Первичная структура каталазы гриба Penicillium vitale тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Г6 ОД АКАДЕМШ НАУК УКРА1КИ

1НСТИТУТ Б100РГАН1ЧК01 XIMII ТА HAOTOXIMII

;Í ДПР 193';

На правах рукопису УДК 577.112,5

МИРОШНИЧЕНКО ОЛЬГА САЛАВАТ1ВНА

ПЕРБИННА СТРУКТУРА КАТАЛАЗИ ГРИБА PENICILLIUM VITALE

02.00.10 - б1оорган1чна х1м1я, х1м1я природних та ф1з1олог1чно активних речовин

Автореферат дисертацП на эдобуття наукового ступеня кандидата б!олог1чних наук

Ки1в - 1994

Дисертац1ею е рукопис.

Робота виконана у в!ддШ ыолекулярних механ1зи1в б1осинтезу б1ль 1нституту молекулярно! б!ологП та генетики АН Укра'хни.

Науков1 кер!вники - доктор 61олог1чних каук

Е. А. Козлов

кандидат б!олог1чних наук Т.Л.Лев1т1на

0ф1ц1йн1 опоненти - доктор х!>.ичних наук,

професор С.Б.Серебряний

кандидат б!олог1чних наук Л. О.Чернух1на

Пров1дна орган!зац1я - Ки!вський ун1верситет

1м. Т.Шевченка

Захист в1дбудеться року на зас!данн1 спец1а

л1зовано! вчено! ради Д 016.65.01 в 1нститут1 б!оорган!чно1 х!ки та нафтох!мП АН Укра!ни (253660, м. Ки1в, вул. Мурманська, 1).

3 дисертац!ею можна ознайомитись у б!бл1отец1 1нституту 61 оорган1чнох х!мП та нафтох1м11 АН Укра1ни (253660. м. Ки'1в, вул Мурманська, 1).

Автореферат роз!сланий "¿2." __1994 року.

Вчений секретар

спец1ал1зовано! вчено! ради Д.М.Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РСБОТИ

Актуальк1сть проблем1.!. Вивчення ззаемозв'язку структури 1 функцп 1ермент1в е одним з найактуальн1ших напрямк1в у п1знанн1 х1м!чн;:х особ життед1яльност1. Основою анал1зу структурно-функЩокальних взаемо->1 дносин е знания ам1нокислотно! посл1доеност1 i лросторово! структури ■1лка.

Дана робота являе собою досл1дхення, присэячене вивченню первин-:oï структури каталази гриба Pénicillium vitale (дал! FYC).

Катзлаза (ЕС 1.11.1.6 К^О^: Н^О^оксидоредуктаза) - фермент, який ¡Ютиться у кл!тинах переважно! 61льшост1 аеробких срган1зм1в 1 зд1йс-œe розкладання перекису водню на воду 1 моле.чулярний кисень. Ун1вер-¡альнЮть 1 ефективн1сть ферменту роблять його безумовно ц1кавим сб'-:ктом, структурно-функцюнальне досл1дже::кя якого дозволить наблкзкти-;я до розум1нкя механ1зму дП каталази, цо бере участь в окислювально-Иднозлювальних реакц1ях орган1зму.

На OCKOB1 рентгеноструктурного анал!зу (Vainshteln et al. ,1935) >уло Естаковлено просторозу структуру молекули FVC, ¡до складаеться 1з готирьох 1дентичних субодиннць; х1д пол1 пептидного ланцяга; елементи $торинно5 структури та запропоновано модель орган1зац11 активного ;ентра 1 можлпву ам1нокислотну посл1довн1сть pvc. Очевидно, що для 'либшого розум1ння молекулярного механ1зму дП' цьогэ ферменту, окр!м ipocTopoEoï структури, необх1дко також знания достоз1рно$ ам1нокнслот-

iol посл1довност1. '

У процес1 реал1зац11 ochobhoî фуккцП каталаза пс-ряд з 1ниши ок-зидоредуктазами (пероксидаза, суперокспддисмутаза) бере участь у заснет! орган!эму в1Д згубного впливу перекису водно та 1нших токсичних лродукт1в кискевого метобол!зму. Протягом останн1х рок1в з'явилися перспектив» р1зноман1ткого застосування препарат1в каталази у широкому :пектр1 захворювань людини, а також у >:арчов!й та х1м1чн1й промисло-еостях, що стимулюе досл1дження у напрямку спрямовано! модифЗкацП Ферменту.

Мета та задач1 досл1дження. Метою дано! робот», було з'ясування ам1нокислотно! посл1довнсст! PVC Х1м1чними методам, вилвлення П

структурних особливостей та встановлення еволюц!йних вгаемов1днос: м!ж досл1джувакою каталазою та каталазами 1ншого лоходженкя. В задач1 дакого досл1дження входило:

1. Вкд1леккя та з'ясування ' будоЕИ тркптичних пептид1в модиф1кован< по залишках л1зину мале!новим анг1дридом 1 немодиф1козано! катала;

2. Бивченкя . будови бромц1 анових пептид1в.

3. Реконс?рукц1я пол1пептидного ланцюга РУС на осиов1 'будови вид1л< них лептид1в, а також пор!вняння 1х з в1домими первиннкми структз рами 1нших каталаз.

4. З'ясування езолюц1йних взаемов!дносин РУС з 1чшими каталазами.

Кауиова новизна робота. Еперше.встановлено будову ряду трипти* них 1 бромц:аиозих пептид!в, як! перекривають псшпептидний ланцх РУС, що нараховуе 697 ам1нокиелотних залишк1в. Реконструйовано 1 лока л1зовано ш1сть д1лякск пол1пептидного ланцюга- каталази, як1 м1стя2 557 ам1нокислотких залишкЛв. З'ясовано еЕолюц1йн1 взаемов1дносини для 16 каталаз р1гних таксоном1чних труп орган1зм1в.

Практична ц!нн1сть робота. С?риман1 результата можуть бути основ визчення молекулярного ме.чан1зму д11 каталаз 1 ц1леспрямовано! модиф1 кац11 ферменту методами генетично! 1кженерП. Результата дссл!дженн можна Еикористовувати також в курсах лекц1й в учбових закладах.

Апробац1я матер!ал1в дисертацП. Результата робота допов1далися VII 1 VIII Бсесоюзних симпоз1умах по х1м!1 б1лк1в 1 пептид!в (Талл1н 1987; Тб1л1с1, 1990); на школ1-конференц1I "Структура 1 функц1я б1опо л1мер1в" (Льв!в, 1989).

По матер1алах дисертацП опубл1ковано 5 статей, список яких наведено в к.1нц1 автореферату.

Структура та об'ем роботи. Дисертащя викладена на 92 стор1нка: машинописного тексту 1 складаеться 1з вступу, огляду л1тератури, мат»' р1ал1в 1 метод!в, результат^ та 1х обговорення, заключения, висновк1] 1 списку цитовано! л1тератури. Огляд лИератури шстить дан1 щодо ф1-з!олаг1чно1 рол!, ф1зико-х1ы1чних 1 катал!тичних властивостей, наяв-

jtI !зофермент!в, просторово! структури, ам1кокислотних посл1довкос-i каталаз. Список л!тератури нал!чуе 125 джерел. Дисертац!я включав' габлицъ 1 6 рисунк1в.

2ЛАТЕР1 АЛИ I МЕТСДИ

Препарата каталази люб'язно надан1 сп1врсб1тнлками Тнституту dxImII АН Укра1ни. У робот1 використано наступн1 метода: модиф!хац1я пка га эалииками л!зину мале1новим анПдридсм (Butler.Hartley,1972), ^1чне розщеплення б1лка бромц1аном (Gross, Wltkop, 1962) 1 частковим слотним Пдрол1зом, ферментативне розцеплення 51лка трипсином 1 xl-трипсином, модиф1кац1я б1лка мале!новям ан?1дридом. При розд1ленн1 Ml шей пептид!в впкористовуэали методи гелъ-ф1льтрузання, зворотно-зоео1 високоефективно! р1динко! хроматограф!I (KPLC), екстраицП ган!чними розчинниками, висскозольтного електрофорезу 1 хроматогра-I на папер!. Застосовано такэж автоматичнлй та ручний метода секве-вання (Гусак та 1н., 1S7S), мегоди М-к1нцевого 1 ам1нокиелотного ал1з1в .

РЕЗУЛЬТАТ!! Д0СЛ1ДЖЕННЯ I IX ОБГОВОРЕННЯ

РанШе.в наш1й лабораторП розпоча.ю вивчення триптичних пептид1в С (Гусак та 1н., 1939). Нами досл1джено пептиди, отриман! при роз-пленн1 трипсином мале!л-каталази (Тт), бромц1анов1 пептиди (BrCN), а кож продовжено анал1з триптичних пептид1в (Т) немодиф!ковано! ката-зи.

Триптичн! пептиди мале!л-каталази. Субодиниця каталази мЮтить по

> ам1нокислотних залишк1в л1зину 1 арг1нину. При розщепленн1 трипси-м мале1новано! каталази теоретично сл!д оч1кувати отримання 31 пел-да. В результат! розцеплення було одержано дв1 фракцП - розчинних 1 розчинних пептид!в. Обидв1 фракцП розд!ляли за посередництвом ком-нац1й р1зних метод1в. Схеми розд!лення цих фракц1й представлен! на ic.l 1 2 (цифрами п!сля операц1й гель-ф1льтрування 1 HPLC позначе-

> номери п!к!в; цифрами в граф! "в/в електрофорез" - число отркманих

Ср5К.ц1я F

; V л ï ■ - § i¿. т L-уг- ci н h л : Toycp'iài'î }¡V 50 X, 170Б10рй~ î П'

гель-ф1льтругакня Ге.~ь-ф1^ыруЕвкня T.-yV'pe^rl KV 40 5кî мания га хкеких труп

Екстракц1я HPLC

В/в елёктрс-^орез i хроматограф!я на папер!

ПёПТИДИ Im

i с Ö- "ri i О ¿D 6 14

10 16 б 55 34 17 26 14 41- 7 22 7 50

15-29 19 3S 43 22 47 25 41

31,32,57 22,23 44- 41

27-29,35,36 46 44,48,49

?v;e. 1. Схема розд1ленни рогчинно! фракц11 Tin пептид1з

ль-ф!льтрування, уореаг1 НУ 50

ль-ф1льтруЕання, уореаг1 НУ 40

1мання захисних уп

1С

в електрофорез хроматограф!я лапер!

гсткди Тм

II III

12 1

_н о о о _н

IДракц1я Н, фракц1й; "о"- осад; "н"- надо_[ | садоза р1дина; п!дкреслено

фрзкд! £, як1 з подэльтэму не досл!джували; в граф! "пептиди Тт" зазначено номера пептид!з, отриманих внасл1док розд!лек-ня).

На рис.3 представлено результата гель-ф!льтрування роз-чинних 1 нерозчкнних пептид!в.

В ус!х фракц1ях пептид!з, отриманих Екасл1док гель-ф1дъ-трування, зн1мали захисн! кале 1льн1 групи. У деяких вг.пад-ках при цьому одерхузглп осад:;, як! В1ДД1ЛКЛН в!д надосадово! р1дини. 0тр;:мак1 таким чином 20 фракц!й розд1ляли дал! методами екстракцП ергак!ч:-:;;;>.«; розчинкикаш, зворотнс-фазэво1 КгЬС, високовольткого електро-форезу .а хроматограф!I на напер! . Результат:: фракц!о:~:узан-ня методом НРЬС наведено ка рис.4.

В результат! розд!лення отримано 210 фракц1й, гомогекн1сть ягах ■¡тролювали М-к1нцевим та ам!нокислотним анал1зами, а декотрих -гктрофорезом в ПААГ.

Внасл!док розд!ленкя одержано 48 1ндив1дуальЕих пептид!в, побудо-яких з'ясовували ручним методом секвенувакня (до 10 стад1й) 1 азто-гичним секвенуванням. Еелик.1 пептиди додатково субфрагкентували теином 1 обмежеким кислотним г!дрол!гом'(пептиди Тш1 1 Тш2).- Су5-1гменти п1сля розд!лення вксокоамътним електрофорезом 1 хроматогра-;ю на папер1 секвенузали. Тоиптичн1 субфрагменти Тт пептид1з не наняться, а пептиди (А), отриман1 при обмеженому кислотному г!дрол!з!, вставлен! в табл.1.

24 41

52 ЕЗ

Г

21-25

?..2. Схема розд!лення нерозчикко! фракцП Тт пептид!в

-б-

/л? ген ла *со т л»

■ },о

г,в 1,0

'►¿-Л

23 40 60 лг да.

Бис.о. Г~л>-ф1ЛЪТруваННЯ рОЗЧИКН/Гл (а) 1 НёрОоЧИННИХ (С) п«птид1 т.риптичного г1дрол1зату мале!ковано! катэлази. Колонка: Т2 Тоуог>(г3.г1 КУ-5П, 2x100 ом; ллгднт: 0,2 М НН НСО (з додавання^ О М Г'УЗН! ДЯНХЛОрИДУ ДЛЯ фраКЦП КёрОЭЧИННИХ П«ПйД1В>) об' фракцП 3 мл; швидкЮть елюцП 20 мл/год, Пунктиром погкач* р"гХрсматогрраф1ю п1ка 1. ?ко.н. КР1С фракцИ 1-П'-2-0 (а); об'еднаних фракц1й II1-1-0, Ш-2-111-3-0 (б), прелстзвлених на рис.1, а також фракцП 1-1-0, н е-^Дтно! на ряс.2 (в). Колонка: 1ЛсгаврЬ^ге С-18, 10x200 V елюент: град1ент коиц-нтрацП ацетон1трилу (5-о0"> ь 0,1-'. три ТОрОЦТС'БИЙ кислот 1; шзидкисть злюцк! 2мл/хъ.

Таблиця 1

Пелтиди обмеженого кислотного г1дрол!зу Tinl 1 Tm2

Гептид:

ill, 2А1 nl*2A2

ni, 2АЗ

ni, 2А4

I11A5

«1А6

nlA7

iil,2A8

ill, 2АЭ

»1.2A10 nl,2All

1 П А А О IIj. f ivrtiC

111, 2A13 И1А14 ill ,2A15 ill, 2A16 nl,2A17

Будова

VabAla-Lys

VabGly-Leu-Leu-Ala-Ser-Val-Asn-Lys-Pro-AIa-Ser-Ile-

Ala-Gln-Gly-Ala-Lys

Prq-Ala-Ser-Ile-Ala-Gln-Gly-Ala-Lys

Val-Glу-Leu-Leu-Ala-Ser-Va i -Asn-Lys

Leu-Ala-Lys

Leu-, Thr, G1 u , Pr o, Gl y, A la, Val¿, ¡1 e, Leu, Phe) - Ly s

Leu-Asp-Leu-Gly-Lys

Leu-Gln-Val-Val-Ala-Ser-Ser-Gly-Asp

Ala-Fro-Lys-Fro-Asn-Ser-Asn-Tyr-Phe-His-(Asn,Thr, Gln,

Fro^Gly)

Ala-Ile-Gly-Val-Glu-Ala-Pro-Lys-Pro-Asn

Vsl.-Ala-Lys-Tyr-Asp

(Ser,Thr,Glr>,Pro,Gly.,)-Lys

Leu-Phe-Lys-Asp Leu-Asp-Leu-Gly-Lys-Phe Ala-(Phe,Met)-Arg Arg-Leu-Vál-Ala-Gln-Gly-Asp Arg

ha oohobi викладених данях зд1йскено реконструкции л1зин-вм1сних и пептид'1в, наведених у табл.2. В табл.2 1 надзл1 п!дкреслеко пептиди по'сл1довностями, що перекриваютьея. Стр1лками позначено число стад!й эградац!I за Едманом.

Таблиця

Будова триптичних пептид!в ыале!л-каталази

ептид:

Будова

ml Val-Ala-Lys-Ala-Ile-Gly-Val-Glu-Ala-Pro-Lys-Fro-Asn-Ser-Asn-Tyr-Phe-Hls-íAsnJhr.GÍn.Pro^.GlyJ-íHls.Thr.Ser.Gly.Ala.Ile.FheJ-Val-

_1_:_C_

Ala-Lys-Tyr-Asp-(Thr)Ser,Gln,ProlGly2)-Lys-Val-Gly-Leu-Leu-Al Ser-Val-Asn-lys-Pro-Ala-Ser-Ile-Ala-Gln-Gly-Ala-Lys-Leu-Gln-V Val-Ala-Ser-Ser-Gly-Asp-(Ser,Glxa,Ala,Ile)-leu-Phe-Lys-Asp-Al Phe-Met-Arg-Leu-Yal-Ala-Gln-Gly-Asp-(Thr,Glu,Pro,Val,lie,Leu, Phe)-Lys-Leu-Ala-Ly3-Leu-Asp-Leu-Gly-Lys-Phe-Ser-Arg Tm2 Val-Ala-Lys-Ala-Ile-Gly-Val.-Glu-Ala-Prq-Lys-PrQ-Asn-Ser-Asn-T Fhe-Hl3-(Asn,Thr,Gln,Pro2,Gly)-(Hls,Thr,Ser,Gly,Ala, Ile.Fhe)-Ala-Lys-Tyr-Asp-(Thr,Ser,Gln,Pro,Gly z) -Lys-Val-Gly-Leu-Leu-AI Ser-Val-Asn-Lys-Pro-Ala-Ser-Ile-Ala-Gln-Gly-Ala-Lys-Leu-Gln-V, Val-Ala-Ser-Ser-Gly-Asp-CSer.Glx^Ala.IleJ-Leu-Phe-Lys-Asp-Al, Phe-Met-Ai „•

Tn'.3 Gly-Ser-Prq-Lys-Ala-Tyr-Ser-Asn-Thr-Glu-Pro-Asn-Lys Tjt,4 Gly-Ser-Asp-Leu-Ala-Gln-Gly-Ser-Gln-Ile-Ser-Ser-Gln-Arg Trr¡5 Gly-Thr-Gly-Ala-Hls-Gly-Thr-Fhe-Leu-Sep-Tyr-Gly-Asp-Trp-Ser-A; Leu-Thr-Ala-Alá-Ser-Phe-Leu-5er-Ala-Glu-Gly-Lys-Gln-Thr-Pro.-5i Phe-Thr-Lys-Phe-Ser-Thr-Val-Ser-Gly-Ala-Arg Tü',5 Gly-Val-Asp-Phe-Thr-Glu-Asp-Pro-Leu-Leu-Gln-Gly-Arg Tm7 Fte-Ala- Val -Asp-GliT TiViS Gly-Pl-ie-Fhe-Thr-Ala-Pro-Glu-Arg Tw9 Leu-Val-Thr-Asp-Asn-Gly-Lys

TmlQ PI-.e:-Prc-Glu-Glr.-Gly-Pro-Glu-Leu-Gly-Val-Glu-Asp-Leu-Phe-(Asx;|

T!-ir,Ser3(Gl-/61Gly,Ala,Val(Met, ILe^.leu.Tyr.PheJ-Arg Tml4 Pi-.e-Glu-Leu-i/et-Gln-CAsx.Glx^.Gly.Va^, Ile;L,Leu)-Arg Tir.16 Phe-Asn-Thr-Ser-Glrr-Val-lys Tiv,l7 Gln-Lys-11 e-Gln-Arg Tml8 Lys-Phe-Leu-Asp-Arg TmlQ Thr-Ala-Ser-Gly-Lys-Leu-Gln-Arg TmgQ Ser-Ser-Val-Val-Arg 7m21 Glu-Ar-g

T¡i:22 Sly-Ser-Ala.-Asp-Thr-Ala-Arg Tiv,23 Ile-Ser-Asp^-Asn-Leu-Thr-Ala-Arg Tív.24 As¡?-G:y-Ala-Gly-Glj-M9t-(Asx,Pro , Ile,Leu)-Phe Tm25 Asp-Gly-Ala-ñly-Glu-Met

T;vi25 Phe-Pro-G^-(^-Glv-^-G^-Léu-GW-Val^-Glu-Asp-Leu-Phe-(Asx^

-g-

7hr,Ser3,Glxâ,Gly,Ala,Val,Met,Ile2,Leu Дуг,Phe)-Arg-Glu-Leu-Arsf ¡27 АЦ-Pm-1 ü P-H1 s-Asn-Asp-Asn-Arg

i28 Hl s-Gly-Pro-Asn-He-Gln-Slri-Leii-Gly-Fhe-Asn-Arg-Pro-Pro-Arg \29 Phe-Âsp-Glu-HÎs-Âpg ' '

01 Ala-Ser-Phe-Val-Glu-Thr-Gln-Glu-Trp-Gly-Ala-Lys ¡32 A:?p-Gly-AIa-gly-Glu-Met-(Asx,Pro^, Ile.Leuj-Phe-Ala-Ser-Phe-Val-

Glu-Thr-Gln-Glu-Trp-Gly-Ala-Lys (34 Pj^-Hls-Trp-Tyr-Asp-Leu-Gln-Gly-(S9r,Gluz,Pro(Ala,Val,Ile,Leu2, Trp)-Arg

ß5 Phe-Asn-Thr-Ser-GIn-Val-Thr-Lys-Ser-Ser-Val-Val-Arg 1З6 Val-Pro-Glu-Arg

i3S Phe-Gly-Phe-Asp-Leu-Pro-Leu-Asp-Thr-Lys

41 Phe-Tyr-Val-Asp-Glu-giy-Asn-Fhe-Asp-Ile-Val-Gly-Asn-Asn-ne-Pro-Yal ■-Phe-Phe-1 le^-TrprAsp- ( Thr, Glx, Ala^, Val, Me t, 11 &г, Leu, H1 s ) -Lys-Gln-(Asp,Pro2,Lou)-Arg i42 Ala-Val-Ala-Asp-Fhe-Arg 43 Phe-Leu-Asp-Arg ¡44 Asp-Val -H 1 s - Gly-Pfíe-Ala-Ihr - Arg

45 Äla-Val-Hls-Ala-Arg

»46 Asn-Asp-Asp-Asn-Val-Thr-His-Ala-Arg

47 Gly-Ala-Thr-Leu-Leu-GIn-(Asxz,Thr,Glx,Ile,Leu,,Phe)-Phe-Ala-Phe-

Asp-Arg

46 Fhe-Ser-Arg 49 Thr-Phe-Arg

150 Ala-Phe-Asp-Arg

151 Leu-Phe-Ser-Tyr-Leu-Asp-Thr-Gln-Leu-AsrrArg

52 Met-Gln-(AsÄ5,T}-jr,5erz,Glx3,Gly^,Alas,Val3,Leu,Tyr,Phea)-Lys-Arg

153 Leu-Val- Thr-Asp-Asn:61y-Lys-TI-,г-Lys-Leu-Val-Lys-Phe- His-Trp-Туг-Asp-Leu-Gln-Gly-(Ser,Glx¿,Pro,Ala,Val,I1e,Leu^.Trp)-Arg

154 Gly:Asp-Phe-Arg

¡55 Leu -Val -Ala-Slxi-Gly-Asp- (Glu, Thr,Pro, Val, I le, Leu,Phe)-Lys ¡56 Leu-Gl!vVal-Val-AIa-Ser-Ser-Asp-(Ser,Glu,51n,Ala,Ile)-Leu-Fhe-

Lys-Asp-Ala-Phe-Met-Arg i57 Gln-Asn-Ser-Ser-Asn-Pro-Thr-Arg

Таким чином, нами встановлено будову 48 пептид1в, що нарахов; ють 719 залишк1в ам!нокислот. У тому числ1 34 пептиди з посл1довност ми, цо не перекриваються, включають 572 заливки ам!нокислот.

Тркпткчи1 пептиди кемодиф!ковано! каталази. В цьому розд1л1 ви] ладено дан1, як1 доповнюють, або уточнюють наведену ран1ше структу; триптичних пептид1в (Гусак та 1н.,1989).

Еисоковс'Льтним електрофорезом 1 хроматограф1ею на nanepl нами б; ло вид1леко 24 триптичних пептиди. 1х побудову представлено у табл.3

Таблица 3

Будова триптичних пептид!в немодиф!ковано! каталази

Пептид: Будова

1 ! о

Т2 Gly-Thr-Gly-Ala-(Asx ,Thr ,3ег .Glx.Gly- ,Ala,,Leu .Tyr.Fhe .Tj

—г --- —f-г ¿. «с Ч 3 3 3 2.

his)-Lys

14 Ala-1le-Gly-Val-Glu-(Asx^,Thr .Ser^.Glx,Pro^,Gly ,Ala^,Val,11<

Ту г, Piie Lys, H i s^) -Lys T5 His-Gly-Pro-Asn-fAsx.Glx .Pro^.Gly,Ile,Leu,Phe,Arg)-Arg T6 Asp-Gly-Ma-Gl7-Glu-Met- (Asx,Pro- , 11 e, Leu,Phe) -Ala-Ser-Phe-Va!

Glu-Thr-Gln-Glu-Trp-Gly-Ala-Lys T15 Ala-Ser-Pne-Val-Glu-Thr-Sln-Glu-Trp-Gly-Ala-Lys T16 Gin'-Thr-Pro-Ser-Phe-Thr-Lys T17 Gly-Fro^Ser-^r.Gly.Ala ,Leu)-Arg T21 Giy-Val-Ala-Leu-Gly-Lys T23 Gln-Giy-Leu-Glu-Gly-Lys

T35 Gln-Val-Leu-Asn-Ser-(Gly,Ala,Met)-Met-(Thr ,Glu,Phe)-Pne-(Arg

Thr,¿er,Pro)-Arg ' T41 Leu-Val-Thr-Asp-Asn-Gly-Lys T52 Phe-Ser-Arg T53 Phe-(His,Pro,Leu)-Arg T54 Phe-Ser-Hls-Trp-Lys T55 Gln-Gln-Gln-Lys-Lys T55 Ala-(Gln^, Glu,Gly,Ala,Phe)-Lys T57 Tyr-Asp-(Thr,Ser,Gin,Pro.GlyJ-Lys

LÎ

59 30 51

53

64

65 65

hl

н2 нЗ

Phe-Gly-Lys Thr-Fhe-Arg

Phe-(Asx.Glx^.Gly,Valz,Met, Ile^.L&u )-Arg

Lys-Phe-Gly-Val-Asn-Gly-Fhe-Val-Hls-Thr-Arg

ÂsîT-Asn-Lys

Asn-Asn-Lys-Arg

Arg

Asn-(Asx,Glx3,Pro(Gly ,Ala,Val2lMet£,île3,Leu,Phe ,His)-Arg Phe-(Asx,Ser,Glx3,Pro,Gly,Ala,yal, Ile,Leu3,Tyr,Trp ,Hls)-Arg Fhe-Prq-Glij-Gln-(Asx5,Thr, Ser^,Glx3,Fro,Gly^,Ala,Val^,Met,île^, Leu ,Tyr,Phe?,Arg)-Arg

Пептид T35 додатково суСфрагмектували хшотрипсином. Отркмано два Н1тиди: TSSChl - Asn-(Ser,Sly,Aia,'/et )-Met ! T36Ch2 - Glr>-(Asn,Thr , ir,Glu,Gly,Ala,Val, Iie,Leu,Phe)-Plie, ка ochobI якш: реконструйовако 36.

Пептиди, няведйн! у табл.я, нарахоЕутоть 312 ам1нокислотнпх зал':а-1в. 23 пептиди з поелровностями, то на перекриваються mí,y. собою, 1етять 308 ам1нокислотних ззлишк!з.

Бромц!анов1 пелтиди. ?озд1лення бромц!анових пептид1э зд1йснено ами ран1ше (Лев1т1на та 1h.,1SS9). В Baal Я робот! досл!дкено п'ять ндив1дуальних пептид!в, будову яких наведено в табл.4.

Таблиця 4

. .Будова бромц!анових пептид!в PVC

[ептид

_1_

Будова

JrCNl Asp-Val-Ile-Ile-Glu-Thr-Leu-HSer

3rCN6 Phe-Gln-Fro-Gly-Hls-île-Val-Ar^-eiy-Val-Asp-r^'V-ir-Giu-Aso-Fro-Leu-Lê^-GÎ^

Hls-Gly-Pro-Asn-Ile-Gln-Gln-Löu-Gly-Phe-Asn-Arg-Fro-Pro-Arg-Ala-

_:_2_

Pro-Ile-Hls-Asn-Asp-Asn-Arg-Asp-Gly-Ala-Gly-Glu-HSer BrCN7 Gln-Val-Ala-Asn-Ala-Asn-Ser-Val-Asp-Glu-Gly-Gln-Ala-Asn-Ser-As S lu- (Thr ,Giy, Ala., Val, Leu, Tyr, Fhe. ) -Lys-Arg-val -Ala-Lys-Ala-Пй-Rly-Val-Glu-Ala-Pro-Lys-Fro-Àsn-Ser-Asn-Tyr-Phe-Kls-(Asn, Thr.Gln.Pro^.GlyJ-ÇHls.Thr.Ser.Gly.Ala.île.PheJ-Val-Ala-Lys-Tv Asp-(Thr,Ser^Gln,Pro,Gly.,)-Lys-Val-Gly-Leu-LôU-Ala-Ser-Val-Asn Lys-Pro-Ala-Ser-Ile-Ala-Gln-Gly-Ala-Lys-Leu-Gln-Val-Yal-Ala-Sâ Ser-Gly-Asp-(Sei\Glu,Gln,Ala,Ile)-Leu-Phe-Lys-Asp-Ala-Phe-HSer BrCN'S Gln-Asp-Gly-Val-(Val, Ile)-Glu-(Rlx,, I',L^u)-Arù-Phe-Gly-Phe-

Asp-Leu-Pro-Leu-Asp-Thr-Lys-Gln-Val-Leu-Asn-Ser-Ala-KSer BrCNQ Leu-Phe-Asp-Glu-Val-Ile-Gly-Ala-HSer

Пептида BrCNB 1 BrCN7 отримано в сум1ш1 (BrCN'5,7) y сп1вв1дношен Kl 5:1. На сум!ш1 BrCN6,7 пройдено 32 стадП деградацП за Едманом Сум!га також розш.еплювали трипсином, х!мотрипсином. . удову триптични: 1 хШотриптичних субфрагмент1в представлено в табл.5.

Таблица 6

Триптичн! 1 х1мотриптичн1 субфрагменти сум!ш1 BrCN6,7

Пептид

. Вудова

С-ГиМОХ i

3rCNST2

BrCN'573

BrCN6T4

БгСНбТб

БгСКбТб

BrCN'777

ВГСК7Т8

3/CN7T9

ErCNôChl

BrCN6Ch2

Fhe-Gly-Leu-Hls-Ala-Asp; Val-Туг-L*u-Ser-Asn-

■uln-Fro-Gly-Hls-Ile-Val-Arg •V'al-Asp-Fhe-Thr-Glu-Asp-Fro-Leu-Leu-Gln-Gly-Ar-g

•Ser-Tyr-Leu-Asp-Thr-Gln-Leu-Asn-Arg •Fro-Asn-Ile-Gln-Gln-Leu-Gly-Phe-Asn-Arg-Pro-Pro-Arg

• 11e-H1s-Asn-Asp-Asn-Arg •Ma-Gly-Glu-HSer •Lys

Fhe-Gly-Pro-Gly-Ala-Asp-filn-Туг-Arg-

CThr.Ser.Gln.PrOjGly^-Lys •(Asx.Se^.Glx^Gly.Ala^.Val^, Ile,Leu,Fhe)-Lys Leu-Asp-Thr-Gln-Leu

■Hls-Gly-Fro-Asn-Ile-uln-Gln-Leu-Gly-Phe

"СМбСЬЗ Азп-АгЕ-Рго-Рго-Аге-АТа-Рго-Пе-Шз

-СН6СЬ4 Азп-Азр-А5п-Агд-Азр-С1у-А1а-В1у-Б1и-Н2ег

■•СКбСЬБ 61у-РЬе-Азп-Аге-Рго-Рго-Аге-А1а-Рго-11е-Н1з

^N7(316 5ег-Уа1-Азп-31и-(61п,51у,А1а)-Азп

На основ! сп1вв1дношення пептид1в ВгСМб 1 БгСК7 у сум1ш1 розрахо-шо 1х зм1кокислотний склад та 1дектиф1ковано 1х субфрагменти. Для ;конструкц11 БгСК7 залучено пептиди Тт1, 7ш2, Тт52. Зуло таксс* вг.ко-ютано пептиди, отриман1 нами при розцепленн1 каталази стаф1лококозою потеазою: 5р2б - 61уЧ31п-А1а-Азп-Бег-Азр-51и; ЗрЗО - А1а-Азп-Зег-Уа1-зп-С1и; Бр39 - 5ег-Азр; 5р40 - Б1п-Уа1-Азп-А1а-Азп.

Пептид БгСШ розщеплюЕали трипсином.Одержано два пептиди: ВгС\'5Т1-1е-(А-5р3,71-1Г,2ег,61и1Рго)а1у,А1а,Уа1,1еи31Р11е2_)-НБег 1 ЕгС1»'8Т2 - в!п-, Азр, А 1а, Уа1,1_еи)-НБег. Для його реконструкц! I притягнуто пептид 36 (табл.3), а також Т31 - РЬе-бХу-РЬе-АБр-Ьеа-Рго-Ьеи-Азр-ТЬг-Ьуз 1 513 - 61у-Уа1-(В1хг, 110,Ьеи)-Агг-РЬе-С1у-РЬе-Азр-Ьеи-Рго-1еи-Азр-Т|->г-/з-61п-Уа1-1еи-Азп-5ег-А1а-Мег-61и.

Наведен1 у табл.4 бромц1анов1 пептиди м1стять 213 ам!нокислотних

1ликк1в.

Реконструкц1я пол1пептидного ланцюга РУС. Для реконструкц1I пол1-

5птидного ланцюга РУС ми визначили М-к1нцевий ам1нокислотний залишок-1Г. На ц!Я основ1 ми вважаемо, що на Н-к1нц1 розм1щуеться пептид Тт19 габл.2). Ми вважаемо, що С-к1нцевим пептидом е Тш7 (табл.2), тому що 1н е неспецкф1чним для трипсина 1 вид1ляеться з великим виходом.

Пор1внюючи поСудову пептид1в, каведених у табл.2-4, м1ж собою та в1домкми ам1нокислотними посл1довностями 15 каталаз, а також з мсж-явою ("рентгеноструктурною") ам1нокислотною посл1добн1стю досл!джува-э! нами РУС, ми реконструювали 1 локал1зували ще чотири дыянки пол1-эптидного ланцюга РУС. У п1дсумку ш1сть д1лянок нараховують 557 ам1-жислотних залишк1в. 1з досл1джених нами в дан1й робоИ 1 ранше (Гу-ак та 1н.,1989) триптичних пептид1в ам1нокислотн1 посл1довност1 21 эптида не перекриваються м!ж собою 1 з ам!нокислотними посл1доьноетя-

ми локал1зованих д!лянок. Ц1 пептиди м!стять 140 эалиж1в ам1нокис. (табл.6).

Таблица 6

Триптичн! пептиди, додатков! до реконетруйованих д!лянок

Пептид: . Будова

Tm3 Gly-Ser-Frc-Lys-Ala-Tyr-Ser-Asn-Thr-Glu-Fro-Asn-Lys

Tnvi Gly-Ser-Asp-Leu-Ala-Gln-Gly-Ser-Gln-Ile-Ser-Ser-Gln-Arè'

Tir,17 Gin-Lys-Ile-Gln-Arg

TmlB Lys-Fhe-Leu-Asp-Arg

Tir,23 , He-Sôr-nSp-Asn-Leu-Thr-AiA-Arg

Tm35 Fhe-Asn-Thr-Ser~Gln-Val-Lys-Ser-5er-Val-Val-Arg

TmRi Gîy-Asp-Pl-ie-Arg

Tir,57 Gln-Asn-Ser-Ser-Asn-Pro-Thr-Arg

T7 Gln-(Asn,ThrJGln,Gly,Ala,Val)-Lys

T12 Glu-Val-Thr-Gln-Gly-Ile-(Frc.^, Val,, Il*,Leu^)-Lys

T18 Asp- Ile-Lys

T21 Gly-Val-Ala-Leu-Gly-Lys

T23 Gln-Gly-Leu-Glu-Gly-Lys

T25 . Gly-Leu-Gln-Gly-Lys

T28 Thr-Pro-Lys

T40 Gln-(Asn,Wet,Leu)-Arg

T53 Phô-(Hls,Prû,Leu)-Arg

T56 Ala-(Glnz,Glu,Gly,Ala,Phe)-Lys

"59 Fhe-Gly-Lys

T65 Asn-Asn-Lys-Arg

Tc.6 ■ Arg

Таким чином, пол1пептидний ланцюг включав 697 ам1нокислотних е Це на 27 палншк1в перевишу?, довжину пол 1 пептидного ланцюга данями рентгеноструктурного экал1зу. В д1лянках "рентгеноструктурнс пос'л!довност 1 РУС, [до в1дпов1дають локал 1 зовашм нами д!лянкам, авт рами (Уа1пзЬШп е1 а1., 1936) 1дентиф1ковано 433 ам!нокислотних г

шки (77 X). Виходячи з наших даних випливае, що рентгеноструктурним годом в1рно 1дентиф1ковано 200 ам1нокислотних залишк1в (48 %).

Кижче наведено пор1вняння д!лянок PVC з ам1нокислотними посл1дов-стями каталаз HPII Escherichia coll (ЕСС) та печ!нки Сика (Б1С):

.С ADNRDPASDQ\m,KEQRAAQKPDVLTTGGGNFVGDKLNS LTVGP RGFLLVQ 52

'С TASGKLQR GPS (LGAAT) RG ATLLQ

1С ...LKAPDTRNEKLNSLEDVRKGSENYALTTMQGVKIADDQN3 LRAG3 RGPTLLE 106

-л*--*** -----а— —- - - - - * * - — -- л----

)VVFIDEM AHFDRERIPERVVHAKGAGAFGYFEVTHDITRYSKAKVFEHIGKRTFIAVRFSTV 115 )LLFTEDI)FAFDRERVPEJ!AVHARGTGAKGTFLSYGDWSNLTAASFLSAEGKQTFSFTKFSTV

)FILEEKI THFDHERIPERIVHARGSAAHGYFQPYKSLSDITKADFLSDPNKITPVFVRFSTV 169 • * - - — —*—-----*---- - - — - — - *----

------- -------—M---- Уг*

5ESG3ADT VRDFRGFAVKFYTEDGfJWDN VGNMTPIFFIKDALLFPSFI HS QK RUPQ THLK 176 jARGSADTARDVKGFATRFYVDEGWFD I VGN'N IPVFFIVDV11ETLMA (HA)KQ(PDPL)R 3GAGSADTVRDIRGFATKFYTEEGIFDLYGNNTPIFFIQDAHKFPDFV HA VK PEPH WAIP 230 -------■*----*-- -~k------*---- -«

- * ilr * - ---*

«-DPDMVWFVSLRPESLHQVSFLFSDRGIFDGHRHM DGYG3 HTFKLVNADuEAVYCKFHY 235

h'RM (ErFTT) RTFRLVTDHGKTKLVKFHW JQSAHDTFTOYYSLQPETLHNVMWAMSDRG IPRSYRTM EGFGI HTFRLINAEGKATFVRFHW 293

— - — - ?V —4% —— — — -- ~

TDQG IKNLSVEDAA RLAHEDPDY6LRDLF NA I ATGNYPSWTLY IQVMTFSEA EIFPFNPF 296'

DLQG(IL3LPYEEAV) RFPEQGP ELG V EDLF (ES IEAVDEGEYTLEIQSMNFSND)RELR

PLAG KASLVWDEAQ KLTGRDPDFHRaELW EAIEAGDFPEYELGFQLIPEEDE FKFDFDLL 354

- - ---k-~ * . —* *-т«с ----- -- - - * Tit.

-16- -- - - * -*тк * - *------- -

DLTK WPHGDYPLIPVGKLVLNRN PV NYFAEVEQLAFDPSNMrPGIEPSPDKMLQGRLFAYPD S

M(IE)MLFDEVIGAMFQPGHIVRGVDFTEDPLLQGRLFSYLD DPTKUPEELVPVQRVGKMVLNRN PD NFFAENEQAAFHPGHIVPGtDFTNDPLLQGRLFSYTD 4

— - — —- -A - — —- A — A- — -" — A- — A Vс —

THRKRLG=PNYLQIPVNCPYRARVANYQRDGFMCM MDNQG GAF<\'YYPN3FSAPEHqpSAL= 4'

TQLNRHG-PNIQQLGFNRPPRAPI Kw'DNRDGAGB.Î ( IDLPP ) FA3FVETQEVGAK

TQISRLG3FNFHEI P I NRPTOPYHNFQSDGMHKM GIDTN PA=NYEPNS INDNWPRETFPG 4'

----к—к —k - *------ - —h -*— * * -

===~=EHR=THFSGDVQRFN=SAMDDNV7QVRTFYLKVLNEEQRKRLCENIAGHLKDAQL«FIQ 4 '<

FDLHSFSHVfrCrSVraFVHTR^^^

FKrSGFESYQERVET.N'KVRERS?SFGî\TSHFHLr»'LSQTPFEÇRH I VD3FSFELSKVVRP=Y IR 54

- A A- — ~A —>'c

-* — — ** — к A "

KKAVK »FSDVliPEYG CR IOALLDKYNEEKFKN 60

AN'SDE (AFA-VALTYG ) KRVAKAIGVEAFKFHSNYFH (PPTQNG ) ( IHFTASG ) VAKYD (GPTGQ ER WD QLAHIDLTLA QAVAKK'LG IELTDDQLNI TP FPDYNG LKKDPS- LSLYA IPDGD 59

a • a — ~ — ■*-■>»с— a — ~— -- a - a ~ - —

5)KVGLLASVNKPASIAQSAKLQYVASSGD(AQEIS)LFKDArMRLVAQGD(ITVLPFE)KLAKL Y KGRVVAILLNDEVRSADLLAILKALKAK GVHAK LLY=SRM3EVTADD GTVLPIA ATFAG 65«

■¿rtc- * • A - - - - —

DLGKFSRFELMQDGV(IV)E(ILEQE)RFGFDLPLDTKQVLN5AMSM(FETT)F(RPTS)R AF3LTVDAVIVPCGH IA D IADNG DANYYLMEAYKHLKPIALAG DARK F RATI KIADQ 71',

** - - A - *8 * " - A - * - *

FAVDQ

GEES I VEADSADGSFÎ^DELLTUMAHRVVoR I PK I DK IPA 750

У пор!внюзаних посл1довностях BLC 1 ЕСС рисочками 1 з1рочками значено ам1кокислотн1 залипки в!дпов1дно ¡дентичн! 1 гомолог!чн! 1 нокислотним залишкам РУС. У дужках д!лянок PVC ам!нок.ислотн1 залиш-розстаЕлен! за принципом максимально! схожост! з !нщими каталазами.

Для шести пор1внюваких д1лянок нам;: розрахований ступ!нь спор1дке-ст1 (Z 1дентичних 1 гомолоПчних залншк!в до загального числа залип-з, що пор1внвються) РУС до BLC, ЕСС та 13 1кших каталаз. Ступ!нь спо-дненост1 РУС до BLC для чотирьох д1лянок (за Екклкченням М-к1кцевих) дадае в1дпов1дно 60, 45, 52, 38 Z, а до ЕСС - 61, 47, 54, 32 У :ix каталаз для зазначеких д!лянок в!н зм!нюзться у д!апьзон1 S3 -i %. Спостер1гаеться эниження ступеня спор1дненост1 для д1хя.чок у лрямку в1д N-до С-к!нця, що природно. оск1льки у найблкжчу до N-KiH-[ д1лякку входять три з чотирьох ам(нокислотних залпи;к1в активного "ятра : Н!з74, Serll3, Asnl47 (кумерац1я за BLC) а таком 11 ам1неклейких залишк1в, що взазмод1ють з гемом. В деяк!й Mlpl вир!зкяеться >етя д1лянка, тому що м!стить четвертий ам!нокислоткий залипск активно центра - Туг367, а тзкож десять залишк1в, що взаемод!ють з гемом. Фед цих десяти залишк!в нами 1дектиф1ковано три суттевпх зам!ни -.е329, Gln334, Gln361, пор!вклльно з 1нзими каталазами, в яклх у ц;:х i-пл-енккх зкаходяться залишки аминокислот Asp, Glu, His. Ми вважаемо, > зам!кою заряджеких зал;пж!в на гидрофобн! 1 кезаряджен1 можна пояс-1ти п!двищену ст1йк!сть РУС у розчинах.

Таким чином, моина в!дзначити високий ступ!нь консерватиБност1 ¡лянок пол1 пептидного ланцшга каталаз, в1дпов1дальних за II основку ^нкц!« - розкладакня перекису еодкю. С Шдстаэи вважати, що додатков1 -к!нцев1 домени РУС 1 ЕСС не мають суттезого значения для головно! тащН, про що св1дчить низький стуШнь ïx гомблогП (32 %) в межах зр1внювально1 д1лянки.

Ступ1нь спор!днекост1 в цЬтсму для шести д!лянок складае 48 % у /С 1 BLC та 44 % у РУС 1 ЕСС, колпваючись при пор1внянн1 з 1ншими камазами чезначно (48 - 32 тод1 як каталазп 1ншого походження про-зляють б1льшу схожЮть (95 - 32 7.). Найб!льса схож1сть каталазп РУС -¡являеться з каталазами ссавц1в, нижча - з каталазами рослин 1 м1кро-^ган1зм1в, у той час як каталазп таксоном!чно близьких груп проявлять значно вищий ступ!нь спор!дненост! (95 - 70 7.).

-18-

ЗАКЛЮЧЕННЯ

Не дивлячись на те, що наш встановлено будову наберу пептид1: що перекривають увесь пол1пептидний ланцюг, нам не вдалося реконстру] ват;: пел! пепткдкий ланцюг FVC кав!ть при пор!внякн1 з 1ншмк каталаз; ми, Тим не менте ми вважаемо, ¡до головну мету робота досягнуто, oí к1льки наш в1рог1дно реконструйовано 1 лекал!зовано ш1сть д1лянок го л 1 пептидного ланцюга каталази, котр1 включають 83 7. довжики лакцюга На основ! цих даккх з'ясовано ступ!нь спор1дненост! м1ж 10 каталазам; встановлено консервативн1 функц1 онально важлив! д1ля.ч.чи та зизначе] зам1ни суттеЕих ам1нокислотких залишк1в, ¡до обушвлюють, як нам зда< ться, влаетивост1 каталаз, як1 Ыдр1зняють íx е1д 1нших. Однак ми р< Симо спробу виписати моюшзу ам1нокислотну посл1довн1сть, заповнкж' пром1жи м1к реконструйованими д1лянками (стр,13 - 15) триптичнга пептидами, як1 не вв1йшли до них (табл. 6), за принципом максимальнс схожост! з 1ншими каталазами:

Thr-Ala-Ser-Gly-Lys-Leu-Gln-Arg-Arg-Phe-Asn-Thr-Ser-Gln-Val-Lys-

Ser-Ser-Val-Val-Arg-Gln-Gly-Leu-Glu-Gly-Lys-Gly-Pro-Ser-iThrjRly,Ala,

Leu)-Arg-Gly-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-(AsxThr,Glx, I le,Leuz,Phe)-Phe-Ala:

Phe-Asp-Arg-Glu-Arg-Val-Pro-Glu-Arg-Ala-Val-Hls-Ala-Arg-Gly-Thr-Gly-

Ala-Hls-Gly-Thr-Fhe-Leu-Ser-Tyr-Gly-Asp-Trp-Ser-Asn-Löu-Thr-Ala-Ala-100

Ser-Phe-Leu-Ser-Ala-Glu-Gly-Lys-Gln-Thr-Pro-Ser-Phe-Thr-Lys-Phe-Ser-

Thr-Val-Ser-Gly-Ala-Ar'g-Gly-Ser-Ala-Asp-Thr-Ala-Arg-Asp-Val-Hls-Gly-

Phe-Ala-Thr-Arg-Pl-ie-Tyr-Val-Asp-Glu-Gly-Asn-Phe-A|g-Ile-Val-Gly-Asn-

Asn-Ile-Pro-Val-Phe-Phe-Ile-Trp-Asp-Val-Ile-Ile^Glu-Thr-Leu-Met-Ala-

(His,Ala)-Lys-Gln-(Asp,Pro^,Leu)-Arg-Phe-(Hls,Pro,Leu)-Arg-Phe-Gly-

Lys-Gly-Asp-Fhe-Arg-Ile-Ser-Asp-Asn-Leu-Thr-Ala-Ar^-Gly-Ser-Asp-Leur

Ala-Gln-Gly-Ser-Gln-He-Ser-Ser-Gln-Arg-Gly-Val-nfa-Leu-Gly-Lys-Hls-

Arç-mêt-^Thr^,Glu.Pro,Phe)-Arg-Thr-Phe-Arg-Leu-Val-Thr-Asp-Asn-Gly-

Lys-Thr-Lys-Leu-Val-Lys-Phe-Hls-Trp-Tyr-Asp-L<?u-Glfi-Gly-(Ser)Glxx,Prc

AlajVal.Ile.Leu^.Trpî-Àrg-Phe-Prû-Glu-Glri-Gly-Pro-Glu-Leu-Gly-Val-GU

Asp-Leu-Phe-(AsxJ<,Thir,Serb)Glx6,Gly,AlalVal)MetJIle^LeulTyr.Phe)-Ar'í

Glu-Leu-Arg-Gln-Asn-Ser-Ser-Asn-Pro-Thr-Arg-Glu-Val-Thr-Gln-Gly-Ile-

(Pro Val v I le, Leu )-Lys-Gln- ( Asn ,Me t, Leu ) - Arg-Asn-(Glu, 11 e ) -Met-Leu-

Fhe-Asp-Glu-Val-Ile-Gly-Ala-Met-Phe-Gln-Pro-Gly-Hls-Ile-Val-Arg-Gly-

I-Asp-Phe-Thr-Glu-Asp-Pro-Leu-Leu-Gln-Gly-Arg-Leu-F'ne-Ser-Tyr-Leu-

P-Thr-Gln-Leu-Asn-Arg-Hls-Gly-Pro-Asn-Ile-Gln-Gln-Leu-Gly-Fhe-Asn-

ï-Prû-Fro-Arg-Ala-Pro-Ile-Hls-Asn-Asp-Asn-Arg-A^p-Gly-Ala-Gly-Glu-

t-(Asp,Pro2,Ile^LeuJ-Fhe-Ala-Ser-Phe-Val-Glu-ihr-Gln-Glu-Trp-Gly-

a-Lys-Gln-CAsn.Thr.Gln.Gly.Ala.YalJ-Lys-Asp-Ile-Lys-Phe-Asp-Glu-Hls-

ï-Fhe-Ser-Hls-Trp-Lys-Phe-Gly-Val-Asn-Gly-Phe-Val-Hls-Thr-Arg-Asn-

p-Asp-Asn-Val-Thr-His-Ala-Arg-Gly-Fhe-phe-ihr-Ala-Pro-Glu-Arg-Gln-

ii-Gln-Lys-Lys-Arg-Ala-Vai-Ala-Asp-Fhe-Arg-Met-Gln-Val-Asn-Ala-Asn-

r-Val-Asn-Glu-Gly-Gln-Ala-Asi^-oAr-Asp-Glu-i'Thr.Gly^lag.Val.Leu.Tyr,

?a)-Lys-Arg-Val-Ala-Lys-Ala-Ile-Gly-Val-Glu-Ala-Pro-Lys-Prc-Asn-Ser-'

-.-Tyr-Fhe-Kls-vAsnjTiir.Glri.Fro^Gly^-CThr.Ser.Gly.Ala.Ile.Fhe.His)-

1-Ala-Lys-Tyr-Asp-(T'nr. Ser, Glu, Pro, Gly_}-Lys-Val-Gly-Leu-Leu-Ala-

550

n-Val-Asn-Lys-Pro-Ala-Ser-Ile-Ala-Gln-Giy-Ala-Lys-Leu-Gln-Val-Val-i-Ser-Ser-Gly-Asp-(Ser,Glu, Gin,Ala,I1e)-Leu-Fhe-Lys-Asp-Ala-Fhe-Môt-ï-Leu-Val-Ala-Glu-Gl^-Asp-(Thr,Glu,Pro,Val,Ile,Leu,Phe)-Lys-Leu-Ala-s-Leu-Asp-Leu-Gly-ñys-Fhe-Ser-Arg-Fhe-Glu-Leu-Met-Gln-Asp-Gly-Val-ïl,Ilô)-Glu-(Glx3, Ile.LeuJ-Arg-Phe-Gly-Fhe-Asp-Leu-Fro-Leu-Asp-Thr-s-GlivVal-Leu-Asn-Ser-Ala-Met-Gly-Met-CThr^.Glu.Fhei-Fhe-iAr^.Thr, г,Pro)-Arg-A?a-(Gin г, Glu, Gly, Ala, Fhe )-Lys-Gly-Leu-Gln-Gly-Lys-Thr-:>-Lys-Gly-Ser-Pro-Lys-Ala-Tyr-S¿r-Asn-7hr-Glu-Pro-Asn-Lys-Asn-Asn-

3-Arg-Gln-Lys-Ile-Gln-Arg-Lys-Phe-Leu-Asp-Arg-Phe-Ala-Val-Asp-Gln »

Ka д1лянках можливо! посл1довност1 9-27, 164-203 , 288-314 , 4077, 650-592 триптичн1 пептиди можуть бути переставлен1 як в межах 1янск, так 1 м1ж ними. Ступ1нь спор1дненост1 можливо! ам!кокислотно1 :л1довност1 РУС з 1ншими каталазами неэначно в!др!эняетъся в1д тако-для.в1рог1дно виписаних д1лянок. Отже ми вважагмо, що ochobhí вис-зки щодо с-труктурно-функц1 ональних 1 еволюц1йних взаемов1дносин 1KOM в1рог!дн1.

-20-ЕИСНОВКИ

1. Отримако 48 триптичних пептид1 в модиф1ковано! за залишками мал.':1новим акг!дридом каталази та з'ясоЕано 1х повну або часткову будову. 34 пептиди з поел!довностями, що не перекриваються, нарахо: ють 572 ам1некиелотн1 залишки.

2. Одержано 24 триптичних пептиди немодиф1 ковано! каталази 1 в; начено !х будсву. 23 пептиди з по.-!л1довкоетями, що не перекриваю1 ся, мЮтять 137 ам1нокислотних залишк1в.

3. Стримано 5 бромц!анових пептид1Е, що нал1чу»ть 218 ам1нок] лотних залигклв, та з'ясовано 1'х побудову.

4. ¡з зазначеного набору пептид!в реконструйовано ш1сть д!ля] пол1пептидного ланцюга РУС, як! включають у сум1 557 ам1нокислои залишк1в (83 7, до ели ни ланцюга), а також в1д1брано 21 триптичний п* тид з посл!доеностями, котр1 не перекриваються, що складае ще 140 а\ нокислотних згл;:шк1в. ?еконструйован1 д1лянки м!стять вс! вежлив 1 функцЮнуЕання фермента залишки ам1нокислот.

5. По реконструйованих д!лянках визначено ступ1нь спор1днено< РУС з !наими каталазами та з'ясовано еволюц1йн1 взаемов1дносини 16 I талаз.

6. Пор1внюючи отриман1 дан! з ам!нокислотними посл1довностями каталаз, Еиписако найв1рог1дн1иу ам1нокислотну посл1довн!сть РУС, : нал!чуг 667 ам!нокислотних залишк!в.

СПКСОК ПРАДЬ. 0ПУБЛ1К03АЖХ' ПО TSJ,il ДИСЕРТАЦП

1. Левитина Т.Л., Гусак Н.М., Гудкова Л.З., Мирошниченко О.С., ?о-■дан Н.З., Атепалихина С.А., Кириленко М.Т., Козлов Э.А. Сравнительное шическое исследование первичной структуры каталазы гриба Pénicillium Itale // YII Бсесоюз.симлоз. по химии белков и пептидов: Тез.докл.-' шлинн, 1987.-С.65-65.

2. Левитина Т.Л., Гусак Н.М., Боднин К.З., Кириленко М.Т., Мироа-■Î45HKO О.С., Козлов З.А. Бромциановые фрагменты каталазы гриба Penl-111lum vitale /7 Биополимеры и клетка.-1939.-5, N5.- С.55-53.

3. Мирошниченко О.С., Кириленко М.Т., Левитина Т.Л., Гусак Н.М., :-злов Э.А. Бромциановые Фрагменты каталазы гриба Pénicillium vitale t школа-конференция "Структура и функции биополимеров": Тез.докл.-ьвов, 1989.

4. Левитина Т.Л., Гусак К.М., Гудкова Л.В., Мирошниченко О.С., гепалихина С.А., Козлов Э.А. Изучение аминокислотной последователь-осты гриба Pénicillium vitale; триптические фрагменты малеил-произ-одного фермента // YIII Всесоюз. симп. по химии белков: Тез.докл.-5илиси, 19SO.-C.99.

5. Мирошниченко О.С. Биогенез, физиологическая роль и свойства' аталаэы // Биополимеры и клетка.- 1992,- 8, N6.-С.3-25.

6. Козлов Э.А., Гудкова Л.З., Левитина Т.Л., Кириленко М.Т., Ми-ошниченко О.С. Дополнительное исследование триптических пептидов ка-алазы гриба Pénicillium vitale // Биополимеры и клетка.-1993.-9,N1.-.22-25.

7. Левитина Т.Л., Мирошниченко О.С., Гудкова Л.В., Бобровская .Т., Латышко Н.В., Козлов Э.А. Триптические пептиды малеил-каталазы риба Pénicillium vitale. 1. Выделение и аминокислотный состав // иополимеры и клетка.- 1993.- 9, N2.- С.3-8.

8. Левитина Т.Л., Бобровская М.Т., Гусак К.М., Мирошниченко О.С., удкова Л.В., Латышко Н.В., Козлов З.А. Триптические пептиды мале ил-аталазы гриба Pénicillium vitale. 2. Строение пептидов //Биополимеры

клетка.- 1993.- 9, N3.- С.42-45.

Зам. Формат 60x84/16 Обл.-вид.арк. 1,0

Шдписано до друку 17.02.1994 р. Тиран 100_

Пол1граф1чна дгльниця ITS ïm.М.М.Боголюбова АН Укра1'ни