Определение лабильных аналитов и продуктов их метаболизма методами ГХ-МС и ВЭЖХ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

¿2-і.

Даншпок Александра Александровна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛАБИЛЬНЫХ АНАЛИТОВ И ПРОДУКТОВ ИХ МЕТАБОЛИЗМА МЕТОДАМИ ГХ-МС И ВЭЖХ

02.00.02 - аналитическая химия

Автореферат 5 ДЕК 2013

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Воронеж - 2013

005542985

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Воронежский государственный архитектурно-строительный университет»

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент

Рудакова Людмила Васильевна

Официальные оппоненты: Нифталнев Сабухи Илич-оглы, доктор

химических наук, профессор, ФГОУ ВПО "Воронежский государственный университет инженерных технологий", заведующий кафедрой неорганической химии и химической технологии

Голубнцкий Григорий Борисович, доктор химических наук, ОАО "Фармстандарт -Лексредства", г. Курск, начальник отдела новых технологий

Ведущая организация: ФГБУН «Институт физической химии и

электрохимии имени А. Н. Фрумкина РАН» г. Москва

Защита состоится «18» декабря 2013 г. в 16.00 на заседании Диссертационного совета Д 212.038.19 при Воронежском государственном университете, расположенном по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, ауд.439.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета. Автореферат разослан « 15» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Столповская Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Расширение возможностей применения метода газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) для скринингового определения как можно более широкого класса соединении, имеющих токсикологическое, наркологическое и судебно-химическое значение крайне актуально. Острота проблемы связана с непрерывным увеличением числа такого рода аналитов, которые зачастую являются лабильными веществами, что приводит к возникновению ряда трудностей в процессах пробоподготовки и газохроматографического определения. Иногда о наличии в пробе искомого вещества можно судить только по продуктам их превращений.

Удешевление оборудования ГХ-МС за счет усовершенствования аппаратуры и массового производства приборов привело к значительном;,' распространению данного метода. Несмотря на то, что в настоящее время в результате выполнения ряда федеральных целевых программ в стране существует значительный парк хромато-масс-спектрометров, их полноценное применение затруднено в связи с отсутствием соответствующего методического обеспечения. Поэтому разработка унифицированных способов определения большого количества подконтрольных соединений (скрининг), включающая формирование масс-спектральных библиотек удерживания для распространенных хроматографических фаз является необходимой и насущной задачей настоящего времени.

Срашштельная простота и надежность идентификации соединении с помощью ГХ-МС делает выгодным применение данного метода даже в случае невозможности определения самих нативных соединений, вследствие их термолабильности или биотрансформации в организме человека. Значительная часть данной работы посвящена вопросам модификации исходных форм, позволяющей дальнейшее их определение методом ГХ, а также вопросам деградации определяемых соединении в процессах хранения, метаболизма и пробоподготовки. Определение продуктов подобных процессов позволяет сделать вывод о природе исходных соединении.

Цель исследования - разработка усовершенствованных методик хромато-масс-спектрометрического обнаружения лабильных аналитов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• Выявление корреляционных зависимостей индексов удерживания на среднеполярной фазе по сравнению со слабополярными (фенил)мелилсилоксановыми фазами.

• Разработка способов выделения подконтрольных нативных соединении и продуктов их деградации и биотрансформации методами жидкостной (ЖЖЭ) и твердофазной (ТФЭ) экстракции из биообъектов.

Разработка методик количественного определения биологически активных соединений с использованием методов ГХ-МС и ВЭЖХ.

Идентификация продуктов деградации ряда соединений и их метаболитов методами ГХ-МС, ВЭЖХ, УФ- и ИК-спектроскопии, а также направленным синтезом.

Научная новизна работы.

Установлена корреляционная зависимость между индексами удерживания для 420 соединений на фазах, аналогичных 5% и 50% феншшетшшолисилоксан (EVDX-5ms и DB-17ms)

Идентифицированы ранее не известные производные, метаболиты, продукты окисления и дериваты, образуемые инсектицидом бенсультапом и лекарственными препаратами дротаверином и кветиапином (всего 30 соединений), определены их хроматографические, УФ- и масс-спектральные характеристики. Исследован процесс термолиза производных кветиапина в условиях ГХ.

Измерены коэффициенты распределения для 5 соединегаш в системе хлороформ-вода в зависимости от рН водной фазы, и найдены условия для проведешш ЖЖЭ.

Показаны пути оптимизации пробоподготовки в условиях ТФЭ и измерены эффективность экстракции для 12 соединений из перечисленных групп.

Практическая значимость. Создана библиотека индексов удерживания 420 соединений, имеющих токсикологическое, наркологическое и судебно-химическое значение для фаз EVDX-5ms nDB-17ms

Разработаны способы количественного определения в биообъектах (кровь внутренние органы) банкола, нереистоксина, дротаверина, кветиапина и продуктов их окисления методом ВЭЖХ. Разработаны способы идентификации нереистоксина, дротаверина, кветиапина и продуктов их деградации и биотрансформации методом ГХ-МС, включающие стадию пробоподготовки, основанную на ЖЖЭ или ТФЭ.

Положения, выносимые на защиту:

• Существует нелинейная корреляционная зависимость между индексами удерживания на среднеполярной и слабополярных фазах для летучих соединений.

Усовершенствованы условия ТФЭ, в которых аналит переводится для концентрирования в ту или иную молекулярную или ионную форму.

• Результаты идентификации лабильных аналитов в биообъектах по результатам скринингового ГХ-МС и вспомогательных методов (ВЭЖХ УФ и ИК-спектроскопии).

• Способы количественного определения бенсультапа, дротаверина и кветиапина методами ГХ-МС и ВЭЖХ.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены на конференциях: IV съезд ВМСО (Москва, 2009); III Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2009); VII Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-2009" (Йошкар-Ола, 2009 г.); Всероссийская конференция Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии" (Самара 2009)Г)' П Междунар°дный симпозиум по сорбции и экстракции (Владивосток

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 4 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ для опубликования научных трудов, 8 тезисов и материалов докладов на международных и всероссийских конференциях и симпозиумах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, списка цитируемой литературы id 150 источников. Материал работы изложен на 126 страницах, содержит 33 рисунка, 7 таблиц, приложение.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В Главе 1 (Методы хроматографического определения лабильных соединений в биологических объектах) представлен критический обзор публикаций по вопросам хроматографического определения соединений, подлежащих контролю в биологических объектах. Были рассмотрены сферы применения, достоинства и ограничения методов ГХ и ВЭЖХ. Нестабильность ряда соединений в условиях определения или их биотрансформации накладывает ограничения на выбор методов определения и пробоподготовки. Видоизменения исходных соединений (метаболизм, окисление и гидролиз) приводит к необходимости идентификации получающихся продуктов и - в ряде случаев - к необходимости косвенных количественных определений. Несмотря на преобладание ВЭЖХ в анализе биоматериалов на наличие нестабильных токсикантов, следует заключить, что создание методик, ориентированных на применение метода ГХ-МС в обзорных режимах позволяет снизить трудоемкость и увеличить экспрессность и надежность определения. Обзор способов пробоподготовки показал приоритет метода ТФЭ при определении соединений в сложных матрицах. В главе дана также краткая характеристика изучаемых аналитов, рассмотрены вопросы необходимости коррекции используемых методов для их выделении и определения.

Во второй главе описаны объекты исследования и методики эксперимента.

Основная часть исследования выполнена на приборах: газовые хроматографы 6890 (Agilent Technologies), оснащенные азотно-фосфорным, пламенно-ионизационным и масс-селективным квадрупольным детектором 5375VL; жидкостной модульный хроматограф 1200 (Agilent Technologies) с бинарным насосом G1312A и диодно-матричным детектором (ДМД) G1315B. Колонки: слабополярная EVDX-5ms, среднеполярная DB-17ms (ГХ) и SB-C18 (ВЭЖХ). ИК-спектры регистрировали на спектрометре FTS Scimitar 2000 (Digilab) в таблетке бромида калия. УФ-спектры измеряли на спектрофотометре 8453 (Agilent Technologies). Величину рН растворов проб и элюентов измеряли с помощью рН метра Эксперт-001 (Эконикс-эксперт). Для ТФЭ применяли два вида патронов: обращенно-фазовые AccuBOND II ODS-C18 (200мгхЗ мл) и смешанные AccuBond II

EVIDEX (200мг* 3 мл).

Для подтверждения идентификации ряда соединений использовали метод встречного синтеза (кислотный и основный гидролиз, окисление). Модификацию определяемых соединений проводили ацетилированием (АС) или триметилсилилированием (TMS).

Для обработки масс-хроматограмм использовали программный пакет AMDIS (NIST), выполняющий деконвотоцшо масс-хроматограмм и идентификацию целевых соединений. Масс-спектры расшифровывали с помощью программы «MS Interpreter 2.0» (NIST). Идентификацию известных соединений осуществляли, используя базу данных ГХ-МС NIST08.

В главе 3 рассмотрены вопросы использования колонки со среднеполярной фазой (50% фенилметилполисилоксана) для подтверждения идентификации соединений и их метаболитов в скршшнговом режиме ГХ-МС. Проведен корреляционный расчет индексов удерживания.

В методе ГХ-МС применяют для идентификации параметр удерживания и масс-спектр компонеш-а. Эти параметры не могут быть вычислены с допустимой погрешностью на основании только общих физико-химических характеристик идентифицируемого соединения; библиотеки удерживания на среднеполярных фазах малораспространены. Тем не менее, при использовании линейного индекса как параметра удерживания можно определять корреляционные зависимости между индексами, измеренными для неполярных фаз (7ЛР) и используемой среднеполярной фазой (Imp). В качестве источника данных для этих зависимостей взяли многочисленные опубликованные значения /Л7> (для метилполисилоксана) или (что более предпочтительно), индексы для распространенных слабополярных фаз (5% фенилдиметилполисилоксан, /¿р). Последние были взяты из внутрилабораторных библиотек, что улучшило корреляцию. Следует отметить, что в этом случае появляется дополнительный идентификационный показатель - разница - 1ц>, характеризующая полярность соединения.

В процессе экспертных исследований биообразцов мы измерили величины Ьа>мхр более 420 соединений, имеющих наркологическое, токсикологическое и судебно-химическое значение и определили корреляцию между этими величинами и значениями 7Лр (опубликованными) и 1ц> (измеренными нами). Для расчета неизвестных значений Imp.calc предложено использовать линейную зависимость:

¡MP.c.u.c(TMr.) = a + b*IL[,(TLP), (1)

где Тм>, Ти> отражают температурные режимы работы колонок.

Дискриминацию значений, применяемых в расчете (1) осуществляли по следующему алгоритму. Если относительная погрешность расчета равна

■ ^МР.ЕЛР I

Д/,% = 100* МР-ЕХР ; (2)

^МР.ЕХР

тогда значения А/,% расположенные в порядке возрастания для всего использованного массива данных образуют ^-образную кривую. Рис. 1.

Рис. 1. Отклонения Д/,% для всех ^ рассматриваемых соединений,

№ расположенные в порядке возрастания

Значения 1щ>,ехр и 1и>,юа>> соответствующие находящимся на линейном участке этой кривой значениям Д/,% использованы для расчета параметров уравнения (1). Поскольку краевые значения Д/,% равны ±4%, то все соединения, характеризующиеся большими отклонениями расчета, дискриминированы. Данная зависимость позволяет выбрать группу соединений, для которых допустим расчет индексов по уравнению (1). Число соединений, вошедших в данную группу,

составляет 70% от общего количества случайно отобранных соединений, коэффициент корреляции для аппроксимации по уравнению (1) равен 0.994. Большие отрицательные ошибки характерны для слабополярных соединений, индексы которых почти не меняются при смене фаз; большие положительные ошибки - для высокополярных соединений. На Рис. 2 приведены значения абсолютной разницы индексов удерживания (А/ = 1мг,ехр - 1и>,ЕХр) группы отобрагашх соединений в зависимости от удерживания (1ц>,ехр) на слабополярной фазе; линейная зависимость соответствует расчетным значениям согласно уравнению (1).

1000 П

500 0

д|%

Рис. 2. Зависимость величин ДI группы отобранных среднеполярных соединений от их индексов для слабополярной фазы.

500

1500

2500

3500

Полученная зависимость использована для оценки индексов удерживания исследуемых соединений для среднеполярной фазы DB-17ms, а также для подтверждения правильности идентификации их структур.

В Главе 4 (Определение нереистоксина, его производных и метаболитов) рассмотрены возможности ТФЭ и ГХ-МС в определении бенсультапа (SVS"-[2-(диметиламино)-1,3-пропанедил] дибензолтиосульфонат) (I), который является распространенным средством борьбы с колорадским жуком. Для него характерна легкая гидролизуемость в водной среде в присутствии оснований до дигидронереистоксина (II), быстро окисляющегося до непосредственно действующего компонента нереистоксина (4-диметиламино-1,3-дитиолан) (Ш) уже в присутствии кислорода воздуха.

"V Y Y

, Л,Л — А

Ч» s, 9 sh sh s-s

I н ш

Скорость гидролиза бенсультапа была изучена в модельных растворах (50 об. % ацетонигрила в фосфатном буфере) измеряли методом ВЭЖХ, (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость убывания концентрации бенсультапа от рН

200 время, мин

рН2.80

В свою очередь, образующийся нереистоксин подвергается дальнейшему окислению. Из смеси продуктов окисления нами были выделены два основных соединения, которые идентифицированы как сульфоксид (в виде смеси диастереомеров IV, IV') и сульфон V.

Метаболизм нереистоксина идет тремя путями: S-метилирование, окисление и N-дезметилирование, проходящие через стадию образования дигидронереистоксина (II). В образцах мочи обнаружили и идентифицировали три соединения (VII, VIII, VIII'), причем VIII, Vm' образуют диастереомерную пару. Соединения IX, X идентифицировали после ацетилирования.

Все сказанное указывает на нецесообразность прямого определения бенсультапа в биообразцах. Исключением могут быть лишь среды с заведомо высоким (и возможно, мало изменяющимся) его содержанием: например, содержимое желудка или промывные воды. Также это соединение отличается термолабильностью, что делает возможность его определения методом ПХ весьма сомнительной. Поэтому предложен метод обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием кислого (рН 3) элюента для предотвращения гидролиза. На рис. 4 приведена хроматограмма торгового образца бенсультапа и его УФ-спектр в

элюенте

mAU

600

<00

200

mAU

t/W

200 220 240 260 280 им

Рис. 4. ВЭЖХ-хроматограмма торгового образца бенсультапа.

О 2 4 в 6 10 min

Состав подвижной фазы - линейный градиент от 50 до 90 об.% ацетошприла в фосфатном буфере 10 мМ. Детектирование при 205 нм, запись спектра 200-500 нм. Калибровочный график линеен, по крайней мере, в диапазоне 0.3-300 мкг/мл. Порог обнаружения составляет около 0.05 мьсг/мл, относительное среднеквадратичное отклонение (СКО, %) результатов измерения 0.8%.

Производные нереистоксина (бенсультапа) могут быть определены методом ГХ с масс-селективным или термоионным детектированием. Поскольку специфика судебно-химического анализа предполагает необходимость проведения подтверждающих определений, мы разработали варианты определения прошводных бенсультапа с использованием двух фаз разной полярности. В табл. 1. приведены индексы удерживания рассмотренных соединений.

Пороги обнаружения нереистоксина близки как для масс-спектрометрического детектора (в режиме регистрации общего ионного тока), так и для азотно-фосфорного детектора и примерно равны 0.1 мкг/мл.

Рис. 5. ГХ-МС- хроматограмма компонентов, выделенных из | образца мочи методом ТФЭ,

« <с регистрация общего ионного тока.

ЭЗ I (Времена удерживания:

I нереистоксин- 5.19, IV - 6.17, IV' -

_ * " • 1 6.25, V- 6.49 мин)

5.0 60 70 ит

Табшща 1. Индексы удерживания производных и метаболитов нереистоксина

Х^Х-^А Л

° О

«I IV, IV V VI

Y Y Т Т

ЛЛАД

VII VIII", VIII IX X

Соединения IV, IV', V, VII, VIII, VIII", IX, X не представлены в базе N[8108.

Разнообразие свойств производных бенсультапа не позволяет выработать единый способ очистки проб методом ТФЭ. Поэтому предложено три варианта экстракции в зависимости от вида аналитической задачи. В табл. 2 приведены условия проведения ТФЭ для трех групп соединений.

Таблица 2. Условия ТФЭ определяемых соединений

Соединение Выход (%) Патрон (механизм) Состав

кондиционирование и загрузка элгаирование

I 96 AccuBOND II ODS-C18 (гидрофобный) 30 об.% ацетонитрила в фосфатном буфере 50 мМ, рН5 этилацетат

III IV V 88 74 86 AccuBOND II ODS-C18 (гадрофобный, различие удеряэдвания молекулярной и ионной форм) водный раствор К2НР04, 100 мМ, рН~8.3 фосфатный буфер, 100 мМ рН 2

VII VIII IX-X 52 5 10-20 AccuBOND II EVIDEX (катион ообменный) водный раствор ортофоофорной кислоты рН 2 дихлорметан:изопропанол:водный раствор аммиака, (78:20:2)

Из-за нестабильности бенсультапа в основной среде использование ионнобменного механизма для его выделения не целесообразно, поскольку предполагает элюировашге основными растворами. Но растворимость банкола в воде крайне низка, поэтому для его загрузки использовали водные растворы, содержащие 30 об.% ацетоншрила.

Показано, что соединения III-V являются катионами при рН<3 и растворимы в воде. Однако для их выделения ионообменный способ неприменим, поскольку он приводит к относительно высоким выходам только при низкой ионной силе загружаемого раствора. При переходе к реальным образцам (моча, экстракты

„зсо

£ s 100

на двух колонках

Соединение M EVDX-5ms ll.f DB-17ms I2.f h.s - h .s

III (нереистоксин) 149 1309 1527 218

IV 165 1551 1892 341

IV 165 1580 1927 347

V 181 1637 2028 391

VI (тиоциклам) 181 1554 1803 249

VII 179 1396 1602 206

VIII" 195 1696 2064 368

VIII 195 1696 2067 371

IX 165 1341 1544 203

X 181 1633 1996 363

биологических тканей) выход аналитов резко снижался (-15%), что, скорее всего, обусловлено малыми константами обмена. Эти соединения могут быть экстрагированы с применением гидрофобного механизма, но подобный подход неизбежно расширит круг соэлюируемых соединений, а, следовательно, значительно снизит чистоту экстрактов. Поэтому предложено воспользоваться различием гидрофобного удерживания ионных и молекулярных форм Ш-У (что было показано методом ВЭЖХ). Действительно, такой подход не является стандартным способом использования обращенно-фазовых патронов. Но различие в удерживании форм (30-50 раз) делает его вполне применимым. Метаболиты (VII, VIII и исходные формы 1Х-Х) плохо удерживаются на обращено-фазовых патронах ЧТО, скорее всего, является следствием ВЫСОКИХ значений рКа} данных соединений. Поэтому для их выделения использовали методику, предназначенную для определения основных соединений.

Глава 5. (Определение дротаверина и продуктов его окисления в скрининговом анализе). Дротаверин (но-шпа, 1-(3,4-диэтоксибензшшден)-6,7-диэтокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин гидрохлорид) - синтетический аналог папаверина, широко распространенное в фармакологической практике соединение, обладающее миотропным спазмолитическим действием.

Несмотря на то, что физико-химические характеристики дротаверина делают его удобным объектом для определения методом ВЭЖХ-ДМД, мы полагаем необходимым включение этого соединения в общий список компонентов, определяемых скрштанговым методом ГХ-МС. В пользу подобного подхода свидетельствует легкая окисляемость дротаверина, приводящая к образованию ряда продуктов его окислительной деградации в биообразцах, надежная идентификация которых возможна только с помощью масс-селективных детекторов. Поэтому, несмотря на то, что нам неизвестны работы по исследованию ГХ-поведения дротаверина, основное внимание уделено именно этому варианту определения, а также идентификации продуктов окисления.

Окисление дротаверина может протекать (последовательно или параллельно) как с участием мостиковой метиленовой группы, соединяющей циклические фрагменты, так и с участием метиленовых групп, принадлежащих к изохинолиновому циклу.

В первом случае образуется этаверин X - спазмолитик, входящий в ряд фармацевтических композиций. Этаверин - постоянный спутник дротаверина, характеризующийся меньшей окисляемостью, хорошо заметный как в режиме ГХ, так и ВЭЖХ. Соединение ХП весьма стабильно и (подобно этаверину) также почти всегда присутствует в дротаверин-содержащих смесях; соединение XI напротив, весьма неустойчиво. Дальнейшая деградация приводит к разделению бензилыюго и изохинолинового фрагментов и образованию (в частности) диэтоксильных производных бензойной кислоты (I, ДЭБК), изохинодина (П, ДЭИХ) и дигидроизохинолинона (III, ДГИХ). Соединение 1а (этилат ДЭБК) образуется при пробоподготовке образцов, содержащих деградированный дротаверин в присутствии этанола. Соединение 16 (триметилсшшльное производное ДЭБК) можно наблюдать при силилировании подобных образцов, ацетат 4 - при их ацетилировании.

r^i

' :2нЛ C^O 1

1 и III O

CjHsOv^^^sv. 1 Ti A. с2н6о

СгИбО""^ Jl J J CjHjO-^-^ S^N

т у c2h6°Y^ '"'oH c2H60 c2H60

с2н6о'^ c2H5o ^ CzHjO ^^ c2H6o

Сф

г

IV

о о

VII

XI

XII

Соединения V, VI являются дезэтилированными метаболитами дротаверина; соединения VIII, IX могут являться как продуктами метаболизма (дезэтилирование), так и окисления. Мы не определяли положений дезэтилированных групп; можно лишь сказать, что этих положений как минимум, два. Индексы удерживания рассмотренных соединений приведены в табл. 3. Соединения 1а, 16, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, XI, XII отсутствуют в базе N18108.

Таблица 3. Индексы удерживания производных и метаболитов дротаверина на двух колонках разной полярности.

Соединение М EVDX-5ms DB-7ms ¡2 Г ll.F

h.F h.F

la 238 1754 2056 302

16 282 1792 - _

II 217 1971 2327 356

III 235 2271 2819 548

IV 277 2306 2767 461

V 369 2878 3482 604

VI 369 2892 3503 611

VII (дрота верин) 397 2917 3518 601

VIII 367 2951 3582 631

IX 367 2978 3622 644

X (этаверин) 395 ЗОЮ 3644 634

XI 411 3203 3903 700

XII 409 3299 4034 735

Для количественного определения дротаверина использовали метод внутреннего стандарта (гексадецила додеканоат). В режиме SCAN для широкого диапазона концентраций (2-950 мкг/мл) калибровочный график хорошо описывается квадратичной зависимостью (квадрат коэффициента корреляции R2 = 0.9999), порог обнаружения 470 нг/мл. В режиме SIM по трем ионам (область малых концентраций, 0.1-2 нг/мл) калибровочный график практически линеен, R2 = 0.9999, порог обнаружения 9 нг/мл. СКО определения относительной площади пика

дротаверина составляет 2.2%. Хроматограмма производных дротаверина, выделенных из мочи, приведена на рис.6.

~ Рис. 6. ГХ-МС-хроматограмма,

извлеченния из мочи

(детектирование по общему я cq ионному току). Колонка DB-17ms.

£ ~ Времена удерживания (мин)

j_f М. ь ^ ' компонентов: 8.58 (II), 13.0 (VII),

700

л

8 500

<гз

1 300 £

s 100

2.0 6.0 10 14 18 мин 15.5 (XI), 16.8 (XII).

Для малоокисленных образцов усовершенствовали ВЭЖХ-ДМД методику определения дротаверина и ряда его производных. Величина рКА дротаверина (измеренная методом ВЭЖХ в элюенгах состава 40 об. % ацстонитрила в фосфатном буфере при 25°С) примерно равна 4.6. Учитьшая легкую окисляемость дротаверина (преимущественно в форме основания), а также зависимость состояния хромофора от рН, должны использоваться сильнокислые элюенты. С другой стороны, при снижении рН элюента ниже 2, ухудшается разделение компонентов VII, X, ХП. Поэтому предложено применение элюентов с рН 2.2-2.5. Но эта величина должна уточняться при использовании определенной колонки. Предложено два варианта хроматографирования - градиентный и изократический режимы.

При объеме ввода 10 мкл и детектировании при 7 =202 нм калибровочный график практически линеен (7^=0,9998) в диапазоне концентраций 0,02 - 100 мкг/мл. Порог обнаружения 2 нг/мл. СКО определения площади пика дротаверина (абсолютная калибровка) составляет 0.8%.

Для выделения дротаверина использовали ЖЖЭ и ТФЭ. В условиях ЖЖЭ дротаверин экстрагируется из водных растворов в хлороформ в широком (1—9) диапазоне рН с высокими коэффициентами распределения (>9). Тем не менее, при экстракции дротаверина из кислых растворов (что обусловлено меньшей окисляемостью) невозможно получать чистые экстракты вследствие соэкстракции ряда соединений матрицы. Поэтому предлагается метод ТФЭ с использованием патрона АссиВопс! II ЕУГОЕХ. В данном случае отличительной особенностью проведения ТФЭ является отсутствие стадии сушки, и добавление к элюату 0.1 мл уксусной кислоты. Эффективность ТФЭ проверяли методом ВЭЖХ. При экстракции из водных модельных растворов для двух патронов средний выход составил 93.0 % (расхождение 4 %) из мочи 94,8 % (расхождение 3 %).

Глава 6. (Особенности выбора метода определения кветиапина в биообъектах). Кветиапин (яиеПарше, сероквель, зегояие1, 2-[2-(4-дибешо[Ь,1][1,4]тиазешш-11 -ил-1 -гшперазиш1л)этокси]-этанол) - атипичный нейролептик, сравнительно новое антипсихотическое средство, применяемое для лечения острых ангипсихотических состояний, и, в частности - для лечения шизофрении. Фармакологической особенностью кветиапина является его почти полная (-99%) биотрансформация. В этом случае аналитику следует сосредоточиться на определении одного из метаболитов. С другой стороны, прием кветиапина в токсических дозах может привести к снижению степени

биотрансформации и, следовательно, к формированию его значительных концентраций в биообъектах.

Методом ГХ-МС мы идентифицировали ряд метаболитов и производных кветиапина и определили их удерживание, табл. 4.

Таблица 4. Индексы удерживания производных и метаболитов кветиапина на двух колонках

Соединение м EVDX-5ms DB-17ms h,f~ Í1,f

h.f Izf

1 227 2354 2911 557

II 295 2744 3392 648

III 339 3070 3796 726

IV 323 3110 3925 815

V 411 3095 _ —

VI 367 3136 3833 697

VII 337 3172 3964 792

VIII 381 3173 3879 706

IX (кватиапин) 383 3347 4120 773

X 455 3389 _

XI 425 3461 4231

где R = - Н (П), - (СН2)2 -ОН (Ш), - СНО (IV), - (СН2)2 -O-TMS (V), - (СН2)2 -0-C2H5 (VI), - Ас (VII), - (СП2)2 -О-Ас (VIH), - (СН2)2 -0-(CH2)2 -ОН (IX, кветианин), - (СН2)2 -0-(CH2)2 -O-TMS (X), - (СН2)2 -0-(CH2)2 -О-Ас (XI). Соединения I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, X, XI не представлены в базе NIST08. Согласно нашим измерениям, в смеси метаболитов (наблюдаемых данным методом) преобладает соединение II.

Рассмотрение хромато графических процессов и анализ масс-спектров окрестностей хроматографических зон кветиапина, его производных и дериватов привело к выводу о низкой термостабильности подобных соединений. На это указывает, в первую очередь, несовпадение селективных масс-хроматограмм, рис. 7. Ион с m/z 210 соответствует производным кветиапина (m/z 210, Ci3H8NS+), 207 -вероятным продуктам термолиза.

а б в г д

Рис. 7. Фрагменты (2 мин) селективных масс-хроматограмм кветиапина (а) и его дериватов - ацетильного (б) и триметилсилилыюш (в) производных, колонка (EVDX-5ms); кветиапина (г) и его ацетата (д), колонка (DB-17ms). Ионы m/z 207 (пунктирная линия), 210 (сплошная линия).

Обосновать факт термолиза аналитов в колонке хроматографа можно, изменив селективность разделения (рис. 7, колонка DB-17ms). Изменение удерживания предполагаемых продуктов термолиза, приводит к картине, характерной для процессов реакционной хроматографии. Расшифровка масс-спектров этих продуктов привела к заключению о наличии в их структурах фенантридинового

фрагмента (т/г 207, СмНц^). Поскольку характер кластеров молекулярных ионов также говорит об отщеплении у производных кветиапина атома серы, то можно утверждать протекание следующего процесса:

В пользу такого предположения говорит также характер зависимости отношения площади пика, образованного ионом m/z 207 к сумме площадей пиков с т/г 207 и 210 (доля m/z 207) от времени пребывания в колонке, рис. 8. (Приведена зависимость для ацетата кветиапина, температура колонки 300°С).

Рис. 8. Доля площади пика, образованного ионом m/z 207 от суммы площадей пиков m/z 207 и 210 для кветиапина ацетата. Абсцисса -время пребывания смеси в колонке (300°С).

Согласно нашим оценкам, основанным на близости эффективных сечений ионизации, доля продукта термолиза в случае кветиапина ацетата составляет около 17%. Очевидная воспроизводимость процесса термолиза (и времен удерживания) производных кветиапина приводит к получению приемлемых метрологических характеристик. Предлагается определение кветиапина и его метаболитов посредством их ацетильных производных. Полноту и воспроизводимость протекания процесса ацетилирования контролировали методом ВЭЖХ. Для пяти параллельных обработок образцов кветиапина с концентрациями 3.3 и 170 мкг/мл коэффициенты вариации составили 2.8% и 1.6% соответственно. Ни в одном случае не был обнаружен исходный кветиапин.

Для количественного определения использовали метод внутреннего стандарта (гексадецила додеканоат) и режим SIM по 4-м ионам. В диапазоне концентраций 5 -170 мкг/мл кветиапина калибровочная зависимость хорошо аппроксимируется полиномом второго порядка (R2 = 0.998), порог обнаружения 0.94 мкг/мл. СКО относительных площадей кветиапина ацетата составило 3.9% (для 11 измерений).

Рис 9. ГХ-МС-хроматограмма ацетилированного образца (общий ионный ток, колонка EVDX-5ms). Сигнал со временем удерживания 14.102 мин соответствует _соединению VII, 19.343 -0 « 8 0 «.о 16 0 мин квешашшу ацетату Метод ВЭЖХ может быть использован в качестве вспомогательного из-за малохарактеристичности УФ-спектров аналитов и плохого разделения

14

700 500

й 300

(U v* 100

I.L л LI II ,

хроматографических зол (Рис. 10). Состав подвижной фазы - линейный градиент от 20 до 50 об.% ацетонитрила в растворе хлорной кислоты (20 мМ), 15 Mim. Детектирование при 206 и 285 нм, запись спектра 200-400 нм. Калибровочная зависимость практически линейна в диапазоне 0.4 - 170 мкг/мл (длина волны 206 нм). Порог обнаружения (при объеме водимой пробы 40 мкл) составляет 20 нг/мл.

Рис. 10. ВЭЖХ-хроматограмма. Пик со временем удерживания 10.609 принадлежит кветиапину. Группа пиков в области 9.74 мин и 11.18 мин имеют У Ф-спектры, подобные спектру кветиапина и, по-видимому, принадлежат его

метаболитам.

Для выделения кветиапина из водных растворов применяли методы ЖЖЭ и ТФЭ. Эффективность экстракции кветиапина при разных значениях рН из водных растворов в хлороформ определяли методом ВЭЖХ. Согласно полученным результатам можно сделать вывод о том, что кветиапин экстрагируется в хлороформ только в виде однозарядной (катионной) и нейтральной форм (степень извлечения более 95%). При рН водной фазы < 2 потери кветиапина при однократной экстракции хлороформом и соотношении фаз (1:1) составили менее 5%.

ТФЭ проводили на патроне AccuBond II EVIDEX по катионообменному механизму при значении рН 4.5, обуславливающем однозарядную форму кветиапина и его производных (что было показано методом ВЭЖХ) и снижающем загрязнение элюата соединениями с более низкими значениями рКл. Для трех процедур экстракции степень извлечения кветиапина из образцов мочи составила 99.6% при СКО 2.4%. Мы не проводили количественных оценок выделения метаболитов II и III, но эти соединения всегда присутствовали при данном способе очистки на регистрируемых хроматограммах.

Выводы

1. Измерены линейные индексы удерживания более чем для 420 соединений на среднеполярной фазе DB-17ms и определена корреляционная зависимость между индексами соединений средней полярности, измеренными на аналогах 5% и 50% фенилметилполисилоксана. Показана возможность прогнозирования (приблизительного расчета) индексов удерживания значительной доли среднеполярных соединений для целей подтверждающего скринингового определения методом газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием с использованием среднеполярной фазы.

2. Определены с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии приблизительные значения констант ионизации для 5 стабильных соединений, на основании которых разработаны способы выделения 12 соединений (производных, продуктов окисления) методом жидкостно-жидкостной экстракции, а также их выделения из сильно загрязненных биологических жидкостей на

15

СКО составило 0.7% (для пяти измерений).

m au 150

50

JLjJu^—M--«

0 2 4 6

10 12

обращенно-фазовых и смешанно-фазовых патронах методом твердофазной экстракции.

3. Разработан алгоритм и проведена идентификация 34 соединений, являющихся производными, метаболитами, дериватами и продуктами деградации групп бенсультапа, дротаверина и кветиапина, определены их хроматографические свойства, получены ультрафиолетовые и масс-спектры. Предложен метод обнаружения данных соединений в биологических жидкостях в условиях обзорного анализа.

4 Разработаны способы количественного определения бенсультапа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в моче; дротаверина и кветиапина методом газовой хромато-масс-спектрометрии в моче. Порога обнаружения для бенсультапа, дротоверина и кветиапина составляют 0.05 мкг/мл, 470 нг/мл и 0.94 мкг/мл, соответственно.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Gas and liquid chromatography-mass spectrometry studies on the metabolism of the synthetic phenylacetylindole cannabimimetic JWH-250, the psychoactive component of smoking mixtures / A. Grigoryev, A. Melnik, S. Savchuk, A. Simonov, V. Rozhanets // J. Chromatogr. В.- 2011.- V. 879,- P. 2519- 2526.

2. Григорьев A.M. Хроматографические методы определения дротаверина и идентификация его производных и метаболитов в биообразцах. / A.M. Григорьев, A.A. Мельник, Л.В. Рудакова // Изв. вузов. Химия и химическая технология. - 2012. -

Т. 55,вып. 2.-С, - 18-23

3. Григорьев A.M. Идентификация и определение производных нереистоксина методами ГЖХ-МС и ВЭЖХ для целей судебно-химического и токсикологического анализа / A.M. Григорьев, А.А.Мельник, Л.В. Рудакова // Сорбционные и хроматографические процессы.- 2008. - Т. 8, вып. 5. - С. 766-778.

4. Мельник A.A. Определение кветиапина, его производных и метаболитов методами газожидкостной хромато-масс-спектрометршш и высокоэффективной жидкостной хроматографии в биологических образцах / A.A. Мельник, A.M. Григорьев, Л.В Рудакова // Сорбционные и хроматографические процессы,- 2010,- Т.

10, вып. 1.-С. 35-46.

5. Григорьев A.M. ГХ-МС в исследовании термолабильных производных дротаверина / A.M. Григорьев, A.A. Мельник, Л.В. Рудакова // IV съезд ВМСО. III Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы».- Москва, 2009. - С. 51.

6. Григорьев A.M. Масс-сиектральные характеристики и индексы удерживания (ГЖХ) кветиапина, его производных и метаболитов / A.M. Григорьев, A.A. Мельник, Л.В. Рудакова // IV съезд ВМСО. III Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы»,-

Москва, 2009.-С. 61.

7. Григорьев A.M. Определение нереистоксина, его производных и метаболитов хроматографически?.га методами в биообъектах / A.M. Григорьев, A.A.

Мельник, JI.B. Рудакова // Тезисы докладов VII Всеросс. конф. по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-2009". - Йошкар-Ола, 2009. - С. 74-75.

8. Григорьев А.М. Конвергенция удерживания гомологических рядов в газовой и жидкостной хроматографии / A.M. Григорьев, A.A. Мельник, Л.В. Рудакова // Всероссийская конференция "Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии". тез.докл. - Самара, 2009 г. - С. 32.

9. Григорьев A.M. Определение дротаверина, его производных и метаболитов: ПКХ или ВЭЖХ? / A.M. Григорьев, A.A. Мельник, Л.В. Рудакова // Всероссийская конференция "Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии". тез.докл,- Самара, 2009 г. - С. 95.

10. Григорьев A.M. Компенсационное поведение в газожидкостной хроматографии гомологических рядов / A.M. Григорьев, A.A. Мельник, О.Б. Рудаков // Съезд аналитиков России "Аналитическая химия - новые методы и возможности" тез.докл,- Москва, 2010 г. - С. 87.

11. Григорьев A.M. Обзорные библиотеки для автоматизированных хромато-масс-спектрометральных определений в области судебной химии и химической токсикологии с применением фаз разной полярности / Григорьев A.M. Мельник A.A. Савчук С.А. // Съезд аналитиков России "Аналитическая химия -новые методы и возможности" тез.докл,- Москва, 2010 г. - С. 255-256.

12. Григорьев А.М. Физический смысл и координаты областей компенсации удерживания гамологичный рядов в газожидкостной хроматографии / A.M. Григорьев, A.A. Мельник, О.Б. Рудаков // мат. V Всерос. Конф. «физико-химические процессы в конденсированных средах и на межфазных границах Фагран 2010» -Воронеж, 2010 г. - С. 700-703.

Работы МШе 1--4 опубликованы в изданиях, соответствующих списку ВАК РФ.

Подписано в печать 12.11.13. Формат 60x84 Усл. печ. л. 1. Тираж 120 экз. Заказ 1170.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типоірафии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3

ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АРХИТЕКТУРНО-СТРОИТЕЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

04201452531 ^^

На правах рукописи

ДАНИЛЮК АЛЕКСАНДРА АЛЕКСАНДРОВНА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛАБИЛЬНЫХ АНАЛИТОВ И ПРОДУКТОВ ИХ МЕТАБОЛИЗМА МЕТОДАМИ ГХ-МС И ВЭЖХ

Специальность 02.00.02 - Аналитическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент Рудакова Л.В.

Воронеж-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение................................................................................ 4

ГЛАВА 1. Обзор литературы..................................................... 8

1.1. Применение высокоэффективных вариантов газожидкостной и жидкостной хроматографии для анализа биологических образцов: достоинства и недостатки..........................................................................8

1.2. Твердофазная экстракция как метод разделения и концентрирования компонентов проб.................................... 17

1.3. Жидкостно-жидкостная экстракция................................. 24

1.4. Бенсультап.............................................................. 26

1.5. Дротаверин (Но-шпа)................................................... 29

1.6. ' Кветиапин (Сероквель)............................................... 31

Заключение по главе 1...................................................... 32

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования

2.1. Основное (хроматографическое) оборудование.................... 34

2.2. Дополнительное оборудование...................................... 35

2.3. Характеристика объектов исследования и реактивов............ 36

2.4. Статистическая обработка и аппроксимация

экспериментальных данных.................................................. 39

ГЛАВА 3. Использование среднеполярной фазы

(50% фенилдиметилполисилоксан) для подтверждающих определений.

Корреляционный расчет индексов удерживания............................... 42

ГЛАВА 4. Определение нереистоксина, его производных и метаболитов. Метод твердофазной экстракции

4.1. Бенсультап................................................................ 48

4.2. Нереистоксин и продукты его окисления.......................... 51

4.3. Метаболиты нереистоксина............................................ 60

Заключение по главе 4.........................:............................ 65

ГЛАВА 5. Определение дротаверина и продуктов его окисления в скрининговом анализе

5.1. Продукты окислительной деградации дротаверина........................66

5.2 Применение метода ГХ-МС для определения дротаверина и

идентификации продуктов его окисления..............................................................................67

5.3. ГХ-МС в исследовании термолабильных производных дротаверина........................................................................................................................................73

5.4. Метод ВЭЖХ..........................................................................................................................74

5.5. Пробоподготовка биообразцов..............................................................................77

Заключение по главе 5............................................................................................................80

ГЛАВА 6. Особенности выбора метода определения кветиапина в биообъектах

6.1. ГХ-МС............................................................................................................................................81

6.2. ВЭЖХ..............................................................................................................................................90

6.3. Пробоподготовка биобразцов..................................................................................91

Заключение по главе 6..............................................................................................................94

Выводы......................................................................................................................................................................95

Литература..............................................................................................................................................................97

Приложение........................................................................................................................................................110

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Расширение возможностей применения метода газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) для скринингового определения как можно более широкого класса соединений, имеющих токсикологическое, наркологическое и судебно-химическое значение крайне актуально. Острота проблемы связана с непрерывным увеличением числа подобных аналитов, нередко характеризующихся малой химической и термической стабильностью, что приводит к возникновению затруднений при проведении пробоподготовки и газохроматографического определения. Иногда о наличии в пробе исходных веществ можно судить только по продуктам их превращений.

Удешевление оборудования ГХ-МС за счет усовершенствования и увеличения производства соответствующей аппаратуры привело к значительному распространению данного метода. Несмотря на то, что в настоящее время в результате выполнения ряда федеральных целевых программ в стране существует значительный парк хромато-масс-спектрометров, их полноценное применение затруднено в связи с отсутствием соответствующего методического обеспечения. Поэтому разработка унифицированных способов определения большого количества подконтрольных соединений (скрининг), включающая формирование масс-спектральных библиотек удерживания для распространенных хроматографических фаз является необходимой и насущной задачей настоящего времени.

Сравнительная простота и надежность идентификации соединений с помощью ГХ-МС делает выгодным применение данного метода даже в случае невозможности определения самих исходных соединений, вследствие их термолабильности или биотрансформации в организме человека. Значительная часть данной работы посвящена вопросам модификации исходных соединений, позволяющей дальнейшее определение продуктов их

трансформации методом ГХ-МС, в том числе вопросам деградации определяемых соединений в процессах хранения, метаболизма и пробоподготовки. Определение продуктов подобных процессов позволяет сделать вывод о природе исходных соединений.

Цель исследования - разработка усовершенствованных методик хромато-масс-спектрометрического обнаружения лабильных аналитов. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• Выявление корреляционных зависимостей индексов удерживания на среднеполярной фазе по сравнению со слабополярными (фенил)метилсилоксановыми фазами.

• Разработка способов выделения подконтрольных исходных соединений и продуктов их деградации и биотрансформации методами жидкостной (ЖЖЭ) и твердофазной (ТФЭ) экстракции из биообъектов.

• Разработка методик количественного определения биологически активных соединений с использованием методов ГХ-МС и ВЭЖХ.

• Идентификация продуктов деградации ряда соединений и их метаболитов методами ГХ-МС, ВЭЖХ, УФ- и ИК-спектроскопии, а также направленным синтезом.

Научная новизна работы.

Установлена корреляционная зависимость между индексами удерживания для 420 соединений на фазах, аналогичных 5% и 50% фенилметилполисилоксан (Е\Т)Х-5т8 и БВ-Птв)

Идентифицированы ранее не известные производные, метаболиты, продукты окисления и дериваты, образуемые инсектицидом бенсультапом и лекарственными препаратами дротаверином и кветиапином (всего 30 соединений), определены их хроматографические, УФ- и масс-спектральные характеристики. Исследован процесс термолиза производных кветиапина в условиях ГХ.

Измерены коэффициенты распределения для 5 соединений в системе хлороформ-вода в зависимости от рН водной фазы, и найдены условия для проведения ЖЖЭ.

Показаны пути оптимизации пробоподготовки в условиях ТФЭ и измерена эффективность экстракции для 12 соединений из перечисленных групп.

Практическая значимость. Создана библиотека индексов удерживания 420 соединений, имеющих токсикологическое, наркологическое и судебно-химическое значение для фаз ЕУОХ-5гш и ОВ-17шз.

Разработаны способы количественного определения в биообъектах (кровь, внутренние органы) банкола, нереистоксина, дротаверина, кветиапина и продуктов их окисления методом ВЭЖХ. Разработаны способы идентификации нереистоксина, дротаверина, кветиапина и продуктов их деградации и биотрансформации методом ГХ-МС, включающие стадию пробоподготовки, основанную на ЖЖЭ или ТФЭ. Положения, выносимые на защиту:

• Существует нелинейная корреляционная зависимость между индексами удерживания на среднеполярной и слабополярных фазах для летучих соединений.

• Усовершенствованы условия ТФЭ, в которых аналит переводится для концентрирования в ту или иную молекулярную или ионную форму.

• Результаты идентификации лабильных аналитов в биообъектах по результатам скринингового ГХ-МС и вспомогательных методов (ВЭЖХ, УФ и ИК-спектроскопии).

• Способы количественного определения бенсультапа, дротаверина и кветиапина методами ГХ-МС и ВЭЖХ.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы

доложены на следующих конференциях: IV съезд ВМСО (Москва, 2009 г.);

III Всероссийская конференция с международным участием «Масс-

6

спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2009 г.); VII Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-2009" (Йошкар-Ола, 2009 г.); Всероссийская конференция "Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии" (Самара, 2009 г.); II Международный симпозиум по сорбции и экстракции (Владивосток 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 4 статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ для опубликования научных трудов, 8 тезисов и материалов докладов на международных и всероссийских конференциях и симпозиумах.

ГЛАВА 1. Обзор литературы 1.1. Применение высокоэффективных вариантов газожидкостной и жидкостной хроматографии для анализа биологических образцов: достоинства и недостатки.

Газожидкостная хроматография (ГЖХ, ГХ) - универсальный метод разделения и анализа смесей, основанный на различном распределении соединений между двумя фазами: неподвижной жидкости и подвижного газа [1-4]. Коэффициент распределения может быть выражен следующим образом:

= (1.1)

где С^ , С™ - концентрации распределяющегося соединения [ в жидкой (неподвижной) и газовой фазе соответственно. Поскольку (в общем случае) сумма энергий взаимодействий между распределяющимся соединением и веществом фазы в конденсированной среде фазе выше, нежели в газовой, то величина К,-, в основном, определяется выбором жидкой фазы [6]. Кроме того, распределение определяется температурой системы, и поэтому изменение температуры обычно служит оперативным способом изменения удерживания аналитов.

Селективность разделения двух любых соединений [ и ] описывается коэффициентом разделения:

(1-2)

Обычно изменение температуры мало сказывается на селективности разделения. Поэтому основным способом управления процессом разделения в ГХ является подбор фазы [5,6]. За время существования метода ГХ исследователями было предложено значительное количество разнообразных фаз [5-8], следствием чего явились значительные

затруднения при сравнении результатов хроматографических измерений. Возросшие требования к достоверности и унификации анализа привели к разумному сокращению видов используемых фаз. Выпускаемые в настоящее время капиллярные колонки покрыты ограниченным числом фаз, охватывающим весь диапазон полярности - от почти неполярных диметилполисилоксанов до полярных полиэтиленгликолей. Высокая воспроизводимость изготовления хроматографических фаз и обработки материала подложки позволила создавать библиотеки хроматографического удерживания [9].

Поскольку объектами судебно-химического и химико-токсикологического анализа являются соединения с достаточно высоким молекулярным весом, то для их элюирования методом ГХ необходимы термостабильные и инертные неподвижные фазы. В настоящее время наиболее распространены фенилметилполисилоксановые полимеры с различным содержанием фенильных групп, причем концентрация этих групп определяет полярность фазы. Верхняя граница рабочего диапазона температур таких колонок обычно составляет 320-350°С. Диметилполисилоксаны (Рис. 1А) характеризуются наименьшей полярностью. Эти фазы в настоящее время применяются редко из-за несколько сниженных характеристик хроматографируемых зон (наличие «хвостов»), хотя пригодны в качестве «эталонных фаз».

Фазы, содержащие 5% фенильных групп (Рис. 1Б) наиболее распространены. Их полярность несколько выше, нежели у диметилполисилоксанов. Среднеполярные фазы, содержащие 50% фенильных групп (Рис. 1В) получили несколько меньшее распространение, хотя (согласно нашему опыту работы), эти фазы наиболее удобны для проведения подтверждающих анализов. Как правило, колонки, содержащие среднеполярные фазы и предназначенные для разделения определения фармакологически активных и токсичных соединений, имеют

меньшую длину (15 м) по сравнению со слабополярными и неполярными колонками (около 25-30 м) из-за высокого удерживания аналитов. Для повышения термической стабильности и снижения испарения продуктов термодеструкции неподвижной фазы изготовителями применяется ряд не разглашаемых технологических приемов; в частности, изменение скелета полимеров на фенилареновые структуры (Рис. 1Г). Действия изготовителей в этом направлении могут приводить к кардинальному изменению химической структуры фазы, вследствие чего вместо указания состава фазы последние маркируются как «виртуально подобные» одному из канонических вариантов. Селективность таких фаз в целом, подобна аналогам.

сн,

I 0

0-51 —

сн3

100%

сн.

о-бг

I

сн3 J

А

95%

Б

о-б! —

СН

--О-Б!

СН

\ /

сн,

I 3 51 — I

сн

з-1

сн3-

-о -81 —

т ■ сн3-

100%

В Г

Рис. 1. Структуры фенилполисилоксановых неподвижных фаз. Для надежности идентификации соединений методами ГХ необходим правильный выбор не только колонки, но и способа детектирования [10-14]. За время существования метода ГХ предложено значительное количество детекторов, но только некоторые из них пригодны для использования в практике аналитической токсикологии и судебно-медицинской экспертизы. В первую очередь, это пламенно-ионизационный детектор (ПИД) [15]. Этот детектор можно отнести к умеренно селективным: он обладает высокой чувствительностью к

сгораемым органическим соединениям и почти не чувствителен к присутствию воды и негорючих примесей в газе-носителе и элюируемых смесях. ПИД относится к потоковым детекторам: он мало чувствителен к колебаниям расхода газа носителя и температуры. К недостаткам можно отнести необходимость поддержания условий сгорания аналитов (и, следовательно, постоянства расхода водорода и соотношения потоков водорода и газа-носителя) и нечувствительность к соединениям, несгораемым в воздушно-водородном пламени [3,16]. Идентификация аналитов возможна только с помощью характеристик их удерживания на применяемой хроматографической фазе.

Специфика биологических образцов, подлежащих

хроматографическому анализу, заключается в основном, в богатстве матрицы и малом содержании определяемых компонентов [17-20]. В этом случае малая селективность применяемого детектора может стать совершенно неприемлемой. Невозможно подобрать условия элюирования так, чтобы достичь желательного («до базовой линии») разделения всех определяемых компонентов и соединений матрицы образца. Это затруднение приводит к тому, что область применения ПИД ограничена анализом достаточно простых (или очищенных) образцов со значительным содержанием аналитов. Анализ большинства биообразцов требует применения более селективных детекторов. Из существующего набора селективных детекторов, обычно применяемых в ГХ (электронозахватный, пламенно-фотометрический, хемилюминисцентный,

термоионизационный) наиболее используемым является последний (ТИД) [21] благодаря его повышенной чувствительностью к фосфор- и (что более важно) к азот-содержащим соединениям - наиболее распространенным в практике судебно-химического и химико-токсикологического анализа. Как пламенно-ионизационный, так и термоионизационный детекторы характеризуются малой стоимостью и высокой надежностью. Все эти

детекторы являются одноканальными, и получение дополнительной информации о компонентах образца приводит к необходимости соединения их в тандем или применение делителей потока, выходящего из хроматографической колонки. Газовый хроматограф, оборудованный делителем потока и двумя детекторами (пламенно-ионизационным и термоионизационным) является минимально возможным средством для ГХ-анализа биологических образцов средней сложности. В качестве газа-носителя обычно применяется азот высокой степени очистки. Совместное использование детекторов различной селективности предоставляет дополнительные возможности для идентификации и правильного обнаружения аналитов [22].

Значительный и непрерывно расширяющийся список обнаруживаемых соединений и их метаболитов [23-27] требует получения большей информации о детектируемых соединениях, нежели та, которую могут дать одноканальные детекторы.

Появление сравнительно дешевых и надежных масс-спектрометрических детекторов (МСД, МС) способствовало росту интереса к методу ГХ. Использование МС как многоканального детектора дает возможность определять наличие и измерять содержание аналитов на фоне зна�