Синтез и изучение пептидных антагонистов гастрина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 547.964.4

Юлия Матвеевна ТАСКАЕВА

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ПЕПТИДНЫХ АНТАГОНИСТОВ ГАСТРИНА

Специальность 02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 1991

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор химических наук, профессор Ю. П. Швачкин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор химических наук В. А. Шибнев кандидат химических наук Е. Н. Олсуфьева

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ЦХЛС - ВНИХФИ им. С.Орджоникидзе

Защита состоится « 2.8 » МРЯ 1991 г. в 4час. па

заседании Специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус «А», аудитория 50/ .

Автореферат разослан « 43 » С1НО(1/1$ 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совет кандидат химических наук

/

И. Г. Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Регуляторные пептиды широко распространены в природе и играют важную роль в процессах жизнедеятельности. Среди регуляторных пептидов особое внимание привлекают желудочно-кишечные гормоны, в частности, гастрин.

Несмотря на большое число исследований, посвященных гастрину, многие принципиальные проблемы, касающиеся молекулярных механизмов действия, взаимосвязи между структурной организацией молекулы и ее биологической активностью, модификаций, приводящих к возникновению антагонистического эффекта, до сих пор остаются открытыми. Создание антагонистов гастрина является важной задачей, так как решение ее связано с созданием новых лекарственных препаратов для ■ лечения больных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта. Однако .. до сих пор изучение пептидных антагонистов гастрина проводилось ■ недостаточно. Применяемые в настоящее время терапевтические'средства действуют неспецифично и обладают недостаточно высокой активностью. ,

Поэтому весьма актуальной проблемой является разработка методов синтеза и изучение структурных модификаций, приводящих к созданию высокоактивных антагонистов гастрина..

Цель работы. Целью настоящей работы является синтез структурных аналогов фрагментов гастрина, обладающих антагонистической активностью, и изучение свойств этих соединений.

Научная новизна и практическая значимость работы. Б результате проведенного исследования осуществлен синтез неизвестных ранее структурных аналогов фрагмента 13-16 гастрина, отличающихся от природной последовательности модификацией остатка глицина в положении 33 или его заменой на остаток * -аминокислоты. Проведен син-

тез серии новых структурных аналогов фрагмента 14-16 гастрина, отличающихся от природного трипептида замещениями аминокислотных остатков в положениях 14, 15 или 16. Впервые синтезированы нуклео-аминокислотные аналоги фрагмента 14-16 гастрина, содержащие остатки нуклеоаминокислот в положении 14. Получены новые структурные аналоги фрагмента 14-17 гастрина, содержащие алкильные и аралкиль-ные заместители в амидной группировке. В тестах in vitro установлено, что ряд синтезированных структурных аналогов гастрина проявляет свойства антагонистов природного гормона. В опытах in vivo показано, что некоторые структурные аналоги фрагментов 13-16 и 14-16 гастрина тормозят желудочную секрецию, индуцированную пента-гастрином. Обнаружено, что нуклеоаминокислотный аналог фрагмента 14-16 гастрина, содержащий в положении 14 остаток 1»-/-(ураци-лил- и1 )-«-аланина, будучи неактивными тестах in vitro, проявт ляет высокую активность антагониста гастрина в опытах in vivo.

Результаты настоящего исследования имеют общий характер и могут сЬть использованы при дальнейших исследованиях по синтезу пептидных анатагонистов гастрина, а также при изучении закономерностей связей между структурой и активностью в ряду аналогов гастрина.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на УП Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Таллинн, 1987 г.), на П съезде гастроэнтерологов (Днепропетровск, 1989 г.), на Всесоюзной научной конференции по нейрогуморальным механизмам регуляции (Томск, 1989 г.), на УШ научной конференции по вегетативной регуляции (Тбилиси, 1989 г.).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного изучению связи между структурой и биологической активностью в ряду аналогов тетрагастрина, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литера-

туры. Работа содержит -/^7 страниц машинописного текста, зключая 15 таблиц, ,16 схем, 12 рисунков и список цитируемой литературы (125 ссылок).

СОДЕРЖНЙЕ РАБОТЫ

I. Синтез структурных аналогов фрагмента 13-16 гастрина. замещенных в положении 13

Гастрин. является природным желудочно-кишечным гормоном. В

структурном отношении он представляет собой гептадекапептидамид

1 5 11Ч°зН) 15 . 17 ,

Руг-а1у-Рго-Тгр-Ьеи-(а1и)д-А1а-Туг-С1у-Тгр-Ме1-Азр-РЬе-МН2 .

Гастрин вызывает секрецию соляной кислоты, усиливает секрецию ферментов поджелудочной железы, пепсина, повышает моторику кишечника и обладает рядом других фунций. Установлено, что минимальным фрагментом, обладающим полным спектром биологических активностей, свойственных гастрину, является С-концевой тетрапептидамид, получивший название тетрагастрина/

Показано, что удаление С-концевого остатка фенилаланина в пептидах, родственных гастрину, приводит к возникновению антагонистической активности. Минимальным фрагментом, сохраняющим антагонистические свойства является последовательность 14-16 гастрина.

Нами были синтезированы аналоги фрагмента 13-16 гастрина, от-' личающиеся от природной последовательности модификацией остатка глицина в положении 13 или его замещением на остаток »-аминокислоты. Нашей задачей было установить, приводит ли введение гидрофобных заместителей на N -конце пептида к увеличению сродства к гастриновым рецепторам и возрастанию биологической активности. Мы

запланировали синтез следующих аналогов: #

Здесь и далее, если не указано особо, все аминокислоты ь-ряда.

Во с-Glу-Ттр-Leu-Asp-NH„

(I)

Boc- S —Ape—Trp-Leu-Asp—NHg (ill)-

BOC-6 -Ahx-Trp-Leu-Asp-NH2 (IV)

Boc- ¡f -Aby—Trp-Leu-Asp-NHg (II)

где y-Abu - у-амивоыасляная кислота; S -Ape - ¿-еминовалериановая кислота; £-Ahx - £-аиинокапроновая кислота.

Соединения 1-1У отличаются от природного гастринового фрагмента замещением остатка Met на остаток Leu. Известно, что такая замена в пептидах, родственных гастрину, не влияет на биологический ответ. Аналоги 1-1У были синтезированы в растворе наращиванием цепи, начиная с С-концевой аминокислоты (схема I).

Схема I.

Тгр

Leu

Asp

Boc Boc Вое

OSu

Вое Вое

н

OSu

Вое Вое н

HCl/ди океан

H2/Pd

OSu

Boc

Boc tfa/dcm H

tfa/dcm

OBzl

OH OBzl

• nh2

OBzl

nh2

OBzl mh2 OBzl

nh2

OBzl

nh2

OBzl

NHo

2

OBzl ^ NHo

KH2 (I-I/) X e Gly, ¡f-Abu, S-Ape, £ -Afax

Для образования пептидной связи был использован метод активированных эфиров. Аминогруппы защищали трет-бутилоксикарбонильной группировкой (Вое), С-конец был защищен анидной группой, j>- карбоксильная группа аспарагиновой кислоты - бензиловым эфиром. Для удаления Вос-грушш применяли раствор трифг оруксусной кислоты или

хлористого водорода в органическом растворителе. Вос-группу из остатка триптофана удаляли 4 н. раствором хлористого водорода в диоксане, с добавкой анизола, в атмосфере инертного газа. Для отщепления /-бензилового эфира из остатка аспарагиновой кислоты использовали реакцию каталитического гидрогенолиза.

Некоторые физико-химические констранты и выходы соединений 1-1У представлены в таблице I.

2. Синтез структурных аналогов фрагмента 14-16 гастрина, замещенных в положении 14. 15 или 16

Известно, что изменение расстояния между боковыми группами остатков триптофана и аспарагиновой кислоты приводит к сильному снижению агонистической активности. Нашей задачей было выяснить, сохраняется ли эта закономерность в ряду антагонистов гастрина. С этой целью мы синтезировали следующие аналоги фрагмента 14-16 гастрина, в которых в положение 15 введены остатки у-аминомасля-ной, S-аминовалериановой или б-аминокапроновой кислот:

Вос-Тгр- f-Abu-Asp-NH2 (V) Вос-Тгр- S-Ape-Asp-NHg (VI) Вос-Ггр- £-Ahx-Asp-HHg (VII)

Соединения У-УП синтезированы в растворе последовательным наращиванием цепи, начиная с С-концевой аминокислоты (схема Z), с использованием н -гидроксисукцининидннх эфиров.

При изучении структурно-функциональных зависимостей в раду"' аналогов других пептидных биорегуляторов (вещества Р, брадаагникз и др.) было установлено, что замена'остаяков ь-аминокаслог на остатки »-аминокислот в некоторых случаях приводит к возникновению агонистических свойств. Кроме того, введение нзпротеиногенных аминокислот приводит к повышению устойчивости пептида к фермента-

тивному расщеплению.

Схема 2

Тгр

х

ASp

Вое ---OSu

OBzl

OSu Н

Вое

TFA/DCM

Вое

OSU

н

ЫН2 DBzl

ын2

Вое

H2/Pd

NH2 (V—VII)

вое

где X В ¡¡"-Abu, 6"-Аре, £ —Ahx

Мы синтезировали аналоги фрагмента 14-16 гастрина, в которых остатки l-триптофана и ь-метионина были замещены на остатки D-триптофана и d-лейцина.

Соединение X, известное из литературы как конкурентный антагонист гастрина, было использовано нами в качестве эталона. Аналоги УШ-Х были получены аюлогично соединениям У-УП.

Наличие остатка триптофана в пептидах создает сложные проблемы в процессе их синтеза, а также делает полученные соединения неустойчивыми при хранении. Мы осуществили синтез аналога фрагмента 14-16 гастрина, в котором остаток триптофана был замещен на остаток фениле па вина, а также получили пептид, в котором к этому аналогу с к-конца был присоединен остаток Вос-^з-аланина (в ряду аналогов тетрагастрина, проявляющие агонистическую активность присоединение к N-концу остатка Вос-Р-аланина приводит к резкому повы-вешю биологической активности. Полученный пептид, так называемый

Boc-B-Trp-leu-Asp—NHg (VIII) Boc-Trp-D-Leu-Asp—NHg (IX) Boc-Trp-Leu-Asp-NH2 (X)

пентагастрин, обладает активностью, равной активности 17-членного природного .гастрина).

Вос-РЬе-Ьеи-Азр-1?Н2 (XX) Вое-/ -А1а-№е-1.еи-Азр-МН2 (XII)

Стратегия синтеза была аналогична примененной при синтезе соединений 1-Х.

Известно, что остаток аспарагиновой кислоты в положении 16 играет ваяную роль в проявлении гастриновыми пептидами специфического биологического действия - подавляющее большинство замен этого остатка приводит к полной потере агонистической активности. Так как нашей задачей было создание антагонистов гастрина, нами были синтезированы аналоги с заменами в этом положении на остатки аминокислот, несущих в боковой цепи положительный заряд или лишенные заряда:

Вос-Тгр-Ьеи-Зег-ИН2 (XIII) Вос-Тгр-Ьеи-Ьеи-Ш^ (XV)

Вос-Тгр-Ьеи-Ьуз-1№2 (XIV) Вос-Тгр~Ьеи-Агд-НН2 (XVI)

Соединения ХШ-ХУ были синтезированы в растворе последовательным наращиванием цепи, начиная с С-концевой аминокислоты. Для образования пептидной связи использовали метод активированных н-гид-роксисукцинимидных эфиров. Аналог ХУ1 синтезировали карбодиимидным методом с добавкой N -гидроксибензотриазола. Гуанвдиновую группу остатка аргинина защищали нитрогруппой, удаление которой на стадии демаскирования проводили формиатом аммония в присутствии 10% палладия на угле (схема 4).

Показано, что остаток триптофана в положении 14 играет существенную роль при связывании гастрина с рецептором, однако замены этого остатка в некоторых случаях не приводят к потере биологической активности. В то же время замена остатков белковых аминокислот

на остатки нуклеоаминокислоты з молекулах других биоактивных пептидах (энкефалине, дерморфине, циклогистидинпролине и др.) приводит к повышенной устойчивости к действию протеолитических ферментов и высокой биологической активности.

Схема 4.

тгр

1еи

Вое Вое Вое Вое вое

он н — рсс.новт

ИаОН

форыиат аммония

овс

ОЕ1:

он

Агд

. Вое — ^ о!

жи

Вое

ьсс.новт

|/Ы02 Н — ь- нн

кн2 2

/

ко£ кн,

кн.

(XVI)

Кроме того, нуклеоаминокислоты обладают способностью к образованию водородных связей за счет присутствующего в боковой цепи нуклеинов вого основания, что.может благоприятствовать взаимодействию пептида с рецептором. Исходя из этого, нами были синтезированы аналоги фрагмента 14-16 гастрина, содержащие в полонении 14 остатки нуклео-аминокислот: I.-/-(урацилил-и1 )-<*-аланина (ь-иа1), минил-и1 )-«.-аланина (ь-Та1) и ь-^-(аденилил-н9 )-<*--аланина (1,-Аа1):

Вос-Ь-0а1-Ьеи-Азр-НН2 (XVII)

Вос-Ь-Тга-Ьеи-Азр-Ш2 (XVIII)

Вос-Ь-Аа1-Ьеи-А5р-Ш2 (XIX)

Исходные нуклеоаминокислоты были получены в препаративном масштабе четкрехстадийным синтезом.

Р

инэ

ИН.

сн,

2

сн.

сн.

2

2

HgN-CHCOOH

Н N-CH-COOH

H2N-CWCOOH

Tal

Aal

Соединения ХУП-Х1Х были синтезированы в растворе последовательным наращиванием цепи, начиная с С-концевой аминокислоты. Реакцию образования пептидной связи проводили методом.активирозанных эфиров (пентафторфениловых или м-гидроксисукцинимидных), либо карбодиимидным методом с добавкой 1-гидроксибензотриазола. ^-Карбоксильную группу остатка аспарагиновой кислоты защищали бензиловым эфиром, который на последней стадии удаляли каталитическим гидро-гинолизом в присутствии 10% палладия на угле.

Некоторые константы и сведения о выходе пептидов У-Х1Х представлены в таблице I.

3. Синтез структурных аналогов фрагмента 14-17 гастрина.

Существует гипотеза, что после связывания гастринового пептида с рецептором, происходит ферментативное расщепление связи между остатками Met и Asp, и освобождающийся при этом С-концевой ди-пептид Asp-phe-tfHj определяет агонистическую активность гасгрйна. В то же время известно, что фенильное кольцо боковой цепи остатка фзнилаланина участвует в процессе связывания с гастриновыми рецепторами, а стимуляция желудочной секреции обеспечивается амидной группировкой. Исходя из этого, мы синтезировали аналоги фрагмента 14-17 гастрина, в которых было сохранено положение боковой Цепи

замещенных в амидной группировке

Таблица I.

№ соед. ! ! Соединение ! ! l l T I ^пл j | УФ ! Выход, I n,

I I ! 2 ! 3 I °C j(CI,®WA)j Л i HM ( e ) ! "

I t 2 ! 3 ! 4 I 5 f 6 l 7 I 8 ! 9

I Boc-Gly-Trp-beu-Asp-NHg 0,56 0,84 0,75 199-201 -26,0° Л min ^max ¿max 250 284 293 1520) 4740) 3960) 63

Ii Boc- y-Abu-Trp-Leu-Asp-NH^ 0,59 0,94 0,74 234-235 -11,2" imin imax 3max 248 281 285 2930) 6160) 5560) 97

m Boc- S-Ape-Trp-Leu-Asp-HHg 0,83 0,89 0,88 199-202 -23,0° /Imin ylmax Ягаах 248 280 250 2720) 5620) 4970) 22

IV Вое-6-Ahx-Trp-Leu-Asp-NH2 0,68 0,88 0,79 206-206 -23,0° Ämin Яшах Яшах 250 284 293 1390) 5260) 3573) 44

V 1 Вос-Тгр- у—Abu—Asp—NHg 0,59 0,77 0,80 90-92 -22,6° ümin /1тах ?max 244 281 290 1740) 5540) 4710) 97

VI Boc-Trp- f-Ape-Asp-NHg 0,51 0,73 0,64 130-132 19,4° jtmin jlmax )max 245 281 289 1690) 4780) 4090) 76

VII Bog—Trp— £-Ahx-Asp-NH2 0,42 0,85 0,72 115-117 -23,9° )min ^max Amax 244 280 289 2130) 4810) 3900) 78

2

13 ! 4

VIII BoC-D-Trp-Leu-Asp-NHg 0,72 0,82

IX Вое—Trp—D—Leu—As p—NH^ 0,72 0,82

X Boc-Trp-Leu-Asp-NHg 0,83 0,88

XI Boc-Phe-Leu-Asp-HHa 0,74 0,82

XII Boc- ^-Ala-Phe-Leu-Asp-NH2 0,82 0,80

XIII Boc-Trp-Leu-Ser-NH2 0,64 0,92

XIV Boc-Trp-I/eu-bys-NH^ 0,04 0,27

XV Boc-Trp-Leu-Leu-NHg 0,83 0,84

XVI Boc-Trp-Leu-Arg-NH2 0,01 0,38

Таблица I (продолжение)

! 5 ! 6 ! 7 ! 8 ! 9

о,81 131-132 -26,0^* )пип /)тах }тах 244 (1420) 281 (5020) 290 (4180) 56

0,81 129-131 -22, ег Лтгп }иах /!тах 245 (1580) 280 (5410) 290 (4540) 72

0,85 222-224 - 62

0,79 168-170 -27,8° - 66

0,65 176-178 -26,3° - 77

0,95 107-109 - 4,7° ?тах /1тах 243 (1847) 274 (5147) 290 (4679) 27

0,44 118-120 - 9,4° Дгаах 243 (1633) 274 (5306) 290 (5034) 50

0,64 227-230 -32,2° /)тах Л шах 245 И 660) 280 (6050) 290 (5040) 76

0,52 250 ^ 7.8** Лтд.п ^гаах Лтах 252 (2096) 280 (4762) 290 (4190) 57

Таблица I (продолжение)

11_2__I 3 1.4! 5 ! 6 1 7 I_8__1 9

XVII Вос-Ь-иа1-11еи-А5р-ЫН2 0,52 0,66 0,78 179-181 -52,3° 232 (2170) )шах 264 (8680) 55

XVIII Вос-Ь-Та1-Ьеи-Азр-Ш12 0,39 0,83 0,73 159-161 -20, (Г Ып 236 (1515) Ашах 270 (3030) 48

XIX Вос-Ь-Аа1-Ьеи-Аз р-Ш 0,61 0,38 0,56 191-193 - 8,/*° 232 (1058) Ьах 262 (3527) 50

• *Хроматографические системы: (I) хлороформ - метанол (4:1);

, (2) н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:1); (3) 1-пропанол - 25/5 аммиак - вода (14:1:5).

**С = 0,5

"Растворитель - ДМСО

остатка фенилаланина, а аыидная группировка была модифицирована путем введения в нее алкильных заместителей нормального и разветвленного строения, либо фенилэтильной группы. Был такте синтезирован аналог тетрагастрина со свободной карбоксильной группой (ХХУ). Вос-Тгр-Ьеи-Азр-РЬе-нннех (хх) Вос-Тгр-Ьеи-Аэр-РЬе-ЯНВи (XXI)

Вос-Тгр-Ьеи-Азр-РЬе-НН1Ви (XXII) Вос-Ггр-Ьеи-Азр-РЬе-ГШВи*" (XXIII)

Вос-Тгр-Ьеи-Азр-РЬе-иНСН^РЬ (XXIV) Вос-Тгр-Ьеи-Азр-РЬе-ОН (XXV)

Соединения ХХ-ХЛ1 синтезированы в растворе последовательным наращиванием цепи, начиная с С-концевой аминокислоты. Реакцию образования пептидной связи проводили методом н-гидроксисукцинимид-ных эфиров. Замещенные амидные группировки получали путем конденсации N-защищенного фенилаланина с соответствующим амином. Для защиты аминогруппы фенилаланина и промежуточных пептидов использовали трет.-бутилоксикарбонильную группу, которую удаляли 70^-ной трифгоруксусной кислотой в хлористом метилене. ^-Бензиловый эфир аспарагиновой кислоты удаляли каталитическим гидрогенолизом в присутствии 10/& палладия на угле.

Соединение ХХ1У получали фрагментной конденсацией (2+2) в соответствии со схемой 5. Конденсацию фрагментов осуществляли карбо-дйимйдным методом с добавкой 1-гидроксибензотриазола. Бензиловый эфир аспарагиновой кислоты удаляли форматом аммония в присутствии 10%-ного палладия на угле. Соединение ХХУ синтезировали по аналогичной схеме.

Некоторые физико-химические константы и сведения о выходе соединений ХХ-ХХУ представлены в таблице 2.

Таблица 2.

№ I | в.* I Тпп I МР ! УФ !Вых(

соед,! Соединение !-£-! „Ш1 1/лТ™л»л1 л ч ! %

1_ _| I |2 13 ! С ¡(1Л,ДМФА); А(нм (е ) ]

XX Вос-Тгр-Ьеи-Аэр-РЬе-ЫННех 0,64 0,98 0,92 162-164 -39,2° ?тах ),так 243 275 292 (1908) (4770) (4389) 94

XXI Вос-Тгр-Ьеи-Авр-РЬе-ЛНВи 0,81 0,97 0,89 182-183 -42,1° ?тах ^тах 248 283 291 (2054) (5842) (4950) 88

XXII Вос-Тгр-Ьеи-Азр-РЬе-Ш1Ви 0,85 0,98 0,92 179-181 -42,3° /1т1п }тах }тах 249 283 291 (2083) (4722) (4167) 55

XXIII Вос-Тгр-Ьеи-АБр-РЬе-КНВи'" 0,83 0,98 0,90 151-153 -25,2° Атхп ?тах Мах 256 283 291 (2703) (4032) (3243) 57

XXIV Вос-Тгр-Ьеи-Азр-РЬе-МН(СН2)2РЬ 0,85 0,98 0,93 173-175 -32,4° Ят1п ?.гаах }тах 244 279 289 (1796) (4191) (3992) 60

'XV Вос-Тгр-Ьеи-Аэр-РЬе-ОН 0,57 0,97 0,75 134-141 -15,4° )т1п }тах )тах 244 281 291 (1379) (3621) (3448) 63

* Хроматографические системы: (I) хлороформ - метанол (4:1);

(2) н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:1);

(3) 1-пропанол - 2.5% аммиак - вода (14:1:5).

Схема 5.

Trp

Leu

Вое

Во с Вое

формиат аммония

Asp

Вое Вое

он Вое DCC, HOBT

DBzl TFA/DCC — ^ ОН

DCC,

РЬе

Вое Вое

он OBzl

н

HOBT

OBzl

,OBzl

он

ЫН(СН2)2рь

HH(CH2)2Ph NH(CH2)2Ph ИН(СН2)2РЬ

NH(CH2)2Pb

■ KH(CH2)2Ph XXIV

В процессе синтеза полученные соединения очищали экстракцией, переосакдением, перекристаллизацией и колоночной хроматографией на силмкагеле. Индивидуальность промежуточных соединений контролировали с помощью тонкослойной хроматографии в нескольких системах растворителей, а индивидуальность и строение конечных пептидов подтверждали данными тонкослойной хроматографии, аминокислотного анализа, УФ-спектрофотометрии.

Изучение биологической активности структурных аналогов фрагментов гастрина

Биологическая активность синтезированных соединений оценивали

* ** . ___-

в тестах in vitro и в опытах m vivo.

*

Исследования проведены совместно с канд.мед.наук А.Ю.Иеиановым (научно-исследовательский институт фармакологии АМН СССР).

Исследования проведены совместно с докт.мед.наук Л.С.Василевской (Институт питания АМН СССР).

- 16 -

Исследование биологической, активности в тестах in vitro_

В тестах in vitro изучалась способность исследуемых пептидов ингибировать действие пентагастрина (мощного агониста) путем вытеснения его с поверхности гастриновых рецепторов, расположенных на подвздошной кишке морской свинки. Регистрировалось сокращение кишки под влиянием пентагастрина, введенного на фоне испытуемого вещества. Опыты, в которых сокращение вызывали введением одного пентагастрина, служили контролем и принимались за 100$. Действие исследуемого аналога выражали в процентах от соответствующего конт-

п

роля. Пентагастрин вводили в концентрации 10 М, которая была определена в условиях проводимого эксперимента как субмаксима льна я.

Результаты биологического тестирования соединений I-XIX представлены в таблице 3. Пептиды I-XIX вводили в концентрации 3»Ю~^М.

Анализ полученных данных показал, что аналоги фрагмента 13-16 гастрина, содержащие в положении 13 Бок-глицин или остаток к-за-мещенной w-аминокислоты, проявляют свойства антагонистов гастрина (соед. 1-1У). Их активность несколько выше, чем активность фрагмента 14-16 гастрина (соед. X). По мере увеличения числа металено-вых групп в цепи v -аминокислоты заметного увеличения антагонистического эффекта не наблюдается.

Расстояния между остатками триптофана и аспарагиновой кислоты В ряду антагонистов гастрина, так же как и ряду агонистов, имеет существенное значение для проявления пептидом биологического действия. Так при незначительном изменении этого расстояния (соед. У, У1) антагонистический эффект сохраняется, если se это расстояние меняется в большей мере, то связывания пептида с гастриновыми рецепторами не происходит (соед. УН).

Конфигурация остатка аминокислоты в положении 15 фрагмента 14-16 метрика не оказывает существенного «лиявия на антагонисти-

Таблица 3.

К» соед. 1 Соединение ! Контроль, ! % ! Эффект, ! /о

I Вос-С1у-Тгр-1<еи-Азр-НН2 100,0+2,9(4) 23,4+9,3(4)

и Вое- 5"-АЬи-Тгр-Ьеи-Азр-Шг 100,0+5,6(5) 40,2+14,1(4)

ш Вое- £-Аре-Ггр-Ьеи-Азр-ЯН^ 100,0+3,5(4) 37,1+4,7(5)

IV Вое- 6-АЬх-Тгр-Ьеи-Аэр-Н!^ 100,0+7,3(5) 27,6+16,9(4)

V Вос-Тгр- 5_-АЬи-Азр-НН2 100,0+4,9(10) 35,2+6,1(4)

VI Вос-Тгр- 8-Аре-АБр-КН2 100,0+8,4(6) 30,6+12,8(3)

VII Вос-Тгр- £ -АЬх-Азр-ЖИг - ■ неактивно

VIII Вос-Е>-Тгр-1.еи-Азр-ЫН2 - неактивно

IX ВОС-Тгр-Е)-Ьеи-АЗр-ЫН2 100,0+6,9(3) 40,4+5,5(3)

X Вос-Тгр-Ьеи-Азр-НН2 100,0+6,0(7) 56,0+2,2(4)

XI Вос-Р11е-Ьеи-А5р-МН2 - -- неактивно

XII Вое-а-А1а-РЬе-Ьеи-Азр-1Ш2 100,0+6,9(3) 20,8+2,1(3)*

XIII Вос-Тгр-Ьеи-Зег-ЫН2 100,0+12,3(5) 42,3+8,3(6)*

XIV Вос-Тгр-Ьеи-Ьуз-КН2 100,0+3,3(8) 50,5+7,6(6)*

XVI Вос-тгр-Ьеи-Агд-ш2 100,0+3,5(4) 37,2+5,6(3)*

XVII Вос-Ь-Иа1-Ьеи-Азр-ЯН2 неактивно

XVIII Вос-1/-Та1-Ьеи-Азр-ИН2 - неактивно35'

XIX вос-1,-Аа1-ьеи-Азр-ш2 ■ - неактивноя

Приведены значения среднего арифметического, среднеквадратичного отклонения и числа параллельных опытов (в скобках). 0,05,

34 Соединения вызывали сокращение подвздошной кишки морской свинки.

ческие свойства'пептида. Так замена остатка 1»-леЙцина на остаток б -лейцин (соед. IX) не приводит к существенному изменению величины эффекта по сравнению с соед. X. Замена яе остатка ь-триптофана в этом фрагменте на остаток о-триптофана (соед. УШ) приводит к исчезновению активности.

Деления С-концевого остатка фенилаланина в молекуле тетрагаст-

рина и одновременная замена остатка триптофана на остаток фенил-аланина критическим образом сказываются на способности пептида взаимодействовать с гастриновыыи рецепторами. Так соединение XI было неактивно, а соединение 2П оказывало сложное воздействие: ' оно подавляло действие пентагастрина, но и само вызывало сокращение подвздошной кишки (из-за неспецифического взаимодействия с другими видами рецепторов, расположенных на поверхности подвздошной киики или же в силу иных причин). Аналогичный эффект наблюдался и при замене остатка аспарагиновой кислоты во фрагменте 14-16 на остатки других аминокислот (соед. ХШ-ХУ1).

Замена остатка триптофана на остатки нуклеоаыинокислот во фрагменте 14-16 приводит к потере сродства к гастриновым рецепторам (соед. ХУБ-Х1Х).

Модификация С-концевого дипептида в тетрагастрине за счет введения алкильных и аралкильных заместителей в амидную группировку способствует возникновению антагонистического эффекта (соед. ХХ-ХХ1У), причем активность этих соединений на порядок выше активности аналогов фрагмента 14-16 гастрина. Они оказывали антагонистическое действие в концентрации 10~б М (таблица 4), а соединения XX и ХХШ проявляли слабый антагонистический эффект и в концентрации ict7 м.

Исследование биологической активности в опытах in vivo_

Б опытах in vivo изучалась способность синтезированных пептидов подавлять желудочную секрецию, стимулированную пентагастри-ном у собак. Исследования были выполнены на 4 собаках весом 12-16 кг с фистулой желудка. Пентагастрин вводили в дозе 50 мкг, исследуемые вещества - в дозе 60 мг на собаку.

Полученные результаты представлены на рис. I, 2 и 3, на которых показаны объемы выделяемого желудочного сока при введении пен-

Таблица Ч.

№ ! соед.! Соединение | Контроль, % ! Эффект, ! Ч

XX Вос-Тгр-Ьёи-Азр-РЬе-ШНех 100,0+9,2(9) 16,6+11,2(3)

XXI вос-тгр-Ьеч-Азр-РЬе-кнвц 100,0+8,5(4) 17,4+12,2(3)

XXII Вос-Тгр-Ьеи-Аэр-РЬе-кнхВи 100,0+4,3(5) 24 ,4+8,6(3)

XXIII Вос-Тгр-Ьеи-Аэр-РЬе-ННВи1" 100,0+6,0(6) 27,5+7,3(3)

XXIV Вос-Тгр-1,еи-Азр-РЬе-ЫН(СН2)2РЬ 100,0+10,5(5) 49,7+16,8(5)

XXV Вос-тар-Ьеи-Аэр-РЬе-ОН 100,0+6,1(5) 28,5+4,7(4)*

Приведены значения среднего арифметического, среднеквадратичного отклонения и числа параллельных опытов (в скобках). Р «с 0,05. Соединение вызывало сокращение подвздошной кишки морской свинки.

тагастрина на фоне исследуемых соединений. Опыт с введением только пентагастрика (ПГ) слукил контролем. Приведены значения доверительных интервалов (Р «с 0,05).

Чя-м

100908070- 1 "

60- Т т

50" т — Л —

40" ГТ1

3020-Ю--

ПГ 1 II III 13"

Рис. I. Влияние соединений 1-1У на желудочную секрецию, индуцированную пентагастрином.

У,кл1

90" Т 80---

70" т — __

60- ' 1 50- 1 1

40-30' 20-п>-

ПГ У У1 - УП УШ IX

Рис. 2. Влияние соединений У-1Х на желудочную секрецию, индуцированную лентагастрином.

У,мл 1 эсг 80-70"*

60--- 1 5040-30-- 1

20-- 1 10--

ПГ Ш ПУ хш

Рис. 3. Влияние соединений ХП, Х1У, ХУЛ на желудочную секрецию, индуцированную пентагастриноы. '

Анализ полученных данных позволяет выявить следующие закономерности связи между химической структурой и активностью. Введение в положение 13 фрагмента 13-16 Гагарина остатка Бок-глицина или остатков и -замещзнных v-аминокислот приводит к соединениям, обладающими антагонистическими свойствами (соед. 1-1У). Так же, как и в тестах in vitro, закономерного роста активности при увеличении длины цепи w-аминокислоты не отмечается..

При введении остатков »-аминокислот в положение 15 фрагмента 14-16 гастрина (соед. У-У11), вызывающем изменение расстояния между остатками триптофана и аспарагиновой кислоты, полученные аналоги не ингибируют желудочную секрецию статистически достоверно. Но, как видно из рис. 2, наблюдается тенденция к уменьшению их влияния на стимулированную секрецию при увеличении числа метиленовых групп в цепи v -аминокислоты, что не находится в противоречии с данными, полученными в тестах in vitro.

Введение остатка D-лейцина в положение 15 (соед. IX) не влечет за собой потери антагонистической активности, которой обладает фрагмент 14-16 гастрина, а при инверсии конфигурации аминокислоты в положении 14 (соед. УШ) ингибиторные свойства не сохраняются.

Замещение остатка триптофана на остаток фенила лани на (соед. ХП) приводит к неактивному соединению. Этот результат согласуется с литературными данными, полученными при изучении аналогов тетра-гастрина, о важности атома азота в индольном кольце боковой цепи триптофана для биологической активности гастриновых пептидов. Видимо, гетероатом азота взаимодействует с комплементарной группой в активном центре рецептора, и отсутствие этого взаимодействия разрушает как агонистическую, так и антагонистическую активность.

Высокую антагонистическую активность показало соединение Х1У,

полученное путем замены остатка аспарагинавой кислоты на лизин (рис. 3). Оно подавляло стимулированную пентагастринои авлудочную секрецию приблизительно в 3 pasa. В проведенных нами опытах in vivo этот аналог оказывал наиболее сильное антагонистическое действие.

Свойства высокоактивного ингибитора желудочной секреции, вызываемой пентагастринои, проявило нуклеоаминокислотный аналог ХУЛ, содержащий остаток ъ-/ -(урацилил-н1)-<*-аланина в положении 14. Он угнетал желудочную секрецию, tío сравнению с контрольный опытом (введением одного пентагастрина), в 2 раза. Однако отсутствие активности у этого пептида в тестах in vitro свидетельствует о том, что антагонистический эффект в данном случае достигается не в результате взаимодействия с гастриновыми рецепторами, а каким-то опосредованным образом.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен синтез неизвестных ранее структурных аналогов фрагмента 13-16 гастрина, отличающихся от природной последовательности модификацией остатка глицина в положении 13 или его замещением на остаток м-замещенной w-аминсасислоты.

2. Проведен синтез новых структурных аналогов фрагмента 14-16 гастрина, отличающихся от природного трипептида замещениями аминокислотных остатков в положениях 14, 15 или 16.

3. Впервые синтезированы нуклеоаминокислотные аналоги фрагмента 14-16 гастрина, содержащие остатки нуклеоаминокислот в положении 14.

4. Получены новые структурные аналоги фрагмента 14-17 гастрина, содержаще алкильные и аралкильные заместители в амидной группировке.

5. В тестах in vitro установлено, что ряд синтезированных структурных аналогов фрагментов гастрина проявляют свойства анта-

- 23 -

гонистов природного гормона.

6. В опытах in vivo показано, что некоторые структурные аналоги фрагментов 13-16 и 14-16 гастрина тормозят желудочную секрецию, индуцированную пентагаетрином.

7. Обнаружено, что нуклеоаминокислотный аналог фрагмента 14-16 гастрина, содержащий в положении 14 остаток ь -_£-<урацилил-н')-о<.-аланина, будучи неактивным в тестах in vitro, проявляет высокую антагонистическую активность в опытах in vivo.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ОТРАЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. Таскаева Ю.М., Коршунова Г.А., Василевская Л.С., Швачкин Ю.П. Синтез структурных аналогов фрагментов 13-16 гастрина и изучение их влияния на желудочную секрецию. Ц Хим.-фарм. журнал. 1990. Т. 24. №2. С. 124-12?.

2. Таскаева Ю.М., Коршунова Г.А., Василевская Л.С., Швачкин Ю.П. Синтез и свойства потенциальных антагонистов гастрина. // Тез. докл. УП Всес. симпозиума по химии белков и-пептидов. Таллинн. 1987. С. 249.

3. Таскаева Ю.М., Стан Е.Я., Василевская Л.С. Сравнение механизмов действия различных ингибиторов желудочной секреции. // В кн. "Актуальные проблемы гастроэнтерологии". Тез. докл. II съезда гастроэнтерологов УССР. Днепропетровск. 1989. С. 295-296.

4. Василевская Л.С., Таскаева Ю.М. Действие новых синтетических аналогов гастрина на желудочную секрецию. // В кн. "Нейрогукщ-ральные механизмы регуляции висцеральных органов и систем". Тез. докл. Всесоюзной научной конференции по нейрогуморальным механизмам регуляции. Томск. 1989. С. 26-27.

5. Василевская Л.С., Таскаева Ю.М. Новые синтетические аналоги гастрина и их действие на желудочную секрецию. // В кн. "Цент-

-гч -

ральная регуляция вегетативных функций". Тез. докл. УШ научной конференции по вегетативной регуляции. Тбилиси. 1989. С. 19.

6. Таскаева Ю.М., Коршунова Г .А., Мвачкин Ю.П. Синтез аналогов тетрагастрина, замененных в амидной группировке. // ЖОХ, в печати . . :

7. Таскаева Ю.М., Коршунова Г.А., Швачкин Ю.П. Синтез нуклеоамиво-кислотвых аналогов фрагмента 14-16 гастрина. // Вестник МГУ, сер. Химия, в печати.

'Тос^а^')

З'к- Ш<г> т«р. J00 Тип, Мчн-И «ультра СССР