Определение некоторых тиоловых соединений в биологических объектах методом вольтамперометрии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ



Дорожко Елена Владимировна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ТИОЛОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ МЕТОДОМ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

Специальность 02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

2 5 НОЯ 2010

Томск-2010

004614268

Работа выполнена на кафедре физической и аналитической химии Национального исследовательского Томского политехнического университета

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ доктор химических наук,

доцент

Короткова Елена Ивановна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор химических наук,

профессор Гунцов Александр Владимирович

доктор химических наук, профессор Ковалева Светлана Владимировна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится «

ь

декабря 2010 г. на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.269.04 при ГОУ ВПО НИ ТПУ по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке ГОУ ВПО НИ ТПУ по адресу: г.Томск, ул. Белинского, 53.

Автореферат разослан: «3 » ноября 2010 г.

Ученый секретарь совета по защите л п// Т.М. Гиндуллина

докторских и кандидатских диссертаций

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Биологически-активные серусодержащие соединения (БАСС), такие как глутатион, цистеин, метионин, липоевая кислота, содержащие тиоловые (8Н-) группы, играют важную роль в физиологических и биохимических процессах в организме человека и животных. Особую роль тиоловым соединениям отводят при рассмотрении их в качестве компонентов неферментатнвного звена антиоксндантной защитной системы организма наряду с мочевой, аскорбиновой кислотами, различными формами токоферола. Присутствующие в организме тиоловые соединения в первую очередь подвергаются действию активных кислородных радикалов, что предохраняет от их действия функциональные группы биологических молекул и клеточных мембран. Другим важным свойством тиоловых соединений является их способность образовывать комплексные соединения с ионами металлов С(12\ №2+,Си2+). Это позволяет защищать

организм от токсичного действия «тиоловых ядов». Поэтому, уровень суммарного содержания тиоловых соединений в биологических объектах может выступать в качестве показателя оксидативного стресса и детоксикации организма.

На основе серусодержащих соединений создан целый ряд синтетических антиоксидантов для защиты клеток от окислительного стресса; радиопротекторов; лекарственных препаратов, применяемых при терапии атеросклероза, ишемической болезни сердца, тггоксикащт. На сегодняшний день, в качестве БАД выпускаются глутатион, метионин, Ь-цистеин я и-липоевая кислота, применение которых рекомендуется при профилактики и лечении многих заболеваниях.

Исследование серусодержащих соединений имеет и диагностическую ценность при определении содержания сульфгвдрильных групп в сыворотке крови у больных с разными заболеваниями. Поэтому разработка новых чувствительных, доступных и экспрессных методик для определения тиоловых соединений в биологических объектах является актуальной задачей, от решения которой зависит оценка окислительных процессов и детоксикации организма в диагностических целях.

В данной работе в качестве метода суммарного определения тиоловых соединений в объектах природного и искусственного происхождешы предлагается использовать простой в аппаратурном оформлении, экспрессный и высокочувствительный метод вольтамперометрии, имеющий большие потенциальные возможности. Цель работы:

Исследовать физико-химические закономерности окисления-восстановления ряда серусодержащих соединений (глутатиона, цистеина, метионина, липоевой кислоты) с целью разработки вольтамперометрической методики определения суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи: 1. Исследовать электрохимические свойства ряда тиоловых соединений (глутатиона, цистеина, метионина, липоевой кислоты) в зависимости от ряда факторов (природы фонового электролита, рН раствора, наличия ионов металлов, материала электрода).

2. ассмотреть закономерности процесса комплексообразования между ионами ртути (I), (II), меди (II) с глутатионом. Определить состав и константы устойчивости комплексов и 1^(08)2 методами потендиометрии, спектрофотометрии. Исследовать физико-химические закономерности окисления-восстановления глутатиона, цистеина, метионина, липоевой кислоты на ртутно-нленочном электроде.

3. Используя метод катодной вольтамперометрии и процесс электровосстановления кислорода, исследовать антиоксидшггаые свойства ряда серусодержащих соединений для выяснения их роли в механизмах взаимодействия с кислородом и его активными радикалами.

4. Разработать вольтамперомтерическиую методику количественного химического определения суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека. Провести оценку метрологических характеристик методики. Провести сопоставление результатов определения суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека методами спектрофотометрии и вольтамперометрии.

Научная новизна.

Впервые установлены закономерности окисления-восстановления глутатиона на платиновом электроде (1ЧЭ) в присутствии ионов ртути (И), стекло-углеродном электроде (СУЭ) в присутствии ионов меди (И) методом циклической вольтамперометрии. Показано, что ионы ртути (II) образуют устойчивые комплексы с глутатионом. Определены потенциалы катодных и анодных пиков цистеина, метионина и липоевой кислоты на РПЭ. Предложены схемы окисления-восстановления тиоловых соединений в присутствии ионов металлов.

Впервые исследованы составы комплексов ^(ОЯ)? и ^2(08)2, определены их константы устойчивости методами потенциометрии и спектрофотометрии.

Впервые исследована антиоксидантная активность (АОА) ряда тиоловых соединений (глутатиона, цистеина, метионина, липоевой кислоты) методом катодной вольтамперометрии с использованием процесса электровосстановления кислорода. Предложены схемы взаимодействия тиоловых соединений с кислородом и его радикалами.

Впервые разработан новый подход к определению суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека, используя метод вольтамперометрии, отличающийся высокой чувствительностью, простотой, экспрессностью и удобством анализа. Проведено сопоставление результатов анализа независимым спектрофотометрическим методом. Практическая значимость.

Разработана вольтамперометрическая методика количественного химического определения суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека. Проведено суммарное содержание тиоловых соединений в сыворотке крови человека в норме и при патологии алкоголизма, используя вольтамперометрическую методику.

Доступность и простота приборного оформления, минимальная пробоподготовка дают возможность использования датой методики для медицинских исследований в контроле над эффективностью лечения и профилактики оксидативного стресса и детоксикации организма в клинической практике.

Проведена оценка антиоксидаптной активности ряда тиоловых соединений по отношению к процессу элекгровосстановления кислорода. Полученные результаты позволили выявить наиболее активные антиоксвданты из ряда тиоловых соединений и дать рекомендации для их дальнейшего использования.

Определены оптимальные условия определения глутатиона в объектах искусственного происхождения на СУЭ в присутствии ионов меди (II) на уровне концентрации 1.0-10"9 моль/л и Pt электроде в присутствии ионов ртути (II) на уровне концентрации 1.0-10"4 моль/л. Результаты и положения, выносимые на защиту:

1. Результаты оценки влияния природы фонового электролита, рН раствора, наличия ионов металлов, материала электрода на электрохимические свойства ряда тиоловых соединений (глутатион, цистеина, метионина, липоевой кислоты) в модельных растворах.

2. Методом потенциометрии установлен состав комплексов Hg(GS)2 и Hg2(GS)2, определены их константы устойчивости 1пр2=88,4 и 1п[)2=36,0.

3. Результаты определения антноксидантной активности ряда тиоловых соединений с использованием процесса электровосстановления кислорода методом катодной вольтамперометрии.

4. Результаты определения суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека в норме и патологии методами спектрофотометрии и вольтамперометрии.

Достоверенность полученных результатов:

1. Проведено сопоставление результатов по определению состава комплексов Hg(GS)2 и Hg2(GS)2, полученных методом потенциометрии с методом спектрофотометрии. Результаты сопоставимы между собой.

2. Проведено сопоставление результатов по определению антноксидантной активности ряда тиоловых соединений методом вольтмперометрии с методом спектрофотометрии. Результаты, полученные двумя методами, коррелируют между собой.

3. Проведено сопоставление результатов по определению суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека в норме и патологии методами спектрофотометрии и вольтамперометрии. Результаты, полученные двумя методами, коррелируют между собой.

Апробация работы.

Основные результаты работы представлены устными и стендовыми докладами на российских и международных конференциях и симпозиумах: на международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (г.Тюмень 12-16 сентября, 2005г), на международной конференции «ISRANALYTICA» (г. Иерусалим, Израиль, 2006г.), на Всероссийской научной конференции с международным участием «Электроаналитика 2005» (Екатеренбург 23-27 мая, 2005г.), на международном конгрессе по аналитической химии «ICAS-2006» (г. Москва, 2006г), на VII всероссийская конференция по электрохимическим методам анализа с международным участием (г. Москва, 2008г), на Международной научно - практической конференция «Биотехнология» (г. Москва, 2008), на Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП « Исследования

и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического

комплекса России на 2007-2012 годы» (г. Москва, 2009г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и тезисы 9 докладов. Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 173 страницах, содержит 11 таблиц, 42 рисунка и библиографию из 213 наименований. Работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы и приложений.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе приведен литературный обзор, в котором рассмотрены физико-химические свойства, биологическая роль, методы определения тиоловых соединений.

Во второй главе описаны условия эксперимента, способы приготовления растворов и электродов, представлены данные об используемом оборудовании и обьекгах исследования.

Третья глава посвящена исследованию электрохимических свойств глутатиона в зависимости от влияния различных факторов: материала электрода, природы фоновых электролитов, рН раствора, наличия ионов металлов. Описаны электрохимические свойства цистеина, метионина, липоевой кислоты. Исследованы свойства комплексообразования глутатиона с ионами ртути (I) и (П) методами потенциометрии и спектрофотометрии. Исследованы физико-химическим закономерностям восстановления глутатиона на ртутно-пленочном электроде.

В четвертой главе представлены результаты определения антиоксидантной активности тиоловых соединений по отношению к процессу элекгровосстановления кислорода методом катодной вольтамперометрии. Представлены результаты сравнительных определений АОА тиоловых соединений методом спектрофотометрии.

В пятой главе дано описание методики количественного определения глутатиона в модельных средах и суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека методом вольтамперометрии. Определены метрологические характиристики методики. Представлены результаты сравнительных определений суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека в норме и патологии методами спектрофотометрии и вольтамперометрии.

Экспериментальная часть

Объекты исследования

В качестве модельных систем для поиска аналитических сигналов тиоловых соединений и исследования их антиоксидантных свойств были рассмотрены модельные растворы: Ь-глутатиона (ОБН); 1,-цистеина (СУЗ); метионина; а-липоевой кислоты.

/

,он

Цистеин

НО

ОН

О

СН

СН

о

СНг (СНг)< ОН

/ ч / \/

СН, СН с.

1 I п

\

БН

Глутатион

Рнс.1 Структурные формулы Ь-глутатнтиона, Ь-цистеина, метношша и а- лнпоевой

Для определения суммарного содержания тиоловых соединений в биологических объектах была использована сыворотка крови шодей без видимых патологий и больных алкоголизмом. Электрохимические свойства БАСС исследовались на вольтамперометрическом анализаторе ТА-2 («Техноаиалит» г. Томск). Использовались индикаторные электроды: платиновый (14), ртутно-пленочный (РПЭ), стеклоуглеродный (СУЭ). В качестве электрода сравнения в работе использовали хлоридсеребряный электрод (ХСЭ). В качестве вспомогательного электрода использовали СУЭ. Исследование аитиоксидаитных свойств тиоловых соединений осуществляли на СУЭ с использовашкм анализатора «АОА-1» («Полиант» г. Томск).

Исследование электрохимических свойств тиоловых соединений

Исследование влияния материала электрода, природы фоновых электролитов, рН раствора, наличие ионов металлов на электрохимических свойств глутатиона

Изучено влияние материала электрода на электрохимические свойства глутатиона. Методом циклической вольтамперометрии были найдены аналитические сигналы 0811 на РПЭ в катодной и анодной областях (рис. 1). Потенциал окисления вБН составил Е—0.065В, потенциал восстановления составил Е=-0.237В.

кислоты

Основное содержание работы

Рис. 1. Циклические

вольтамперограммы окисления-

восстановления на РПЭ в фосфатном буферном растворе (рН 6.86) в отсутствии вещества (1); и в присутствии 5.2-10"4 М 08Н (2); 8.2-10"' М О ЯП (3); 9.8'Ю"4М08Н (4).\У=60 мВ/с.

I, мкА

Рис. 2. Зависимость тока восстановления СБН на РПЭ от его концентрации в растворе в области от 4.5-10"5 моль/л до 1.1-10"3 моль/я. и'-бОик/с; рН 6.86 фосфатный буфер.

Ток пика восстановления отражает восстановление комплекса ртуть-глутатион. Ток пика окисления отражает формирование комплекса ртуть-глутатион на поверхности РПЭ. Полный электродный механизм может быть представлен уравнениями (1-2):

Нё2>1) + 208-<=>^(08)2(ас1) (1)

Нё(08), (ас1) +2е" +2Н+(а<1) <->Нё + 20ЯН(ас1) (2)

Используя данные условия эксперимента, была построена зависимость тока восстановления С ЯН на РПЭ от его концентрации в растворе, имеющая прямолинейный характер в области концентраций от 4.5-10"5 до 1.1-10"3 М (рис. 2). Предел обнаружения ОЙН составил 1.3-10"5 М.

На электродах из других материалов (Р1, СУЭ) в данной области потенциалов ОЯН оказался неактивным. Отсутствие сигнала ОЗН в отсутствии ионов-комплексообразователей свидетельствует о том, что электрохимическая активность ОБН проявляется в области потенциалов от Е=0.0 до -0.40 В за счет комплексообразования с ионами металлов через тиоловую группу.

С целью выбора фонового электролита исследовали восстановление СтБН на РПЭ в растворах: фосфатные буферные растворы с рН 4.01 * 9.18 и боратные буферные растворы с рН 4.01 9.18. Все перечисленные растворы можно использовать для вольтамперометрического определения ОЭН на РПЭ при Епк=-0.237 В, однако рабочим фоновым электролитом был выбран боратпый буферный раствор (рН 9.18), на фоне которого регистрируются четко выраженные и хорошо воспроизводимые пики восстановления.

На рис. 3 представлена зависимость тока восстановления вЗН на РПЭ при Е=-0.237 В в боратном буфере от рН раствора.

Рис. 3. Зависимость тока Рис. 4. Зависимость потенциала

восстановления 0811 на РПЭ при Е=- восстановления 68Н на РПЭ от рН раствора,

0.237 В от рН раствора при Со?н=5.б-10"4 моль/л

концентрациях глутатиона в растворе:

С1=8.2-10"5 моль/л (1); С2=5.6-10"4

моль/л (2)

В области рН 8-9 наблюдался максимальный ток восстановления 08Н, тогда как в сильно - щелочных (рН 10-11) и нейтральных (рН 6.86) средах ток имел минимальное значение. Интервал рН от 8 до 9, по-видимому, способствует смещению равновесия в сторону анионной формы глутатиона 05" с последующим образованием комплексного соединения с ионами ртути:

ОЯН<->08~+ Н+ (3)

На рис. 4 представлена зависимость потенциала восстановления ОБИ на РПЭ от рН раствора. Из зависимости потенциала максимума пика восстановления СтУН на РПЭ от кислотности среды следует, что с увеличением рН происходит смещение потенциала пика в анодную область, что связано с предшествующей реакцией депротонизации, в результате которой образуется анионная форма глутатиона по уравнению (3).

Значение рН в точке пересечения продолжения прямолинейного участка экспериментальной зависимости Е от рН соответствует величине константы диссоциации глутатиона рК=7.92. Из этих данных вычислено значение эффективной константы диссоциации ОЭН по тиоловой группе, которое составило Кэф=1.2-10"8.

При исследовании комплексообразующих свойств ОКИ с ионами ртути Щ2+ были сняты катодные вольтамперограммы в области потенциалов Е= от 0.0 до -0.8 В на 1ЧЭ в боратном буферном растворе (рН 9.18).

На рис. 5 представлены вольтамперограммы восстановления ионов ртути (3.4-10 5 М) в отсутствии и в присутствии раствора вйН на Р1Э.

Рис. 5. Вольтамперограммы восстановления ионов Н£2+(3.4-10"5 моль/л) в отсутствии (1) и в присутствии вЭН в растворе: 5.9-1С)"5 моль/л (2); 1.2-10"5 моль/л (3); 1.8-10' моль/л (4). Ш=60мв/с; рН 9.18 боратньш буфер; Трехэлектродиая ячейка. Рабочий электрод платиновый

12 С010 моль/л

Рис. б. Зависимость тока восстановления 0511 в присутствии ионов Щ2+ от концентращш 5 СЙН в растворе в области от 1.0-10"4 моль/л до 1.2-10"3 моль/л. \У=60мв/с; рН 9.18 боратньш буфер; Трехэлектродиая ячейка. Рабочий электрод платиновый

В отсутствии ОЭН в исследуемом растворе ионы Н§2+ восстанавливаются в одну стадию по схеме (рис. 5, кривая 1):

Нё2+ +2е<->211ё° (Е1=-0.169 В) (4)

При введении в ячейку раствора ОЙН (5.9-10"5М) был обнаружен новый пик при Е2=-0.430 В (рис. 5, кривые 2), который значительно увеличивался с увеличением концентрации 08Н, при этом первый пик уменьшался (рис. 5, кривые 3-4). Данные электрохимические явления связаны с образованием комплекса Щ(08)2, который восстанавливается при потенциале Е2=-0.430 В. За счет связывания свободных ионов в устойчивый комплекс при введении раствора ОЭН, первый пик восстановления при потенциале Е1=-0.169 В уменьшается и смешается в более электроотрицательную область потенциалов. Наиболее эффективная конценграция соли Щ(М03)2 составила 3. 7-10"5 М.

Необходимо отметить, что комплекс Н§(08)2 предварительно адсорбируется на поверхности Р1 Полный электродный механизм может быть представлен следующей схемой:

+ ОХ"

Нё(08)2(аЧ)

Нё(08)2(аЧ) .

^(С8)2(ас1)

Нё(08)2(ас1)+2Н++2е .

: Нё°+208Н (Е2=-0.430 В)

(5)

(6) (7)

Используя данные условия эксперимента, была построена зависимость тока восстановления комплекса Н§(08)2 от концентрации 08Н в растворе, имеющая прямолинейный характер в области концентраций от 1.0-10"4 до 1.2-10"3 М (рис. 6). Предел обнаружения й8Н по току восстановления комплекса Щ(08)2 составил 8.3-10"5 М.

В работе было проведено исследование реакции комплексообразования 6811 с ионами меди Си2+ на СУЭ в боратном буферном растворе (рН 9.18). На платиновом электроде перенапряжение выделения меди очень мало, следовательно, для оценки влияния меди на глутатион в качестве индикаторного электрода был выбран СУЭ.

Ю

|,мкА 16—

-15-'-и С "10

Рис. 7. Волыамперограммы восстановления ионов С'и~+(4.2-10"5 моль/л) в отсутствии (2) и в присутствии ввН в растворе: 1.3710"11 моль/л (3); 6.8-Ю"8 моль/л (4). (1) - линия остаточного тока. \У=60 мв/с; рН 9.18 борзтный буфер; Трехэлекгродная ячейка. Рабочий электрод стеклоуглероднын

Рис. 8. Зависимость тока восстановления 05II в присутствии ионов Си2+от концентрации 08Н в растворе в области от 1.0-10"' моль/л до 2.0-10"8 моль/л. \\'^60мв/с; рН 9.18 боратный буфер; Трехэлектродиая ячейка. Рабочий электрод стекло углеродный

На рис. 7 показаны вольтамперограммы восстановления ионов меди Си2+ на СУЭ в отсутствии и в присутствии ОйН. В отсутствии ОЧИ в растворе иоиы меди Си2+ восстанавливаются на СУЭ в одну стадию по механизму (рис. 7, кривая 2):

Си (Е!=-0.18В)

(8)

При введении в электрохимическую ячейку раствора йЯН 1.37-10"1 М (рис. 7, кривая 3) появляется новый пик при Е2=-0.4 В, который так же как и первый при Е1=-0.18 В увеличивается с добавлением концентрации СйН 6.8-10'8 М (рис. 7, кривая 4). Замечено, что потенциал пика восстановления при Е=-0.18 В в присутствии ОЭН смешается в сторону более отрицательных, значений потенциалов.

Было предложено, что данные электрохимические явления связанны с тем, что при введении ОвН в раствор образуется комплексное соединение состава Си (08)2, которое адсорбируется на поверхности СУЭ:

Си2+ + 208" <-> Си(03)2(ая) (9)

Си(08)2(ас1) <-->Си(08)2(аа)

(10)

Адсорбированный комплекс восстанавливается на СУЭ в две стадии. При этом следует отметить, что анионы 08" выступают в качестве катализатора процесса восстановления ионов меди из комплекса до Си0: Си(08)2(аф + е" +НГ<->Си(08)(ас1) +1108 (Е=-0.22 В)

Си(08Хас1) + е" +Н+<->Си° +1108 (Е2=-0.40 В)

(И) (12)

Прямолинейная зависимость тока восстановления комплекса Си(08) при Е2=-0.40 В от концентрации 08Н в растворе при данных условиях эксперимента сохранялась в области от 1.0-10"11 до 2.0-10'8 М (рис. 8), предел обнаружения 08Н составил 8.2-10"12М.

Таким образом, в присутствии ионов меди в растворе образуется комплексное соединение глутатиона с медью, которое позволяет значительно снизить предел обнаружения глутатиона до 8.2-10'12 М, используя в качестве аналитического сигнала пик восстановления комплекса Си((К) при Е=-0.40 В на СУЭ. Оптимальная концентрация ионов меди в растворе составила 4.2-10"5 моль/л в боратном буферном растворе рН 9.18.

Новая методика определения в указанном диапазоне концентраций ОЭН имеет преимущества по сравнению с используемыми вольтамперометрическими методами: значительно увеличивается чувствительность метода, использование в качестве электродного материала не токсичной ртути, а СУЭ. Однако, аналитический сигнал 0811 в присутствии ионов меди (II) на СУЭ плохо воспроизводится в условиях эксперимента, что затрудняет его использование для разработки методики определения тиоловых соединений в биологических объектах.

Таким образом, исследованы электрохимические свойства Ст8П. Рассмотрено влияние различных факторов на его электрохимические свойства: материал электрода, рН раствора, природа фоновых электролитов.

Установлено, что процесс окисления-востановления глутатиона на РПЭ идет с формированием комплекса Щ(08)2, в случае анодного тока, и с восстановлением комплекса Н§(08)2, в случае катодного тока. Наиболее оптимальной средой для электрохимического определения ОЭН является боратный буферный раствор с рН 9.18. Из экспериментальных данных впервые вычислено значение эффективной константы диссоциации 08Н КЭф=1.2-10"8 на РПЭ методом вольтамперометрии.

Изучено явление комплексообразования СтЭН с ионами и Си2+. Сделано ряд предположений по механизмам восстановления комплексов Н§(08)2, Си(08): на Р(Э и СУЭ.

Исследование электрохимических свойств иистеина, метионина и липоевой кислоты на РПЭ

В данном разделе были изучены электроаналитическтие свойства цистеина, липоевой кислоты, и метионина на РПЭ с целью поиска аналитического сигнала от 8Н-групп исследуемых молекул для разработки методики суммарного определения тиоловых соединений в сыворотке крови человека.

В работе были сняты циклические вольтамперные кривые для всех исследуемых веществ (рис. 9, 11, 13) и получены пики окисления и восстановления тиоловых соединений в зависимости от их концентрации в растворе. Потенциалы катодных и анодных пиков представлены в табл. 1.

Таблица 1. Потенциалы катодных и анодных пиков тиоловых веществ

Название Еа, В Ег, В

Цистеин -0.082 -0.187

Липоевая кислота -0.309 -0.373

Метионин - -0.315

Следует отметить, что для исследуемых веществ пики восстановления и окисления в области потенциалов от -0.082 до -0.373 указывают на формирование на РПЭ (в случае анодных пиков) и восстановление (в случае катодных пиков) тиол-ртутных комплексов через БН-группы. Форма циклических вольтамперных кривых и разность потенциалов катодных и анодных пиков говорят преимущественно об квазиобратимых или обратимых электродных процессах.

Необходимо отметить, что в исследуемом диапазоне концентраций 3-Ю"4 -2-10"3 моль/д ток восстановления тиоловых соединений, кроме метионнна, прямопропорционален их концентрациям в растворах. Это может быть использовано для разработки методик их количественного определения в модельных средах. Так же сигналы могут быть использованы для разработки методик количественного определения суммарного определения тиоловых соединений в сыворотке крови человека по цистеину или липоевой кислоте в указанном диапазоне концентраций.

Рис. 9. Циклические волыамперограммы Рис. 10. Зависимость тока восстановления цистепна на РПЭ в фоновом электролите - цистеин па РПЭ от его концентрации в

боратиый буфер рН 9.18; \У=60 мВ/с; (1) - растворе; \У=60мв/с; рН 9.18 боратный фоновая кривая; (2) - 2.6-10"4 моль/л; (3) - буфер 7.7-10^ моль/л

Рис. 11. Циклические

вольтамперограммы липоевой кислоты на РПЭ в фоновом электролите -боратный буфер рН 9.18; \\г=60 мВ/с; (1) — фоновая кривая; (2) - 2.6-10"4 моль/л; (3)-7.7-Ю-4 моль/л

С, моль/л

Рис. 12. Зависимость тока восстановления липоевой кислоты на РПЭ от ее концентрации в растворе на РПЭ; Ш=60мв/с; рН 9.18 боратный буфер

I, мкА

боратный буфер рН 9.18; У/=60 мВ/с; (1) - фоновая кривая; (2) - 1.3-10"3 моль/л; (3) -7.6-10° моль/л

Определение констант устойчивости и состава комплексов ртуть-глутапшон методами потенциометрии и спектрофотометрии

Для определения состава комплексов ртуть-глутатион и их констант устойчивости (1пр„) с ионами ртути (I) и (II) методом потенциометрии в работе использовалась установка для измерения ЭДС системы, платиновый и хлорид-серебрянные электроды, растворы нитратов солей ртути Н^(М03)2 (1-Ю"6 моль/л) и Щ2(Ж>з)2 (1-Ю"6 моль/л) . Постоянство ионной силы поддерживалось раствором КЫОз (1 моль/л). Использовался свежеприготовленный раствор ОШ (5 моль/л), из которого методом последовательного разбавления готовили другие растворы ОШ. Определение потенциала системы проводили в борагном буферном растворе рН 9.18. Исследуемый раствор продували инертным газом азотом для удаления следов кислорода. Первоначально исследовалась система Н£(П)-0811.

Анализ экспериментальных зависимостей равновесного потенциала системы Е от концентраций иоиов Щ2+ и лиганда ОЭ" при различных их соотношениях на основе уравнения Нернста (13) позволил определить параметры процесса комплексообразования - число лигандов (п) и константу устойчивости 1п[1„ комплекса Щ(08)2.

Е=Еи-Щ; ЬпРп+—£лС(ЯЫ-—-1пС(ОБ) ^

Где ¡^-универсальная газовая постоянная 8,31 Дж/моль-К;

Г-температура, К;

Р-постоянная Фарадея 96485,3 Кл-моль"1;

рп-константа устойчивости комплекса

Е0/_формальный электродный потенциал системе не содержащей комплексообразующих частиц, а только ионы ртути Щ2+.

Рис. 14. Зависимость потенциала Рис. 15. Зависимость потенциала системы ртуть системы ртуть (П)-глутатион(Е, В) от (1)-глутатаои (Е, В) от lnCosn- Концентрация InCGSH- Концешрация ионов Hg2+ 3-10" ионов Hg 22+ 3-10"6 моль/л 6 моль/л

Согласно рис.14 было определено число лигандов, входящих в состав комплекса Hg(GS)2, которое равно п=2,48=2. Константа устойчивости комплекса Hg(GS)2 составила lnp2=88,39 (logp2=38,38).

Аналогичным способом были определены параметры процесса комплексообразовапия комплекса Hg2(GS)2 по экспериментальной зависимости Е от концентраций ионов одновалентной ртути I Ig22+ и лигандов GS' при различных их соотношениях, (рис. 15). Было определено количество лигандов п=1,93=2. Константа устойчивости комплекса Hg2(GS)2 составила lnp2=36,03 (logP2=15,64).

Таким образом, на основании значений констант устойчивости комплексов ионов ртути (I) и (II) с глутатионом, можно сделать вывод, что наиболее стабильным является комплекс ионов двухвалентной ртути состава Hg(GS)2. Это позволяет предположить, что он формируется на поверхности РПЭ быстрее, чем комплекс Hg2(GS)2.

Метод спектрофотометрии был выбран для сравнения полученных результатов по составу комплекса Hg(GS)2 с методом потепциометрии.

Исследование комплексообразовапия системы Hg(II)-GSH проводились на спектрофотометре СФ-46, используя кювету с толщиной поглощающего слоя 1 см. Длины волн устанавливали в области 180-250 нм с погрешностью ±0,1 им. В качестве раствора сравнения использовали бидистнллированную воду.

Максимум спектров поглощения Hg(II) (СН£(шз)2=Ь5-10 моль/л) и GSH (Cgsh =1,5-10"5 моль/л) соответствовали значениям ?щв(щ=200 нм и A,gsh=195 нм (рис. 16). При совместном присутствии Hg(II) и GSH появляется новый спектр поглощения при 215 нм, соответствуя спектру поглощения комплексного соединения системы Hg (И) - GSH. В дальнейшем оптическую плотность измеряли при А,=215 им.

iso 190 гвд !Ю гго гзо гла aso

Рис. 16. Спектры поглощения систем ртуть

- глутатион в водных средах: 1 - GSH Рис. 17. Зависимость оптической плотности (1,5-Ю"5 моль/л); 2 - Hg(N03)2 (1,5-10"5 раствора А от мольного соотношения моль/л); 3 - комплекса Hg(GS)2 (CGSn 1,5-10" [GSH]/[HgII] 5 моль/л И CHg(N03)2 1,5-10" МО ль/л)

По кривой насыщения (рис. 17) методом молярных соотношений найдены оптимальные мольные соотношения компонентов комплексного соединения Hg(GS)2 при 1=215 нм, которые равны 1:2, что согласуется с экспериментальными данными потенциометрического метода.

Исследование антиоксидантных свойств тиоловых соединений волыпамперометрическим и спектрофотометрическим методами

В данной работе предлагается использовать вольтамперометрический метод для исследования антиоксидантных свойств тиоловых соединений, основанный на модельной реакции электровосстановления кислорода.

Для исследования антиоксидантных свойств тиоловых соединений методом вольтамперометрии, использовалась модельная реакция электровосстановления кислорода (ЭВ 02), протекающей на СУЭ электроде в области потенциалов от 0 до -1.2 В по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в живых клетках.

02 + е"<=4=> 02 " (14)

02 " + Н+.<=> Н02 (15)

При введении серуеодержащих соединений в электрохимическую ячейку ток ЭВ 02 первоначально возрастал в связи с резким смещением равновесия в сторону образования супероксид анион радикала 02 ~ , а затем уменьшался при последующих добавках вещества в раствор, что связано с взаимодействием тиоловых соединений с анион - радикачом кислорода по механизму:

02 <==r=± 02 ~ + R-SH (16)

02 "+ 2 R-SH <=> R-S-S-R + Н02 (17)

При этом потенциал полуволны кислорода сдвигается в положительную область (рис.18).

Рис. 18. Вольтамперограммы тока ЭВ О2 (1)-в фоновом электролите (фосфатный буфер рН 6.86) и в присутствии глутатиона: (2) С=М0"5 моль/л; (3) С=5- 10° моль/л;(4) С=8- 10"5 моль/л; (5)-лшшя остаточного (фонового) тока в отсутствии кислорода в растворе. Скорость развертки потенциала - 60 мВ/с

В работе была проведена оценка антиоксиданной активности серусодержащих соединений при их концентрациях в электрохимической ячейкеМО "3 моль/л, используя кинетический критерий, отражающий количество активных кислородных радикалов, прореагировавших с антиоксидантом за минуту

времени. Ккин (мкмоль\лмин):_

где - ток ЭВ 02 в присутствии АО в растворе, мкА,

10 - ток ЭВ 02 в отсутствии АО в растворе, мкА;

С'', С002 - исходная концентрация кислорода в растворе,

—

1--

*о у

мкмоль/л,

г - время протекания реакции взаимодействия антиоксиданта с активными кислородными радикалами, мин.

По результатам определений строился график зависимости функции (1 —1\10) от времени 0:), затем определялся коэффициент ангиоксидантной активности исследуемых веществ - К.

В табл. 2 представлены результаты определения коэффициентов антиоксцдантной активности для исследуемых серусодержащих соединений и стандартных антиоксидантов в их наиболее эффективных концентрациях (С =1-10"3 моль/л). В качестве стандартных аптиоксилаптоп были выбраны аскорбиновая кислота, дигидрокверцетин и селенит натрия.

Таблица 2. Рассчитанные значения коэффициентов антиоксидантной активности

Название вещества К, мкмоль\л-мин.

Аскарбиновая кислота 1.15+0.04

Дигидрокверцетин 0.65±0.03

Селишгг натрия 1.28+0.02

Глутатион 4.35±0.03

Цистеин 3.44+0,05

Цистин 2.81+0.03

Метионин 1.02+0.03

Липоевая кислота 4.86+0.02

Таурин 2.30+0.04

Как видно из табл. 2, БАСС проявили хорошую аотиоксидантную активность относительно стандартных антиоксидантов. Липоевая кислота и глутатион показали наибольшие значения. Метионин проявил минимальную антиоксидантную активность.

Методика определения суммарного содержания пшоловых соединений в сыворотке крови человека методом вол ь пиши ером етрии

Для разработки методики определения суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека был использован аналитический сигнал СЭП при катодной развертке потенциала при Е=-0.237 В на РПЭ, где зависимость прироста предельного тока восстановления ОХИ от увеличения его концентрации в растворе линейна. Эта область находилась между концентрациями от 6.4-10"5 до 6.2-10"4.

Методика заключалась в съемке вольгамперограмм восстановления суммарного содержания тиоловых соединений сыворотки крови на РПЭ при потенциале Е—0.237В. В качестве аппаратурного оформления использовался вольтамперометрический анализатор ТА-2 с подключенной к нему электрохимической ячейкой, состоящей из индикаторного РПЭ, хлорид -серебряных электродов сравнения и вспомогательного электрода.

Использовалась постояинотоковая вольтамперометрия с линейной скоростью развертки потенциала бОмВ/с. Оптимальным фоном являлся боратный буфер 0.025 М, рН 9.18. Удаление кислорода осуществляли путем его вытеснения инертным газом азотом в течении 15 минут. Азот подавали через стеклянную трубочку в электрохимическую ячейку.

Обобщенные результаты показателей качества результатов анализа для диапазона исследуемых концентраций, представлены в таблице 3._

Таблица 3. Показатели качества результатов анализа

моль/л СГк. ±Д

0.000064 1.9 Ю"6 2.7 10"6 6.0 10"6

0.00031 3.2 10"5 4.4 10"5 8.8 10°

0.00061 4.1 10"5 5.3 10"5 10.4 10"5

аг-Бт,- значение

показателя повторяемости для результатов, полученных по методике в условиях повторяемости;

ст/г^'йл - значение показателя промежуточной прецизионности результатов, полученных в условиях внутрилабораторной прецизионности;

±Д - показатель точности результатов измерения.

Используя разработанную методику было проведено определите суммарного содержания тиоловых соединений белковой и небелковой природы в сыворотке крови здоровых людей и больных алкоголизмом методом добавок. Исследовали сыворотку крови 50 здоровых и 50 больных алкоголизмом людей. В качестве метода сравнения был использован классический метод спектрофотометрии определения тиоловых соединений в сыворотке крови человека.

В таблицах 5 и 6 представлены результаты сравнительных определений суммарного содержания тиолов белковой и небелковой природы в сыворотке крови

в норме и при патологии алкоголизма (выборка из 50 результатов), измеренных двумя методами.

Таблица 5. Найденные значения концентрации суммарного содержания белковых

и небелковых тиоловых соединений в сыворотки крови человека без видимых патологий, определенные вольтамперометрическим и спектрофотометрическими

Номер образца сыворотки Концентрация белковых тиолов, С-10"3 моль/л Концентрация небелковых тиолов, С-10'3 моль/л

крови Вольтамперо Спектрофого Вольтамперо Спектрофото

человека метрический метрический метрическии метрический

без метод метод метод метод

видимых

патологий

1 0.16±0.07 0.10±0.03 0.062±0.00б 0.054±0.003

2 0.18±0.07 0.10+0.02 0.078+0.002 0.034+0.006

3 0.25+0.04 0.16+0.05 0.072+0.04 0.060+0.005

4 0.16±0.04 0.09+0.05 0.080±0.004 0.056+0.005

5 0.28±0.03 0.13+0.03 0.063+0.003 0.040+0.003

6 0.3110.06 0.25±0.06 0.074±0.006 0.035±0.007

7 0.24+0.02 0.18+0.06 0.067±0.006 0.047+0.005

8 0.22+0.06 0.12±0.03 0.074±0.007 0.045±0.008

9 0.15+0.04 0.08+0.04 0.065±0.005 0.022+0.003

Таблица 6. Найденные значения концентрации суммарного содержания белковых и небелковых тиоловых соединений в сыворотки крови человека при патологии алкоголизма, определенные вольтамперометрическим и спектрофотометрическими методами____

Номер Концентрация белковых Концентрация небелковых

образца тиолов. тиолов,

сыворотки С-10 моль/л С-10"3 моль/л

крови Вольтамперо Спектрофо Вольтамперо Спектрофо

человека метрический тометрический метрический тометрический

оез метод метод метод метод

видимых

патологий

1 0.58+0.07 0.50+0.03 0.08210.006 0.05410.003

2 0.51±0.07 0.4710.02 0.08810.002 0.03410.006

3 0.4810.04 0.3010.05 0.09210.04 0.06010.005

4 0.63+0.04 0.5610.05 0.09410.004 0.07610.005

5 0.61+0.03 0.5610.03 0.09310.003 0.04010.003

6 0.5010.06 0.4210.06 0.09410.006 0.03510.007

7 0.5710.02 0.45+0.06 0.097+0.006 0.047+0.005

8 0.5210.06 0.40+0.03 0.09410.007 0.04510.008

9 0.5510.04 0.4110.04 0.09510.005 0.02210.003

По результатам, представленным в таблицах 5 и 6 видно, что полученные данные хорошо коррелируют между собой. Это позволяет рекомендовать вольтамперометрическую методику использовать в клинических лабораториях.

ВЫВОДЫ

1. Исследованы электрохимические свойства глутатиона, цистеина, метионина, липоевой кислоты в зависимости от материала электрода, природы фонового электролига, рН раствора, наличия ионов металлов. Показано, что оптимальными условиями определения тиоловых соединений являются рН 9.18, фоновый электролит: боратный буфер, использование РПЭ.

2. Исследованы физико-химические закономерности восстановления глутатиона, цистеина, метионина, липоевой кислоты на РПЭ. Показано, что ионы металлов (Hg (II), Си (II)) образуют устойчивые комплексы с глутатионом. Предложены схемы окисления - восстановления тиоловых соединений в присутствии изученых ионов металлов.

3. Исследованы составы комплексов и определены константы устойчивости комплексов Hg(GS)2 и Hg2(GS)2 методами потенциометрии и спектрофотометрии.

4. Исследованы антиоксвдантные свойства глутатиона, цистеина, метионина, липоевой кислоты методом катодной вольтамперометрии с использованием процесса электровосстановления кислорода. Предложены схемы взаимодействия тиоловых соединений с кислородом и его радикалами. Проведены сравнительные определения антиоксидантных свойств тиоловых соединений методом спектрофотометрии. Выявлены наиболее активные соединения.

5. Разработана вольтамперомтерическая методика количественного химического определения суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека. Проведены корреляционные исследования результатов определения тиоловых соединений в сыворотке крови человека в норме и патологии алкоголизма методами спектрофотометрии и вольтамперометрии.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Дорожко Е.В., Короткова Е.И., Карбаинов Ю.А. Исследование антиоксидантных свойств глутатиона методом вольтамперометрии // Матерьалы международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки», Тюмень 12-16 сентября 2005г, С.53-55.

2. Dorozhko E.V., Korotkova E.I., Avramchik О.А, Karbainov Y.A.. New method and analyzer for antioxidant activity determination of serum blood // Materials of the 9th Annual Meeting of the Israel Analytical Chemistry Society (Israel Scientific Conference) "ISRANALYTICA 2006". 2006. P. 95.

3. ДорожкоЕ.В., Короткова Е.И., Карбаинов Ю.А. Вольтамперометрический метод иследования антиоксидантных свойств глутатиона // Всероссийская научная конференция с международным участием «Электроаналитика 2005», Екатеренбург 23-27 мая 2005.С. 85.

4. Dorozhko E.V., Korotkova E.I., Karbainov Y.A. Study of antioxidant properties of blood serum by voltammetry // International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006, June 25-30.2006. Moscow, Russia, p.128.

5. Короткова Е.И, Драчева JI.B., Дорожко Е.В. Исследование антиоксвдантных свойств пробиотнческих композиций // Аналитические методы измерений и приборы в пищевой промышленности, Москва 2007. С.29.

6. Короткова Е.И., Дорожко Е.В., Аврамчик O.A., Вторушина А.Н. Разработка анализатора для определения антиоксидантов в биологических объектах // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП « Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» Сборник тезисов, 6-7 декабря 2007.С. 218-219.

7. Короткова Е.И., Липских О.И., Дорожко Е.В. Исследование антиоксвдантных свойств пробиотнческих композиции // Международная научно-практическая конференция Биотехнология. Вода и пищевые продукты. 11-13 марта, 2008.С. 116.

8. Дорожко Е.В., Короткова Е.И. Физико-химические закономерности окисления-восстановления глутатиона // VII всероссийская конференция по электрохимическим методам анализа с международным участием. 2008. С. 34.

9. Драчева JI.B., Дорожко Е.В., Короткова Е.И. Применение вольтамперомстрического метода при изучение бионтиоксидантов // Журнал Пищевая промышленность № 4. 2008. С. 28-29.

10. Дорожко Е.В., Драчева JI.B., Аврамчик O.A. Изучение антиоксидантной активности пропионовокислых бактерий // Журнал Пищевая промышленность № 2. 2009. С. 12-13.

П.Плотников Е.В., Короткова Е.И., Дорожко Е.В., Букель М.В., В. Линерт В. Исследование суммарной антиоксидантной активности сыворотки крови человека в норме и патологии алкоголизма методом вольтамперометрии // Заводская лаборатория, №12. 2009. С. 12-16.

12.КоротковаЕ.И., Плотников Е.В., Дорожко Е.В., Букель М.В. Разработки по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем с участием научных организаций Австрии // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП « Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» Сборник тезисов, 6-7 декабря 2009. С. 218-219.

13. Дорожко Е.В., Короткова Е.И. Исследование электрохимических свойств глутатиона методом вольтамперометрии // Известия ВУЗов. Химия и химическая технология. Т 53 (2). 2010. С.118-124.

Автор считает своим долгом выразить искреннюю признательность научному руководителю - д.х.н., доценту кафедры ФАХ, НИ ТПУ Коротковой Елене Ивановне за всестороннею помощь при подготовке и написании диссертационной работы, а также д.х.н., профессору каф. Экологии и безопасности жизнедеятельности, НИ ТПУ Романенко C.B. за помощь в постановке рада экспериментов и консультации по использованию программы ASSAER, к.х.н., доценту каф. ФАХ, НИ ТПУ Пикуле Н.П. за консультации по расчету качественных метрологических показателей МВИ, также хочется поблагодарить за внимательное отношение и конструктивные предложения по работе д.х.н., проф., НИ ТПУ Колпакову H.A., к.х.н. доцента НИ ТПУ Гиндуллину Т.М.

Подписано к печати 02.11.10. Бумага офсетная. Печать RISO. Формат 60x84/16. Тираж 110 экз. Заказ № 38-0179 Центр ризографии и копирования. Ч/П Тисленко О.В. Св-во №14.263 от 21.01.2002 г., пр. Ленина, 41, оф. № 7а.

Условные обозначения и сокращения

Введение

ГЛАВА 1. Литературный обзор

1.1. Свойства и биологическая роль тиоловых соединений

1.1.1. Глутатион

1.1.2. Цистеин

1.1.3. Метионин

1.1.4. Липоевая кислота

1.2. Методы определения тиоловых соединений

1.2.1. Спектральные методы

1.2.2. Электрохимические методы 29 1.2.1. Хроматографические методы

1.3. Методы исследования комплексообразования веществ

1.3.1. Методы, основанные на измерении коллигативных свойств

1.3.2. Оптические методы

1.3.3. Методы ЯМР и ЭПР

1.3.4. Методы, основанные на исследования ионного обмена

1.3.5. Электрохимические методы

1.4. Методы исследование комплексообразования тиоловых соединений с ионами металлов

1.5. Методы определения антиоксидантной активности биологически-активных веществ

ГЛАВА 2. Экспериментальная часть

2.1. Аппаратура, ячейки, электроды

2.2. Реактивы

2.3. Объекты исследования

2.4. Методы исследования

2.4.1 Исследование электрохимических свойств тиоловых соединений

2.4.2 Вольтамперометрический метод определения антиоксидантной активности тиоловых соединений

2.4.3. Приготовление сыворотки крови

ГЛАВА 3. Исследование физико-химических закономерностей окисления-восстановления тиоловых соединений

3.1 Исследование электрохимических свойств тиоловых соединений

3.1.1. Исследование электрохимических свойств глутатиона

3.1.2. Исследование электрохимических свойств цистеина, липоевой кислоты и метионина

3.2. Определение констант устойчивости и состава комплексов глутатион-ртуть методами потенциометрии и спектрофотометрии

3.2.1 Исследование комплексообразования системы ртуть-глутатион методом потенциометрии

3.2.2. Исследование комплексообразования системы ртуть-глутатион методом спектрофотометрии

3.3. Исследование предположитьельного механизма оксиления- восстановления глутатиона на РПЭ

3.4. Исследование параметров адсорбции глутатиона на РПЭ

ГЛАВА 4. Исследование антиоксидантных свойств тиоловых соединений вольтамперометрическим и спектрофотометрическим методами

ГЛАВА 5. Метрологические аспекты методики определения суммарного содержания тиоловых соединений в объектах искусственного и природного происхождения

5.1. Разработка и подготовка В А методики определения суммарного содержания тиоловых соединений в объектах искусственного и природного происхождения

5.2. Определение суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека методами вольтамперометрии и спектрофотометрии.

Сравнительные определения

ВЫВОДЫ

Биологически-активные серусодержащие соединения (БАСС), такие как глутатион, цистеин, метионин, липоевая кислота, содержащие тиоловые группы (БН-группы) играют важную роль в физиологических и биохимических процессах в организме человека и животных. Особую роль тиоловым соединениям отводят при рассмотрении их в качестве компонентов неферментативного звена антиоксидантной защитной системы организма наряду с мочевой, аскорбиновой кислотами, хинонными формами токоферола [1]. Присутствующие в организме тиоловые соединения в первую очередь подвергаются действию активных кислородных радикалов, что предохраняет от их действия функциональные группы биологических молекул и клеточных мембран. Другим важным свойством тиоловых соединений является их способность образовывать комплексные соединения с ионами металлов , Сс1~ , N1" ,Си~ ) [2]. Это позволяет защищать организм от токсичного действия «тиоловых ядов». Поэтому, уровень суммарного содержания тиоловых соединений в биологических объектах может выступать в качестве показателя оксидативного стресса и детоксикации организма.

Исследование серусодержащих соединений имеет и диагностическую ценность, например определение содержания сульфгидрильных групп в сыворотке крови у больных с заболеваниями центральной нервной системы показало зависимость их уровня от вида заболевания (опухолевые, воспалительные) и его активности [3]. Активность патологического процесса при заболеваниях печени, в частности при циррозах, соответствует снижению содержания сульфгидрильных групп в сыворотке крови по сравнению с нормой [4]. Эффективно проводимая терапия и достижение ремиссии при этих заболеваниях сопровождаются повышением уровня свободных сульфгидрильных групп.

На основе серусодержащих соединений создан целый ряд синтетических антиоксидантов для защиты клеток от окислительного стресса; радиопротекторов; лекарственных препаратов, применяемых при терапии атеросклероза, ишемической болезни сердца, интоксикации [5]. На сегодняшний день, в качестве БАД, выпускаются глутатион, метионин, Ь-цистеини а-липоевая кислота, применение которых рекомендуется при профилактики и лечении многих заболеваниях.

Существует ряд методов определения тиоловых соединений как в биологических объектах, так и в объектах искусственного происхождения. Основными из них являются: оптические методы (флуориметрические и колориметрические), методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и некоторые электрохимические методы (амперометрическое и потенциометрическое титрование). Сложность методик, ограниченный круг анализируемых объектов, недостаточная чувствительность методов, использование дорогостоящих реактивов и аппаратуры не позволяют использовать их в медицинской экспресс-диагностике. Поэтому разработка новых чувствительных, доступных и экспресных методик для определения тиоловых соединений в биологических объектах является актуальной задачей, от решения которой зависит оценка окислительных процессов и детоксикации организма в диагностических целях.

В данной работе в качестве метода суммарного определения тиоловых соединений в объектах природного и искусственного происхождения предлагается использовать простой в аппаратурном оформлении, экспрессный и высокочувствительный метод вольтамперометрии, имеющий большие потенциальные возможности в области электроаналитической химии.

Цель работы: Исследовать физико-химические закономерности окисления-восстановления ряда серусодержащих соединений (глутатиона, цистеина, метионина, липоевой кислоты) с целью разработки 7 вольтамперометрической методики определения суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие / задачи: г!

I 1. Исследовать электрохимические свойства ряда тиоловых соединений глутатиона, цистеина, метионина, липоевой кислоты) в зависимости от ряда факторов (природы фонового электролита, рН раствора, наличия ионов металлов, материала электрода).

2. Рассмотреть закономерности процесса комплексообразования между ионами ртути (I), (II), меди (И) с глутатионом. Определить состав и константы устойчивости комплексов Н§(08)2 и Н^2(08)2 методами потенциометрии, спектрофотометрии. Исследовать физико-химические закономерности окисления-восстановления глутатиона, цистеина, метионина, липоевой кислоты на ртутно-пленочном электроде.

3. Используя метод катодной вольтамперометрии и процесс электровосстановления кислорода, исследовать антиоксидантные свойства ряда серусодержащих соединений для выяснения их роли в механизмах взаимодействия с кислородом и его активными радикалами.

4. Разработать вольтамперомтерическиую методику количественного химического определения суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека. Провести оценку метрологических характеристик методики. Провести сопоставление результатов определения суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека методами спектрофотометрии и вольтамперометрии.

Научная новизна.

Впервые установлены закономерности окисления-восстановления глутатиона на платиновом электроде (Р1Э) в присутствии ионов ртути (II), стекло-углеродном электроде (СУЭ) в присутствии ионов меди (II) методом циклической вольтамперометрии. Показано, что ионы ртути Н^ (II) образуют 8 устойчивые комплексы с глутатионом. Определены потенциалы катодных и анодных пиков цистеина, метионина и липоевой кислоты на РПЭ. Предложены схемы окисления-восстановления тиоловых соединений в присутствии ионов металлов.

Впервые исследованы составы комплексов Н£(С8)2 и Н§2(С8)2, определены их константы устойчивости методами потенциометрии и спектрофотометрии.

Впервые исследована антиоксидантная активность (АОА) ряда тиоловых соединений (глутатиона, цистеина, метионина, липоевой кислоты) методом катодной вольтамперометрии с использованием процесса электровосстановления кислорода. Предложены схемы взаимодействия тиоловых соединений с кислородом и его радикалами.

Впервые разработан новый подход к определению суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека, используя метод вольтамперометрии, отличающийся высокой чувствительностью, простотой, экспрессностью и удобством анализа. Проведено сопоставление результатов анализа независимым спектрофотометрическим методом.

Практическая значимость.

Разработана вольтамперометрическая методика количественного химического определения суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека. Проведено суммарное содержание тиоловых соединений в сыворотке крови человека в норме и при патологии алкоголизма, используя вольтамперометрическую методику.

Доступность и простота приборного оформления, минимальная пробоподготовка дают возможность использования данной методики для медицинских исследований в контроле над эффективностью лечения и профилактики оксидативного стресса и детоксикации организма в клинической практике.

Проведена оценка антиоксидантной активности ряда тиоловых соединений по отношению к процессу электровосстановления кислорода. Полученные результаты позволили выявить наиболее активные антиоксиданты из ряда тиоловых соединений и дать рекомендации для их дальнейшего использования.

Определены оптимальные условия определения глутатиона в объектах искусственного происхождения на СУЭ в присутствии ионов меди (И) на уровне концентрации 1.0-1 (Г9 моль/л и Р{ электроде в присутствии ионов ртути (II) на уровне концентрации 1.0-10"4 моль/л. Результаты и положения, выносимые на защиту:

1. Результаты оценки влияния природы фонового электролита, рН раствора, наличия ионов металлов, материала электрода на электрохимические свойства ряда тиоловых соединений (глутатион, цистеина, метионина, липоевой кислоты) в модельных растворах.

2. Методом потенциометрии установлен состав комплексов Щ(СЗ)2 и Н£2(08)2, определены их константы устойчивости 1пр2=88,4 и 1пр2=36,0.

3. Результаты определения антиоксидантной активности ряда тиоловых соединений с использованием процесса электровосстановления кислорода методом катодной вольтамперометрии.

4. Результаты определения суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека в норме и патологии методами спектрофотометрии и вольтамперометрии.

Достоверенность полученных результатов:

1. Проведено сопоставление результатов по определению состава комплексов Н£(08)2 и Н§2(С8)2, полученных методом потенциометрии с методом спектрофотометрии. Результаты сопоставимы между собой.

2. Проведено сопоставление результатов по определению антиоксидантной активности ряда тиоловых соединений методом вольтмперометрии с методом спектрофотометрии. Результаты, полученные двумя методами, коррелируют между собой. 3. Проведено сопоставление результатов по определению суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека в норме и патологии методами спектрофотометрии и вольтамперометрии. Результаты, полученные двумя методами, коррелируют между собой. Апробация работы. Основные результаты работы представлены устными и стендовыми докладами на российских и международных конференциях и симпозиумах: на международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (г.Тюмень 12-16 сентября, 2005г), на международной конференции «ЗНАКАХ, УТ1СА» (г. Иерусалим, Израиль, 2006г.), на Всероссийской научной конференции с международным участием «Электроаналитика 2005» (Екатеренбург 23-27 мая, 2005г.), на международном конгрессе по аналитической химии «1СА8-2006» (г. Москва, 2006г), на VII всероссийская конференция по электрохимическим методам анализа с международным участием (г.Москва, 2008г), на Международной научно-практическаой конференция «Биотехнология» (г. Москва, 2008), на Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП « Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (г. Москва, 2009г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и тезисы 9 докладов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям по Федеральной целевой программе (ФЦП)

РФ: Государственный контракт № 02.512.11.2174 (2007-2008гг),

Государственный контракт № 02.512.11.2282 (2009-2010гг) Тема:

Разработка анализатора для определения антиоксидантов в биологических

11 объектах», гранта Российского Фонда Фундаментальных Исследований № 07 - 08 - 00227 - а (2007-2009гг) Тема: «Разработка новых автоматизированных комплексов по определению антиоксидантов в объектах».

Автор, выражает глубокую признательность и благодарность за совместное проведение исследований и обсуждение результатов работы проф. д.м.н. Н.В. Чердынцевой (НИИ онкологии СО РАМН г. Томск), д.х.н., проф. A.A. Бакибаеву (ТПУ г. Томск), проф., д.х.н. H.A. Колпаковой за помощь в обсуждении результатов работы.

Личный вклад автора состоял в постановке и решении основных задач, проведении экспериментальных, исследований в области исследования физико-химических закономерностей окисления-восстановления тиоловых соединений, вольтамперомтерического определения их антиоксидантной активности, разработке методики определения суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека, интерпретации и анализе полученных результатов.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 166 страницах, содержит 11 таблиц, 42 рисунка и библиографию из 213 наименований. Работа состоит из введения, семи глав, выводов, списка литературы и приложений.

выводы

1. Исследованы электрохимические свойства глутатиона, цистеина, метионина, липоевой кислоты в зависимости от материала электрода, природы фонового электролита, рН раствора, наличия ионов металлов. Показано, что оптимальными условиями определения тиоловых соединений являются рН 9.18, фоновый электролит: боратный буфер, использование РПЭ.

2. Исследованы физико-химические закономерности восстановления глутатиона, цистеина, метионина, липоевой кислоты на РПЭ. Показано, что ионы металлов (Н^ (II), Си (II)) образуют устойчивые комплексы с глутатионом. Предложены схемы окисления - восстановления тиоловых соединений в присутствии изученых ионов металлов.

3. Исследованы составы комплексов и определены константы устойчивости комплексов Н§(08)2 и Н^2(08)2 методами потенциометрии и спектрофотометрии.

4. Исследованы антиоксидантные свойства глутатиона, цистеина, метионина, липоевой кислоты методом катодной вольтамперометрии с использованием процесса электровосстановления кислорода. Предложены схемы взаимодействия тиоловых соединений с кислородом и его радикалами. Проведены сравнительные определения антиоксидантных свойств тиоловых соединений методом спектрофотометрии. Выявлены наиболее активные соединения.

5. Разработана вольтамперомтерическая методика количественного химического определения суммарного содержания тиоловых соединений в сыворотке крови человека. Проведены корреляционные исследования результатов определения тиоловых соединений в сыворотке крови человека в норме и патологии алкоголизма методами спектрофотометрии и вольтамперометрии.

1. Fox R.B. Prevention of granulocyte-mediated oxidant lung injury in rats by a hydroxyl radical scavenger, dimethylthiourea // J. Clin. 1.vest. — 1984. - V. 74. — P. 1456-1464.

2. Orrenius S., McConkey D.J., Nicotra P. Mechanisms of oxidant-induced cell damage // Oxy-Radicals in Molecular Biology and Pathology. 1988. - V. 64. - P. 327-339.

3. Мороз Л.А. Роль серосодержащих соединений в патогенезе и лечении хронических неспецифических заболеваний // Вопросы клинической лабораторной диагностики. 1973 - № 12 — С. 133-136.

4. Плаксина Г.В. Новое в диагностике наследственных и приобретенных заболеваний печени // Вопросы клинической лабораторной диагностики. — 1973. -Т. 34. № 15. - С. 140-142.

5. Sies Н. Oxidative stress From basic research to clinical application // Am. J. Med. - 1991. - V .91. - № 5. - P. 32-38.

6. Stefek M., Benes L. Pyridoindole stobadine is a potent scavenger of hydroxyl radicals // FEBS Lett. 1991. -V. 294. - P. 264-266.

7. Arnold J., Hammerschmidt S., Arnold K. Role of functional groups of human plasma and luminal in scavenging of NaCI and neutrophil-derived hypochlorous acid//Biochim. Biophys. Acta. 1991. -V. 1097. - P. 145-151.

8. Kanofsky J.R. Quenching of singlet oxygen by human plasma // Photochem. Photobiol. 1990. - V. 51.-№32-P. 130-303.

9. Wayner D. M., Burton G.W., Ingold K.U. The relative contribution of vitamin E, urate, ascorbate, and proteins to the total peroxyl radical-trapping antioxidant activity of human blood plasma // Biochim. Biophys. Acta. 1987. -V. 924.-P. 408^19.

10. Hainan G.R. M.M., Bast A. Scavenging of hypochlorous acid by both reduced and oxidized lipoate // Pharm. Weekbl. Sci. Ed. 1992. -V. 14, suppl.B. — P. 6-12.

11. Pryor W.A., Church D.F., Govindan C.K., Crank G. Oxidation of thiols by nitric oxide and nitrogen dioxide: synthetic utility and toxicological implications // J. Org. Chem. 1982. - V. 47. - P. 156-159.

12. Биленко M.B. Ишемические и реперфузионные повреждения органов и тканей. М.: Медицина, 1989. - 368 с.

13. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспецифической реакции организма на экстремальное воздействие (Обзор) // Вопросы медицинской химии. 1988. - № 6. - С. 2-11.

14. Fliss H., Menard M. Oxidant-induced mobilization of zink from metallothionein // Arch. Biochem. Biophys. 1992. -V. 293. - P. 195-199.

15. Чеботарев E.E., Барабой B.A., Дружина H.A. Окислительные процессы при гамма-нейтронном облучении организма. Киев: Наук. Думка, 1986. — 216с.

16. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. JL: Наука, 1985. - 234 с.

17. Кулинский В.И., Колесниченко JI.C. Биологическая роль глутатиона // Успехи современной биологии 1990. - Т. 110. - № 1. - С. 20-33.

18. Sohal R.S. The free radical hypothesis of aging // Aging. Clin. Exp. Res. -1993.-V. 5.-№ l.-P. 3-17.

19. Meister A., Tate S.S. Annual Review of Biochemistry // Journal of Biological Chemistry. 1976. - V. 45. - № 1. - P. 559-604.

20. Колисниченко Л.С., Кулинский В.И. Глутатионтрансферазы // Успехи современной биологии. 1989. - Т. 107. - № 2. - С. 179-194.

21. Carvalho F.D., Remiao F, Vale P. Glutathione and cysteine measurement in biological samples by HPLC with a glassy carbon working detector // Biomed. Chromatogr. 1994. -V. 8. - P. 134-136.

22. Yim C.-Y., Hibbs J.B., McGregor J.R. Use of N-acetyl cysteine to increase to increase intracellular glutathione during the induction of antitumor responses by IL-2//J. Immunol. 1994.-V. 152.-P. 5796-5805.

23. Кулинский В .И., Колесниченко JI.C. Обмен глутатиона // Успехи биологической химии. 1990. - Т. 31. - С. 157-179.

24. Hirayama К., Yasutake A., Inoue М. Effect of oxidative stress interorgan metabolism of glutathione. Medical, Biochcmical and Chemical Aspects of Free Radicals. Amsterdam: Elsevier, 1989. - 559-562 p.

25. Freedman J.H., Ciriolo M.R., Peisach J. The role on glutathione in copper metabolism and toxicity // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 5598-5605.

26. Poot M. Oxidants and antioxidants in proliferative senescence // Mutat. Res. 1991.-V. 256.-P. 177-189.

27. Droge W, Schulze-Osthoff K., Mihm S. Functions of glutathione and glutathione disulfide immunology and immunopathology // FASEB J. 1994. -V. 8.-P. 1131-1138.

28. Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты. Тюмень: Изд-во Тюменского гос. ун-та, 1997.-34 с.

29. Хайлова JI.C., Юркевич А. М., Северин С. Е., Коферменты // Под ред. Яковлева В.А.- М.: Химия, 1973. 256 с.

30. Меныцикова Е.Б., Панкин В.З., Зенков Н.К. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: Слово, 2006. - 349 с.

31. Cross J.V., Templeton D.J. Thiol oxidation of cell signaling proteins: Controlling an apoptotic equilibrium // J. Cell. Biochcm. 2004. - V. 93. -P. 104-111.

32. Кулинский В.И., Колисниченко JI.C. Биологическая роль цистеина // Успехи современной биологии. 1991. -Т. 112. -№ 1. -С. 112-145.

33. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Природные антиоксиданты // Успехи химии. 1985.-Т. 54.-С. 1540-1558.

34. Bullock M. W. The synthesis of (7?)-(+)-lipoic acid using a monooxygenase-catalysed biotransformation as the key step // J. Amer. Chem. Soc. 1952. - V. 74. -P. 3455-3462.

35. Березов T.T., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия // Под ред. С.С. Дебова. М.: Медицина, 1982. - 750 с.

36. Основы биохимии // Под ред. A.A. Анисимова. М.: Высшая школа, 1986.-551 с.

37. Храмилин В.Н., Демидова И.Ю., Рагозин А.К. Перспективы клинического применения альфа-липоевой кислоты // Consilium medicum. -2001.-T. 3.-№ 11.-С. 12-18.

38. Барабой В. А., Брехман И.И., Голоткин В.Г., Кудряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. Санкт-Петербург: Наука, 1992. - 292 с.

39. Ланкин В.З. Тихазе А.К., Каминный А.И., Беленков Ю.Н. Антиоксиданты и атеросклероз: Критический анализ проблемы и направление дальнейших исследований // Журнал Патогенез. 2004. - № 1. — С. 71-86.

40. Тарасов Н.И., Тепляков А.Т., Малахович Е.В. Состояние перекисного оксиления липидов, антиоксидантной защиты крови у больных инфарктом миокарда, отягощенным недостаточностью кровообращения // Терапевтический архив. 2002. -№ 12. - С. 12-15.

41. Ефимов A.C., Науменко В.Г., Перекисное окисление липидов в эритроцитах больных сахарным диабетом с диабетическими ангиопатиями // Проблемы эндокринологии. 1985. - № 1. - С. 6-9.

42. Козлов Г.С, Балаболкин М.И, Буйдина Т.А. Возможности инсулиновой коррекции некоторых метаболических сдвигов при инсулинозависимомсахарном диабете //В кн: Хирургические заболевания и сахарный диабет. — М.:Наука, 1989.-56 с.

43. Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза // Под ред. Органова Р.Г. М.: Наука, 2006. - 267 с.

44. Ziegler D., Hanefeld М., Ruhnau К.J., Grics F.A. Study Group. Treatment of symptomatic peripheral neuropathy with the antioxidant a-lipoic acid // Diabetologia. 1995. - V. 38. - P. 1425-1433.

45. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. -V. 82.-P. 70-81.

46. Asaoka K., Takahashi K. An enzymatic assay of reduced glutathione using glutathione S-aryltransferase with o-dinitrobenzene as a substrate // J. Biochem. — 1981.-V. 90.-P. 1237-1242.

47. Bernt E., Bergmeyer H.U. Glutathione // Methods of enzymatic Analysis. -1974.-V. 4.-P. 1643-1649.

48. Рожнова О.И., Котова Д.Л., Селсменев В.Ф., Крысанова Т.А. Спектрофотометрическое определение цистеина в водном растворе // Журн. аналит. химии. 1999. - Т. 54. -№ 12.-С. 1265-1267.

49. Dimas A.M., Zaia D.A.M., Kelly C.L., Ribas and Cassia T.B., Zaia K.C.I.

50. Spectrophotometric determination of cysteine and/or carbocysteine in a mixture of151amino acids, shampoo, and pharmaceutical products using /?-benzoquinone // Talanta. 1999.-V. 50. -№ 5.-P. 1003-1010.

51. Teshima Norio, Nobuta Takuya, Kawashima Takujl. Utilization of a copper catalysis for the spectrophotometric determination of cysteine // Bunseki Kagaku. -2001.-V. 5. — № l.-P. 47-51.

52. Thomas A. LaRue. Spectrophotometric determination of methionine with pentacyanoaminoferrate // Anal. Biochem. 1965. - V. 10. -№ l.-P. 172-174.

53. Ferreira A.V., Van der Merwe H.J., Slippers S.C. Spectrophotometric determination of maleyl-DL-methionin // Small Ruminant Research. 1996. — V. 22.-P. 79-83.

54. Shankaran D.R., Narayanan S.S. Mechanically immobilized copper hexacyanoferrate modified electrode for electrocatalysis and anpermetric determination of glutathione // J. Bull. Korean Chem. Soc. 2001. - V. 22 - № 8. -P. 816-820.

55. Ricci F., Arduini F., Amine A., Sozzo U., Moscone D., Palleschi G. Modified screen printed electrodes for glutathione detection // Symposium S7-03. Euroanalysis 13. - 2004. - P. 1140.

56. Будников Г.К., Зиятдинова Г.К., Валитова Я.Р. Электрохимическое определение глутатиона // Журн. аналит. химии. — 2004. — Т. 59. — № 6. — С. 645-648.

57. Seymour Е.Н., Wilkins S.J., Lawrence N.S., Compton R.G. Electrochemical detection of glutathione: an electrochemically initiated reaction pathway // Anal. Lett. 2002. - V. 35. - № 8. - P. 23-30.

58. Yang Shu-Tao, Gan Nan-Qin, Lin Zhi-Xin, Cai Ru-Xiu. Electrochemical detechion of glutathione Л Chem. J. Chin. Univ. 2002. - V. 23. - №6. -P. 1026-1031.

59. Wenrui J., Wei L., Qiang X. Capillary zone electrophoresis with electrochemical detection for the determination of glutathione' in human red bloodcells without preseperation of hemoglobin // J. Chrom. Sci. 2000. — V. 38. — № 12.-P. 545-549.

60. Ricci F., Arduini F., Tuta C.S., Sozzo U., Moscone D., Amine A., Palleschi G. Glutathione ampermetric detection on a tiol-disulfide exchange reaction // Anal. Chim. Acta. 2006. - V. 558. - P. 164-170.

61. Dursun Z., Sahbaz I., Nil Ertas F., Nisli G. Voltammetric and flow injection amperometric determination of cysteine at a glassy carbon electrode in the presence of copper (II) ions // Turk J. Chem. 2003. - V. 27. -P. 513-519.

62. Шайдорова JI.Г., Зиганшина С. А., Г.К. Будников. Электрокаталитическое окисление цистеина и цистина на угольно-пастовом электроде, модифицированном оксидом рутения (IV) // Журн. аналит. химии. -2003.-Т. 58.-№6.-С. 640-645.

63. Shidong Fei, Jinhua Chen, Shouzhuo Yao. Elecrochemical behavior of L-cysteine and its detection at carbon nanotube electrode modified with platinum // Anal. Biochem. 2005. -V. 339. - P. 29-35.

64. Kyriacou D. Rapid Voltammetric Determination of Methionine with a Platinum Electrode // Nature. 1966. - V. 211. - P. 519-521.

65. Lypez Fonseca J.M. and Arredondo M.C. Polarographic determination of methionine by measurement of the nickel(II) catalytic pre-wave // Analyst. 1982. - № 107.-P. 903-907.

66. Tan W.T., Goh J.K. Electrochemical Oxidation of Methionine Mediated by a Fullerene-Ceo Modified Gold Electrode // Electroanalysis. 2009. - V. 20. -№22.-P. 187-191.

67. Tian Fang Kang and Yin Yu Shi. Determination of lipoic acid using semi(aнaлoгo)-differential cathodic stripping voltammetry in the presence of copper(II) // Analyst. 1994. - V. 119. - P. 1067-1070.

68. Зиятдинова Г.К., Григорьева JT.B., Будников Г.К. Электрохимическое определение унитиола и липоевой кислоты на электродах, модифицированных углеродными нанотрубками // Журн. анал. химии. -2006. Т. 52. - № 4. - С. 45-49.

69. Sitton A., Schmid M.G., Giibitz G., Hassan Y. Aboul-Enein. Determination of lipoic acid in dietary supplement preparations by capillary electrophoresis // J. of Biochem. and Biophysic. Methods. 2004. - V. 61. - № 2. - P. 119-124.

70. Murayama K., Kinoshita T. Determination of glutathione on HPLC using N-chlorodanasyl-amide (NCDA) // Anal. Lett. 1981. -V. 14B. - P. 379-384.

71. Anderson M.E. Tissue glutathione // Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. Boca Raton: CRC Press, 1986. 317 p.

72. Xinjian Huang, Th. Kok W. Determination of Cysteine and N-Acetylcysteine in Urine by Liquid Chromatography with Indirect Amperometric

73. Detection // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. — 1991. — V. 14.-№ l.-P. 2207-2221.

74. Araki A., Sako Y. Determination of free and total homocysteine in human plasma by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection // Anal. Biochem. 1992. - V .2. - P. 218-29.

75. Cole D.E. C., Lehotay D. C. Simplified Simultaneous Assay of Total Plasma Homocysteine and Methionine by HPLC and Pulsed Integrated Amperometry // Clinical Chemistry. 1998. -V. 44. - P. 188-190.

76. Amara A., Coussemacq M., Geffard M. Molecular detection of methionine in rat brain using specific antibodies // Neuroscience Lette. 1995. - V. 85 -№ 13.-P. 147-150.

77. Hajyehia A.I., Katzhendler Nassar T. Determination of lipoic acid and dihydrolipoic acid in human plasma and urine by high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection // J. Chromatogr. Anal. 2000. -V. 870.-№ 1, P. 381-386.

78. Soichiro S., Toshimasa T., Takeshi F., Shinsuke I. Simultaneous determination of alpha-lipoic acid and its reduced form by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection // Journal of chromatography. B,

79. Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 2007. - V. 854. -P. 109-117.

80. Teichert J., Preiss R. Determination of lipoic acid in human plasma by highperformance liquid chromatography with electrochemical detection // J. Chromatography. 1995. - V. 672. -№ 2. - P. 277-281.

81. Andreas Mattulat and Werner Baltes. Determination of lipoic acid in meat of commercial quality // Zeitschrift fur Lebensmitteluntersuchung und -Forschung A. 1992.-V. 194 -№ 4. — P. 326-329.

82. Kataoka Hiroyuki, Hirabayashi Noritoshi, Makita Masami. Vitamins and Coenzymes // Trends in Analytical Life Sciences. 1997. - V. 1- № 1. - P. 6369.

83. Jason С. H. Shih and Scott C. Steinsberge. Determination of lipoic acid in chick livers and chicken eggs during incubation // Anal. Biochm. 1981. - V. 116. -№ 1 - P. 65-68.

84. Bjerrum J., Schwarzenbach G., Sillen L.G. Stability Constants, Part I, Organic Ligands, part II, Inorganic Ligands. London: Chemical Society, 1957. -169 p.

85. Martell A.E., Smith R.M. Critical Stability Constants. Plenum Press, 1977. -254 p.

86. Бек M., Надьпал И. Исследование комплексообразования новейшими методами. М.: Мир, 1989. - 405 с.

87. Souchay P., Research P. The Nature of Inorganic Solute Species in Water // Advances in Chemistry. 1967. -V. 4. - № 11. - P. 234-245.

88. Kenttamaa J. A Cryoscopic Study of Ionic Association in Bivalent Metal Sulphates using Saturated Aqueous Solutions // Acta Chem. Scand. 1958. -V. 12.-P. 1323-1328.

89. Rossotti F.J.C., H.S.J. Rossotti H.S.J. Dissociation constants of inorganic acids and bases in aqueous solution // Phys. Chem. 1954. - V. 63. - P. 1041— 1057.

90. Jensen J.B. Potentiometric study of imidazole complexation withproton, Co(II), Ni(II), Cu(II), Zn(II), Cd(II) ions under physiological conditions // Acta Chem. Scand. — 1972. — V. 26.-P. 4031^1038.

91. Csaszar J., M. Ban. Optical spectra, ligand field theory, complex structure (in Hungarian). Akademiai Kiado: Budapest, 1972. - 234 p.

92. Nakamoto K., McCarthy P.J. Spectoscopy and Structure of Metal Chelate compounds. New York, London: Sidney, 1968. — 234 p.

93. Figges B.N. Inroduction to ligand fields // John Wiley & Sons Ltd. London and New York, 1966. 361 p.

94. Ostromisslensky J. Determination of the composition of metal complexes // Trans. Farad. Soc. 1911. - V. 44. - P. 268-272.

95. Denisov R.B. Structure-sensitive transition between Euclid and fractal form of Luders bandTrans // Farad. Soc. 1912. - V. 8. - P. 20-27.

96. Job P. Calculation of the equilibrium constants // Anal.Chim. Phys. 1928. -V. 9.-P. 113-124.

97. Булатов М.И., Калинкин М.П. Практическое руководство по фотоколориметрическим и спектрофотометрическим методам анализа. М.: Химия, 1986.-432 с.

98. Шлефер Г.Л. Комплексообразование в растворах. М.-Л.: Химия, 1964. -380 с.

99. Поил Д., Шнейдер В., Бернстейн Г. Спектры ядерного магнитного резонанса высокого разрешенияю М.: ИЛ, 1962. - 232 с.

100. Эмсли Д., Финей Л., Сатклифф Д. Спектры ядерного магнитного резонанса высокого разрешения. T.l. -М.: Мир, 1968. — 132 с.

101. Абрагам А., Блини Б. Электронный парамагнитный резонанс переходных ионов. М.: Мир, 1972. - 332 с.

102. Керрингтон А., Мак-Лечлан Э. Магнитный резонанс и его применение в химии. М.: Мир, 1970. - 426 с.

103. Jensen J.B. Potentiometric study of imidazole complexation withproton, Co(II), Ni(II), Cu(II), Zn(II), Cd(II) ions under physiological conditions // Acta Chem. Scand. 1972. - V. 26. - P. 4031^1038.

104. Csaszar J., M. Ban. Optical spectra, ligand field theory, complex structure (in Hungarian). Akademiai Kiado: Budapest, 1972. - 234 p.

105. Nakamoto K., McCarthy P.J. Spectoscopy and Structure of Metal Chelate compounds. New York, London: Sidney, 1968. — 234 p.

106. Figges B.N. Inroduction to ligand fields // John Wiley & Sons Ltd. London and New York, 1966. 361 p.

107. Ostromisslensky J. Determination of the composition of metal complexes // Trans. Farad. Soc. 1911. - V. 44. - P. 268-272.

108. Denisov R.B. Structure-sensitive transition between Euclid and fractal form of Luders bandTrans // Farad. Soc. 1912. - V. 8. - P. 20-27.

109. Job P. Calculation of the equilibrium constants // Anal.Chim. Phys. 1928. -V. 9.-P. 113-124.

110. Булатов М.И., Калинкин М.П. Практическое руководство по фотоколориметрическим и спектрофотометрическим методам анализа. М.: Химия, 1986.-432 с.

111. Шлефер Г.Л. Комплексообразование в растворах. М.-Л.: Химия, 1964. -380 с.

112. Попл Д., Шнейдер В., Бернстейн Г. Спектры ядерного магнитного резонанса высокого разрешенияю М.: ИЛ, 1962. - 232 с.

113. Эмсли Д., Финей Л., Сатклифф Д. Спектры ядерного магнитного резонанса высокого разрешения. T.l. -М.: Мир, 1968. 132 с.

114. Абрагам А., Блини Б. Электронный парамагнитный резонанс переходных ионов. М.: Мир, 1972. - 332 с.

115. Керрингтон А., Мак-Лечлан Э. Магнитный резонанс и его применение в химии. М.: Мир, 1970. - 426 с.

116. Marcus Y. Ion Exchange // Marcell Dekker, New York, 1967. 101 c.

117. Inczedy J. Analytical applications of Ion Exchangers, Pergamon Press, Oxford, 1966. 126 c.

118. Lengyel Т., Torko J. Recent results in Chemistry (in Hungarian), Budapest, 1970.- 166 c.

119. Rossotti F.J., Whewell R.J. Critical evaluation of stability complexes constants // J. Chem. Soc. Dalton. 1977. -V. 34. - P. 1223-123.

120. R. J. Whewell, Ph. D.Thesis, oxford (1972).

121. Альберт А, Сержент E. Константы ионизации кислот и оснований М.-Л.: Химия, 1964.-232 с.

122. Schwarzenbach G.D. Die Komplexometrische. Titration. Schtutgart, 1956. - 184 с.

123. Palaty V. Sodium ion complexes with ethylenediaminetetraacetic acid // Can. J. Chem. 1975,-V. 41.-P. 118-124.

124. Mohan M.S., Rechnitz G.A. Ion-Electrode Study of the Calcium-Adenosine Triphosphate System // J. Am. Chem. Soc. 1982. - V. 94. - P. 1714-1724.

125. Leden I., Physik Z. Formation constants of complex species // Chem. Leipzig. 1941. - V. A188. - P. 160-169.

126. Schwarzenbach G., Anderegg G., Metal buffers as standards in direct potentiometric determination of metal ion activities // Helv. Chim. Acta. — 1941. — V. 40.-P. 1773-1789.

127. В.И. Кравцов В.И. Равновесие и кинетика электродных реакций комплексов металлов. Ленинград: Химия, 1985. - 207 с.

128. Irving Н. Advances in Polarography, Vol. 1. Oxford: Pergamon Press, 1960.-42 p.

129. Bond A.M. Investigation of the formation of complex by potentiometric titration // Chem. Rev. 1971. - V. 6. - P. 377-399.

130. Lingane J.J. Voltammetry of metal complexes // J. Chem. Rev., 29, 1 (1941).158

131. D.D. DeFord, D. N. Hume, J. Am. Chem. Soc. 1951. - V. 73. - P. 53215340.

132. Semiha Cakir, Ender Bicer, Osman Cakir, Binary and ternary complexes of Cu(llj ions with saccharin and cysteine // Electrochemistry Communications 2. — 2000.-V. 33.-P. 124-129.

133. Будииков Г.К. Электрохимические реакции хелатов металлов в органических и смешанных растворителях. Казань: Из-во Казанского университета, 1986.-256с.

134. Белоглазкина Е.К., Дубинина Н.С., Моисеева А.А., Зык Н.В., Комплексы Ni(II) с амино- и имино-циклогексилсульфидами. Синтез и электрохимическое исследование // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. — 2007.-Т. 33. -№ 3. С. 193-200.

135. Tamamushi R., Tanaka N. The Reduction of Indium(III) in Thiocyanate Solutions at the Dropping Mercury ElectrodeBull // Chem. Soc. Japan. 1949. -V. 22.-P. 227-232.

136. Ringbom A., Ericson L. Guidelines for the determination of stability constants // Chem. Scand. 1974. - V. 87. - P. 1105-1109.

137. Картушинская А.И., Стромберг А.Г., Колпакова H.A. Определение состава комплексов, непосредственно участвующих в электродном процессе, методом ППН // Электрохимия. 1971. - Т. 7. - № 9. - С. 1243-1248.

138. Matsuda Н., Anabe J. Slow Discharge and Electrochemical Mechanisms // J. Electrochem. 1959. - V. 63. - P. 1164-1172.

139. Стромберг А.Г., Попова JI.H. Разный механизм катодного и анодного процессов // Электрохимия. 1968. - Т. 4. -№. 9. - С. 1034-1038.

140. Stricks W., Kolthoff I. М. Polarography of glutathione // J.Am. Chem. Soc.- 1953. V. 75. - P. 5673-5679.

141. Shoukryb M., Cheesman U. and Rabenste D. Polarimetric and nuclear magnetic resonance studies of the complexation of mercury by thiols // Can. J. Chem. 1988.-V. 66.-P. 3184-3189.

142. Stary J., Kratzer K. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry. — 1988. V. 126. -№ 1. - P. 69-75.

143. Paul D. Oram, Xiaojun Fang, Quintus Fernando. The Formation Constants of Mercury(II)-Glutathione Complexes // Chem. Res. Toxicol. — 1996. — V. 9. — №4.-P. 709-712.

144. Semiha Cakir, Ender Bicer, Osman Cakir. Binary and ternary complexes of Cu(\\) ions with saccharin and cysteine It Electrochemistry Communications 2. — 2000.-V. 3.-P. 124-129.

145. Crow D.R. Polarography of Metal Complexes. — London: Academic Press, 1969.-59 p.

146. Hargis L.G. Analytical Chemistry: Principles and Techniques. Prentice-Hall: Englewood Cliffs, NJ, 1988. - 424 p.

147. Shetty P. and Shetty N. Rapid Complexometric Determination of Mercury(II) Using Glutathione as a Selective Demasking Reagent // Turk J Chem. 2004. - V. 28. - P. 573-577.

148. Heileen Hsu-Kim. Stability of Metal-Glutathione Complexes during Oxidation by Hydrogen Peroxide and Cu(II)-Catalysis // Environ. Sci. Technol. -2007. V. 41. - № 7. - P. 2338-2342.

149. Halliwell B. Antioxidant characterization. Methodology and mechanism. // Biochemical Pharmacology. 1995. - V. 49. - № 10. - P. 1341-1348.

150. Antolovich M., Prenzler P.D., Patsalides E., McDonald S., Robards K. Methods for testing antioxidant activity. // Analyst. 2002. -V. 127. - P. 183-198.

151. Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay // Free Radic. Biol. Med. 1999.-V. 26.-№9.-P. 1231-1237.

152. Магин Д.В., Измайлов Д.Ю., Попов И.Н., Левин Г., Владимиров Ю.А. Фотохемилюминесценция как метод изучения антиоксидантной активности в биологических системах. Математическое моделирование // Вопр. мед. химии 2000. - Т. 4, - № 2. - С. 62-68.

153. Ghiselli A., Serafmi A., Maiani G., Azzini Е., Ferro-Luzzi А. А fluorescence-based method for measuring total plasma antioxidant capability // Free Radic. Biol. Med. 1987. - V. 18.-№ l.-P. 29-36.

154. Krasovska A., Rosiak D., Czkapiak K.,. Lukaszewicz M. Chemiluminescence detection of peroxyl radicals and comparison of antioxydantactivity of phenolic compounds // Cur. Topics. Biophys. 2000. - V. 24. - P. 8995.

155. Benzie I.F., Strain J,J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of "antioxidant power": the FRAP assay // Anal. Biochem. 1996. — V. 239.-№ l.-P. 70-76.

156. Korotkova E.I., Karbainov Y.A., Avramchik О.А. Investigation of antioxidant and catalytic properties of some biologically active substances by voltammetry // Anal. Bioanal. Chem. 2003. - V. 375.-№ l.-P. 465-468.

157. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Связь физико-химических характеристик ингибиторов с их строением. Теория и практика жидкофазного окисления // М.: «Наука», 1975.-240 с.

158. Kasaikina О.Т., Kortenska V.D., Marinova Е.М. The inhibitory activity of natural phenolic antioxidants in the oxidation of lipid substrates // Russ. Chem. Bull. 1997. - V. 46. - № 6. - P. 1070-1073.

159. Хасанов В.В., Рыжова Г.Л., Мальцева Е.В. Исследование антиокислительных свойств соединений с использованием реакции окисления сульфита натрия // Химия раст. сырья 2004. -№ 3. - С. 77-85.

160. Valkonen М., Kuusi Т. Spectrophotometric assay for total peroxyl radical-trapping antioxidant potential in human serum // J. Lipid Res. 1997. - V. 38. -P. 823-833.

161. Владимиров Ю.А., Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., Азимбаев Т.К. Активированная кумарином хемилюминосценция липопротеидов низкой плотности в присутствии ионов двухвалентного железа // Биофизика 1992. — №37.-С. 1041-1047.

162. Владимиров Ю.А. Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как инструмент в медико-биологических исследованиях / Ю.А. Владимиров // Соросов, образов, журн. 2001. - Т. 7. - № 1. - С. 16— 23.

163. Лозовская Е.Л., Сапежинский И.И. Сравнительная эффективность некоторых медицинских препаратов как акцепторов супероксид-радикала // Биофизика 1993.-Т. 38.-С. 31-36.

164. Лозовская Е.Л., Сапежинский И.И. Сравнительная эффективность некоторых лекарственных препаратов как акцепторов супероксидных радикалов. // Биофизика. 1993. - Т. 38. -№ 1. - С. 31-36.

165. Арзамасцев А.П., Шкарина Е.И., Максимова Т.В., Пахомов В.П. и др. Оценка показателей антиоксидантной активности препаратов на основе лекарственного растительного сырья // Хим.-фарм. журн. 1999. - Т. 33.-№11.-С. 17-20.

166. Шарипов Г.Л., Казаков В.П., Толстиков Г.А. Химия и хемилюминесценция 1,2-диоксикетанов. М.: Наука, 1990. — 288 с.

167. Беляков В.А., Васильев Р.Ф., Федорова Г.Ф. Хемилюминесценция при окислении непредельных органических соединений в растворах. // Изв. АН СССР. Сер. Хим. 1983. - № 12. - С. 2709-2717.

168. Васильев Р.Ф., Наумов В.В., Федорова Г.Ф. Молекулярная хемилюминесценция липидов и ее влияние на определение активности антиоксидантов. Тезисы докладов IV Межд. конф. «Биоантиоксидант». — М.: 2002. С. 73-74.

169. Сао G., Alessio Н.М., Cutler R.G. Oxygen radical absorbing capacity assay for antioxidants // Free Radic. Biol. Med. 1993. - V. 14. - № 1. - P. 303-311.

170. Mayer В., Schumacher M. High-Throughput Fluorescence Screening of Antioxidative Capacity in Human Serum // Anal. Biochem. 2001. - V. 297. - № 2.-P. 144-153.

171. Hu Y.-L. A simple electrochemical method for the determination of hydroxyl free radicals without separation process // Talanta — 2007. — V. 74. — № 4.-P. 760-765.

172. Абдуллин И.Ф., Турова E.H., Будников Г.К. Кулонометрическая оценка антиоксидантной способности экстрактов чая электрогенерированным бромом. // Журнал аналит. химии. 2001. - Т. 56. - № 6. - С. 627-629.

173. Абдуллин И.Ф., Турова Е.Н., Будников Т.К., Зиятдинова Г.К., Гайсина Г.Х. Электрогенерированный бром — реагент для определения антиоксидантной способности соков и экстрактов. // Заводская лаборатория. -2002.-Т. 68.- №9. -С. 12-15.

174. Бумбер А.А., Корниенко И.В., Профатилова И.А., Внуков В.В., Корниенко И.Е., Гарновский А.Д. Полярографический метод в изучении антиоксидантной активности аминокислот и белков. // Журнал общей химии. -2001.-Т. 71. -№ 8. С. 1387-1390.

175. Hatano Т., Kagawa Н., Yasuhara Т., Okuda Т. // Chem. Pharm. Bull. — 1988. V. 36. - P. 2090-2097.

176. Chevion S., Roberts M.A., Chevion M. The use of cyclic voltammetry for the evaluation of antioxidant capacity // Free Rad. Biol. Med. 2000. — V. 28. -P. 860-870.

177. Ge В., Lisdat F. Superoxide sensor based on cytochrome С immobilized on mixed-thiol SAM with a new calibration method // Analytica Chimica Acta. -2002.-V. 454.-P. 53-64.

178. Chen J., Wollenberger U., Lisdat F., Ge В., Scheller F.W. Superoxide sensor based on hemin modified electrode // Sensors and Actuators B. 2000. - V. 70. -P. 115-120.

179. Lisdat F., Ge B., Reszka R., Kozniewska E. An electrochemical method for quantification of the radical scavenging activity of SOD // Fresenius J. Anal. Chem. 1999. - V. 365. - P. 494-498.

180. Ignatov S., Shishniashvili D., Ge B., Scheller F.W., Lisdat F. Amperometric biosensor based on a functionalized gold electrode for detection of antioxidants // Biosensors & Bioelectronics. -2002. V. 17.-P. 191-199.

181. Campanella L., Favero G., Persi L., Tomassetti M. New biosensor for superoxide radical used to evidence molecules of biomedical and pharmaceutical interest having radical scavenging properties // J. Pharm. Biomed. Anal. 2000. -V. 23.-P. 69-76.

182. Campanella L., Favero G., Persi L., Tomassetti M. Evaluation of radical scavenging properties of several plants, fresh or from a herbalist's, using a superoxide dismutase biosensor // J. Pharm. Biomed. Anal. 2001. - V. 24. -P. 1055-1064.

183. Chevion S. Free Redical Biology and Medicine. 2000. - № 28. - P. 860870.

184. Singh R., Whitesides G.M., Patai S. The Chemistry of Sulphur-containing Functional Group. John Wiley and Sons. UK:Chichester, 1993. — 82 p.

185. Reid R.S. and Rabenstein D.L. H-NMR study of the removal of methylmercury from intact erythrocytes by sulfhydryl compounds // Can. J. Chem. 1981.-V. 59.-P. 1505-1515.

186. Wandruszka von R., Yuan X. Determination of sulfur species by cathodic square wave stripping voltammetry; compounds relevant to natural sulfur mineralization // Talanta 1993. - V. 40 - P. 37-42.

187. Mladenov M., Mirceski V., Gjorgoski I., Jordanoski B. Redox kinetic measurements of glutathione at the mercury electrode by means of square-wave voltammetry. The role of copper, cadmium and zinc ions // Bioelectrochemistry. -2004.-V. 65.-P. 69-76.

188. Alvarez R.R., Henandez F. A simple electrochemical method for the determination of tiols // Anal. Biochem. 2006. - № 56. - P. 1267-1269.

189. Heyrovsky M., P. Mader P., S. Vavricka S. The anodic reactions at mercury electrodes due to cysteine // J. Electroanal. Chem. 1997. - V. 430. - P. 103-117.

190. Майрановский С.Г., Страдынь Я.П., Безуглый В.Д. Полярография в органической химии. — JL: Химия, 1975. — 256 р.

191. Химия органических соединений серы. М.: «Химия», 1975. 512 с.

192. Dursun Z., Sahbaz I., Ertas F. Nil, Nisli G. Voltammetric and flow injection amperometric determination of cysteine at a glassy carbon electrode in the presence of copper (II) ions //Turk. J. Chem. 2003. - V. 27. -P. 513-519.

193. Clevenger W.L., Winefordner J. D. Atomic Spectrometry update-advances in atomic absorption and fluorescence spectrometry and related techniques // Crit. Rev. Anal. Chem. 1997. - V. 27. -№ 1 - P. 513-519.

194. Emteborg H., Hadgu N. and Baxter D. C. Preliminary appraisal of a novel sampling and storage technique for the speciation analysis of lead and mercury in seawater // J. Anal. At: Spectrom.- 1994. V. 32. - № 9 - P. 106-112.

195. Puk R. and Weber J. H. Speciation of methylarsenic, methyl- and butyltin, and methylmercury compounds and their inorganic analogues by hydride derivatization // Appl. Organomet. Chem. 1994. - V. 8. - № 5 - P. 293-301.

196. Ramaswamy S.G. and Jakoby W.B. Study of enzyme kinetics of phenol sulfotransferase by electrophoretically mediated microanalysis // Methods Enzymol.- 1987.-V. 143.-P. 201-211.

197. Robert J.M. and Rabenstein D.L. Co-ordination chemistry of the methylmercury(II) ion in aqueous solution: a thermodynamic investigation // Anal. Chem. 1991. -V. 63.-P. 2674-2688.

198. Ballatori N. and Clarcson T. W. Molecular and ionic mimicry and the transport of toxic metals // Science- 1982. V. 61. - P. 216-220.

199. Ballatori N., Clarcson T. W. Methylmercury-thiol uptake into cultured brain capillary endothelial cells on amino acid system // Biochem. Pharmacol. 1984. -№33.-P. 1087-1092.

200. Ballatori N. and Clarcson T. W. Dependence of biliary secretion of inorganic mercury on the biliary transport of glutathione // Biochem. Pharmacol. — 1984. -№33.-P. 1093-1099.

201. Батлер H. Ионные равновесия. — Л.: «Химия», 1973. 448 с.

202. Практикум по электрохиии // под ред. Б.Б. Дамаскина. М.: Высшая школа, 1991.-287 с.

203. Cakir S., Bicer Е., Cakir О. Square-wave adsorptive stripping voltammetric behavior of fresh and aged glutathione solutions at physiological // Electrochem. Com.-1999.-V. l.-P. 257-261.

204. Шольц Ф. Электроаналитические методы теория и практика. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2006. — 326 с.

205. Галюс 3. Теоретические основы электрохимического анализа. — М.: Мир, 1974.-552 с.

206. Чевари С., Чаба И., Секей Й. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах клетки и метод определения ее в биологических материалах // Лаб. Дело 1985. - Т. 11. - С. 678-681.

207. Короткова Е.И., Аврамчик О.А., Юсубов М.С. и др. Определение антиоксидантной активности экстрактов растительного сырья методом катодной вольтамперометрии // Хим.-фарм. журн. — 2003. Т. 37. — № 9. — С. 55-57.

208. Korotkova E.I., Avramchik О.А., Angelov Т.М. and et al. Investigation of antioxidant activity and lipophilicity parameters of some preservatives // Electrochim. Acta. 2005. - V. 36. - P. 1246-1248.

209. Балаховский С.Д., Балаховский И.С. Методы химического анализа крови. М.: Медгиз, 1953. - 747 с.

210. Вихарев А.А., Зуйкова С.А., Чемерис Н.А., Домина Н.Г. Физико-химические методы анализа. М: «Химия», 1979. - 345 с.

211. Зайцев В.Г. Содержание белковых и небелковых тиоловых групп в плазме крови при сахарном диабете, мочекаменной болезни и опухолях желудочно-кишечного тракта // Бюллетень сибирской медицины- 2006. -Т. 1.-С. 19-22.

212. Gerard-Monnier D., Chaudiere J. Metabolism and antioxidant function of glutathione // Pathol. Biol. 1996. - V. 44. - P. 77-85.