.

8. Изучение биологической активности нуклеоаминокислотных аналогов опиоидных пептидов

Поскольку целью исследования являлся синтез аналогов нейро-тептидов с повышенной устойчивостью к действию ферментов орга-шзма, синтезированные наш нуклеоаминокислотные аналоги опиоид-шх пептидов были проверены на ферментостабильность. В качестве

Tyr

Boc

BOO+0H H

HOBtjDCC

Boa Boc-

Boc-Boc Boc Boc H

D-Met BoaVOH

Phe His

HiOMe

Leu

Met

HOBtlDCC

OH

OMe OMe OMe OH

OPfp H

l.OH 2

• OH I . H+ \

OMe Boc

OMe Boc

OH H HOBtlDCC

Boc

OH H HOBtjDCC

Boo--OH

HOBtlDCC

CxeMa 10

Asp Boc-jOH(Bzl) DCC

OPfp(Bzl) NH4OH Boc-J-NH^ (Bzl)

PfpOH Boc

H|NH2(Bzl)

TFA

•NH2(Bzl) «H2 (Bzl)

NH2(Bzl)

NH2(Bzl)

-NH2(Bzl)

NH„

renranenTH^HHe aHajiora aeJftTopJnHa

Taöjmua 10

TCX, Bhxoä,

CoeflsnieHHe Ol, Rf %

MeOH CHCT.I

H-Tyr-D-Met-Phe-His-Leu-Met-Asp-NH2 + 12,2 0,70 87

H—Tyr-L-Met-Phe—His—Leu-Met-Asp-NH2 -5,2 0,70 66

H-Tyr-D-Ala-Phe-His-Leu-Met-Asp-NH2 -0,6 0, 72 71

H-Tyr-D-Met-Phe-His-Leu-Leu-Asp-NH2 -4,0 0,71 58

H-Tyr-D-Met-Phe-His-Tyr-Met-Asp-NH2 + 3,2 0, 74 79

H-Ty r-D-Me t-Phe-Hi s-Tyr-X,eu-Asp-NH2 +2, 7 0, 73 84

H-Tyr-D-Met-Ptie-Phe-Tyr-Leu-Asp-NHj -3,7 0, 75 78

H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Met-Asp-NH2 -1,9 0, 76 80

ферментных препаратов использовали как индивидуальные протео-литические ферменты, так и препарат ферментов, находящихся в го-могенатах головного мозга крысы.

Киоторфин, дипептид Н-Туг-ьув-ОН и их нуклеоаминокислотные аналоги 76-81, содержащие остатки ь- или о-лизина, подвергали действию гомогенатов мозга крыс при 37°с в буферном растворе с рН 7,4. Появление в инкубатах продуктов распада пептидов обнаруживали с помощью ТСХ. Показано, что -киоторфин и его лизиновый аналог гидролизуется в течение 30 мин практически полностью,нуклеопепти-ды 76-78 претерпевают существенную деградацию лишь в течение 3 часов, а гидролиз соединений 79-81, содержащих о-лизиновый остаток, в течение этого времени не наблюдается.

Нуклеоаминокислотные аналоги эшеефалинов, в которых глицин-2 заменен на Б-аминокислотный остаток, а фенилаланин-4 - на остаток нуклеоаминокислоты, были испытаны на чувствительность к индивидуальным протеолитическим ферментам, а именно, а-химотрипсину, лейцинаминопептидазе, пепсину, папаину, термолизину, субтилизину и термитазе.

Наличие остатков в-аланина или о-фенилаланина в положении 2 энкефалина обеспечивает стабильность аналогов 83-97 к действию лейцинаминопепгидазы. Метионин- и лейцин-эккефалины разрушаются в этих условиях за 20 минут.Показано, что термитаза, субтилизин, термолизин, химотрипсин и папаин проявляют эстеразную активность по отношению к метиловым эфирам аналогов энкефалинов 84-эо, однако разрушение пептидных связей при этом не происходит.

Устойчивость связи С1у3-наа4 была исследована в лаборатории ферментов ИБХ РАН с помощью энкефалиназы на примере аналога н-туг-о-А1а-с1у-Аа1-ьеи-оме. Скорость расщепления нуклеопептида оценивали по уменьшению концентрации исходного пептида и появлению в инкубатах продуктов деградации с помощью ВЭЖХ, используя в качестве стандарта сравнения лейцин-энкефалин. В результате установлено, что нуклеопептид «4 не подвергается биодеградации в течение 2 часов, в то время как лейцин-энкефалин в этих условиях полностью расщепляется за 15 минут, претерпевая гидролиз •пептидной связи с1у3-РПе4. <

Дерморфин, его и-концевые фрагменты 1-4 и 1-5, а также укороченные аналоги дерморфина, содержащие остаток нуклеоаминокисло-

ты в положении 4 или 5, подвергали действию ферментов, находящихся в препаратах лиофнлизованных мембран мозга крыс. Инкубацию проводили в буфере с рН 7,4 при 37 °С. Появление продуктов распада регистрировали через 3 и 24 часа с помощью ВЭЖХ. Время появления продуктов распада в инкубатах приведено в таблице II.

Строение продуктов распада определяли после их выделения с помощью ВЭЖХ и аминокислотного анализа их кислотных гидролизатов.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что нук-леоаминокислотные аналоги исследованных опиоидных пептидов обладают повышенной устойчивостью к действию протеолитических ферментов.

Необходимым условием проявления нейропептидом биологического действия является его взаимодействие с соответствующим рецептором, поэтому биологическое тестирование опиоидных пептидов включает, в первую очередь, исследование по связыванию новых синтезированных соединений с опиатными рецепторами, как с центральными (локализованными в мозгу), так и с периферическими (локализованными в других органах). Наиболее хорошо изученным эффектом опиоидов является обезболивающее действие, поэтому исследования в тестах in vitro сочетались для всех синтезированных соединений с тестированием на анальгетическую активность в опытах in vivo.

В лаборатории биокинетики НИИ физ.-хим.биологии им. А.Н.Бело-

Таблица II Время биодеградации аналогов дерморфина

Дерморфин Дерморфин (1-4) Дерморфин(1-5) [uai4]-дерморфин(1-5) [Aai4]-дерморфин(1-5) [Tai4 j-дерморфин(1-5) [Tai4]-дерморфин(I-4) [dl-uai5]-дерморфин(I-5) [DL-Aai5]-дерморфин(I-5)

DM(1-4) DM(1-5)

(104)

(105)

(106) (107) (98) (100)

DM

- 3 часа

- 3 часа

- 3 часа

- 24 часа

- 24 часа

- 24 часа

- 24 часа >24 часа >24 часа

зерского МГУ с помощью радиорецепторного анализа (РРА)было изучено специфическое связывание синтетических опиоидов с опиатными рецепторами мембран головного мозга крыс. О степени связывания судили по результатам конкурентного вытеснения исследуемым соединением меченного тритием специфического лиганда. В качестве стандартных использовали антагонист морфиновых рецепторов налоксон, а также высокоспецифические ц- и а-опиатные лиганды dago и dadle или DSLET соответственно.

Способность синтезированных аналогов взаимодействовать с периферическими рецепторами была исследована нами совместно с Чи-ченковым О.Н. на кафедре фармакологии I ММА им. И.М.Сеченова. В качестве классических моделей изолированных органов использовали подвздошную кишку морской СВИНКИ (guinea pig ileum, GPI), В КОТОРОЙ содержатся преимущественно д-рецепторы, и семявыносящий проток мыии (mouse vas deferens, MVD), В КОТОРОМ НаХОДЯТСЯ, В ОСНОВном, s-рецепторы. Величину связывания с рецепторами оценивали по icsq - константе ингибирования , равной концентрации исследуемого вещества, при которой амплитуда электрически стимулированных сокращений органа, уменьшилась вдвое. Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 12.

Установлено, что все синтезированные пептиды проявляют способность специфически связываться с периферическими опиатными рецепторами, причем некоторые из-исследованных соединений проявляют высокую активность в тестах gpi и mvd. Кроме того' показано, что нуклеоаминокислотные аналоги энкефалина и дерморфина, модифицированные по положению 5, более активны в тесте mvd ( аналоги 91, 94, эт. loi-юз), в то время, как аналоги,содержащие нуклеоамино-кислотный остаток в положении 4, имеют большее сродство к n-рецепторам. Величина рецепторной селективности или избирательности ц/5 определялась как отношение констант ингибирования ic50 в тесте gpi к таковой в тесте mvd. Чем меньше это отношение, тем большее сродство имеет лиганд к д-рецептору, и наоборот, лиганд с высоким отношением взаимодействует преимущественно с 5-рецептором. Так, аналоги знкефалина 85-88 и аналоги дерморфина 105-112 характеризуются выраженной д-селективностью, среди них наиболее высоким сродством к рецептору обладают соединения, содержащие остаток тлшнилаланина в положении 4 пептида (аналоги

Опиоидная активность тетра- и пентапептидных аналогов энкефалина и дерморфина.

Таблица 12

1Ссл>ЯМ0ЛЬ р/8 ЭДед ,НМ0ЛЬ/ШШЬ

Соединение СР1 МУВ

■ ■■7 интрзцистерн. внутриЕен.

Н-Туг-В-АХа-СХу-ТаХ-Ьеи-ОМе 85 734-249 1600*480 0,46 0,36(0,15-0,62) 670(600-860)

Н-Туг-В-АХа-СХу-ВаХ-Ьеи-ОМе 86 4360-1850 7600*3350 0,57 4,65(1,49-10,25) 1210(670-2320)

н-туг-в-Рйе-аху-тах-ьец-оме 88 399-1 СЮ 3130*1050 0,13 5)8(1}4™ЕЗ|7) 760(510-960)

Н-Туг-В-РПе-СХу-иаХ-Ьеи-ОКе 89 ;1,03*0,54)105 5 105 - 20 2460(1680-3890)

Н-Туг-В-АХа-С-Ху-Рйе-ВЬ-АаХ-ОН 91 612-58 9,65*1,03 63 - -

Н-Туг-В-АХа-С-Ху-РПе-ВЬ-АаХ-НЕо 93 873*83 - - - -

Н-Туг-В-А1а-С-1у-РПе-ВЬ-иа1-КНо 94 1290*180 49 «¿Я ? 39 0,4(0,013-1,45) 1100(700-1570)

Н-Туг-В-АХа-ОХу-РПе-АаХ-ОН 96 766*133 - - 0,32(0,25-0,38) 1070(930-1200)

Н-туг-В-АХа-С-Ху-РИе-В-АаХ-ОН 97 354±49 2,79*0,32 131 0,1(0,05-0,16) 550(450-690)

Н-Туг-В-АХа-РЬе-ТаХ-Туг-ННо 105 160*50 430*10 0,4 0,038(0,01-0,17) -

Н-йт-Б-АХа-Рйе-аи'-БЬ-иаа-ИНо 98 210*50 100*10 2,0 0,45(0,2-1,9) 1300(950-1500)

Н-Туг-В-АХз-Рйе-СХу-ВХг-АаХ-КНэ 100 690*150 310*50 р ^ 0,65(0,2-2,5) -

Н-ф-от-П-» 1 о_РЪо_Г}1 Т7_ПТ_ А в 1 -ПИ*" л* 1 И ПАи х иь их^ ш аих им 103 340*80 41*5 8,0 0,34(0,2-2,0) -

Н-Туг-В-АХа-РЬе-иаХ-Туг-МН, 104 320*20 320*60 1,0 П в(П *5_9 -

Н-Туг-В-АХа-РЬе-СХу-ВЬ-ТаХ-ОН 102 760+20 3,6+0,4 214 т лт я_е> т* "1*/ -

Н-Туг-В-АХа-РЬе-ОХу-ВЬ-ПаХ-ОН 101 150*20 14*2 11 1,6(0,2-5,8) -

Н-Туг-В-АХа-РЬе-АаХ-Туг-Ш, 106 1800*400 4600*600 0,4 4,0(0,7-23) -

Н-Туг-В-АХа-Р}1е-Та1-Ш2 107 250*90 6900*3000 0,04 0,63(0,17-8,1) 320(250-420)

Н-Туг-В-АХа-РЬе-ТаХ-ШАй 108 26*13 550*160 0,05 4,8(0,26-30,38) ЬОО

Н-Туг-В-АХа-Рйе-ТаХ-]ШСН(Рй)СН3 109 340*150 5300*2400 0,06 -

. Н-Туг-В-Мег (0)-Рйе-Та1-Ш2 110 5,22* 7000* 0,0007 0,071(0,025-0,226)

Н-Туг-В-Мег (О)-РЬе-ТаХ-ШАй 111 0,5* 475* 0,001 0,023(0,009-0,139)

н-Туг-в-кег (0)-Рйе-тах-шся(РЛ)СН3112 45,1* 7540* 0,006 1,19(0,46-3,05)

107-112). Нуклеопепгиды 97,102 обнаруживают высокое сродство к з-рецепторам, превосходящее по величине селективности такой широко используемый в практике г-лиганд, как dadle.

Анальгетическое действие нуклеоаминокислотных аналогов энкефалинов и дерморфина в опытах in vivo на белых мышах оценивали с помощью модифицированного метода Гафнера при интраци-стернальном (i.e.) и внутривенном (i.v.) введении . Ряд нуклео-. аминокислотных аналогов энкефалинов и дерморфина при интрацистер-нзльном введении оказывают выраженное антиноцицептивное действие. Следует отметить, что все синтезированные аналоги заметно превосходят по активности Leu-энкефалин (88нм/мышь), нуклеопептиды 85, 94, 96-98, 100-105, 110-112 по активности при данном способе введения существенно превосходят морфин (4нм/мышь), некоторые обладают очень высокой анальгетической активностью (105,110,111). Антиноцицептивное действие изученных соединений было специфическим, так как налоксон (1мг/кг внутривенно) полностью устранял или предупреждал действие опиоидных пептидов. Продолжительность действия в дозах, близких к ЭД50, составляла для всех аналогов энкефалинов 30 минут; аналоги дерморфина имеют продолжительность действия в интервале от 30 до 45 минут. При внутривенном введении нуклеоаминокислотные аналоги энкефалинов и дерморфина по анальгетическому действию уступают морфину(420нм/мышь). Наиболее высокой активностью обладают тетрапептидные аналоги дерморфина, содержащие в амидной группе гидрофобные заместители (107,108) и

[d-Aal5l"dm(l-5) (97).

С целью объяснения необычно высокой анальгетической активности аналога ios был проведен конформационный расчет этой молекулы. Работа проводилась в институте органического синтеза Латвии, в группе д.х.н. Никифоровича Г.В. Было показано, что соединение обладает весьма ограниченной конформационной подвижностью^ в наборе низкоэнергетических конформаций лишь одна конформация пептидного остова стабилизирована водородными связями типов Nff^Tyr1).. .C0(Giy4) и ОН (Туг5).. ,0C(Aia2), благодаря чему эта конформация приобретает существенный выигрыш в энергии. Возможно, именно необычной конформацией объясняется суперактивность пептида.

8. Закономерности связи между структурой и активностью аналогов дерморфина и дельторфинз.

Гептапептидные аналоги исследовали на связывание с центральными опиатными рецепторами и на анальгетическую активность при интрацистернальном введении. Результаты исследования гепгапептид-ных аналогов дерморфина, в которых остаток в положении I был заменен на остаток модифицированных аминокислот (114-116) или на остатки нуклеоаминокислот (117-119) представлены в таблице 13. Замена остатка тирозина-1 на остатки модифицированных аминокислот приводит к снижению связывания с и- и 5-рецепторами. Нуклеоамино-кислотные аналоги дерморфина (117-119) полностью теряют способность специфически связываться с опиатными рецепторами. По анальгетическому действию гептапептидные аналоги уступают дер-морфину, что соответствует результатам по связыванию с опиатными рецепторами. Полученные данные подтверждают решающую роль тирози-на-1 для проявления анальгетической активности. Единственное соединение, которое сохраняло относительно высокую анальгетическую активность - это аналог не, содержащий остаток тиминилаланина в первом положении. Анальгетический эффект , вызываемый соединением не, вероятно не опосредован взаимодействием с опиатными рецепторами, а обусловлен другим механизмом.

Результаты проверки активности гептапептидных аналогов дель-торфина (табл. 13) показали, что дельторфин (120) и его аналог 125 .проявляют высокое сродство к а-опиатным рецепторам и только в незначительной степени связываются с м-рецепторами. селективность к б- рецепторам - у этих соединений одна из самых высоких среди известных 5-лигандов. Замена остатка Б-метионина-2 на остаток ь-метионина (аналог- 121) приводит к снижению связывания с опиатными рецепторами, что свидетельствует о важности реконфигурации аминокислотного остатка в положении-2 для связывания с рецепторами. Замены в положениях 5 и 6 не оказывают влияния на проявление дельта-селективности дельторфина (соединения 122-125). Замена остатка гистидина-4 на остаток фенилаланина и глицина (аналоги 126, 127) приводит к существенному изменению рецелторной селективности Повидимому, гистидин в четвертом положении и отрицательно заряженная боковая группа остатка аспарагиновой кислоты в седьмом ш-

Активность гептапептидных аналогов дерморфина и дельторфина.

Таблица 13

П

WWW /\ЯЧ 1 lÍJ

И/Л

( till /ЧЛ-ТТТТТ- \

U-.Tirp-.Tí—А 1 о«.РЬо_ГП 17'_Фтгг»_ТЭТЧ-Ч_С;

ifc AJA А* A ÜW A. J 4 i X U UU1 1111Q

A4 AJA \WlUiQ / XJ Ai.U Ж 11W U4.J 1J4, 4. i. W uCl

tf-.TiTWÍWrV' \_Г)_Д 1 Q_t>bo_m тг_Фтгг.__Т>г»о_Чог»_ЛШ 1* xjl V^IU^ / AAU AilW uxj Aj J. A A W 4JWA Ш^О

Н-РЯе (4ffl£ )-B-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NHo

u t.

A4 lUi. А/ AJ.U X A W WWA iUi^

11 UU1 U il^O AilW Ja.X A W WW* iUK)

U_Ui 10 «TI- Alo -Ph О-Г. 1 n-rvJMU

11 LUUU XJ X iiW AJA X A W WW A llllQ

H-Tyr-D-Met-Phe-His-Leu-Met-Asp-SlC li-Tyr-Kst-Phs-Kls-beu-Met-Asp-KKo "

р-'Плгт'-П-ЛТ o_Pho_W1 а_Т.оп_Ма+-АчП-ЫЧ-

11 ijl X/ Axu X 1LU MXU ÍJWU «uw U nwu 1U1Q

H-Tyr-D-Met-Pîis-His-Leu-Leu-As^-îîHo

11 X j X ¿/ ши W X 11U ÜXW AJA MtW U лйр 11A1Q

Ц—Фттт'—'П—Mat—PViö—tfl а__Фтгт»_Т.оп_ А ап_ЛТТТ

11 ijl jj UtW V 4 ихы AJA XIWU

U—Фтгг»_'П—Wot—Pbo—Pho—Aar>—WTÎ

11 IJ* ÏJ 1UW U XUU A iiw AJA ÜWU ЛЫК HIAO

«_Ф-1ГГ»_"П>. Alo _PV»а-ГС 1 тг_Фтгп_Мо t - А ап_ЛШ

11 Л, J X IS A^U A 1XW UXJ A J A 1UW и eujj 1«11<^

(113)

(114)

М1Ц1 \,,и/

(116)

(11Т)

(118)

(119)

(120)

M SM \ <«- • !

! 15>Э\ V '«-•-/

(123)

(124)

(125) (125) (127)

A Pin В

853-112 930-91 748-84 >1000 >1000 >1000 4900-280 >5000 44-10-200 >5000

ovoniiTn

а i > ■ 1 »1

10000 i nnnn

I wuww

2408-195

>10000 >10000 23,3-5,2 145-11

лп Q±ö 1

— ^ F ^ ^» '

/1Я К±1П R

, W i w , w

75,0-15,2

01 7±"7 П

*_w y . • y и

1 А О

I -г , w Li ,

110-14 a а±ч л

0,08

0,3

210

73

29 160 0,65 0,59 1.5

0,02(0,01-0,05) 1,5(1,1-2,0)

>25 0,2( 9,1 (5,7-14,5) >25

22(14-30)

Ut. I tu /

1 Ail Э-СМ Ï

■ w V i L. i_-r t

■ЭЛ /1 1-Л1 \ \ i i -т. ,

tb \U I. f /

U Kurt yf_1 R V \ I T, W y i i w, • /

13(5-35) 15,8(13,1-17,2)

ложенш являются важным условием для проявления «-селективности дельторфином. Дельторфин и его гептапентидные аналоги проявляют низкую анальгетическую активность.

9. Синтез аналогов циклогистидилцролина и карнозина.

С целью поиска высокоактивных пептидов, родственных циклоги-стидилпролину и карнозину, был проведен целенаправленный синтез большого числа аналогов с изменяющейся гидрофобностью и стеричес-кими параметрами входящих в них аминокислотных остатков. Б частности были получены циклонуклеопептиды, аналоги ЦГП, в которых либо остаток пролина, либо остаток гистидина были заменены остатками одной из непротеиногенных аминокислот, а именно, саркозина, норлейцина, 3-нитротирозина и нуклеоаминокислот uai, Tai и Aal.

Синтез этих соединений проводили по схеме, которая включала три стадии: 1)получение полностью защищенного дипептида,- 2) получение частично защищенного дипептида со свободной аминогруппой; 3) внутримолекулярная циклизация линейного дипептида в соответствующий дикетопиперазин. В качестве n-защитных групп использовали Вос-группу, карбоксильную группу защищали с помощью сложного эфира или амида. Образование пептидной связи проводили методом активированных эфиров (пентафторфениловых или с использованием I-гидроксибензотриазола в присутствии dcc ). Вос-группу удаляли обработкой 4н. раствором хлористого водорода в диоксане, 1н. раствором хлористого водорода в безводной уксусной кислоте или трифторуксусной кислотой в среде инертного растворителя; Внутримолекулярную циклизацию проводили в присутствии насыщенного при 0°С раствора аммиака в метаноле , либо при нагревании в О,IM растворе уксусной кислоты во вторичном бутиловом спирте в присутствии эквимолекулярных количеств ы-метилморфолина или триэтилами-на.

Индивидуальность синтезированных соединений контролировали посредством ТСХ на силикагеле и целлюлозе, а также данными элементного и аминокислотного анализов. Некоторые константы аналогов ЦГП приведены в таблице 14.

Мы осуществили также синтез серии структурных аналогов карнозина, отличающихся'от природного (З-аланил-ь-гистидина либо мо-

дификацией остатка гистидина, либо замещением остатка /з-аланина на остатки других непротеиногенных аминокислот.

Таблица 14

Аналоги циклогистидилпролина

Т.пл., тех, И- В Выход,

Соединение °С системе: %

о 5 7*

С(—Н1Б-Нур-) (128) 184 0 ,72 0, 81 50

с(-Н1в-иа1-) (129) масло 0 0, 72 46

с(-Н1Б-Та1-) (130) 169-171 0 ,33 0 ,81 15

с(-Н1в-Аа1-) (131) 226-228 0 ,28 0 48 20

с(-Н13-Туг(3-Ш2) ] (132) 156-158 0 ,64 0 37 30

с (—Н± Б-Ш.е-) (133) 219-221 0 ,86 0 ,80 50

с (-Шв-Ваг-) (134) 230 0 13 0 ,49 16

с[-Щб (Вот) -Рго] (135) 180-182 0 90 0 ,92 63

с(-иа1-Рго-) (136) 142 0 50 0 25 55

с(-Та1-Рго-) (137) 125-128 0 94 0 ,86 30

с(-Аа1-Рго-) (138) 165-167 0 ,56 0 ,46 11

с(-Еаг-Рго-) (139) масло 0 20 0 35 43

*Система 7: хлороформ-метанол-вода, 65:25:4

Синтез аналогов карнозина проводили аналогично тому, как било описано для синтеза линейных предшественников циклогистидилпролина. В таблице 15 приведены структуры нуклеоаминокислотных аналогов карнозина, а также некоторые другие аналоги карнозина, представляющие интерес с точки зрения их биологической активности.

10. Изучение биологической активности структурных аналогов циклогистидилпролина и карнозина.

Принимая во внимание, что карнозин выполняет роль эндогенного антиоксиданта и участвует в системе защиты биологических макромолекул от повреждающих окислительных реакций, а также учитывая структурное сходство этого пептида с циклогистидилпролином,

мы цредцриняли изучение антисдесидантной активности этих соединений.

Таблица 15

Аналоги карнозина

Соединение Т.ПЛ., °С е£ в системе: Выход, %

I 5 7

Вос-(3-А1а-Н1з(Вот)-ОН 140) - - 0,42 0, 86 50

Н-|3-А1а-Н1з (Вот) -ОН 141) - - 0, 76 0, 95 92

Вос-Нур-Н1з-0Ме 142) 182-186 - 0,22 - 66

2ТРА-Н-Нур-Н±Б-ОМе 143) - - 0,11 0, 15 98

Вос-те-Нхэ-ОМе 144) 189-190 - 0,67 0, 88 57

2НС1■Н-Ше-Ихв-ОМе 145) 158-161 - 0,35 0, 38 98

Вос-Баг-Н1з-0Ме 146) - о. 61 - 0, 87 66

2НС1•Н-Баг-Н1Б-0Ме 147) 121-123. 0, 19 0, 19 95

Вос-Ца1-Н1з-0Ме 148) 151-155 - 0, 30 88

2НС1•Н-Ца1—Н1г—ОМе 149) - - - 0, 03 79

Вос-Та1-Н1з-0Ме 150) 97-101 0, 86 0,38 86

2НС1* Н—Та1—Н1б—ОМе 151 ) 148-152 0, 63 - 0, 19 99

Вос-Аа1-НхБ-ОМе 152) 135-138 - о. 46 87

ЗНС1•Н-Аа1-Н1Б-ОМе 153) 185—18В 0, 40 - 0, 13 95

Вос-Туг(3-Ы02)-Н1э-ОМе 154) 84-87 0, 70 0, 30 58

НС1 • Н-Ту г (ЗШ2) -Н1 з-ОМе 155) 163-165 0, 53 0,06 70

Вос-/3-А1а-Н1з-ОМе 156) 189-191 0, 88 - 0, 53 67

2НС1•Н-/3-А1а-НаБ-0Ме 157) 210-211 - 0, 07 0, 04 98

Вос-зг-АЬи-Н1з-0Ме 158) 161-162 - - 0, 79 75

2НС1•Н-у-АЬи-Н1з-0Ие 159) 222-224 - - 0, 05 99

Вос-0-иа1-Н1з-0Ме 160) 134-136 - 0, 53 0, 73 67

2НС1•Н-0-иа1-Н1Б-0Ме 161) 187-190 - 0, 15 0, 44 94

BOc-His-Tyr-OEt 162) 205-207 0, 47 0, 85 90

Для этой цели были использованы тесты in vitro, катализируемое ионами двухвалентного железа аскорбат-зависимое окисление ли-пидов в мембранах саркоплазмагического ретикулума из скелетных мышц кролика (тест I) и свободно-радикальное окисление кумола в присутствии азо-бис-изобутиронитрила (тест 2), а также опыты in vivo ( влияние исследуемых соединений на окисление липидов в организме крыс). Эти исследования проводились на Биологическом факультете МГУ (д.б.н. Болдырев A.A.) и в Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (д.б.н.Гуляева Н.В.).

Было установлено , что ряд синтезированных структурных аналогов ЦГП и карнозина обнаруживают отчетливо выраженную антиоксидан-тную активность как в тестах in vitro , так и in vivo.

Сведения об антиоксидантной активности соединений приведены в таблицах 16 и п.

В опытах in vivo исследованные соединения ингибируют накопление продуктов перекисного окисления липидов, причем эффект наиболее выражен в мозге, богатом липидами, и выражен значительно слабее в сыворотке крови. Это показывает, что рассматриваемые соединения проявляют антиоксидантную активность в гидрофобной фазе ( в мембранах), что является важным преимуществом синтезированных соединений по сравнению с карнозином, действующим, главным образом, в гидрофильной фазе. Антиоксидантная активность этих соединений уменьшается с уменьшением их гидрофобности.

В работе впервые было показано, что ЦГП проявляет высокую антиоксидантную активность, превышающую в тесте I эффект такого ан-тиоксиданта, как карнозин. В опытах in vivo по антиокислительному действию ЦГП превосходит все другие исследованные соединения (табл.17). Поскольку ЦГП обнаружен в различных отделах головного мозга, можно предположить, что одной из его физиологических функций является участие в системе антиоксидантной защиты тканей аэробных организмов от перекисного окисления липидов клеточных мембран.

Анализ строения циклодипептидов, обнаруживающих антиоксидантную активность.позволяет сделать вывод, что особенно высокой антиоксидантной активностью должны обладать циклодипептиды, в которых один боковой заместитель содержит имидазольный цикл, а другой - ароматическую или гетероароматическую систему.(рис.2).

Рис.2 (^имидэзолил;

н

Ск Л хСН,-!*!

Ч^ р,=ароматический

*3~Н3СГ>Г ч

н

или гетероциклический заместитель

Среди линейных гистидинсодержавдх дипептидов, являющихся аналогами карнозина, особого внимания в качестве соединений с потенциально высокой антиоксидантной активностью заслуживают дипеп-тиды, содержащие на ы-конце трет.-бутилоксикарбонильную группу, которая обеспечивает высокую гидрофобность соединения.

Таблица 16

Антиоксидантная активность аналогов ЦГП и карнозина

Соединение Антиоксидантная активность, мин % к контролю

с (-Н1в-РЬе-) (163) 5,5 100

с(-Н1б-Рго—) (ЦГП) 17, 5 318,2

с(-Н1з-Ьеи-) (164) 8,5 154,5

с(-Уа1-Рго-) (165) 28,8 523,6

Бос-Туг (ЗЮ2) -Н1Б-ОМе (154) 14,6 265,4

НС1■Н-Н13(Вот)-Рго-ОМе (166) 25,4 461,8

Вос-0-иа1-Н1з-0Ме (160) 15,9 289, 1

бос-н1з—туг—оеъ (162) 11,3 205,5

Таблица 17

Антиоксидантная активность in vivo

Соединение ТБК-акгивные продукты окисления Конъюгированные диены

мозг сыворотка мозг сыворотка

Вос-Туг(3N02)-Hí s-OMe (154) 80,4 100,5 75 6 103,0

HCl•H-His(Вот)-Pro-OMe (166) 69,6 101,1 65 9 95, 4

Boc-D-Ual-His-OMe (160) 87,5 89,5 84 3 89, 0

Boc-His-Tyr-OEt (162) 89,2 100,0 77 1 97,6

с(-Val-Pro-) (165) 89, 2 106,3 82 4 103, 3

с(-His-Pro-) (ЦГП) 44, 3 52, 8 -

II.синтез и изучение биологической активности структурных аналогов фрагмента 14-16 гастрина.

Гастрин является природным желудочно-кишечным гормоном и представляет собой гептадекапептидамид:

Руг-С1у-Рго-Тгр-Ьеи-(С1и)5-А1а-Туг(303Н)-С1у-Тгр-МеЪ-Азр-РЬе-ЫН2

Гастрин вызывает секрецию соляной кислоты, усиливает секрецию ферментов поджелудочной железы, пепсина, повышает моторику кишечника и обладает рядом других функций. Минимальным фрагментом, обладающим полным спектром биологических активностей , свойственных гастрину, является С-концевой тетрапептидамид. Показано, что удаление С-концевого остатка фенилаланина в пептидах, родственных гастрину, приводит к возникновению антагонистической активности. Минимальным фрагментом, сохраняющим антагонистические свойства, является последовательность 14-16 гастрина: тгр-ме1:-А8р-мн2.

с целью поиска потенциальных специфических антагонистов гастрина нами была синтезирована серия аналогов фрагмента 14-16 гастрина, замещенных в положении 14, 15 и 16.

Известно, что остаток триптофана в положении 14 играет существенную роль при связывании гастрина с рецептором, однако замены

этого остатка в некоторых случаях не приводят к потере биологической активности. Кроме того, замещение остатка метионина на остаток лейцина не влияет на биологическую активность. С учетом этого нами был проведен синтез аналогов с заменой триптофана на его D-изомер, фенилаланин и на остатки непротеиногенных нуклеоамино-кислот ь-uai, L-Tai и L-Aai. Другие аналоги фрагмента 14-16 гастрина содержали в положении 15 остаток D-лейцина и остатки небелковых аминокислот - r-аминомасляной (Abu), s-аминовалерьяновой (Аре) и с-аминокапроновой (Ahx) кислот. Принимая во внимание тот факт, что остаток аспарагиновой кислоты очень важен для проявления гастрином агонистической активности, мы синтезировали аналоги с заменой этого остатка на остатки основных^ аминокислот. Ниже приведены рассмотренные структуры:

Вое- -D-Trp-Leu-Asp-NH2 (167) Boc- -Trp- -r~Abu-Asp-NH2 (173)

Вос- -Phe-Leu-Asp-NH2 (168) Boc- -Trp- -ä-Ape-Asp-NH2 (174)

Вос- -Ual-Leu-Asp-NH2 (169) Boc- -Trp- -e-Ahx-Asp—NH2 (175)

Вос- -Tal-Leu-Asp-NH2 (170) Boc- -Trp- -Leu-Lys-KH2 (176)

Вос- -Aal-Leu-Asp-NH2 (171) Boc- -Trp- -Leu-Arg-NH2 (177)

Вос- -Trp-D-Leu-Asp-NH2 (172)

Все соединения синтезированы в растворе последовательным наращиванием цепи, начиная с С-концевой аминокислоты. Для образования пептидной связи использовали метод активированных эфиров (пентафторфениловых или и-оксисукцинимидных), либо карбодиимидный с добавкой 1-гидроксибензотриазола. Аминогруппу защищали Вос-группировкой, С-конец был защищен амидной группой, р-карбоксильная группа аспарагиновой кислоты - бензиловым эфиром.Для удаления Вос-группы применяли раствор трифторуксусной кислоты или хлористого водорода в органическом растворителе. Для отщепления /з-бензилового эфира из остатка аспарагиновой кислоты использовали реакцию каталитического гидрогенолиза.

Некоторые константы и выходы соединений приведены в таблице 18.

Таблица 18

Аналоги фрагмента 14-16 гастрина

соединения Т.ПЛ. °c i< Cl.DMF Rf в системе: Выход, %

I 5

Boc-D-Trp-Leu-Asp-NHj 131-132 -26 0,81 0,82 56

Boc-Phe-Leu-Asp-NH2 168-170 -27,8 0, 79 0, 82 66

Boc-Ual-Leu-Asp-NH2 179-181 -52,3 0, 78 0,66 55

Вое—Tal-Leu-Asp-NH^ 159-161 -20,8 0, 73 0, 83 48

Boc-Aal-Leu-Asp-NH2 191-193 -8,9 0, 56 0,38 50

Boc-Trp-D-Leu-Asp-NH2 129-131 -26 0,81 0,82 72

Boc-Trp—jr-Abu-Asp-NH2 90-92 -22,6 0, 80 0,77 97

Boc-Trp-5-Ape-Asp-NH2 130-132 -19, 4 0,64 0, 73 76

Boc-Trp-c-Ahx-Asp-UH2 115-117 -23,9 0, 72 0, 85 78

Boc-Trp-Leu-Lys-NH2 118-120 -9,4 0,44 0,27 50

Boc-Trp-Leu-Arg-NH., • 250 -7,8 0, 52 0,38 57

Чистоту полученных пептидов подтверждали данными тонкослойной хроматографии, аминокислотного анализа и УФ-спектроме трии.

Исследования биологической активности проводились в тестах in vitro совместно с к.м.н. Шемановым А.Ю.(Научно-исследовательский институт фармакологии РАМН ), в тестах in vivo - совместно с д.м.н.Василевской Л.С. (Институт питания РАМН )

in vitro изучалась способность исследуемых пептидов ингиби-ровать действие пентагастрина (ПГ) путем вытеснения его из гаст-риновых рецепторов подвздошной кишки морской свинки: регистрировали сокращение кишки под влиянием пентагастрина, введенного на фоне испытуемого вещества. Сокращение, вызываемое одним гастрином принималось за 100%. Действие исследуемого аналога выражали в

процентах от соответствующего контроля. Пентагастрин вводили в -7 -S

концентрации 10 'М. Пептиды вводили в концентрации 3-10 М. Результаты тестирования представлены в таблице 19.

Анализ полученных данных показал, что конфигурация остатка аминокислоты в положении 15 фрагмента 14-16 гастрина существенно не влияет на антагонистические свойства пептида. Так, замена остатка ь-лейцина на остаток о-лейцина не приводит к существенному изменению величины эффекта. Замена же остатка ь-триптофана в этом фрагменте на остаток Б-триптофана приводит к исчезновению активности (167) .

Таблица 19

Соединение

Контроль, %

Эффект, %

Boc-D-Trp-Leu-Asp-NH2 (167) -

Boc-Phe-Leu-Asp-NH2 (168 ) -

Boc-Ual-Leu-Asp-NH2 (169 ) -

Boc-Tal-Leu-Asp-NH2 (170) -

Boc-Aal-Leu-Asp-NH2 (171) -

Boc-Trp-D-Leu-Asp-NH2 (172) 100 0*

Boc-Trp-r-Abu-Asp-NH2 (173 ) 100 0±

Boc-Trp-a-Ape-Asp-NH2 (174) 100,0-

Boc-Trp-e-Ahx-Asp-NH2 (175)

Boc-Trp-Leu-Lys-NH2 (176) 100 0*

Boc-Trp-Leu-Arg-NH2 (177) 100 0*

неактивно

неактивно

неактивно

неактивно*

неактивно*

40.4—5,5(3) 35,2-6,1(4) 30,6-12,8(3)

неактивно

50.5-7,6(6)* 37, 2*5,6(3)*

Соединения вызывали сокращение подвздошной кишки морской свинки.

Деления С-концевого остатка фенилаланина в молекуле тетра-гастрина и одновременная замена остатка триптофана на остаток фенилаланина критическим образом сказываются на способности пептида взаимодействовать с гастриновымн рецепторами(1б8). Замена остатка триптофана на остатки нуклеоаминокислот во фрагменте 14-16 также приводит к потере сродства к гастриновым рецепторам ( соединения

169-171).

В опытах in vivo изучалась способность синтезированных пептидов подавлять желудочную секрецию, стимулированную пентагастри-

ном у собак. Пентагастрин вводили в дозе 50 мкг, исследуемые вещества - в дозе 60 мкг на собаку. Полученные результаты представлены на рис.3, на котором показаны объемы выделяемого желудочного сока при введении пентагастрина на фоне исследуемых соединений. В качестве контроля служил объем желудочного сока, вызываемый введением одного пентагастрина.

Рис.3

у.мл 90 -

80 70 60 -50 -40 30 20 -10 -

ПГ

167 169

172

173 174

175

анал.

Анализ полученных данных позволяет выявить следующие закономерности между химической структурой и активностью. При введении остатков и-аминокислот в положение 15 фрагмента 14-16 гастрина (соед.173-175), вызывающих изменение расстояния между остатками триптофана и аспарагиновой кислоты, полученные аналоги не ингиби-руют желудочную секрецию, но, как видно из рисунка Г<, наблюдается тенденция к уменьшению их влияния на стимулированную секрецию при увеличении числа метиленовых в цепи и-аминокислоты, что не противоречит данным, полученным в тестах in vitro.

Введение остатка d-лейцина в положение 15 (аналог 172) не влечет за собой потери антагонистической активности, которой обладает фрагмент 14-16 гастрина, а при инверсии конфигурации аминокислоты в положении 14 (аналог 167) ингибиторные свойства не сохраняются. Замещение остатка триптофана на остаток фенилаланина приводит к неактивному соединению (168). Этот результат согласуется с литературными данными, полученными при изучении аналогов тет-рагастрина, о важности атомов азота в индольном кольце боковой цепи триптофана для биологической активности гастриновыХ пептидов. Видимо, гетероатом азота взаимодействует с комплементарной группой в активном центре рецептора, и отсутствие этого взаимодействия разрушает как агонистическую, так и антагонистическую активность.

Высокую антагонистическую активность показало соединение 176, полученное путем замены остатка аспарагиновой кислоты на лизин. Оно подавляло стимулированную пентагастрином желудочную секрецию приблизительно в 3 раза.

Высокоактивным ингибитором желудочной секреции оказался нук-леоаминокислотный аналог , содержащий остаток урацюшлаланина в положении 14 (169). Он угнетал желудочную секрецию в два раза по сравнению с контрольным опытом. Однако отсутствие активности у этого пептида в тестах in vitro свидетельствует о том, что антагонистический эффект в данном случае достигается не в результате взаимодействия с гастриновыми рецепторами, а каким-то опосредованным образом.

Таким образом, можно заключить, что среди непротеиногенных аминокислот определенный интерес в направленном конструировании потенциальных лекарственных средств могут представлять нуклеоами-нокислоты. Нами синтезировано свыше ста аналогов нейропептидов.в состав которых были введены наряду с нуклеоаминокислотами, также остатки других непротеиногенных аминокислот, при этом были обнаружены 14 веществ с заслуживающей внимание биологической активностью (структуры их приведены ниже). Из них - четыре аналога зн-кефалина 85,88,96,97, восемь аналогов дерморфина 102, ios, 108112, us, дипептид 1бо, обладающий ангиоксидантной активностью и неспецифический ингибитор гастрина 169.

H-Tyr-D-Ala-Gly-L-Tal-Leu-OMe

H-Tyr-D-Phe-Gly-Tal-Leu-OMe

H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-L-Aal-OH

H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Aal-OH

H-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-DL—Tal-OH

H-Tyr-D-Ala-Phe-Tal-Tyr-NH2

H-Tyr-D-Ala-Phe-Tal-NHAd

H-Tyr-D-Ala-Phe-Tal-NHCH(Ph)CH 3

H-Tyr-D-Met(0)-Phe-Tal-NH2

H-Tyr-D-Met(0)-Phe-Tal—NHAd

H-Tyr-D-Met(O)-Phe-Tal—NHCH(Ph)CHj

H-Tal-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-liH2

Boc-D-Ual-His-OMe

Boc-Ual-Leu-Asp-NH2

85 88

96

97 102 105 108

109

110 111 112 118 160 169

В груше опиоидных пептидов получены аналоги с избирательным действием в отношении и-рецепторов ( 38, 108-112), а также 5-рецепторов (97,102). Аналоги 85, 96, 105, 108-112 обладают выраженной анальгетической активностью при интрацистернальном и внутривенном введении (85,96). Следует отметить, что среди нук-леоаминокислот наиболее интересной аминокислотой оказался тими-нилаланин: аналоги, содержащие этот остаток ъ положении 4 или 5

(85, 88, 102, 105, 108-112) ОбЛЭДЭЮТ ВЫСОКОЙ ОПИОИДНОЙ ЭКТИВ-

ностью. Значительное усиление активности этих аналогов происходит при одновременном увеличении гидрофобности молекулы и замене о-аланша-2 на метионинсульфоксид. Гептапептидный аналог не, содержащий Tai на N-конце молекулы, проявляет анальгетическое действие, которое не опосредовано взаимодействием с изучаемыми рецепторами, что стимулирует исследования, направленные на выяснение механизма действия пептида. Подобный результат получен и для ингибитора гастрина 169, который не связывается с гастриновыми рецепторами, однако проявляет антагонистические свойства.

ВЫВОДЫ

I. Разработан метод препаративного разделения рацематов нуклео-аминокислот на оптические антиподы, основанный на стереоизбира-тельном ферментативном расщеплении фенацетильных производных

DL-нуклеоашшокислот под действием пенициллинамидазы из е. coli. Предложен удобный метод контроля стереоспецифичности ферментативного расщепления производных нуклеоаминокислот.

2. Разработаны методы синтеза нуклеопептидов.Осуществлен синтез и изучены свойства защищенных и активированных производных оптических изомеров нуклеоаминокислот.Впервые осуществлен полный химический синтез и проведена корреляция конфигураций природных нуклеопептидов, выделенных из Fagus silvatica, и их аналогов.

3. Осуществлен синтез серии неизвестных ранее нуклеоаминокислот ных аналогов опиоидных пептидов: киоторфина , энкефалинов, дер-морфина и дельторфина.

4. Показано, что нуклеоаминокислотные аналоги нейропептидов обладают повышенной устойчивостью к действию тканевых ферментов и, как правило, способны специфически связываться с опиатными рецепторами. Обнаружены аналоги, обладающие высокой избирательностью связывания в отношении и- и &- опиатных рецепторов.

5. В опытах in vivo установлено, что нуклеоаминокислотные аналоги энкефалинов и дерморфина проявляют высокую анальгетическую активность при ннтрацистернальном введении и активны при внутривенном введении.Особенно высокой анальгетической активностью обладают нуклеоаминокислотные аналоги дерморфина, содержащие в положении 4 остаток тиминилаланина.

6. Показано, что замещение остатка тирозина в положении I на остатки тиминилаланина приводит к аналогам дерморфина, проявляющим анальгетическую активность.

7. Синтезированы новые структурные аналоги дельторфина.В тестах in vitro установлено, что полученные синтетические аналоги дельторфина способны специфически связываться с опиатными рецепторами, причем некоторые пептиды обладают высокой 5-селективностью.

8. Осуществлен синтез структурных аналогов циклогистидилпролина и

карнозина, содержащих остатки непротеиногенных аминокислот. Обнаружено, что ряд аналогов циклогистидилпролина и карнозина проявляют высокую антиоксидантную активность и способны эффективно ин-гибировать перекисное окисление липидов in vitro и in vivo.

9. Впервые установлено, что цнклогистидилпролин проявляет высокую антиоксидантную активность, превосходя в этом отношении карнозин. и родственные гистидинсодержащие пептиды. Это позволяет предположить, что одной из физиологических функций циклогистидилпролина является его участие в системе антиоксидантной защиты тканей аэробных организмов от повреждающих реакций перекисного окисления липидов, входящих в клеточные мембраны.

10. Проведен синтез новых структурных аналогов фрагмента 14-16 гастрина. В тестах in vitro и in vivo установлено, что ряд синтезированных аналогов проявляют свойства антагонистов природного гормона и тормозят желудочную секрецию, индуцированную пентагаст-рином. Обнаружено, что аналог фрагмента 14-16 гастрина, содержащий в положении 14 остаток ь-з-(урацилил-1)аланина, будучи неактивным в тестах in vitro, проявляет высокую антагонистическую активность в опытах in vivo.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Мишин Г.П., Коршунова Г.А.,Швачкин Ю.П. Успехи и проблемы твердофазного пептидного синтеза // Успехи химии. - 1974.-Т.43. N II.- С.2014-2044.

2.Швачкин Ю.П., Семилетов Ю.А., Коршунова Г.А..Мишин Г.П. Твердофазный синтез олигонуклеопептида, содержащего монотонный блок из остатков урацилил-^-а-аланина // ЖОХ.- 1975,- Т. 45. - С.247.

3. Швачкин Ю.П., Семилетов Ю.А., Коршунова. Твердофазный синтез олигонуклеопептидов, содержащих монотонный блок из остатков аде-нилил-кэ-аланина. // ЖОХ. - 1975 - Т.45, N9.-C.2II0

4. Швачкин Ю.П., Коршунова Г.А., Воскова H.A. Синтез гомонуклео-пептидов поликонденсацией активированных эфиров нуклеоаминокис-лот. // ЖОХ. - 1976 - Т.46. - С.199-200.

5. Швачкин Ю.П., Воскова Н. А., Коршунова Г.А., Семилетов Ю.А., Савелова Н.В. Получение оптически активных нуклеоаминокислот., // Вестник МГУ. - 1976 - Т.17, N5. - С.598-601.

6. Швачкин Ю.П., Воскова H.A., Коршунова Г.А. Получение стереоре-гулярных гомонуклеопептидов из активированных производных оптических изомеров урацилил-ы1-а-аланина. // ЖОХ. - 1976. - Т.46.-С.2634.

7. Швачкин Ю.П., Воскова H.A., Коршунова Г.А. Полный синтез вил-ЛарДИИНОВЫХ ПеПТИДОВ, ВЫДеЛеННЫХ ИЗ Fagus silvatica. // ЖОХ. -1977. - Т.47. - С.2631-2632.

8. Швачкин Ю.П., Воскова H.A., Семилетов Ю.А., Коршунова Г.А., Купцова О.С., Яковлева И.В. О разделении ß-(тиминил-t^)-а-алашша и э-(цитозинил-ы1)-а-аланина на оптические антиподы. // Вестник МГУ. - 1977.- Т.18, N4. - С.482-484.

9; Романов В.В., Воскова H.A., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Изучение кругового дихроизма нуклеоаминокислот. // Вестник МГУ. -1977. - Т.18, N6. - С.741-743.

10. Романов В.В., Воскова H.A., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Нук-леоаминокислоты и нуклеопептида. Изучение конформации нуклеоаминокислот в растворе. // Биорган. химия. - 1979. - Т.5, N4. -С.536-545.

11. Воскова H.A., Романов В.В., Сумбатян Н.В., Коршунова Г.А.. Швачкин Ю.П. Метод определения абсолютной конфигурации и количественного содержания стереоизомеров аминокислот в смесях. // Биоорган. химия. - 1980. - Т.6, N5. - С.731-736.

12. Семилетов Ю.А., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез стереоре-гулярных нуклеопептидов смешанного типа, содержащих остатки /з-тиминил-^-а-аланина, э-аденилил-ы9-а-аланина и ь-лизина. // ЖОХ. - 1980. - Т.50, N4. - С.958-959.

13. Воскова H.A., Семилетов Ю.А., Коршунова Г.А., Сумбатян Н.В., Швачкин Ю.П. Ступенчатый синтез в растворе стереорегулярных гомонуклеопептидов, содержащих остатки ь-урацилил-^-а-аланина. // ЖОХ. - 1980. - Т.50, N2. - С.477-478.

14. Семилетов Ю.А., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Нуклеоаминокис-лоты и нуклеопептида. vlll. Твердофазный синтез нуклеопептидов смешанного типа, содержащих остатки Р-урацилил-^-а-аланина и аланина. // ЖОХ. - 1981. - Т.51, и!0. - С.2369-2372.

15. Швачкин Ю.П., Семилетов Ю.А., Коршунова Г.А., Галаев И.Ю., Швядас В.К., Березин И.В. Способ получения стереоизомеров /з-аденшшл-л9-а-аланина. // Авт. свид. СССР м 845418. - 1981.

16. Коршунова Г.А., Семилетов Ю.А., Рябцева О.Н., Швачкин Ю.П. Получение оптических изомеров /з-гипоксантинил-^-а-аланина. // Вестник МГУ. - 1982. - Т.23, N2. - С.177-178.

17. Коршунова Г.А., Семилетов Ю.А., Рябцева О.Н., Швачкин Ю.П. О разделении рацематов нуклеоаминокислот на оптические антиподы. // Вестник МГУ. - 1982. - Т.23,. N4. - С.412-413.

18. Voskova Н.А., Romanov V.V.,Korshunova G.A., Shvachkin Yu.P. An express method for determination of absolute configuration and quantity of aminoacid enantiomers in mixtures. // Chemistry of Peptides and Proteins, (Walter de Gruyter, Berlin, New York) -1982. -V.1. - P.373-376.

19. Швачкин Ю.П., Мишин Г.П., Коршунова Г.А. Успехи и перспективы химии нуклеоаминокислот и нуклеопептидов. // Успехи химии. -1982. - Т.51, N2. - C.3II-33I.

20. Рябцева О.Н., Семилетов Ю.А., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез стереорегулярных нуклеопептидов смешанного типа, содержащих остатки ь-нуклеоаминокислот и лизина. // ЖОХ. - 1983. - Т.53, Nio. - C.24II-24I2.

21. Швядас В.К..Галаев И.Ю., Семилетов Ю.А., Коршунова Г.А. Субстратная специфичность пенициллинацилазы из E.coii в ряду производных ы-ацилированных аминокислот и дипептидов. // Биоорган.химия.-1983. - Т.9, N8. -C.II39-II4I.

22. Рябцева О.Н., Коршунова Г.А., Семилетов Ю.А., Швачкин Ю.П. Нуклеоаминокислот и нуклеопептиды. XI. Синтез нуклеопептидов смешанного типа, родственных киоторфину. // ЖОХ. - 1985. - Т.55, N1. - С.208-214. (

23. Рябцева О.Н., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез тиминилала-ниновых аналогов лейцин-5-энкефалина. // ЖОХ. - 1985. - Т.55, N12. - С.2787-2788.

24. Рябцева О.Н., Семилетов Ю.А., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез нуклеоаминокислотных аналогов природных нуклеопептидов. // ЖОХ. - 1985. - Т.55, Nil. - С.2633-2634.

25. Коршунова Г.А., Добкина И.М., Сумбатян Н.В., Швачкин Ю.П. Ферментативный синтез нуклеопептидов. // Хим. прир. соед. - 1986.

- Т.2. - С.252-255.

26. Рябцева О.H., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез нуклеоами-нокислотных аналогов киоторфина. // ЖОХ. - 1987. - Т.57, N5. -С.1200.

27. Коршунова Г.А., Добкина И.М., Рябцева О.Н., Швачкин Ю.П. Нук-леоаминокислоты и нуклеопептиды. XII. Синтез и свойства аденилил-аланиновых аналогов лейцин-5-энкефалинов. // ЖОХ. - 1987. - Т.57, N7. - C.I647-I656.

28. Рябцева О.Н., Петрова М.Г., Коршунова Г.А., Чиченков О.Н., Швачкин Ю.П. Изучение анальгетической активности нуклеоаминокис-лотных аналогов нейропептидов при их интрацистернальном и внутривенном введении мышам. // Фармакол. и токсикол. - 1987. - Т.6. -С.20-23.

29. Рябцева О.Н., Петрова М.Г., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез нуклеопептидов смешанного типа, родственных энкефалинам. // ЖОХ. - 1987. - Т.57, N4. - С.963-964.

30. Коршунова Г.А., Петрова М.Г., Таскаева Ю.М., Сумбатян Н.В., Швачкин Ю.П. Нуклеоаминокислоты и нуклеопептиды. XIv. Синтез и свойства нуклеоаминокислотных аналогов фрагмента 1-5 дерморфина. // ЖОХ. - 1987. - Т.57, N6. - С.1393-1401.

31. Сумбатян Н.В., Грегер К., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез укороченных аналогов дерморфина. // ЖОХ. - 1987. - Т.57, Nil. -С.2647-2648.

32. Чиченков О.Н., Сумбатян Н.В., Рябцева О.Н., Коршунова Г.А., Шорр В.А., Швачкин Ю.П. Сравнение опиоидной активности аналогов энкефалинов и дерморфина. // Фармакол. и токсикол. - 1988. - Т.5.

- С.17-20.

33. Сумбатян Н.В., Коршунова Г.А., Чиченков О.Н., Швачкин Ю.П. Пептид обладающий анальгетической активностью. // Авт. свид. СССР N I5I03I5. - 1987.

34. Бавыкина Н.И., Батрукова М.А., Болдырев A.A., Гуляева Н.В., Дупин A.M., Коршунова Г.А., Обидин А.Б., Швачкин Ю.П. Гистидин содержащие дипептиды, обладающие антиоксидантной активностью. // Авт. свид. СССР, N I6I6II5. - 1988.

35. Швачкин Ю.П., Коршунова Г.А., Бавыкина Н.И., Гуляева Н.В.,Дупин A.M., Болдырев A.A., Северин С.Е. Антиоксидантная активность циклогистидилпролина. // Бюлл. экспер. биол.и медицины. - 1989 -

Т.12. - С.671-673.

36. Варфоломеев С.Д., Зайцев С.В., Курочкин И.Н., Рябцева О.Н., Келдыш -П. Л.,'Коваленко А.Е., Коршунова Г.А., Ишков А.Г., Изотов E.H. Способ определения наркотических опиоидных веществ. // Авт. свид. СССР, N I558I83. - 1989.

37. Коршунова Г.А., Сумбатян Н.В. Дерморфин:синтез аналогов и структурно-функциональные отношения. // Биоорган, химия. - 1989.

- Т.15, N7. - С.869-903.

38. Шендерович М.Д., Лиепиня И.Т., Никифорович Г.В., Сумбатян Н.В., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Конформационно-функциональные отношения дерморфина и его пентапептидных аналогов. // Биоорган, химия. - 1989. - Т.15, N9. - С.II6I-II72.

39. Грегер К., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез пентапептидных аналогов дерморфина. // ЖОХ. - 1989. - Т.59, N12. - С.2801-2802.

40. Бавыкина Н.И., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез нуклеоами-нокислотных аналогов цикло(ь-гисгидил-ь-пролина). // ЖОХ. - 1989.

- Т.59, N1. - С.234-235.

41. Boldyrev A.A., Dupin A.M., Batrukova M.A., Korshunova G.A., Schwachkin Yu.P. A comparative study of synthetic carnosine analogs as antioxidants. // Int.J.Comp. Biochem. Physiol. - 1989. -v.948(2). - P.237-240.

42. Бавыкина Н.И., Габриэлян А.Э., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез дикетошшеразинов родственных циклогистидилпролину. // ЖОХ. - 1990. - Т.60, N1. - С.170.

43. Грегер К., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез тиминилалани-новых аналогов опиоидных пептидов. // Вестник МГУ. - 1990. -Т.31, N3. - С.323.

44. Таскаева Ю.М., Коршунова Г.А., Василевская Л.С., Швачкин Ю.П. Синтез структурных аналогов фрагмента 13-16 гастрина и изучение их влияния на желудочную секрецию. // Хим.-фарм. журнал. - 1990.

- Т.24, N2. - С.124-127.

45. Грегер К., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез и изучение связывания опиатными рецепторами аналогов дермэнкефалина. // ЖОХ.

- 1991. - Т.61, N3. - С.779-780.

46. Таскаева D.M., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез нуклеоами-нокислотных аналогов фрагмента 14-16 гастрина. // Вестник МГУ. -1991. - Т.32, N4. - С.420-421.