Определение интегральной антиоксидантной способности растительного сырья и пищевых продуктов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи —

Храпко Наталья Вячеславовна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕГРАЛЬНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ СПОСОБНОСТИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ПИЩЕВЫХ

ПРОДУКТОВ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

02.00.02 - аналитическая химия

Краснодар 2006

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Кубанского государственного университета

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Темердашев Зауалъ Ахлоович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Рувинский Овсей Евелевич; кандидат технических наук Якуба Юрий Федорович

Ведущая организация: Воронежская государственная

технологическая академия

Защита состоится 28 декабря 2006 г. в ауд. 231 в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.101.10 в Кубанском государственном университете по адресу: г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149, КубГУ

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Кубанского государственного университета: 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149

Автореферат разослан ¿/.^ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук,

доцент ■<] Киселева Н.В.

Актуальность темы. Воздействие на человека неблагоприятных факторов окружающей среды, таких как УФ-излучение, радиация, загрязнения атмосферы и пищевых продуктов химическими соединениями приводит к образованию в организме избыточного количества свободных радикалов, тем самым вызывая дисбаланс в его антиоксидантном статусе.

Источниками антиоксндантов для человека могут служить пищевые продукты и напитки на основе растительного сырья, антиоксидантные свойства которых обусловлены такими биологически активными веществами как фенольные соединения, витамины, протеины, сахара, карбоновые и аминокислоты. Поэтому антиоксидантная активность (АОА) пищевых продуктов является одним из показателей, определяющих их биологическую ценность. Антиоксиданты также широко используются для предотвращения окислительной порчи жиров и ж иросо держащих продуктов в процессе производства и хранения. Однако применение синтетических антиоксидантов ограничено из-за их возможного токсического действия. Это проводит к необходимости поиска альтернативных соединений в растительном сырье, обладающих высокой антиоксидантной активностью и безвредных для человека.

В настоящее время наиболее популярны методы оценки антиоксидантной активности, основанные на ингибировании окисления различных липидных субстратов с последующим определением продуктов окисления. Большинство этих методов, относящихся к данной группе, являются длительными и дают плохо воспроизводимые результаты, поэтому разработка новых методов определения, сочетающих экс пресс ность с достоверностью и высокой воспроизводимостью полученных данных, остаются актуальной задачей.

Настоящая работа выполнялась при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 03-03-96548, № 06-03-96616).

Цель работы. Исследование индикаторной системы Ре(1П)/Ре{Н>-о-фенантролин и разработка на её основе способа определения интегральной антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов.

В соответствие с целью исследования в работе поставлены следующие задачи:

• теоретически обосновать и экспериментально доказать возможность использования индикаторной системы Ре(III)/Ре(11 )-о-фенантролин для разработки с пектро фотометрического способа оценки антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов;

• исследовать влияние индивидуальных восстановителей органической природы и их смесей на индикаторную систему;

♦ оценить суммарную антиоксидантную активность и провести сопоставительный анализ ее величины с известными суммарными характеристиками ряда пищевых продуктов и растительного сырья. Научная новизна. Предложена и изучена индикаторная система Ре{ III )/Ре( 11 )-о-фе на нтро лин для оценки антиоксидантной активности пищевых продуктов и растительных материалов. Исследовано влияние восстановителей фенолыюй и нефенольной природы, присутствующих в пищевых продуктах, на индикаторную систему и показан суммарный характер измеряемой величины антиоксидантной активности.

Показана возможность использования величины суммарной антиоксидантной активности для характеристики качества пищевых продуктов и растительного сырья.

Практическая значимость. Предложен способ определения суммарной антиоксидантной активности пищевых продуктов и лекарственных препаратов на основе растительного сырья с использованием индикаторной системы Ре( 111)/Ре(11 )-о-фенантро л и н.

Проведена метрологическая аттестация методик определения антиоксидантной активности вин и лекарственных растений. Методика апробирована на образцах вина, пива, соков, чая, лекарственных трав и настоек.

На защиту выносятся

спектрофотометрический способ оценки интегральной (суммарной) антиоксидантной способности растительного сырья и пищевых продуктов на его основе;

результаты определения антиоксидантной способности индивидуальных восстановителей с учетом их химической структуры;

результаты анализа смесей восстановителей органической природы для оценки суммарного характера величины АОА; результаты определения суммарной антиоксидантной способности некоторых пищевых продуктов для оценки их экологической безопасности и качества;

результаты исследований по влиянию экологической ситуации территории на величину антиоксидантной активности растительных материалов.

Апробация работы. Основные результат работы доложены на Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России 2004» (Москва, 2004 г.). 11 международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005 г.), заключительной конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края

«р2003юп» (Краснодар, 2005 г.), международном конгрессе по аналитической химии «ICAS - 2006» (Москва, 2006 г.), Всероссийской конференции молодых ученых и II школы им. Н.М. Эммануэля «Окислеиие, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2006 г.), международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и тезисы 6 докладов, получен патент РФ.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, приложения. Диссертационная работа изложена на 178 страницах, содержит 46 таблиц, 7 рисунков и библиографию из 170 наименований.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В литературном обзоре (глава 1) дана классификация и охарактеризованы основные группы антиоксидантов. Рассмотрены способы определения активности индивидуальных антиоксидантов и суммарной антиоксидантной способности растительного сырья и пищевых продуктов.

Во второй главе представлены данные об используемых методах и приборах, описаны условия эксперимента, изложены результаты с обсуждением.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 Исследование системы Ге(Ш)ЛГе(11)~0~фенантролин дли оценки антиоксидантной способности природных объектов

Анализ литературных данных показал, что существующие в настоящее время методы определения антиоксидантной активности в большинстве случаев основаны на способности. антиоксидантов взаимодействовать со свободными радикалами. Для оценки антиоксидантной активности индивидуальных веществ и реальных объектов обычно используют радикалы, образующиеся в . процессе окисления липидсодержаших субстратов либо генерируемые в различных системах (Fe(lll) - Н202, гипоксантин — ксантин оксидаза, пероксидаза хрена — HjOO радикалы ОН', 0"г

Методы, основанные на ингибировании антиоксидантами окисления липидов, дают более достоверные результаты, поскольку характеризуют способность исследуемого объекта подавлять свободнорадикальные окислительные процессы в организме. Однако данные методы являются длительными и трудоемкими, а полученные результаты плохо

воспроизводимы и зависят от многих параметров: природы окисляемого субстрата, концентрации инициатора, начальной скорости окисления.

Антиоксидантное действие большинства биологически активных соединений связано с их способностью легко окисляться, отдавая электрон или атом водорода, что положено в основу определения индивидуальных восстановителей по их воздействию на окислительно-восстановительную систему, содержащую комплексные соединения ионов переходных металлов: Fe(HI) - 2,2' дипиридил, Fe(lll) - трипиридил-триазин, Fe(IIl) - ферроцин, Cu(ll) - неокупроин, Ru - 2,2' дипиридил.

Введение в окислительно-восстановительную систему Fe(IU)/Fe(II) органического лиганда- о-фенантролина увеличивает величину стандартного редокс-потенциал а полуреакции [Fe(Phen)j]° + ё ¡5 (Ге(РЬеп)зУ2 до Е° = 1,10 В, расширяя круг определяемых веществ. Следует также отметить, что способность органического ли ганда образовывать с восстановленной формой железа устойчивый в широком диапазоне рН (2 - 9) окрашенный хелат со значительным молярным коэффициентом поглощения (е = 11100) создает условия для высокочувствительного и селективного определения. Это позволяет использовать систему Fe(lII)/Fe(lI)-o-фенантролин для определения антиоксидантной способности биологически активных соединений.

Окислительно-восстановительная способность выбранной индикаторной системы и чувствительность определения зависят от количества и соотношения Fe(lll) и о-фенантролина, которые целесообразно вводить в реакцию совместно в виде комплексного реагента.

Оптимизацию состава реагента проводили методом многофакторного планирования эксперимента, который позволил выделить и оценить эффект, вызываемый каждым изучаемым фактором в отдельности. Факторами выступали - концентрация Fe(IH), о-фенантролина и объем реагента, вводимый в реакцию с восстановителем. В качестве восстановителя выбрана аскорбиновая кислота, ввиду ее высокого окнелительно-восстановителыюго . потенциала и возможного присутствия в предполагаемых объектах исследования. Границы варьирования уровней факторов определялись шириной диапазона линейности зависимости аналитического сигнала от концентрации аскорбиновой кислоты (0,05 -2,0 м к г/см3), с одной стороны, и достаточной чувствительностью и устойчивостью аналитического сигнала во времени, с другой.

Для каждого состава реагента, по уравнениям регрессии, была рассчитана величина аналитического сигнала при концентрации аскорбиновой кислоты 1,2 мкг/см1 и подобран объем, при котором значение аналитического сигнала максимально. Дальнейшие расчеты позволили заключить, что оптимальным является реагент состава; 0,006 М Fe(III) —

0,01 М о-фенантролина, при его объеме, вводимом в реакцию 1,0 см1 на 100 см3 раствора.

Для доказательства суммарного характера определяемой величины АОА рассматривалось влияние восстановителей органической природы и их суммы на индикаторную систему.

Изучено влияние ряда индивидуальных восстановителей на систему Ре(Ш)-о-фенантролин оптимального состава. Для исследования выбраны широко распространенные в растительном сырье, материалах и используемые в пищевой промышленности антиоксид анты фенольной (галловая кислота, кверцетин, рутин, танин, гидрохинон) и нефенольной (аскорбиновая кислота, цистеин, глутатион) природы.

Аналитический сигнал для перечисленных органических соединений линейно зависит от концентрации вещества в широком диапазоне, но не стабилен во времени. Это приводит к увеличению зависимого коэффициента в уравнении регрессии при сохранении линейности в том же диапазоне (таблица 1). Величина тангенса угла наклона зависимости аналитического сигнала от концентрации восстановителя изменяется от 0,01 для глутатиона до 0,5 для галловой кислоты, что объясняется различной антиоксидантной способностью изучаемых восстановителей. По уменьшению антиоксидантной активности их можно расположить в следующей последовательности: галловая кислота > кверцетин > гидрохинон > аскорбиновая кислота > танин > рутин > цистеин > глутатион. Антиоксидантная активность обусловлена числом и расположением функциональных групп, способных легко отдавать атом водорода (-ОН, -5И, -МН), наличием сопряженных двойных связей, а также пространственной структурой молекул. Так, кверцетин, который имеет две 3' и 4' гидроксильные группы в орто-положении кольца В и одну в 3 положении кольца С является более эффективным антиоксндантом, чем его гликозид рутин, активная 3 - ОН группа которого замещена сахарным остатком (рутинозоЙ). Кроме того, наличие гликозидного остатка приводит к изменению пространственного расположения молекулы, что также является причиной более низкой антиоксидантной способности гликозияов по сравнению с агликонами. Различие в восстановительной способности цистеина и трипептида глутатиона, по-видимому, также обусловлено пространственной структурой их молекул.

Таблица 1 - Зависимость аналитического сигнала от концентрации восстановителя во времени

Восстановитель т, мин Уравнения регрессии а1 Диапазон линейности, м кг/см3

Аскорбиновая кислота 30 у = 0,2306х +0,0037 0,9993 0,05- 1,8

60 у = 0,2465х + 0,0012 0,9996

90 V = 0,2603х + 0,0013 0,9994

120 у " 0,2713х — 0,0004 0,9991

Твиип 30 у-0,1408х +0,0028 0,9992 0,1 -2,0

60 у = 0,1807х +0,0009 0,9997

90 у=-0,2118х + 0,000& 0,9991

120 У-0.2305Х + 0,0039 0,9987

Рутин 30 у = 0,1 ООбх — 0,0011 0,9993 0,1-2,0

60 у = 0,1294х — 0,0016 0,9996

90 у 0,1535х — 0,0025 0,9997

120 у -0,1682х- 0,0024 0,9997

Кперцетик 30 у = 0,3524х — 0,0018 0,9991 0,02 - 0,8

60 у = 0,4390х-0,0043 0,9987

90 у «0,4852х-0,0046 0,9986

120 у = 0,515бх — 0,0044 0,9983

Галловая кислота 30 у »* 0,5201 х — 0,0026 0,9995 0,02-0,8

60 у ■ 0,5817х — 0,0003 0,9991

90 у = 0,6304х-0,0003 0,9989

120 у-0,6642х +0,0003 0,9986

Гидрохинон 10 у 0,3481х + 0,0105 0,9993 0,05-1,4

20 у = 0,3 517х + 0,0078 0,9993

30 у = 0,3522*+ 0.0063 0,9994

60 у **0,3530х + 0,0061 0,9995

90 у = 0,3541х +0,0059 0,9994

120 у «■ 0,3552х + 0,0051 0,9992

Цисте им 30 у = 0,0847х-0,0075 0,9967 0,1-2,0

60 у«0я1141х-0,005! 0,9992

90 у = 0,1301х — 0,0024 0,9997

120 у = 0,1394х —0,0001 0,9998

1 лутатион 30 у = 0,0107х —0,0016 0,9880 1,0-20

60 у = 0,0168х- 0,0022 0,9921

90 у = 0,0212х-0,0024 0,9959

120 у -0,0243х- 0,0022 0,9978

Реальные объекты представляют собой довольно сложные по химическому составу системы, антиоксидантные свойства которых реализуются за счет суммарного содержания и действия восстановителей

различной природы. Как правило, в растительных природных объектах и пищевых продуктах одновременно содержатся фенол ьные соединения, витамины, моно- и полисахариды, органические и аминокислоты. Кроме того, при оценке антиоксидантной способности необходимо учитывать не только природу и содержание восстановителей в исследуемом объекте, но и возможность их взаимного влияния (например, синергизм или антагонизм).

Для сравнения антиоксидантной активности различных восстановителей, их смесей и реальных объектов целесообразно выражать эту величину количеством вещества-стандарта, как принято при определении многих известных суммарных показателей. В качестве вещества-стандарта при определении АОА предложено использовать аскорбиновую кислоту (АК), поскольку установлено, что она по антиоксидантной способности занимает промежуточное положение среди изучаемых восстановителей.

Для подтверждения суммарного характера определяемой величины антиоксидантной активности изучено влияние модельных смесей, содержащих восстановители в различных соотношениях на индикаторную систему Ре(Ш)/Ре(И)-о-фенантралин. Расчет теоретической величины АОА, в пересчете на вещество-стандарт, проводили по уравнениям количественного соответствия, показывающим связь между количеством вещества-стандарта и восстановителя в условиях равной антиоксидантной активности. Экспериментальные значения АОА pácc4tnbiB&nH, подставляя величину аналитического сигнала модельной смеси в усредненное уравнение регрессии зависимости аналитического сигнала от количества аскорбиновой кислоты. Результаты анализа модельных смесей представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, экспериментально полученные и теоретически рассчитанные величины АОА хорошо согласуются. Несколько завышенные результаты для моделей, содержащих аскорбиновую кислоту, вероятно, можно объяснить проявлением ею синергетических свойств. Полученные данные показывают, что определяемая величина -антиоксидантная активность —результат совместного действия всех присутствующих в модельной смеси восстановителей.

Таким образом, определяемый показатель является интегральным и индикаторная система Fe(111)/Fe(11)-<>фенантролин может быть использована при разработке способа оценки суммарной антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов.

Таблица 2 - Результаты анализа модельных смесей (т = 60 мин) (и = 6, Р = 0,95)

Количество компонентов в смеси, мкг Теоретическое значение АОА, мкг АК и 0 »а <г 5 о 5 « < 1 1 ь 1 » д в м 5 5 5 " (7)

п ведено в пересчете на АК

К <■ 1 танин рутин X з: о. о п и 1 1 цистеин Ьй < а: я рутин X | и н цистеин

- 20 20 20 - - 14,66 9,85 35,59 - 60,10 59 ±5

- 10 10 10 - - 7,33 4,92 17,79 30,04 27 ±2

- 50 10 10 - - 36,65 4,92 17,79 - 59,36 52 ±5

- 10 50 10 - - 7,33 24,63 17,79 - 49,75 5! ±4

- 10 10 50 - - 7,33 4,92 89,02 - 101,27 98 ±8

- 30 10 10 - - 21.99 4,92 17,79 - 44,70 38 ±6

- ■ 10 30 30 - - 7,33 14,78 3,41 - 75,52 77 ±9

20 20 20 20 - 20 14,66 9,85 35,59 - 80,10 97 ±9

30 10 10 10 - 50 7,33 4,92 17,79 - 80,04 85 ±10

10 50 10 10 - 10 36,65 4,92 17,79 - 69,36 74 ±10

10 10 50 10 - 10 7,33 24,63 17,79 - 59,75 80 ± 11

10 10 10 50 - 10 7,33 4,92 89,02 - 111,27 129 ± 12

30 30 10 10 - 30 21,99 4,92 17,79 - 74,70 81 ±8

10 10 30 30 - 10 7,33 14,78 53,41 - 85,52 108 ± 10

20 - 10 20 - - - 4,60 24,60 22 ±2

10 - - 20 10 - - - 9,23 19,23 17 ± 2

2 Разработка способа оценки антлоксидантной способности природных объектов

Проведенные нами исследования показали, что аналитические сигналы в индикаторной системе Ре(1П)ЛРе(Н)-о-фенантролин меняются во времени в зависимости от концентрации как индивидуальных восстановителей и их смесей, так и реальных объектов. Это приводит к необходимости строгого контроля времени эксперимента, что делает его длительным, трудоемким, ухудшаются также метрологические характеристики анализа. Устранение этого недостатка и стабилизация аналитического сигнала требуют оптимизации условий протекания реакции. Дня решения поставленной задачи рассматривались различные способы воздействия на реакцию, протекающую в системе: повышение температуры и

введение в реакционную смесь реагентов, традиционно используемых для связывания ионов Ре+3 (фторида натрия, ЭДТА).

Влияние перечисленных параметров изучалось на примере реакции окисления аскорбиновой кислоты, концентрацию которой варьировали в установленных пределах диапазона линейности.

Исследование влияния температуры проводили в интервале 25 — 60 "С. Нижняя граница диапазона соответствует нормальным условиям протекания окислительно-восстановительных процессов, а верхняя обусловлена неустойчивостью аскорбиновой кислоты при температурах выше 50 °С. Установлено, что при выдерживании реакционной смеси в течение 60 мин при температуре ~ 50 °С наблюдается стабилизация аналитического сигнала во времени. Это, вероятно, связано с более быстрым и полным протеканием реакции. Однако при анализе в этих условиях реальных объектов существенной стабилизации аналитического сигнала не наблюдается.

Для стабилизации аналитического сигнала путем вывода из реакции не прореагировавших ионов Ре+3 в реакционную смесь вводили «стол-реагент», в качестве которого применяли комплексообразователи: фторид натрия и ЭДТА в диапазоне концентраций 0,06 мМ — 0,01 М, 0,03 мМ — 0,1 мМ соответственно.

В ходе эксперимента установлено, что введение в реакционную систему более 0,05 мМ ЭДТА приводит к уменьшению во времени аналитического сигнала аскорбиновой кислоты и (или) фенольных антиоксидантов, используемых в качестве восстановителя. Введение ЭДТА в меньших концентрациях приводит к получению стабильного во времени аналитического сигнала для индивидуальных восстановителей, однако при этом не стабилизируется сигнал реальных объектов.

Для большинства изучаемых восстановителей введение в реакцию 0,01 М фторида натрия обеспечивает стабильный во времени аналитический сигнал (таблица 3). В случае танина и рутина наблюдается незначительное нарастание аналитического сигнала во времени.

В аналогичных условиях были получены стабильные во времени аналитические сигналы для реальных объектов, таких как сухое внно, пиво, соки, чай, экстракты лекарственных растений. Это позволило рекомендовать фторид натрия в качестве «стоп-реагента» при определении антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов.

Таблица 3 - Зависимость аналитического сигнала восстановителя от его концентрации во времени в присутствии 0,01 М ШР *

Восстановитель т, мин Уравнения регрессии а2

Аскорбнконая кислота 15 уя0,2619х — 0,0032 0,9996

30 у = 0,2624х~ 0,0035 0,9996

60 у = 0,2626х-0,0024 0,9996

90 у = 0,2628х-0,0032 0,9996

'Г'анип 13 у = 0,1871х + 0,0012 0,9999

30 у-0,1917х + 0,0009 0,9997

60 у = 0,1963х +0,0019 0,9998

90 у = 0,2013х +0,0038 0,9997

Рутин 15 у = 0,1301х-0,0012 0,9999

30 у = 0,1327х-0,0002 0,9999

60 у = 0,1384х - 0,0004 0,9999

90 у = 0,1425х + 0,0017 0,9999

Квер детин 15 у -= 0,3813х —0,0012 0,9986

30 у = 0,3818х —0,0010 0,9982

60 у = 0,382бх - 0,0005 0,9983

90 у - 0,3837х - 0,0006 0,9983

Галловая кислота 15 у = 0,5537х + 0,0030 0,9987

30 у = 0,5546х + 0,0032 0,9986

60 у - 0,5557х + 0,0036 0,9986

90 у = 0,5563х + 0,0026 0,9986

Гидрохинон 15 у-0,3531х +0,0049 0,9996

30 у <=0,3535х +0,0048 0,9997

60 у — 0,3541х + 0,0043 0,9996

90 у - 0,3543х + 0,0045 0,9997

Цнстеии 15 у = 0,0993х-0,0068 0,9976

30 у = 0,0997х-0,0066 0,9980

60 у = 0,1004х — 0,0065 0,9985

90 у0,1004х - 0,0065 0,9982

Глутатиои 15 у = 0,0)68х - 0,0021 0,9928

30 у = 0,0168х-0,0023 0,9930

60 у-0,068х-0.0024 0,9927

90 у = 0,0168х - 0,0023 0,9930

* «стол-реагент» вводился в реакционную смесь через 60 мин после начала реакции

Проведенная оптимизация условий определения АОА: состав и объем вводимого комплексного реагента, выбранный комплексообразователь

и его концентрацию, атакже время выдерживания до и после введения «стоп-реагента», позволил предложить алгоритм методики определения антиоксидантной активности растительных материалов и пищевых продуктов. Комплексный реагент состава 6 мМ Ре(Ш) и 10 мМ о~ фенантролина смешивают с исследуемым образцом (разбавление и объем которого будут зависеть от его антиоксидантной активности), выдерживают фиксированное время, по истечение которого реакцию останавливают добавлением «стоп-реагента» и через установленное время измеряют оптическую плотность испытуемого раствора при характеристической длине волны. Антиоксидантную активность пищевых продуктов и растительного сырья выражают количеством вещества-стандарта (аскорбиновой кислоты), производящим антиоксидантный эффект, эквивалентный действию суммы восстановителей изучаемого образца (в мг аскорбиновой кислоты на г (см3) продукта).

Различные группы пищевых продуктов отличаются по химическому составу и, в том числе, по содержанию восстановителей, поэтому их антиоксид а нтные свойства могут сильно отличаться. Это приводит к необходимости оптимизации условий определения антиоксидантной активности реальных объектов. Кроме того, известно, что разбавление может привести к изменению вещественного состава образца, в частности, за счет протекания реакций гидролиза.

Оптимизацию определения антиоксидантной активности проводили на образцах пищевых продуктов по единой методологии, заключающейся в рассмотрении изменения аналитического сигнала пробы при различном разбавлении и времени выдерживания до введения в реакцию. Критериями оптимальности служили неизменность аналитического сигнала после разбавления пробы при ее выдерживании в течение 60 мин, стабильный в течение длительного времени (до 120 мин) аналитический сигнал после введения «стоп-реагента», а также пропорциональное изменение сигналов при разбавлении.

Так, например, для образцов вина, разбавленных менее чем в 100 раз, наблюдается уменьшение аналитического сигнала пробы в среднем на 12 % при выдерживании в течение часа. При введении в реакцию разбавленных в соотношении 1:100 и 1:200, а также неразбавленных (вводимый объем 0,02 см3) образцов аналитический сигнал стабилен после введения «стоп-реагента» и пропорционально возрастает с увеличением объема пробы.

Проведенные исследования для различных групп пищевых продуктов позволили оптимизировать разбавление и объем пробы, вводимый в реакцию (таблица 4), и рекомендовать внесение ее сразу после разбавления.

По разработанной методике были проанализированы сухие красные и белые вина, пиво, восстановленные и свежеотжатые фруктовые соки, чан и

растительное сырье (таблица 5). Полученные результаты показывают, что величина их антиоксидантной активности варьируется в широком диапазоне.

Таблица 4 - Оптимизированные разбавление и объем пробы, вводимой в реакцию

Объект исследования Разбавление образца Объем пробы, вводимый в реакцию, см3

Вино 1 : 100, 1 :200 1,0-2,0

Пи ей 1 :20 1,0-2,3

Сок 1 : 5 0,2-1,0

Чай 1 г 50, 1 : 100 1,0-2,0

Таблица 5 - Антиоксидантная активность ряда образцов растительного сырья и пищевых продуктов (п = б, Р = 0,95)

Объект исследования Характеристика объекта А О А, мгАК/г

Сухие вина:

Каберне Фанагории ОАО АПФ «Фаиагория» 3,7 ±0,1

Каберне Абрау вино невыдержанное ООО «Кубань — Вино» 2,3 ±0,1

Каберне ООО «Мильстрим — Черноморские вина« 2.0 ±0,1

Каберне ООО «Инвинком», Молдова 2,0 ±0,1

Мускат ООО «Инвинком», Молдова 0,29 ±0,05

Шар доне ЗАО Агрофирма «Мысхако» 0.23 ± 0,02

Пиво:

Балтика №3 светлое, ОАО «Пивоваренная компания «Балтика» 0,21 ±0,01

Балтика №6 темное, ОАО «Пивоваренная компания «Балтика» 0,50 ±0,01

Чай:

Майский сорт высший, ООО «Май» 134 ±7

Краснодарский сорт второй, ЗАО «Дагомысчай» 60 ±3

Соки восстановленные:

Яблочный ОАО «Лебедянский» 0,51 ± 0,04

Апельсиновый ОАО «Лебедянский» 2,2 ±0,2

Растительное сырье:

крапива ОАО «Красногорекле«средства» 21 ± 1

эхиноцея пурпурная ОАО « Краен огорсклексредства» 28 ±1

3 Антиокскдантная активность пншевых продуктов как обобщающая характеристика показателя их качества

Представляло интерес сопоставить известные суммарные показатели конкретных пищевых продуктов, характеризующие их восстановительные свойства, с величиной АОА, определяемой по разработанной методике.

Для ряда пищевых продуктов можно выделить преобладающую группу восстановителей органической природы. Например, антиоксидантные свойства вина в основном обусловлены фенольными соединениями, включающими катехииы, антоциакы, флавонолы, лейкоантоцианы, танины, пива - водорастворимыми компонентам« солода и хмеля (экстрактивными веществами). Основной вклад в величину антиоксидантной активности чая, вероятно, вносят полифенольные соединения (танины). Кроме того, в чае присутствуют замещенные фенолы (галловая кислота, кверцетин, рутин), способные взаимодействовать с индикаторной системой Ре(Ш)/Ре(Н)-о-фенантролин. Это и обусловило выбор объектов исследования — сухое красное вино, пиво, чай - для проведения сопоставительного анализа.

Было определено суммарное содержание фенольных соединений в сухих красных винах спектрофотометрическим методом с использованием реактива Фолина — Чокапьтеу и суммы экстрактивных веществ пива и чая в соответствии с ГОСТ 12787-81 и 28851-90. Установлена взаимосвязь между суммарной антиоксидантной активностью и этими показателями. Зависимость между антиоксидантной активностью и содержанием экстрактивных веществ для образцов, на примере пива, приведена на рис. 1. Для образцов вина наблюдается не только взаимосвязанное изменение антиоксидантной активности и концентрации фенольных соединений, но и довольно близкие значения этих суммарных показателей (таблица б).

Рис. I — Взаимосвязь антиоксидантной активности и суммы экстрактивных веществ пива

АОА мгАК/г

1 - Белый медведь

2 - Ячменный колос

3 - Балтике 3

4 - Дон

5 - Балтика 9

В - Новороссийское 7 - Балтика 6

3.4 3,7 3.0 3,9 4,2 4,в 5,5 Содержание экстрактивных веществ, %

Таблица 6 - Результаты определения суммарных показателей вин (п - б, Р = 0.95)

Объект исследования Суммарное содержание фенол ьных соединений, мг/см3 АОА, мгАК/см3

Каберне Фаиагории, производитель ОАО АПФ «Факагария» 3,6 ± 0,3 3,7 ±0,1

Каберне Абрау (невыдержанное), производитель ООО «Кубань - Вино», 1,9 ±0,1 2,3 ±0,1

Каберне, производитель ООО «Мильстрим — Черноморские вина» 1,9 ±0,1 2,0 ±0,1

Каберне, производитель ООО «Инвиком» 1,7 ±0,2 2,0 ±0,1

Каберне (1)* 1,3 ±0,1 1,3 ±0,1

Каберне (2)* 1,4 ±0.2 1,4 ±0,1

Каберне (3)* 1,5 ±0,2 1,5 ±0,1

Каберне (4)* 0,7 ±0,1 0,83 ±0,06

Русская лоза (купаж), производитель ЗАО «Русская лоза» 1,9 ±0,2 2,3 ± 0,1

Каберне (эталон) 2,7 ± 0,2 2,6 ±0,1

Каберне (виноматериал) 2,1 ±0,2 2,4 ±0,1

Мерло, производитель ООО «Тамань-Arpo» 2,6 ± 0,2 2,8 ± 0,2

Мерло, производитель ООО «Инвиком» 2,1 ±0,2 2,4 ±0,1

Изабелла, производитель ООО «Бастовал» 1,6 ±0,2 1,5 ±0,1

Изабелла (эталон) 1,1 ±0,1 0,69 ±0,03

♦образцы вин Каберне хранились длительное время после откупоривания.

Наблюдаемая взаимосвязь между АОА исследуемых образцов и другими суммарными показателями подтверждает интегральный характер разработанного показателя - антиоксидантной активности.

Особенностью фруктовых соков является отсутствие доминирующей группы восстановителей органической природы. В связи с этим, было изучено влияние ряда веществ, входящих в состав сока: аскорбиновой и яблочной кислот, витамина В|, глюкозы, фруктозы и сахарозы на индикаторную систему Ре( 1N)/Ре(11>-о-фенантроли н. При выборе диапазона исследуемых концентраций восстановителей ориентировались на их содержание в реальных образцах.

Установлено, что сахара: глюкоза, фруктоза и сахароза с индикаторной системой не реагируют и вклада в антиоксидантную активность сока не вносят. Аскорбиновая, яблочная кислоты и витамин В| дают значимые аналитические сигналы при реакции с комплексным

реагентом в диапазонах концентраций 0,05 — 1,8; 2,0 — 10; 10 — 400 мкг/см3 соответственно.

Антиоксидантную активность пищевых продуктов возможно сопоставлять с величиной ванадатной окисляемости, характеризующей способность образца восстанавливать ванадий (V) в кислой среде, что наиболее целесообразно, если в объекте сложно выделить доминирующую группу восстановителей. Однако сравнение можно провести только на качественном уровне путем построения рядов или диаграмм, ввиду того, что анализируемые величины имеют разное выражение единиц измерений.

Была определена ванадатная о кисляем ость разных групп пищевых продуктов ~ сока, пива, чая. Установлено, что последовательность расположения анализируемых образцов, относящихся к одному виду пищевых продуктов, по величинам антиоксидантной активности и ванадатной окисляемости одинакова. Это является качественным доказательством правильности разработанной методики. Диаграмма качественного соответствия для образцов пищевых продуктов, на примере пива, представлена на рис. 2.

АОА, 0,6 1

мгАК/г

0.6 ■

1-&епый медведь 0.4 ■

2-Ячм энный «опое

З-Дон

4-Балтика ЫвЗ 0,3 ■

5-Бяпгика N19

6-Новоросийсков 0,2 •

7-Балтии а

0,1 ■

0,1 0,15 0.2 0,25 0,3

ванадатная окисляемостъ, мМ/г

Рис, 2 - Оценка качественного соответствия АОА и ванадатной окисляемости для пива

Анализ многочисленных проб сухих красных и белых вин разных производителей показал, что антиоксидантная способность красных вин группы «Каберне», «Мерло», «Изабелла» примерно на порядок выше, чем белых вин группы «Шар до не» и «Мускат». Это можно объяснить более высоким содержанием в красных винах фенольных соединений, особенно катехинов, танина и красящих веществ - антоцианов. Кроме того, по показателю антиоксидантной активности, вероятно, можно отделить вина

группы «Изабелла» (0,7 - 1,5 мгАКУсм3) от «Мерло» и «Каберне» (2,3 -3,7 мгАК/см1), а «Мускатные» (около 0,3 мгАК/см3) от «Шардоне» (около 0,2 мгАК/см3).

Для светлых сортов пива: «Белый медведь», «Ячменный колос», «Балтика № 3», «Дон», «Балтика Ла 9», «Новороссийское»' — характерны близкие значения АОА (0,19 ~ 0,26 мгАК/г), между тем как антиоксидантная активность темного пива «Балтика №6» в 2 — 2,5 раза выше и составляет около 0,50 мгАК/г, что объясняется различным содержанием экстрактивных веществ.

Величина АОА свежеотжатого и восстановленных яблочных соков «Фруктовый сад», «Rich», «Вико», (Любимый сад» изменяется от 0,5 до 0,7 мгАК/см3. Антиоксидантная способность апельсинового сока значительно выше и составляет 2,2 мгАК/см3, что связано с большим содержанием витамина С.

Антиоксидантная активность чая высшего сорта: Dilmah, Принцесса Нури, Королевское сафари, Майский чай в 1,5-2 раза выше, чем Краснодарского чая второго сорта, что обусловлено, по-видимому, разной степенью экстракции биологически активных веществ.

На показатель антиоксидантной активности оказывают влияние условия и длительность хранения продукта. Для рассмотрения антиоксидантной активности как показателя качества были проанализированы образцы пива и фруктовых соков, хранящихся с нарушением условий и после окончания срока годности. Кроме того, в течение 1,5 лет контролировали изменение антиоксидантной активности и цветовых характеристик (интенсивности, оттенка) образца вина Каберне.

Установлено, что для образцов пива, хранящихся в аэробных условиях, антиоксидантная активность возрастает, что объясняется накоплением в образце альдегидов. Хранение укупоренного пива при повышенной температуре приводит к незначительному повышению антиоксидантной активности, у просроченного пастеризованного пива антиоксидантная активность несколько уменьшается (таблица 7).

Таблица 7 — Результаты определения антиоксидантной активности образцов пива (п = б, Р = 0,95)

Объект исследования АОА, мгАК/г Объект исследования АОА, мгАК/г

Дон 0,21 ±0,01 Дон (хранилось 30 суток при 1 = 30° С) 0,24 ±0,01

Новороссийское 0,26 ± 0,01 Новороссийское (после истечения срока годности) 0,22 ±0,01

Ячменный колос 0,22 ±0,01 Ячменный колос (хранилось откупоренным) 0,27 ±0,01

Хранение апельсинового сока в течение года приводит к уменьшению его антиоксидантной активности в 2,4 раза. При хранении соков в аэробных условиях в течение 3-х дней величина антиоксидантной активности снижается в 1,5-2 раза как для яблочных, так и для апельсинового соков (таблица 8).

Таблица 8 - Изменение антиоксидантной активности образцов сока в процессе хранения (п = б, Р = 0,95)

День определения АОА апельсинового сока «Тонус», м гАК/см* АОА яблочного сока «Фруктовый сад», мгАК/см3

свежеу пако ванный после окончания срока годности

1 2.2 ± 0,2 0,86 ± 0,07 0,51 ±0,05

3 1,2 ±0,1 0,59 ±0,06 0,36 ±0,04

Хранение вина Каберне в течение 1,5 лет приводит к уменьшению как величины антиоксидантной активности, так и содержания фенольных соединений. Одновременно происходит и изменение такого суммарного показателя, как цветовые характеристики (интенсивность и оттенок), что связано с уменьшением содержания антоцианов и увеличением количества

конденсированных лолифенолов (таблица 9).

[

Таблица 9 - Изменение основных показателей вина в процессе хранения (п = 6, Р = 0,95)

Датп промедекия анализа АОА, мгАК/см3 вина Содержание фенольных соединений, мг/см3 Цветовые характеристики

Интенсивность Оттенок

Февраль 2005 3,7 ±0,1 3.6 ± 0,3 11,15 0,7

Ноябрь 2005 1,2 ±0,1 1,3 ±0,2 7,21 0,8

Апрель 2006 0,9 ± 0,09 1,0 ±0,1 6.59 1,0

Таким образом, проведенные исследования позволили заключить, что для каждого вида пищевой продукции существует диапазон характерных значений антиоксидантной активности, определяющий качество продукции.

4 Влияние экологической ситуации территории на величину антиоксидантной активности растительных материалов

Одним из подходов оценки состояния окружающей среды является реакция растений на различные виды загрязнений. Содержание биологически активных веществ, а, следовательно, и антиоксидантные свойства растений зависят, прежде всего, от видовой принадлежности, а также места произрастания, климатических условий, геохимического состояния почвы, времени вегетации и других экологических факторов.

Для установления влияния неблагоприятных факторов окружающей среды на характер изменения суммарных показателей тест-растений и доказательства возможности их использования в целях экологического мониторинга был разработан алгоритм, включающий обоснование выбора необходимых физико-химических показателей, которые могут влиять на изучаемые параметры объектов исследования; методы и методики анализа; программу отбора проб, ориентированную как на отношение к источнику загрязнения, так и учитывающую период вегетации выбранного тест-растения; обработку и обобщение результатов.

Предварительное определение величины АОА растительных материалов (коры дуба, зверобоя, эхинацеи пурпурной, крапивы двудомной и др.) позволило выбрать в качестве тест-растения крапиву двудомную, так как она обладает достаточно высокой антиоксидантной активностью, а также характеризуется широким ареалом распространения, высокой толерантностью к температуре и количеству осадков, продолжительным вегетационным периодом и развитой поверхностью листа.

При выборе физико-химических показателей учитывали взаимосвязь величины АОА с содержанием биологически активных веществ, обладающих восстановительными свойствами, таких как дубильные вещества. На содержание последних в растительных материалах может оказывать влияние загрязнение окружающей среды, например, токсичными металлами (2п, С<], РЬ, Си), которые могут поступать в растения, в первую очередь, из почвы.

Исходя из возможных значений выбранных физико-химических показателей, был проведен выбор методик анализа. Для определения тяжёлых металлов (2п, С(Э, РЬ, Си) — метод инверсионной вольтам перо метр и и, антиоксидантной активности — с пектрофотометричес к и й метод, дубильных веществ и аскорбиновой кислоты - титриметрический.

Ориентируясь на источник загрязнения - автомагистраль, отбор проб осуществляли на расстоянии 7 и 200 м от него в разные вегетационные периоды. Исследования, проведенные в период с 2004 по 2006 г показали, что содержание Ъп и РЬ в пробах крапивы двудомной, отобранных в 7 м от дороги, примерно в 2 и 3 раза больше, чем в образцах, отобранных на расстоянии 200 м, при этом концентрация свинца в образцах, отобранных у

дороги, превышает ПДК для пищевых продуктов, В тоже время анализ проб почвы показал, что содержание кислотных и подвижных форм свинца, цинка и меди меньше, чем ПДК для их валового содержания, а для кадмия - на уровне фоновых значений для чернозёма.

Суммарное содержание восстановителей - АОА и дубильных веществ в образцах крапивы двудомной уменьшается с приближением к источнику загрязнения (таблица 10), что вероятно связано с защитной реакцией растения на действие загрязнителя.

Таблица 10 - Результаты определения антиоксидантной активности и содержания дубильных веществ в крапиве двудомной (п = б, Р = 0,95)

Образец Расстояние от дороги АОА, м гАК/г Концентрация дубильных веществ, мг/г Концентрация тяжелых металлов, мкг/г

РЬ гп

Июль 2005 200 м 35 ± 3 113 ± 6 0,20 ± 0,02 2,3 ± 0,2

7м 12 ± 1 77 ±5 1,0 ±0,1 4,9 ± 0,5

Аш-уст 2005 200 м 25 ±2 105 ±7 0,26 ±0,03 2,4 ± 0,2

7м 14 ± 1 89 ±6 1,2 ±0,1 5,0 ± 0,5

Апрель 2006 200 м 49 ± 3 141 ±7 0,29 ±0,03 2.8 ± 0,2

7м 25 ±2 107 ±6 1,3 ±0,1 5,9 ± 0,6

Май 2006 200 м 31 ± 2 138± 7 0,32 ± 0,03 2,9 ± 0,3

7 м 23 ±2 121 ±7 1,3 ±0,1 6,2 ± 0,6

ПДК 0,5 10

Выводы

1. Изучено поведение индикаторной системы Ре(Ш)/Ре(11)-о-фенантролин при определении антиоксидантной активности индивидуальных восстановителей и их смесей, показана возможность ее использования для оценки величины АОА растительного сырья и пищевых продуктов.

2. Исследовано влияние ряда индивидуальных восстановителей фенольной и нефенольной природы на индикаторной систему Ге(111 )/Ре(11 )-о-фе н антрол ин и установлено, что их антиоксидантная активность уменьшается в следующем ряду: галловая кислота > кверцетин > гидрохинон > аскорбиновая кислота > танин > рутин > цистенн > глутатион.

3. Установлено, что аналитический сигнал для пищевых продуктов и растительного сырья, регистрируемый с использованием предложенной индикаторной системы, имеет суммарный характер и может быть использован при оценке интегральной антиоксидантной активности исследуемых объектов. Оптимизированы условия (состав и объем

вводимого комплексного реагента, выбранный комплексообразователь и его концентрация, а также время выдерживания до и после введения «стоп-реагента») и предложен алгоритм методики определения суммарной антиоксидаитной активности растительного сырья и пищевых продуктов.

4. Разработана аналитическая схема определения АО А пищевых продуктов и растительного сырья. Обоснована и показана целесообразность использования аскорбиновой кислоты в качестве вещества-стандарта при проведении аналитических определений. Проведена метрологическая аттестация методик определения антиоксидантной активности вина и лекарственных растений.

5. Проведена оценка антиоксидаитной способности ряда пищевых продуктов (сухих красных и белых вин, пива, восстановленных и свежеотжатых фруктовых соков, чая) и лекарственного растительного сырья. Установлено, что для каждого вида пищевых продуктов существует диапазон характерных значений антиоксидаитной активности, определяющий качество продукции.

6. Показана зависимость величины суммарной АОА растительного сырья от условий экологической ситуации территории его произрастания.

Спнсок работ, опубликованных по теме диссертации

1. Цюпко, Т.Г. Антиоксидантная активность - обобщающий показатель качества лекарственных растений / Т.Г. Цюпко, З.А. Темердашев, O.E. Воронова, Н.В. Храпко, А. В. Денисова // Тез. докл. Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России 2004». Москва. - 2004. - С. 187.

2. Цюпко, Т.Г. Спектрофотометрический способ определения суммарной антиоксидаитной активности пищевых продуктов / Т.Г. Цюпко, З.А. Темердашев, О.Б. Воронова, Н.В. Храпко // Тез. докл. II Международного симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии». Краснодар. —2005. — С, 434.

3. Цюпко, ТТ. Разработка методического подхода к скринингу и анализу объектов окружающей среды по обобщенным показателям / Т.Г, Цюпко, З.А. Темердашев, О.Б. Воронова, Н.В. Храпко, А.Н. Бал аба // Тез. докл. Заключительной конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «р2003юг», Краснодар.-2005.-С. 37-39.

4. Tsiupko, T.G. Antioxidant activity as a food product quality criterion / T.G. Tsiupko, O.B. Voronova, N.V. Khrapko, A.N. Balaba // International Congress on Analytical Sciences «1СAS — 2006», Moscow. - 2006. — P. 432.

5. Храпко, Н.В. СпектрофотометрическиЙ способ оценки антиоксидантной активности пищевых продуктов / Н.В. Храпко, А,Н. Балаба, Т,Г, Цюпко, О.Б. Воронова, Е.В. Переверзева, Е.Н. Терещенко, О.М. Баранова // Тез. докл. Всероссийской конференции молодых ученых и 11 школы им. Н,М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты». Москва. — 2006. - С. 156157.

6. Храпко, Н.В Индикаторная система Ре(111)/Ре(11)-органический реагент для определения антиоксидантной активности пищевых продуктов / Н.В. Храпко, Т.Г. Цюпко, З.А. Темердашев, О.Б. Воронова, А.Н. Балаба, Е.В. Переверзева, Е.Н. Терещенко // Тез. докл. Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий». Томск. - 2006. -Т.2-С. 144-145.

7. Цюпко, Т.Г. Разработка методического подхода к определению антиоксидантной активности пищевых продуктов и лекарственного сырья / Т.Г. Цюпко, З.А. Темердашев, О.Б. Воронова, А, В, Денисова, Н.В. Храпко // Наука Кубани. - 2004. - №3 - С, 89-91.

8. Цюпко, Т.Г. Антиоксидантная активность как обобщающая характеристика качества пищевых продуктов / Т.Г. Цюпко, О.Б. Воронова, Н.В. Храпко, З.А, Темердашев // Экологический вестник научных центров Черноморского экологического сотрудничества. -2005. - №2. - С. 91-95.

9. Храпко, Н.В. Методический подход к скринингу и анализу объектов окружающей среды по обобщенным показателям / Н.В, Храпко, Т.Г. Цюпко, З.А. Темердашев, О.Б. Воронова, А.Н, Балаба, Е.В. Переверзева//Наука Кубани. - 2005. - №5. - С. 18-21,

10. Темердашев, З.А. Определение антиоксидантной активности ряда пищевых продуктов с использованием индикаторной системы Ре(Ш)/Ре(1[) - органический реагент / З.А. Темердашев, Т.Г. Цюпко, О.Б. Воронова, Н.В. Храпко, А.Н. Балаба // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. -2006. -Т,72. -№11,

11. Пат. 2282851 Российская Федерация., МПК7 С0ШЗЗ/02. Способ определения суммарной антиоксидантной активности / Цюпко Т.Г., Темердашев З.А., Воронова О.Б., Храпко Н.В. - № 2004138188/13; заявл. 27.12.2004; опубл. 27,08.2006, Бюл. № 24. С. 523.

350040 г. Краснодар, ул. Ставропольская № 149 Типография КубГУ 350023 г. Краснодар, ул. Октябрьская № 25 заказ № 89 тираж 100

Введение.

1 Аналитический обзор.

1.1 Классификация антиоксидантов и их общая характеристика.

1.2 Основные классы природных антиоксидантов.

1.2.1 Фенольные соединения.

1.2.2 Витамины.

1.2.3 Убихинон (коэнзим Q).

1.2.4 Аминокислоты.

1.2.5 Органические кислоты.

1.3 Определение антиоксидантной активности индивидуальных веществ, растительного сырья и пищевых продуктов.

1.3.1 Определение активности антиоксидантов по их способности ингибировать окисление жиров и жиросодержащих субстратов.

1.3.2 Определение активности антиоксидантов по их способности взаимодействовать с кислородными радикалами.

1.3.3 Определение активности антиоксидантов по их способности взаимодействовать со стабильными окрашенными радикалами.

1.3.4 Использование окислительно-восстановительных систем для определения антиоксидантной активности.

1.4 Выводы к аналитическому обзору.

2 Экспериментальная часть и обсуждение результатов.

2.1 Материалы, реактивы и используемое оборудование.

2.2 Приготовление используемых в работе растворов.

2.2.1 Приготовление комплексного реагента.

2.2.2 Приготовление головных (стандартных) и рабочих растворов восстановителей органической природы.

2.2.3 Приготовление 0,5 М раствора фторида натрия.

2.2.4 Приготовление 0,02 М раствора ЭДТА.

2.2.5 Приготовление экстрактов лекарственного сырья и чая.

2.3 Методики для проведения дополнительных исследований.

2.3.1 Методика определения фенольных соединений в вине.

2.3.2 Методика определения цветовых характеристик вина.

2.3.3 Методика определения ванадатной окисляемости.

2.4 Исследование системы Ре(Ш)/Те(П)-о-фенантролин для оценки антиоксидантной способности природных объектов.

2.4.1 Обоснование возможности использования системы Fe(III)/Fe(II)-о-фенантролин для оценки антиоксидантной способности.

2.4.2 Оптимизация состава комплексного реагента Fe(III)-о-фенантролин.

2.4.3 Изучение влияния индивидуальных восстановителей и их смесей на индикаторную систему Ре(Ш)/Ре(П)-о-фенантролин.

2.5 Антиоксидантная активность пищевых продуктов как обобщающая характеристика показателя их качества.

2.5.1 Разработка способа оценки антиоксидантной способности природных объектов.

2.5.2 Сопоставительный анализ известных суммарных показателей и величин антиоксидантной активности пищевых продуктов.

2.6 Метрологическая аттестация методик определения антиоксидантной активности вина, пива и растительного сырья.

2.7 Влияние экологической ситуации территории на величину антиоксидантной активности растительных материалов.

Выводы.

Цепные реакции с участием свободных радикалов являются основной причиной окислительного разрушения клеточных мембран, денатурации белков и нуклеиновых кислот, что приводит к возникновению различных патологических состояний.

В нормальном состоянии образование свободных радикалов в организме регулируется действием антиоксидантной защитной системы, включающей ферменты, сывороточные белки, гормоны, витамины, низкомолекулярные сульфидные соединения и органические кислоты. Присутствуя даже в незначительных количествах, антиоксиданты способны стабилизировать активные свободные радикалы, значительно замедляя или ингибируя, протекающие по цепному механизму, окислительные реакции. Однако, воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды, приводит к избыточному образованию свободных радикалов, тем самым, вызывая дисбаланс в антиоксидантном статусе человека. Такое состояние называется окислительным стрессом.

Дополнительными источниками антиоксидантов для человека могут служить пищевые продукты растительного происхождения: овощи, фрукты, ягоды, соки, вино, чай, кофе и какао. Антиоксидантные свойства пищевых продуктов обусловлены такими биологически активными веществами как фенольные соединения, витамины, протеины, сахара, карбоновые и аминокислоты. Поэтому антиоксидантная активность (АОА) пищевых продуктов является одним из основных показателей, определяющих их биологическую ценность.

Антиоксиданты также широко используются для предотвращения окислительной порчи масел, жиров и жиросодержащих продуктов в процессе производства и хранения. Однако применение синтетических антиоксидантов ограничено из-за их возможного токсического действия. Это проводит к необходимости поиска альтернативных соединений среди растительного сырья, обладающих высокой антиоксидантной активностью и безвредных для человека.

В настоящее время наиболее популярны методы оценки антиоксидантной активности, основанные на окислении различных липидных субстратов с последующим определением продуктов окисления. Несмотря на доступность, большинство методов, относящихся к данной группе, являются длительными и дают плохо воспроизводимые результаты. В связи с этим, разработка новых методов, сочетающих экспрессность с достоверностью и высокой воспроизводимостью полученных данных, остаются актуальной задачей.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 03-03-96548, № 06-03-96616).

Цель работы: Исследование индикаторной системы Fe(III)/Fe(II)~о-фенантролин и разработка на её основе способа определения интегральной антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- теоретически обосновать и экспериментально доказать возможность использования индикаторной системы Ре(Ш)/Ре(И)-о-фенантролин для разработки спектрофотометрического способа оценки антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов;

- исследовать влияние индивидуальных восстановителей органической природы и их смесей на индикаторную систему;

- оценить суммарную антиоксидантную активность и провести сопоставительный анализ ее величины с известными суммарными характеристиками ряда пищевых продуктов и растительного сырья.

В ходе решения поставленных задач в диссертационной работе предложена и изучена индикаторная система Ре(Ш)/Ре(П)-о-фенантролин для оценки антиоксидантной активности пищевых продуктов и растительных материалов.

Исследовано влияние восстановителей фенольной и нефенольной природы на индикаторную систему и показан суммарный характер измеряемой величины антиоксидантной активности.

Показана возможность использования величины суммарной антиоксидантной активности для характеристики качества пищевых продуктов и растительного сырья.

Предложен способ определения суммарной антиоксидантной активности пищевых продуктов и лекарственных препаратов на основе растительного сырья с использованием индикаторной системы Ре(Ш)/Те(П)-о-фенантролин.

Проведена метрологическая аттестация методик определения антиоксидантной активности вин и лекарственных растений. Методика апробирована на образцах вина, пива, соков, чая, лекарственных трав и настоек.

Выводы

1. Изучено поведение индикаторной системы Ре(Ш)/Ре(П)-о-фенантролин при определении антиоксидантной активности индивидуальных восстановителей и их смесей, показана возможность ее использования для оценки величины АОА растительного сырья и пищевых продуктов.

2. Исследовано влияние ряда индивидуальных восстановителей фенольной и нефенольной природы на индикаторной систему Fe(III)/Fe(II)-o-фенантролин и установлено, что их антиоксидантная активность уменьшается в следующем ряду: галловая кислота > кверцетин > гидрохинон > аскорбиновая кислота > танин > рутин > цистеин > глутатион.

3. Установлено, что аналитический сигнал для пищевых продуктов и растительного сырья, регистрируемый с использованием предложенной индикаторной системы, имеет суммарный характер и может быть использован при оценке интегральной антиоксидантной активности исследуемых объектов. Оптимизированы условия (состав и объем вводимого комплексного реагента, выбранный комплексообразователь и его концентрация, а также время выдерживания до и после введения «стоп-реагента») и предложен алгоритм методики определения суммарной антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов.

4. Разработана аналитическая схема определения АОА пищевых продуктов и растительного сырья. Обоснована и показана целесообразность использования аскорбиновой кислоты в качестве вещества-стандарта при проведении аналитических определений. Проведена метрологическая аттестация методик определения антиоксидантной активности вина, пива и лекарственных растений.

5. Проведена оценка антиоксидантной способности ряда пищевых продуктов (сухих красных и белых вин, пива, восстановленных и свежеотжатых фруктовых соков, чая) и лекарственного растительного сырья. Установлено, что для каждого вида пищевых продуктов существует диапазон характерных значений антиоксидантной активности, определяющий качество продукции.

6. Показана зависимость показателя суммарной АОА растительного сырья от условий экологической ситуации территории его произрастания.

1. Kaur, С. Antioxidants in fruits and vegetables the millennium's health / C. Kaur, H. C. Kapoor // Int. J. Food Sci. and Techn. - 2001. - Vol. 36. - № 7. - P. 703-725.

2. Pszczola, D. E. Antioxidants: from preserving food quality to quality of life / D. E. Pszczola // Food Techn. 2001. - Vol. 55. - № 6. - P. 51-59.

3. Lichtenthaler, R Determination of antioxidative capacities using an enhanced total oxidant scavenging capacity (TOSC) assay / R. Lichtenthaler, F. Marx, О. M. Kind // Eur. Food Res. and Technol. 2003. - Vol. 216. - № 2. - P. 166-173.

4. Antolovich, M. Methods for testing antioxidant activity / M. Antolovich, P. D. Prenzler, E. Patsalides, S. McDonald, K. Robards // Analyst. 2002. - Vol. 127.-№ l.-P. 183-198.

5. Gazzani, G. Anti- and prooxidant activity of water soluble components of some common diet vegetables and the effect of thermal treatment / G. Gazzani, A. Papetti, G. Massolini, M. Daglia // J. Agric. and Food Chem. 1998. - Vol. 46. -№ 10.-P. 4118-4122.

6. Halliwell, B. The definition and measurement of antioxidants in biological systems / B. Halliwell, J. M. C. Gutteridge // Free Radical Biol, and Med. 1995. -Vol. 18.-№ 1 - P. 125-126.

7. Pazdzioch-Czochra, M. Spectrofluorimetric determination of hydrogen peroxide scavenging activity / M. Pazdzioch-Czochra, A. Widenska // Anal. Chim. Acta. 2002. - Vol. 452. - № 2. - P. 177-184.

8. Magnani, L. Spectrophotometric measurement of antioxidant properties of flavones and flavonols against superoxide anion / L. Magnani, E. M. Gaydou, J. C. Hubaud // Anal. Chim. Acta. 2000. - Vol. 411. - № 1-2. - P. 209-216.

9. Roginsky, V. Review of methods to determine chain-breaking antioxidant activity in food / V. Roginsky, E. A. Lissi // Food Chem. 2005. - Vol. 92. - № 2. -P. 235-254.

10. Gramza, A. Tea constituents (Camellia sinensis L.) as antioxidants in lipid systems / A. Gramza, J. Korczak // Trends in Food Sci. and Techn. 2005. -Vol. 16.-№8.-P. 351-358.

11. Dorman, H.J.D. Characterisation of the antioxidant properties of de-odourised aqueous extracts from selected Lamiaceae herbs / H.J.D. Dorman, A. Peltoketo, R. Hiltunen, M. J. Tikkanen // Food Chem. 2003. - Vol. 88. - № 2. -P. 255-262.

12. Kim, S. Y. Effect of heating conditions of grape seeds on the antioxidant activity of grape seed extracts / S. Y. Kim, S. M. Jeong, W. P. Park, K.C. Nam, D.U. Aim, S. C. Lee // Food Chem. 2006. - Vol. 97. - № 3. - P. 472-479.

13. Блажей, А. Фенольные соединения растительного происхождения / А. Блажей, А Шутый: перевод со славянского А.П. Сергеева. М.: Мир, 1977.-239 с.

14. Кишковский, 3. Н. Химия вина: учеб. пособие для студентов технол. спец. вузов пищ. пром-сти / 3. Н. Кишковский, И. М. Скурихин. М.: Пищ. пром-сть, 1976. - 311 с.1. V • < »

15. Skerget, М. Phenols, proanthocyanidms, flavones and flavonols in some plant materials and their antioxidant activities / M. Skerget, P. Kotnik, M. Hadolin, A. R. Hras, M. Simonic, Z. Knez // Food Chem. 2005. - Vol. 89. - № 2. - P. 191-198.

16. Mimica-Dukic, N. M. Antioxidant activity of plant phenolic. Flavonoids and phenolic acids / N. M. Mimica-Dukic, M. M. Budincevic, B. A. Mihajlovic, O. S. Gasic // J. Serb. Chem. Soc. 1994. - Vol. 59. - № 11. - P. 823-828.

17. Marinova, E. M. Antioxidant activity and mechanism of action of some phenolic acids at ambient and high temperatures / E. M. Marinova, N. V. Yanishlieva // Food Chem. 2003. - Vol. 81. - № 2. - P. 189-197.

18. Семенов, А. А. Очерк xhmhh природных соединений / А. А. Семенов; ответственный редактор академик Г. А. Толстиков. -Новороссийск: Наука, 2000. 664 с.

19. Yilmaz, Y. Health aspects of functional grape seed constituents / Y. Yilmaz, R. T. Toledo // Trends in Food Sci. and Techn. 2004. - Vol. 15. - № 9. -P. 422-433.

20. Polovka, M. Antioxidant properties of tea investigated by EPR spectroscopy / M. Polovka, V. Brezova, A.j Stasko // Biophys. Chem. 2003. -Vol. 106.-№ 1-P. 39-56.

21. Robards, K. Strategies for the determination of bioactive phenols in plants, fruit and vegetables / K. Robards // J. of Chromatogr. 2003. - Vol. 1000. -№ 1-2.-P. 657-691.

22. Noda, Y. Antioxidant activities of pomegranate fruit extract and its anthocyanidins: delphinidin, cyanidin and pelargonidin / Y. Noda, T. Kaneyuki, A. Mori, L. Packer // J. Agric. and Food Chem. 2002. - Vol. 50. - № 1 - P. 166171.

23. Netzel, M. The excretion and biological antioxidant activity of elderberry antioxidants in healthy humans / M. Netzel, G. Strass, M. Herbst, H. Dietrich, R. Bitsch, I. Bitsch, T. Frank'// Food Research Internal 2005. - Vol. 38. - № 8-9 -P. 905-910.

24. Lapidot, T. pH-Dependent forms of red wine anthocyanins as antioxidants / T. Lapidot, S. Harel, B. Akiri, R. Granit, J. Kanner // J. Agric. and Food Chem. 1999. - Vol. 47. - № 1. - P. 67-70.

25. Валуйко, Г. Г. Биохимия и технология красных вин / Г. Г. Валуйко. -М.: Пищ. пром-сть, 1973 292 с.

26. Di Majo, D. Flavanones in citrus fruit: structure antioxidant activity relationships / D. Di Majo, M. Giammanco, M. La Guardia, E. Tripoli, S. Giammanco, E. Finotti // Food Res. Internal - 2005. - Vol. 38. - № 10. - P. 11611166.

27. Vinson, J. A. Phenol antioxidant quantity and quality in foods: vegetables / J. A. Vinson, Y. Нао, X. Su, L. Zubik // J. Agric. and Food Chem. 1998. - Vol. 46.-№ 9-P. 3630-3634.

28. Makris, D. P. Flavonols in grapes, grape products and wines: burden, profile and influential parameters / D. P. Makris, S. Kallithraka, P. Kefalas // J. of Food Composition and Analysis. 2006. - Vol. 19. - № 5 - P. 396-404.

29. Katalinic, V. Antioxidant effectiveness of selected wines in comparison with (+)-catechin / V. Katalinic, M. Milos, D. Modun, I. Music, M. Boban // Food Chem. 2004. - Vol. 86. - № 4 - P. 593-600.

30. Benavente-Garcia, O. Uses and properties of citrus flavonoids / O. Benavente-Garcia, J. Castillo, F. R. Marin, A. Ortuno, J. A. Del Rio // J. Agric. and Food Chem. 1997. - Vol. 45. - № 12. - P. 4505-4515.

31. Burton, G. W. Vitamin E: application of the principles of physical organic chemistry to the exploration of its structure and function / G. W. Burton, K. U. Ingold // Acc. Chem. Res. 1986. - Vol. 19. - № 7. - P. 194-201.

32. Kiokias, S. Antioxidant properties of natural carotenoid extracts against the AAPH-initiated oxidation of food emulsions / S. Kiokias, V. Oreopoulou // Innovat. Food Sci. and Emer. Techn. 2006. - Vol. 7. - № 1-2. - P. 132-139.

33. Березов, Т. Т. Биологическая химия: учебник / Т. Т. Березов, Б. Ф.

34. Коровкина. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.

35. Leong, L. P. An investigation of antioxidant capacity of fruits in Singapore markets / L. P. Leong, G. Shui // Food Chem. 2002. - Vol. 76. - № 1 -P. 69-75.

36. Di Labio, G. A. Hemiketal formation of dehydroascorbic acid drives ascorbyl radical anion disproportionation / G. A. Di Labio, J. S. Wright // Free Radical Biol, and Med. 2000. - Vol. 29. - № 5- P. 480-485.

37. Chen, H.-M. Antioxidant activity of designed peptides based on the antioxidative peptide isolated from digests of a soybean protein / H.-M. Chen, K. Muramoto, F. Yamauchi, K. Nokihara // J. Agric. and Food Chem. 1996. - Vol.44. -№ 9. -P. 2619-2623.

38. Пищевая химия: учебник для студентов вузов / А.П. Нечаев, С.Е. Траубенберг, А.А. Кочеткова и др.; под. ред. А.П. Нечаева. 3-е изд., испр. -СПб.: ГИОРД, 2004. - 632 с.

39. Cuvelier, М.-Е. Behavior of phenolic antioxidants in a partitioned medium: structure-activity relationship / M.-E. Cuvelier, V. Bondet, C. Berset // J. Amer. Oil Chem. Soc. 2000. - Vol. 77. -№ 8. - P. 819-823.

40. Yen, G.-C. Antioxidant activity of anthraquinones and anthrone / G.-C. Yen, P.-D. Duh, D.-Y. Chuang // Food Chem. 2000. - Vol. 70. - № 4. - P. 437441.

41. Abas, F. Antioxidant and nitric oxide inhibition activities of selected Malay traditional vegetables / F. Abas, N. H. Lajis, D. A. Israf, S. Khozirah, Y. U. Kalsom // Food Chem. 2006. - Vol. 96. - № 4 - P. 566-573.

42. Imark, C. Occurrence and activity of natural antioxidants in herbal spirits / C. Imark, M. Kneubuhl, S. Bodmer // Innovat. Food Sci. and Emer. Techn. -2001.-Vol. 1. № 4 - P. 239-243.

43. Foti, M. Flavonoids, coumarins and cinnamic acids as antioxidants in a micellar system, structure activity relationship / M. Foti, M. Piattelli, M. T. Baratta, G. Ruberto // J. Agric. and Food Chem. - 1996. - Vol. 44. - № 2. - P. 497-501.

44. Kuo, J.-M. Rapid photometric assay evaluating antioxidative activity in edible plant material / J.-M. Kuo, D.-B. Yeh, B. Sun Pan // J. Agric. and Food Chem. 1999. - Vol. 47. - № 8. - P. 3206-3209.

45. Hinneburg, I. Antioxidant activities of extracts from selected culinary herbs and spices /1. Hinneburg, H.J. D. Dorman, R. Hiltunen // Food Chem. -2006.-Vol. 97.-№ 1 P. 122-129.

46. Rapisarda, P. Antioxidant effectiveness as influenced by phenolic content of fresh orange juices / P. Rapisarda, A. Tomaino, R. Lo Cascio, F. Bonina, A. De Pasquale, A. Saija // J. Agric. and Food Chem. 1999. - Vol. 47. - № 11. - P. 4718-4723.

47. Peyrat-Maillard, M. N. Determination of the antioxidant activity of phenolic compounds by coulometric detection / M. N. Peyrat-Maillard, S. Bonnely, C. Berset // Talanta. 2000. - Vol. 51. - № 4. - P. 709-716.

48. Пат. 2102757 Российская Федерация, МПК7 6G01N33/52. Способ определения антиоксидантной активности плазмы крови / Левин Г.Я., Неделяева А.В., Сидоркин В.Г. № 95118976/14; заявл. 09.11.1995; опубл. 20.01.1998, Бюл. № 2 (IIЧ.). - С. 362

49. Gadow, A. Effect of extraction time and additional heating on the antioxidant activity of rooibos tea (Aspalathus linearis) extract / A. Gadow, E. Joubert, C. F. Hansmann // J. Agric. and Food Chem. 1997. - Vol. 45. - № 4. -P. 1370-1374.

50. Hras, A. R. Comparison of antioxidative and synergistic effects of rosemary extract with a-tocopherol, ascorbyl palmitate and citric acid in sunflower oil / A. R. Hras, M. Hadolin, Z. Knez, D. Bauman // Food Chem. 2000. - Vol. 71.-№2-P. 229-233.

51. Van Rutha, S. M. Influence of methanolic extracts of soybean seeds and soybean oil on lipid oxidation in linseed oil / S. M. van Rutha, E. S. Shaker, P. A. Morrisseya // Food Chem. 2001. - Vol. 75. - № 2 - P. 177-184.

52. Garcia-Alonso, M. Evaluation of the antioxidant properties of fruits / M. Garcia-Alonso, S. de Pascual-Teresa, C. Santos-Buelga, J. C. Rivas-Gonzalo // Food Chem. 2004. - Vol. 84. - № 1 - P. 13-18.

53. Natella, F. Benzoic and cinnamic acid derivatives as antioxidants: structure activity relation / F. Natella, M. Nardini, M. Di Felice, C. Scaccini // J. Agric. and Food Chem. - 1999. - Vol. 47. - № 4. p. 1453-1459.

54. Vinson, J. A. Phenol antioxidant quantity and quality in foods: cocoa, dark chocolate and milk chocolate / J. A. Vinson, J. Proch, L. Zubik // J. Agric. and Food Chem. 1999. - Vol. 47. - № 12. - P. 4821-4824.

55. Makris, D. P. Comparison of quercetin and a non-orthohydroxy flavonol as antioxidants by competing in vitro oxidation reactions / D. P. Makris, J. T. Rossiter // J. Agric. and Food Chem. 2001. - Vol. 49. - № 7. p. 3370-3377.

56. Heinonen, I. M. Antioxidant activity of berry phenolics on human low-density lipoprotein and liposome oxidation /1. M. Heinonen, A. S. Meyer, E. N. Frankel // J. Agric. and Food Chem. 1998. - Vol. 46. - № 10. - P. 4107-4112.

57. Чудинова, В. В. Влияние а-токоферола на ферментативное окисление линолевой кислоты / В. В. Чудинова, Е. И. Василенко, Е. И. Захарова Р. П. Евстегнеева // Биоорганическая химия 1996. - Т. 22. - № 10-11.-С. 804-808.

58. Abuja, P. М. Antioxidant and prooxidant activities of elderberry (sambucus nigra) extract in low density lipoprotein oxidation / P. M. Abuja, M. Murkovic, W. Pfannhauser // J. Agric. and Food Chem. 1998. - Vol. 46. - № 10. -P. 4091-4096.

59. Heinonen, I. M. Antioxidant activity of berry and fruit wines and liquors / I. M. Heinonen, P. J. Lehtonen, A. I. Hopia // J. Agric. and Food Chem. 1998. -Vol. 46.-№ l.-P. 25-31.

60. Теселкин, Ю.О. Антиоксидантные свойства дигидрокверцетина / Ю.О. Теселкин, Б.А. Жамбалова, И.В. Бабенкова, Г.И. Клебанов, Н.А. Тюкавкина // Биофизика 1996. - Т. 41. - № 3. - С. 620-623.

61. Заявка 2219215 Российская Федерация., МПК7 6G01N33/00. Способ определения общей антиоксидантной активности / Рогожин В.В. № 97111917/13; заявл. 08.07.1997; опубл. 10.06.1999, Бюл. № 16 (I ч.). - С. 274.

62. Пат. 2160898 Российская Федерация., МПК7 7G01N33/48. Способ определения антиоксидантной активности антиоксидантных препаратов / Михайлов С.С., Романчук Л.А., Фактор Э.А. № 99112421/14; заявл. 07.06.1999; опубл. 20.12.2000, Бюл. № 35 (II ч.). - С. 281.

63. Пат. 2146053 Российская Федерация., МПК7 7G01N33/53, 7G01N33/49, G01N33/84. Способ определения прооксидантной активности биологических материалов / Молчанов А.В., Галактионова Л.П. № 97101937/14; заявл. 10.02.1997; опубл. 10.02.1997, Бюл. № 6.- С. 260.

64. Tanizawa, Н. A new efficacy test of antioxidants based on air-oxidation of linoleic acid / H. Tanizawa, Y. Sazuka, A. Komatsu, S. Toda, Y. Takino // Chem. and Pharm. Ball. 1983. - Vol. 31. - № 11. - P. 4139-4143.

65. Пат. 2144674 Российская Федерация., МПК7 7G01N33/52, 7G01N33/68. Способ определения антиоксидантной активностисупероксиддисмутазы и химических соединений / Сирота Т.В. № 99103192/14; заявл. 24.02.1999; опубл. 20.01.2000, Бюл. № 2 (II ч.). - С. 266.

66. Wei, Q. Y. Synergistic effect of green tea polyphenols with trolox on free radical-induced oxidative DNA damage / Q. Y. Wei, B. Zhou, Y. J. Cai, L. Yang, Z. L. Liu // Food Chem. 2006. - Vol. 96. - № 1 - P. 90-95.

67. Yi, O.-S. Antioxidant activity of grape extracts in a lecithin liposome system / O.-S. Yi, A. S. Meyer, E. N. Frankel // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1997. -Vol. 74.-№ 10.-P. 1301-1307.

68. Fukumoto, L. R. Assessing antioxidant and prooxidant activities of phenolic compounds / L. R. Fukumoto, G. Mazza // J. Agric. and Food Chem. -2000. Vol. 48. - № 8. - P. 3597-3604.

69. Velioglu, Y. S. Antioxidant activity and total phenolics in selected fruits, vegetables and grain products / Y. S. Velioglu, G. Mazza, L. Gao, B. D. Oomah // J. Agric. and Food Chem. 1998. - Vol. 46. - № 10 - P. 4113-4117.

70. Sanahmetoglu, M. Flow injection analysis for monitoring antioxidant effects on luminol chemiluminescence of reactive oxygen species / M. Sanahmetoglu, R. A. Wheatley, I. £akici, I. Kanzik, A. Townshend // Anal. Lett. -2003. Vol. 36. - № 4 - P. 749-765.

71. De Gaulejac, N. S.-C. Comparative study of polyphenol scavenging activities assessed by different methods / N. S.-C. de Gaulejac, C. Provost, N. Vivas // J. Agric. and Food Chem. 1999. - Vol. 47. - № 2 - P. 425-431.

72. Giil^n, I. Comparison of antioxidant activity of clove (Eugenia caryophylata Thunb) buds and lavender (Lavandula stoechas L.) / I. Gtilyin, i. Giingor §at, Beydemir, M. Elmasta§, O. i. Kiifrevioglu // Food Chem. 2004. -Vol. 87. - № 3 - P. 393-400.

73. Dasgupta, N. Antioxidant activity of Piper betle L. leaf extract in vitro / N. Dasgupta, B. De // Food Chem. 2004. - Vol. 88. - № 2 - P. 219-224.

74. Banerjee, A. In vitro study of antioxidant activity of Syzygium cumini fruit / A. Banerjee, N. Dasgupta, B. De // Food Chem. 2005. - Vol. 90. - № 4 -P. 727-733.

75. Girotti, S. Plasma antioxidant capacity determination: comparative evaluation of chemiluminescent and spectrophotometric assays / S. Girotti, E. Ferri, L. Maccagnani, R. Budini, G. Bianchi // Talanta. 2002. - Vol. 56. - № 3 -P. 407-414.

76. Yen, G.-C. Antioxidant and pro-oxidant properties of ascorbic acid and gallic acid / G.-C. Yen, P.-D. Duh, H.-L. Tsai // Food Chem. 2002. - Vol. 79. -№ 3 - P. 307-313.

77. Cao, G. Antioxidant Capacity of Tea and Common Vegetables / G. Cao, E. Sofic, R. L. Prior // J. Agric. and Food Chem. 1996. - Vol. 44. - № 11 - p. 3426-3431.

78. Cheng, Z. Kinetic deoxyribose degradation assay and its application in assessing the antioxidant activities of phenolic compounds in a Fenton-type reaction system / Z. Cheng, Y. Li, W. Chang // Anal. Chim. Acta. 2003. - Vol. 478. - № 1 - P. 129-137.

79. Arnous, A. Correlation of pigment and flavanol content with antioxidant properties in selected aged regional wines from Greece / A. Arnous, D. P. Makris, P. Kefalas // J of Food Сотр. and Anal. 2002. - Vol. 15. - № 6 - P. 655-665.

80. Навас, M.X. Определение восстановительной способности настоек семени канарского канареечника методом хемилюминесценции / М.Х. Навас, A.M. Хименец, А.Г. Асуэро // ЖАХ. 2004. - Т. 59. - № 1 - С. 84-86.

81. Пат. 2157531 Российская Федерация., МПК7 7G01N33/52. Способ определения суммарной антиоксидантной активности крови / Иконникова Е.И., Бурова М.Б. № 99119212/14; заявл. 13.09.1999; опубл. 10.10.2000, Бюл. № 28 (II ч.). - С. 300.

82. Пат. 2163021 Российская Федерация., МПК7 7G01N33/483. Способ определения антиокислительной активности веществ / Формазюк В.Е., Горшкова Т.Н., Сергиенко В.И. № 98120809/14; заявл. 19.11.1998; опубл. 10.02.2001, Бюл. № 4 (II ч.). - С. 316.

83. Atoui, А. К. Tea and herbal infusions: Their antioxidant activity and phenolic profile / A. K. Atoui, A. Mansouri, G. Boskou, P. Kefalas // Food Chem.- 2005. Vol. 89. - № 1 - P. 27-36.

84. Рыжиков, M. А. Применение хемилюминесцентного метода для исследования антиоксидантной активности водных экстрактов из растительного сырья / М. А. Рыжиков, В. О. Рыжикова // Вопросы питания -2006.-Т. 75 № 2 - С. 22-27.

85. Papadopoulos, К. Evaluation of food antioxidant activity by photostorage chemiluminescence / K. Papadopoulos, T. Triantis, D. Dimotikali, J. Nikokavouras // Anal. Chim. Acta. 2001. - Vol. 433. - № 2 - P. 263-268.

86. Li, Y. Evaluation of antioxidant properties of pomegranate peel extract in comparison with pomegranate pulp extract / Y. Li, C. Guo, J. Yang, J. Wei, J. Xu, S. Cheng // Food Chem. 2006. - Vol. 96. - № 2 - P. 254-260.

87. Naguib, Y. M. A. A fluorometric method for measurement of oxygen radical-scavenging activity of water-soluble antioxidant / Y. M. A.Naguib // Anal. Biochem. 2000. - Vol. 284. - № 1 - P. 93-98.

88. Ghiselli, A. Antioxidant activity of different phenolic fractions separated from an Italian red wine / A. Ghiselli, M. Nardini, A. Baldi, C. Scaccini // J. Agric. and Food Chem. 1998. - Vol. 46. - № 2 - P. 361-367.

89. Villano, D. Comparison of antioxidant activity of wine phenolic compounds and metabolites in vitro / D. Villano, M. S. Fernandez-Pachon, A. M.

90. Troncoso, M. С. Garcia-Parrilla // Anal. Chim. Acta. 2005. - Vol. 538. - № 1-2 -P. 391-398.

91. Lopez, M. Study of phenolic compounds as natural antioxidants by a fluorescence method / M. Lopez, F. Martinez, C. Del Valle, M. Ferrit, R. Luque // Talanta. 2003. - Vol. 60. - № 2-3 - P. 609- 616.

92. Fernandez-Pachon, M. S. Antioxidant activity of wines and relation with their polyphenolic composition / M. S. Fernandez-Pachon, D. Villano, M. C. Garcia-Parrilla, A. M. Troncoso // Anal. Chim. Acta. 2004. - Vol. 513. - № 1 -P.113-118.

93. Davalos, A. Antioxidant properties of commercial grape juices and vinegars / A. Davalos, B. Bartolome, C. Gomez-Cordoves // Food Chem. 2005. -Vol. 93. -№ 2 - P. 325-330.

94. Lo Scalzo, R. Effect of thermal treatments on antioxidant and antiradical activity of blood orange juice / R. Lo Scalzo, T. Iannoccari, C. Summa, R. Morelli, P. Rapisarda // Food Chem. 2004. - Vol. 85. - № 1 - P. 41-47.

95. Korotkova, E. I. Study of antioxidant properties by voltammetry / E. I. Korotkova, Y. A. Karbainov, A. V. Shevchuk // J. of Electroanal. Chem. 2002. -Vol. 518.-№ 1 p. 56-60.

96. Korotkova, E. I. Investigation of antioxidant and catalytic properties of some biologically active substances by voltammetry / E. I. Korotkova, Y. A. Karbainov, O. A. Avramchik // Anal. Bioanal. Chem. 2003. - Vol. 375. - № 3 -P. 465-468.

97. Короткова, Е.И. Вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов / Е.И. Короткова // ЖФХ. 2000. - Т. 74. - № 9 -С. 1704-1706.

98. Громовая, В.Ф. исследование антирадикальной и антиоксидантной активности биологически активных карбоновых кислот / В.Ф. Громовая, Г.С. Шаповал, И.Е. Миронюк // ЖОХ. 2002. - Т. 72. - № 5 - С. 828-831.

99. Villano, D. The antioxidant activity of wines determined by the ABTS'+ method: influence of sample dilution and time / D. Villano, M. S. Fernandez-Pachon, A. M. Troncoso, M. C. Garcia-Parrilla // Talanta 2004. - Vol. 64. - № 2 -P. 501-509.

100. Villano, D. Comparison of antioxidant activity of wine phenolic compounds and metabolites in vitro / D. Villano, M. S. Fernandez-Pachon, A. M. Troncoso, M. C. Garcia-Parrilla // Anal. Chim. Acta. 2005. - Vol. 538. - № 1-2 -P. 391-398.

101. Pannala, A. S. Flavonoid B-ring chemistry and antioxidant activity: fast reaction kinetics / A. S. Pannala, T. S. Chan, P. J. O'Brien, C. A. Rice-Evans // Biochem. and Biophys. Res. Commun. 2001. - Vol. 282. - № 5 - P. 1161-1168.

102. Sanchez-Gonzalez, I. In vitro antioxidant activity of coffees brewed using different procedures (Italian, espresso and filter) /1. Sanchez-Gonzalez, A. Jimenez-Escrig, F. Saura-Calixto // Food Chem. 2005. - Vol. 90. - № 1-2 - P. 133-139.

103. Djeridane, A. Antioxidant activity of some algerian medicinal plants extracts containing phenolic compounds / A. Djeridane, M. Yousfi, B. Nadjemi, D. Boutassouna, P. Stacker, N. Vidal // Food Chem. 2006. - Vol. 97. - № 4 - P. 654-660.

104. Kranl, K. Comparing antioxidative food additives and secondary plant products use of different assays / K. Kranl, K. Schlesier, R. Bitsch, H. Hermann, M. Rohe, V. Bohm // Food Chem. - 2005. - Vol. 93. - № 1 - P. 171-175.

105. Miliauskas, G. Screening of radical scavenging activity of some medicinal and aromatic plant extracts / G. Miliauskas, P. R. Venskutonis, T. A. van Beek // Food Chem. 2004. - Vol. 85. - № 2 - P. 231-237.

106. Meda, A. Determination of the total phenolic, flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey, as well as their radical scavenging activity / A. Meda, С. E. Lamien, M. Romito, J. M. Odile G. Nacoulma // Food Chem. 2005. -Vol. 91.-№3-P. 571-577.

107. Shyamala, В. N. Leafy vegetable extracts antioxidant activity and effect on storage stability of heated oils / B. N. Shyamala, S. Gupta, A. J. Lakshmi, J. Prakash // Innov. Food Sci. and Emerg. Technol. - 2005. - Vol. 6. - № 2 - P. 239-245.

108. Choi, H.-S. Radical-scavenging activities of citrus essential oils and their components: detection using l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl / H.-S. Choi, H. S. Song, H. Ukeda, M. Sawamura // J. Agric. and Food Chem. 2000. - Vol. 48. -№9-P. 4156-4161.

109. Choi, Y. M. Antioxidant and antimicrobial activities of propolis from several regions of Korea / Y. M. Choi, D. O. Noh, S. Y. Cho, H. J. Suh, К. M. Kim, J. M. Kim // LWT. 2006. - Vol. 39. - № 7 - P. 756-761.

110. Yu, L. Antioxidant properties of hard winter wheat extracts / L. Yu, Scott Haley, J. Perret, M. Harris // Food Chem. 2002. - Vol. 78. - № 4 - P. 457461.

111. Leonardi, C. Antioxidative activity and carotenoid and tomatine contents in different typologies of fresh consumption tomatoes / C. Leonardi, P. Ambrosino, F. Esposito, V. Fogliano // J. Agric. and Food Chem. 2000. - Vol. 48. -№ 10-P. 4723-4727.

112. Fogliano, V. Method for measuring antioxidant activity and its application to monitoring the antioxidant capacity of wines / V. Fogliano, V. Verde, G. Randazzo, A. Ritieni // J. Agric. and Food Chem. 1999. - Vol. 47. - № 3-P. 1035-1040.

113. Arya, S. P. A new method for the ascorbic acid assay using iron (II) -pyridine-2,6-dicarboxylic acid complex / S. P. Arya, P. Jain, M. Mahajan // Ann. Chem.-2002.-Vol. 92.-№ 11-12-P. 1159-1164.

114. Kleszczewski, T. Flow injection spectrophotometric determination of L-ascorbic acid in biological matters / T. Kleszczewski, E. Kleszczewska // J. of Pharm. and Biomed. Anal. 2002. - Vol. 29. - № 4 - P. 755-759.

115. Kurechi, Т. Studies on the antioxidants XII. Combination effects of antioxidants on the reduction of ferric ions / T. Kurechi, K. Kikugawa, T, Kato, T. Numasato // Chem. and Pharai. Bull. 1980. - Vol. 28. - № 7 - P. 2228-2232.

116. Tutem, E. Simultaneous spectrophotometric determination of systine and systeine in amino acid mixtures using copper (II) neocuproin reagent / E. Tutem, R. Apak // Anal. Chem. Acta. - 1991. - Vol. 255. - № 1 - P. 121-125.

117. Shui, G. Residue from star fruit as valuable source for functional food ingredients and antioxidant nutraceuticals / G. Shui, L. P. Leong // Food Chem. -2006. Vol. 97. - № 2 - P. 277-284.

118. Wong, C.-C. A systematic survey of antioxidant activity of 30 Chinese medicinal plants using the ferric reducing antioxidant power assay / C.-C. Wong, H.-B. Li, K.-W. Cheng, F. Chen // Food Chem. 2006. - Vol. 97. - № 4 - P. 705711.

119. Benzie, I. F. F. Total antioxidant capacity of teas by the ferric reducing / antioxidant power assay / Iris F. F. Benzie, Y. T. Szeto // J. Agric. and Food Chem. 1999. - Vol. 47. - № 2 - P. 633-636.

120. Пат. 2235998 Российская Федерация., МПК7 7G01N33/60. Способ определения оксидантной/антиоксидантной активности растворов / Брайнина Х.З., Иванова А.В. № 2002130523/28; заявл. 14.11.2002; опубл. 10.05.2004, Бюл. №25 (III ч.). - С. 533.

121. Брайнина, Х.З. Оценка антиоксидантной активности пищевых продуктов методом потенциометрии / Х.З. Брайнина, А.В. Иванова, Е.Н. Шарафутдинова // Известия Вузов. Пищевая технология. 2004. - № 4 - С. 73-75.

122. Турова, Е.Н. Применение электрохимических методов для оценки интегральной антиоксидантной способности лекарственного растительного сырья и пищевых продуктов: Афтореф. Дис. . канд. Хим. Наук / ВИНИТИ. -М., 2001.-23 с.

123. Абдуллин, И.Ф. Кулонометрическая оценка антиоксидантной способности экстрактов чая электрогенерированным бромом / И.Ф. Абдуллин, Е.Н. Турова, Г.К. Будников // ЖАХ. 2001. - Т. 56 - № 6 - С. 627629.

124. Зиятдинова, Г.К. Электрохимические методы оценки интегральной антиоксидантной емкости медико-биологических объектов: Афтореф. Дис. . канд. Хим. Наук / ВИНИТИ. -М., 2005. -30 с.

125. Яшин, А.Я. Экспрессный электрохимический метод анализа антиоксидантной активности пищевых продуктов / А.Я. Яшин, Я.И. Яшин, Н.И. Черноусова // Пиво и Напитки. 2004. - № 6 - С. 32-34.

126. Яшин, А.Я. / Новый экспрессный амперометрический способ определения антиоксидантной активности растительных лекарственных препаратов, биологически активных добавок и напитков / А.Я. Яшин, Я.И.

127. Яшин, Н.И. Черноусова. (Рус.). - VRL: http:// www.ikar.udm.ru/sb34-2-2.htm 9 июля 2005.

128. Яшин, А.Я. Анализ пищевых продуктов и напитков методами высокоэффективной жидкостной и ионной хроматографии с электрохимическими детекторами / А.Я. Яшин, Я.И. Яшин // ЖАХ. 2004. -Т. 59.-№ 12-С. 1237-1243.

129. ГОСТ 19885-74 Методы определения содержания танина и кофеина. -М.: Изд-во стандартов, 1975. 5 с.

130. ГОСТ 12787-81 Пиво. Методы определения спирта, действительного экстракта и расчет сухих веществ в начальном сусле. М.: Изд-во стандартов, 1981. - 10 с.

131. ГОСТ 28551-90 Чай. Метод определения водорастворимых экстрактивных веществ. М.: Изд-во стандартов, 1991. - 3 с.

132. Умланд, Ф. Комплексные соединения в аналитической химии / Ф. Умланд, А. Ясен, Д. Г. Тириг, Г. Тириг. М.: Мир, 1975. - 531 с.

133. Пономарев, В.Д. Аналитическая химия. Т.2. Количественный анализ. М.: Высшая школа, 1982. - 288 с.

134. Представление результатов химического анализа (рекомендации IUPAC) // ЖАХ. 1998. - Т. 53. - № 9 - С. 999-1008.

135. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Основные положения и определения. Введ. 2002-23-04. - М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2002.-I, 24с.

136. ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений. Введ. 2002-23-04.-М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2002.-III, 30с.

137. ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Основные методы определения правильности метода измерений. Введ. 2002-23-04.-М.: Госстандарт России: Изд-во стандартов, 2002.-IV, 24с.

138. МИ 2336-2002. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Введ. 2003.01.01. - Екатеринбург: ФГУП «УНИИМ» Госстандарта России, 2004 -46 с.

139. ГОСТ Р 51301-99. Продукты пищевые и продовольственное сырье. Инверсионно-вольтамперометрические методы определения содержания токсичных элементов (кадмия, свинца, меди и цинка). М.: Изд-во стандартов, 1999. - 38 с.

140. ГОСТ 24027.2-80. Сырье лекарственное растительное. Методы определения влажности, содержания золы, экстрактивных и дубильных веществ. -М.: Изд-во стандартов, 1980. 15 с.