Получение эффективных фотосенсибилизаторов на основе порфиринов и хлоринов, содержащих длинноцепные β-оксиалкильные заместители тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им. М.В.ЛОМОНОСОВА НИИ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ РАМН

ПОЛУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНЫХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ ПОРФИРИНОВ И ХЛОРИНОВ, СОДЕРЖАЩИХ ДЛИННОЦЕПНЫЕ Р-ОКСИАЛКИЛЬНЫЕ ЗАМЕСТИТЕЛИ

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Л

На правах рукописи

РЕШЕТНИКОВ Андрей Валентинович

Научные руководители -доктор химических наук Г.В.Пономарев и доктор химических наук, профессор, член-корр. РАМН В.И.Швец

Москва - 1999

СОДЕРЖАНИЕ 1.литер атурный обзор.....................................................................................................6

1.1. Тетрапиррольные соединения как фотосенсибилизаторы для фотодинамической

терапии рака..........................................................................................................................................................8

1.2. водорастворимые производные порфиринов.............................................................................10

1.2.1. "ФОТОФРИН И". История создания, получение и химический состав................................10

1.2.2. Другие тетрапирролы с порфириновым типом макроцикла...................................................15

1.2.2.1. Водорастворимые производные порфиринов, содержащие разнообразные ионизированные группы....................................:........................................................................................................................................18

1.2.2.2. Водорастворимые производные порфиринов, содержащие ковалентно связанные остатки аминокислот..................................................................................................................................................................30

1.2.2.3. Водорастворимые производные порфиринов, содержащие ковалентно связанные остатки Сахаров............................................................................................................................................................................33

1.2.2.4. Водорастворимые производные порфирин-нуклеозидов..................................................................37

1.2.2.5. Водорастворимые конъюгаты порфиринов с прочими биомолекулами........................................39

1.3. водорастворимые производные хлоринов и бактериохлоринов...........................................43

1.3.1. Производные хлоринов и бактериохлоринов, содержащие разнообразные ионизированные группы...............................................................................................................................................................45

1.3.2. Производные хлоринов и бактериохлоринов, содержащие ковалентно связанные остатки аминокислот.....................................................................................................................................................52

1.3.3. Производные хлоринов и бактериохлоринов, содержащие ковалентно связанные остатки Сахаров..............................................................................................................................................................59

1.3.4. Производные хлоринов и бактериохлоринов с нуклеозидами..............................................60

1.3.5. Конъюгаты хлоринов и бактериохлоринов с прочими биомолекулами................................61

1.4. Патенты в области водорастворимых тетрапиррольных фотосенсибилизаторов для ФДТ.66

1.4.1. Производные порфиринов.........................................................................................................67

1.4.1.1. "ФОТОФРИН II"................................................................................................................................67

1.4.1.2. Другие ФС порфиринового ряда.........................................................................................................68

1.4.2. Производные хлоринов и бактериохлоринов...........................................................................74

1.5. Заключение.......................................................................................................................................82

2.обсуждение результатов....................................................................................86

2.1. Синтез производных дейтеропорфирина-1Х, содержащих в боковых заместителях гидроксигруппу, отдаленную от макроцикла на 3 углеродных атома..................................................87

2.1.1. Синтез монозамещенных изомерных 1-гидроксиэтильных производных дейтеропорфирина-1Х.....................................................................................................................................87

2.1.2. Синтез монозамещенных изомерных 1-метил-2-ацетил-3-оксобутильных производных дейтеропорфирина-1Х.....................................................................................................................................93

2.1.3. Синтез дизамещенных 1-метил-2-ацетил-3-оксобутильных производных дейтеропорфирина-1Х.....................................................................................................................................97

2.1.4. Получение порфиринов, содержащих 1-метил-З-оксобутильные заместители....................99

2.1.5. Восстановление порфиринов, содержащих 1-метил-З-оксобутильный периферический заместитель............;........................................................................................................................................101

2.2. синтез триметилового эфира 2-дезвинил-2-(1-метил-3-ацетоксибутил)хлорина е6........105

2.2.1. Присоединение ацетилацетона к хлоринам...........................................................................105

2.2.2. Синтез триметилового эфира 2-дезвинил-2-(1-метил-2-ацетил-3-оксобутил)хлорина е6.. 107

2.2.3. Синтез триметилового эфира 2-дезвинил-2-(1-метил-3-оксобутил)-хлорина еб(ЬХХ1).... 109

2.2.4. Синтез производных хлорина еб, содержащих 2-(1-метил-3-(ацет)оксибутильный)-заместитель.....................................................................................................................................................110

2.3. получение водорастворимых форм синтезированных фотосенсибилизаторов..............111

2.4. Сравнение влияния вида, количества и положения 3-х типов заместителей на свойства ФС........................................................................................................................................................................114

2.4.1. Определение коэффициента распределения (Кр) между н-октанолом и фосфатным буфером, рН 7,4.............................................................................................................................................114

2.4.2. Оценка цитЬтоксической и цитофототоксической активности ряда синтезированных ФС.115

2.4.3. Предположения о влиянии вида, количества и положения 3-х типов заместителей на свойства синтезированных ФС.....................................................................................................................116

2.5. Получение липосомного препарата 2,4-ди(1-метил-3-гидрокси)бутил-дейтеропорфирина-IX, изучение его состава и свойств.............................................................................................................118

3. экспериментальная часть..............................................................................124

4.вывод ы...........................................................................................................................................142

5. литература

144

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время тетрапиррольные соединения (например, порфирины и производные ряда хлорофилла) вызывают большой интерес с точки зрения терапии злокачественных новообразований. В течение последнего десятилетия сформировался соответствующий клинический подход, именуемый фотодинамической терапией опухолей (ФДТ), состоящий в последовательных операциях системного или местного введения соединения (фотосенсибилизатора, ФС) в организм и лазерного облучения опухоли на длине волны, соответствующей одному из максимумов поглощения ФС (как правило, длинноволновому). Одной из проблем такого подхода является повышение селективности накопления ФС в опухоли [1], так как следствием низкой селективности является невысокая эффективность лечения и повышенная чувствительность кожи к дневному свету.

С целью повышения этой селективности использовались такие приемы, как:

1. химическая модификация периферических заместителей ФС [2 - 5] - актуальное и бурно развивающееся направление химии тетрапиррольных соединений, по которому ежегодное количество публикаций составляет несколько сотен;

2. ковал ентное присоединение ФС к моноклональным антителам против опухолеассоциированных антигенов [6, 7];

3. образование нековалентных комплексов ФС с липопротеинами [8];

4. использование ФС в виде липосомных препаратов [9, 10];

5. доставка с помощью векторов, способных селективно связываться с клеточными органеллами раковых клеток [10, 11].

В области синтетических работ по химии тетрапирролов имеется тенденция к созданию соединений с заданными свойствами на основе так называемого структурно-функционального подхода. Этот подход применим, в частности, к конструированию и получению новых фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии опухолей (ФДТ), характеризующихся повышенной туморотропностью и высокой эффективностью разрушения опухолевой ткани при облучении [2, 12 - 16].

Данная работа является логическим продолжением работ, посвященных исследованию химических свойств порфиринов и хлоринов, содержащих остатки Р-дикетонов, и их производных, с целью поиска среди них соединений, обладающих избирательной туморотропностью. По реакции Пономарева [17 - 20], порфирины, содержащие алкоксиметильные или 1-£лк)окси этильные заместители (например, тетраметиловый эфир гематопорфирина-1Х), легко и с высоким выходом реагируют с ацетилацетоном и другими Р-дикетонами в присутствии ацетата цинка с образованием Zn-кoмплeкcoв, из которых кратковременной обработкой НС1 получают порфирины. Целью данной работы был синтез совокупности таких соединений, различающихся природой макроцикла, положением и количеством заместителей, а также синтез ряда их производных, поскольку порфирины, содержащие остатки Р-дикетонов, никогда не исследовались с точки зрения их применимости в ФДТ. То же самое можно сказать и об их производных.

При написании литературного обзора работы ставилась задача собрать справочный материал, который бы охватывал все основные направления и подходы к получению ФС для ФДТ. Ввиду обширности этой задачи и необходимости уложиться в выделенный объем, в обзоре приводятся сведения только о водорастворимых ФС. Цитируемая литература в основном охватывает 1993-1997 годы и практически не перекрывается с приведенной в других обзорах.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ТЕТРАПИРРОЛЬНЫЕ * ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРЫ ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ РАКА

Условные обозначения, принятые в работе:

Русские

Латинские

б- бензол

БОЛ - большие

однослойные липосомы ДП - дейтеропорфирин-1Х ДЦГК - ВД'-дициклогексилкарбо-диимид

Кр - коэффициент

распределения

ЛПНП - липопротеины

низкой плотности

ЛП - липосомный

препарат - здесь: смесь

нагруженных липосом и

несвязавшегося

порфирина;

ЛФ - липосомная форма -здесь: нагруженные

липосомы, отделенные от несвязавшегося ФС; м - метанол

млл

мультиламеллярные липосомы;

МОЛ - малые

однослойные липосомы

НФДТ - направленная

фотодинамическая

терапия опухолей

ПГП - производное

гематопорфирина

р-в Виттига

(этоксикарбонилэтилен)-

трифенилфосфоран

р-р - раствор

св.о. - свободное основание

А -аденозин

Ala - аланин

Alk -алкил

Arg - аргинин

Asp - аспарагиновая

кислота

ВОР - бензтриазол-1-ил-окси-

трис(диметиламино)фо сфония

гексафторофосфат Behl - бактериохлорин BPD-производное бензопорфирина Bu - бутил (-С4Н9) С -цитидин Chi - хлорин СЫеб - хлорин ее Chol - холестерин dRib - дезоксирибоза еРС- яичный

фосфатидилхолин Et - этил G-гуанозин Gal - галактоза Glu - глюкоза Gly - глицин 3Н-Т - тимидин, меченный по 3'- и 5'-положениям тритием Hex - гексил (-СбНп) His - гистидин HpD - hematoporphyrin derivative Im - имидазол Lac - лактоза Leu - лейцин

NMor - морфолин N-Py+:C5H5N+-PGA - полиглюта-миновая кислота Ph(o): -C6H4-R(opto) Ph(m): -СбН4-Ы(мета) Ph(p): -C6H4-R(napa) Met - метионин Por - порфирин РРя - феофорбид а Рг - пропил Ру(т):

-CsH3N(-R)(MeTa) Ру+(т):

-C5H4N+-Me(-R)(MeTa) Ру(о): -C5H3N(-R)(opto) Ру+(о):

-C5H4N+-Me(-R)(opTo) РУ+(Р):

-C5H4N+-H(-R)(napa)

Руг - пиррол

Rib - рибоза

Sac - моносахарид

SDC-натрия

дезоксихолат

Ser -серин

SuOH-

-N-оксисукцинимид Т - тимидин ТНРС-л«езо-тетра[.м-гидроксифенил]хлорин Thr - треонин

1 2

т- толуол Lys - лизин Tos- тозил

ФИТ - фотоиммунотоксин M - по умолчанию 2Н TPS - 2,4,6

ФДТ - фотодинамическая Mal - мальтоза триизопропилбензол-

терапия опухолей Мап - маннит сульфонилхлорид

ФС Me - метил TPPS - сульфированные

фотосенсибилизатор(ы) Melm - 1-метилимидазол мезо-тетрафенилпорфирины

хм - хлористый метилен Ts-тозил

х- хлороформ U-уридин

Un - ундецил (-СцН2з)

Vi- винил

1.1. Тетрапиррольные соединения как фотосенсибилизаторы для

фотодинамической терапии рака.

В 1908 г. В. Хаузманн впервые подробно описал действие тетрапиррольного ФС гематопорфирина-IX (Рис. 1), получаемого из крови, на клетки и животных (цит. по [21]). В 1913 г. Ф. Мейер-Бетц ввел себе гематопорфирин-IX, чтобы изучить его биологическое действие (цит. по [22]). Его работа, как и работа его предшественника, не вызвала резонанса в области клинических исследований рака, но способствовала интенсивному исследованию процессов фотодинамического разрушения

(фотодеструкции) клеток.

В 1942 г. X. Аулер и Г. Банцер (цит. по [21, 22]) сообщили о сродстве гематопорфирина-IX к новообразованиям, что позже было подтверждено в работе Фигге и сотр. (1948) (цит. по [22]), где обсуждалась флюоресценция опухолеассоции-рованных порфиринов под лампой Вудса. Дальнейшее развитие ФДТ было в основном связано с олигомерными производными гематопорфирина-IX, о которых подробно говорится ниже.

В 1970-х гг [23] были in vitro исследованы на предмет фотоцитотоксичности наиболее распространенные порфирины (протопорфирин-IX, гематопорфирин-1Х, дейтеропорфирин-IX, 2,4-диацетилдейтеропорфирин-1Х, мезопорфирин-IX и ряд других), а в 1980-х синтезировано большое число разноообразных 2,4-ди(а-алкоксиэтильных) производных гематопорфирина-IX [24] (подробнее см. в обзоре [21]). Наибольшую активность проявили порфирины, обладающие промежуточной полярностью, причем активность возрастала с ростом липофильности (увеличение

Рис. 1.

Т'

СНСНз СНз X ь

СНз^/Ц^ у.—N N- 7 —СНСНз

4 М VN N- )

СНзЧЛ^ jjA, -СН3

сн2;СЙ2 сн2 ÇH2

соон СООН

ш

Ri=R?=-OH, М=2Н

размеров заместителей от С1 к С5). В это же время было показано, что на туморотропность влияет не только природа макроцикла, но и размеры противоиона для анионных ФС. Например, высокая тропность к опухолям была обнаружена у ионных комплексов 2,4-£шс-(а-метоксиэтил)дейтеропорфирина-1Х ("Димегина") Xl (R1-R2— ОМе) с И-метил-О-глюкозамином [25]: кратность накопления в опухолях по сравнению с окружающими тканями составляла 16-30. У гематопорфирина-IX эта величина была в пределах 2-10.

Среди прочих производных порфиринов значительное внимание в литературе уделялось сульфированным производным тетрафенилпорфина (TPPSX). Из них большой интерес исследователей вызывал порфин, содержащий в га?ра-положениях 4-х л*езо-фенильных заместителей сульфогруппы, - TPPS4 5: (Ri=R2=R3=R4:=-Ph(p)S03H) (Рис. 2). Были получены и использованы для ФДТ in vitro первые N-алкилированные производные л<езо-тетра[пиридил]порфина.

Насколько нам известно, первое упоминание в научной литературе о получении ♦

производных хлоринового ряда для ФДТ относится к 1986 г. [26], когда группа авторов (Дж.Боммер, Ж.Швейда и Б.Бирнхем) сообщила о результатагах своего поиска ФС, удовлетворяющего важнейшим требованиям ФДТ, а именно хорошей туморотропности и интенсивному поглощению в длинноволновой красной области спектра. Им оказался моно-Ь-аспартил хлорин е6 2:(Ri=Vi, R2=COAsp, R3=CH2COOH, R4=COOH). Фактически же впервые рассматривать производные феофорбида a 3:(Ri=Vi, R2=COOH, R3=COOMe) в качестве потенциальных ФС для ФДТ начали в 1984 г. в Японии (И.Саката и сотр.) [27]. Одновременно в США Дж.Боммером и Б.Бирнхемом для японской компании Nippon Petrochemicals Company был заявлен для патентования ряд производных хлорина е6 2:(Ri=Vi, R2=COOH, R3=CH2COOH, R4=COOH) и бактериофеофорбида a 4^R=COOH) как ФС для ФДТ [28].

Рис. 2.

1.2. Водорастворимые производные порфиринов.

1.2.1. "ФОТОФРИН II". История создания, получение и химический

состав.

В середине 50-х годов С. Шварц и сотр. предположили (цит. по [22]), что селективная флюоресценция злокачественных тканей после системного введения гематопорфирина-IX связана вовсе не с ним, а с примесями к нему, так как чистый гематопорфирин-IX получить непросто. Р. Липсон и сотр. (клиника Мэйо, США) в 1961 году (цит. по [22, 29]) сообщили о том, что локализуемость (туморотропность, тропность) гематопорфирина можно увеличить через получение смеси его ацетатов действием 5% серной кислоты в ледяной уксусной кислоте, когда дополнительно протекает олигомеризация полученной смеси in situ под действием серной кислоты. Препарат получил название HpD (hematoporphyrin derivative, в русскоязычной литературе А.Ф.Миронов использует аббревиатуру ПГП, что означает "производное гематопорфирина") и стал первым практически используемым препаратом для ФДТ.

В 1972 г. И. Дайамонд и сотр. (Калифорнийский Университет) критически осмыслили терапевтическое действие такой олигомерной смеси на примере мышиной глиомы, показав, что длительное освещение сенсибилизированных ею опухолей приводит к их деструкции (цит. по [21, 22]). Тогда же начались исследования и в Мемориальном институте Розвелл Парк (США) под руководством Т. Дауэрти [29] по применению HpD для диагностики и лечения рака. Группа российских исследователей (Я.В. Гавриленко, А.Ф. Миронов и др., 1982 г.) [30] использовала для диагностики рака гематопорфирин-1Х.

В 1977-78 гг. упомянутая группа исследователей из Мемориального института Розвелл Парк сообщила о предварительных результатах ФДТ 25 пациентов с рекуррентным раком кожи (цит. по [22, 29]), использовав смесь соединений, полученных по методике Шварца [29]. Впоследствии такая смесь получалась по методике Шварца-Липсона (1961) с модификацией Дауэрти (1979) (цит. по [31]), смысл которой состоит в дополнительном использовании раствора щелочи, как агента, способствующего оптимальному протеканию олигомеризации. Наконец, HpD был путем мембранной фильтрации (а впоследствии - гель-хрома