Превращения ароматической компоненты древесины в процессе биоделингнификации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ
|
Медведева, Светлана Алексеевна
АВТОР
|
||||
|
доктора химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Иркутск
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
1995
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.03
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
р Г Б О А
2 8 л.вг 1 ^государственный комитет российской федерации
по высшему образованию иркутский государственный университет
на правах рукописи
МЕДВЕДЕВА Светлана Алексеевна
превращения ароматической компоненты древесины в процессе биодежгшфшвди 02.00.03. - органическая химия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук
Иркутск - 1995
Работа выполнена в лаборатории биохимии лигнина Иркутского института органической химии СО РАН
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор
Ведущая организация: Новосибирский институт органической
химии СО РАН
заседании специализированного совета Д 063.32.02 по защите дис тэций на соискание ученой степени доктора химических наук при кутском государственном университете по адресу: г. Иркутск, Лермонтова, 126, комн. 430
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке унк ситета.
Отзывы просим направлять по адресу: 664033, Иркутск, а/я 4 ИНУС, ученому секретарю специализированного совета.
Автореферат разослан 1995 г.
Ученый секретарь специализированного
A.A. Семенов
доктор химических наук, профессор
B.К. Воронов
доктор химических наук, ведущий научный сотрудник М.Л. Рабинович
Защита диссертации состоится ■/-/ituu-SjuX' 1995 г. в -¿О
ча
совета, кандидат химических наук
общая характеристика работн
Актуальность темы. Загрязнение окружающей среды в последнее время приобрело характер биосферного процесса. Это повысило требования к безопасности производств, в том числе и целлюлозно-бумажным предприятиям.
Сульфатные и сульфитные традиционные технологии получения целлюлозы, все еще приоритетно использующиеся в России, позволяют вырабатывать целлюлозу высокого качества, но при этом включают в технологическую схему серо- и хлорсодержащие соединения, которые в процессах варки и отбелки превращаются в дурнопахнущие, токсичные и канцерогенные вещества (меркаптаны, диоксины), представляющие большую опасность для окружающей среды. Необходимость перевода целлюлозно-бумажных предприятий в ранг экологически безопасных стимулирует поиск альтернативных варочных процессов и бесхлорных способов отбелки.
Одно их новых направлений создания экологически безвредного процесса переработки древесины в целлюлозу связано с Использованием микроорганизмов (грибов белой гнили) и их ферментов в качестве де-лигнифицирукщих агентов.
Разработки технологий биоделигнификации для целлюлозно-бумажной промышленности активно ведутся за рубежом (Финляндия, США, Япония и др.) начиная с 80-х годов. За этот короткий промежуток времени на основе работ по химии и физиологии биоразложения лигнина и фенолов создана база теоретических знаний, позволяющая подойти к решению практических задач. Пристальное внимание исследователей к этой проблеме, выражающееся почти ежегодными международными конференциями (последняя была в Финляндии в 1995 г.), и быстрый научный прогресс этого направления связаны с достоинствами энергосберегающей и экологически безопасной технологии биоделигнификации, которая может быть реализована при условии рационально подобранных культур и ферментов определенного действия.
К началу наших исследований процессы биоделигнификации изучались с использованием узкого круга лигнинолитических культур, преимущественно гриба РЬапегос1\аеге сЬгузозрог1ш, поэтому вовлечение в сферу исследования других культур, изучение их индивидуальных особенностей биосинтеза ферментов и воздействия на лигноцеллюлозные
субстраты было и в настоящее время остается актуальным.
Всесторонее изучение проблемы биоделигнификации важно не ко для разработки научных основ новой технологии, но имеет и стоятельное теоретическое значение - создание цельной картины деградации лигнина в природе.
Целью настоящего исследования явилось изучение структуры мических превращений ароматической компоненты древесины - лиги при микробиологическом воздействии, исследование механизма фе татавной деструкщти лигнина и поиск оптимальных условий селект делигнификацш лигноцеллюлоз. Для достижения цели были поста следующие задачи:
- изучение особенностей химического строения субстратов -нина лисгаенницы и осины, химических связей лигнина с углевод лигноуглеводной матрице древесины;
- скрининг активных лигниндеструктирущих базидиомицетов;
- изучение реакций и механизма биотрансформации лиги ароматических соединений, моделирующих отдельные фрагменты и лигнина;
- изучение состава внеклеточных ферментов грибов;
- исследование регуляции лигнинолитической способности I и оптимизация условий ее максимального проявления;
- разработка основных подходов к технологическим прог варки и отбелки целлюлозы с включением стадии биоделигнификацг
Методы исследований. Для изучения реакций, происходящих с гагаом в древесине и небеленой целлюлозе при микробиологичес] энзиматическом воздействии, использованы классические химиче современные спектральные (ИК, УФ, ЯМР 1Н и 13С, ЭПР) и хромат фические (гель-хроматография. ТСХ, ГЖХ, ВЭЮС) метода, а также спектрометрия. Значительное внимание уделено усовершенствован* вестных, разработке новых методик анализа и получению с их пс количественной информации. Использован прием моделирования ре на соединениях, репрезентативно представляющих фрагменты и лигнина. Для этого синтезированы арилпропаноЕые и диарилпрош соединения с (3-0-4 связью, а также использованы лигнановые и I феноновые гликозиды, выделенные нами ранее из хвои листие! пихты и сосны.
Научная новизна работы. Впервые получены количественные характеристики внутримолекулярных C-O-G, G-C и СОО-связей и структурообразующих фрагментов в макромолекулах лигнинов лиственницы и осины. Установлены некоторые типы химических связей, формирующих ЛУ сетку лигноуглеводной матрицы древесины осины и лиственницы.В качестве селективных деструкторов лигнина отобраны и впервые изучены высокоактивные лигнолитики - грибы Trametes villosus и Phanerochaete sanguínea. Установлены пути биотрансформации лигнина осины, лиственницы и ароматических соединений, моделирующих структурные звенья лигнина, под действием выбранных грибов, а также комплекс и механизм протекающих при этом химических реакций. Доказана возможность реакции восстановления С^=0 —» Сс*.-0Н, предшествующей разрыву С^-С^ связи, и реакций поликонденсации, протекающих 1л vivo. Впервые исследован состав внеклеточных ферментов грибов Phanerochaete sanguínea и Trametes villosus. Установлена сопряженная регуляция лигнин-и целлюлозразрушащей способности грибов и найдены оптимальные условия проявления микроорганизмами избирательной лигнинразрушающей способности и биосинтеза ферментов лигнинолитического и гемицеллю-лазного действия.
Практическая значимость работы. Сложившиеся в результате исследований представления о процессах деструкции лигнина грибами и выявление сопряженной регуляции лигнин- и целлтолозразрушающей способности грибов имеют общетеоретическое значение и вносят существенный вклад в научные основы новой технологии, использущей микроорганизмы и их ферменты в процессах делигнификации. Теоретически обоснована и практически подтверждена возможность, эффективность и перспективность введения биологических стадий в технологию получения целлюлозы органосольвентным способом и технологию пероксидной отбелки. Эти исследования защищены патентом, авторским свидетельством и являются основой для разрабатываемой бесхлорной технологии пероксидной отбелки целлюлозы, включающей биологическую стадию.
Апробация работы. Результаты работы были представлены и доложены на научном семинаре "Превращения древесины при энзиматическом и микробиологическом воздействиях",' Рига, 1988 г.; Всесоюзной конференции "Основные направления и координация работ в области химии древесины и гемицеллюлозы до 2000 года", Ленинград, 1988 г.; Всесоюзном семинаре "Проблемы окислительно-восстановительных преЕраще-
ний компонентов древесины", Архангельск, 1990 г., 1992 г.; Всесоюз ном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии, Рига, 19S г.; Международном симпозиуме "Экологически безопасный завод будуще го в целлюлозно-бумажной промышленности, Ленинград, 199! г.; конфе ренции "Комплексное использование древесного сырья и пути решени экологических проблем на целлюлозно-бумажных предприятиях", Братск 1991 г.; 7 Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология", Москва 1991 г.; 6 Межреспубликанской школе-семинаре "Исследования в облас ти химии древесины", Рига, 1991 г.; Международной конференции Рар For-93, С.-Петербург, 1993 г.; 7 и 8 Международных симпозиумах "Хи мия древесины и получения бумажной массы", Пекин, 1993 г.; Хельсш ки, 1995 г.; региональной конференции "Производство экологическ чистой целлюлозы", Братск, 1995 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 48 печатных рг бот, получено одно авторское свидетельство и одно положительное ре шение о выдаче патента.
Структура и обЪвм работы. Диссертация состоит из введения 8 глав, выводов, списка цитируемой литературы из 440 наименований приложения. Работа изложена на 470 страницах машинописного текста включает 54 таблицы, 127 рисунков. Выносимые на защиту результат содержатся в главах 1-7, в главе 8 описана техника эксперимента.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
Лигнин и лигноуглеводные комплексы древесины лиственницы и осины Особенности строения лигнинов лиственницы и осины. В ochoi делигнификации и химической, и микробиологической лежат процесс! связанные с функционализацией и деструкцией лигнина, освобождена его из лигноуглеводной матрицы. Без знания структуры лигнина, ос< бенностей связывания его в лигноуглеводной матрице решать пробле! делигнифихации невозможно.
В качестве объектов исследования, то есть исходных субстрат для микробиологической деструкции, мы выбрали лигнины древесга осины (Populus trémula) и лиственницы (larix sibirica). Эти два bi да древесины, относящиеся к различным ботаническим группам - лис венных и хвойных пород соответственно, взяты потому, что осина, о1
носительно бедная экстрактивными веществами, часто служит моделью для разработки технологических процессов получения целлюлозы, что и мы использовали в своей работе. Лиственница же относится к одной из самых распространенных в Сибири, но малоизученных пород.
Сведения о лигнинах осины и особенно лиственницы немногочисленны. Они не дают полной количественной информации о структурообразующих фрагментах, функционализации полимеров и связывании их в жгноуглеводный комплекс. В связи с этим, мы изучили различия и особенности строения лигнинов, выделенных по модифицированному методу Бьеркмана, из здоровой древесины осины (ЛО) и лиственницы (ЛИ). Для этого мы выбрали метод ЯМР спектроскопии, как наиболее информативный и экспрессный при исследовании лигнина, и воспользовались методикой количественного расчета фрагментов, связей и функциональных групп, основанной на совокупном применении спектроскопии ЯМР 'н и 13С.
Согласно полученным результатам ЛЛ отличается от 10 (табл. 1, 2) не только меньшим содержанием ОСНд групп, отсутствием сирингиль-ных фрагментов, но и наличием в структуре карбоксильных групп, большим содержанием карбонильных, гидроксильных групп, Сар-0- и Сп -С связей, то есть он является более окисленным и более конден-
ду
сированным. Существенным отличием ЛО является более высокое содержание алифатических атомов углерода (С0ок), чем это предопределяется фенилпропановым звеном лигнина. Эти результаты согласуются с работами Лапан и сотр., доказавшими присутствие в ЛО алифатическго фрагментов, представленных высшими спиртами и жирными кислотами. Особенностью исследованных лигнинов является наличие слозкноэфирныз групп, не учтенных общеизвестными структурными формулами. Количественный расчет показал, что в ЛО их ~ в 1.5 раза больше, чем в ЛЛ.
1Л состоит из гваяцилпропановых звеньев (&), кроме того, найдены 3,4-дигидроксизамещенные фрагменты (С"). Соотношение эти: структурных единиц составляет 86:14. ЛО содержит сирингильные (3) гваяцылъные и п-гидроксифенильные (Н) звенья в соотношении 58:28: 14. На основании подученных результатов были составлены эмпиричес кие формулы ЛЛ и 10, рассчитанные на фенилпропановую единицу (1 2), и средние структурные формулы (3, 4), рассчитанные по результа там ЯМР спектроскопии на ароматическое кольцо, последняя (4), ка видно, позволяет наглядно выявить наличие аномальных алифатически
Таблиц
Распределение атомов углерода по структурным фрагментам лигшшов лиственницы и осины (на одно ароматическое кольцо)
ФрагментКоличество атомов* Диапазон ХС в спектре ЯМР 13С,
м.д.от ТМС; тип атомов углерод
лиственница осина
СО
соон
COOR
V0(1) (2)
(3)
(4)
(5)
Vе
СН (1 ) (2)
(3)
(4)
СНО CHgO
СН3О
СНр Салк
0.274 0.130 210-185;
0.074 0.000 185-172;
0.256 0.403 172-165;
0.000 0.117 162;
0.000 0.052 160-154;
0.000 1.066 154-151 ;
2.212 0.572 151-140;
0.000 0.539 135-134;
1.517 1.184 140-125;
0.783 1.576
0.931
0.657
0.860 0.333 0.323
0.620
0.572 0.000 0.805 1 .050 2.751
1 .379
1 .444 0.650 0.325
0.461
С4Н,Н'**
с4 н> сз 4G'G' с аС°! С3,5 S;
С3,4 G'G';C3,5 S'
с4 s,s-
C^S.S'.G.G'.-O^ S,S'; C2,6H'H' 119; C^H.H' 131; С9 g H,H* 125-117; Cg'G.G'; 117-110; C2 5 G,G'; C3 5 H,H' 107-103; С^'б S,S' с abo 90-65; CQ! в a-0-4, p-0-4; C7 в p-p,
65-60; Ст в р-0-4, Н. Р-5;
57-54; 0СН3
54-52; Сд в р-1, р-р, р-5
35-10; СН, СНР, СНо группы, не связанные с кислородом
доля атомов углерода ароматичес кого кольца (степень ароматично сти)
* относительная ошибка определения параметров не превышает Б.4%
** S,H,G - S',H',G' структуры, замещенные по фенольному гидрокси.
Таблица 2
Количество основных связей и фрагментов в лигнинах лиственницы и осины (на 100 ароматических колец)
Связь, Листвен- Осина Относитель- Обозначение
фрагмент ница ная ошибка,%
Сар-°-С 98 61 14.0 Простые эфирные арил-алкильные и арилариль-ные связи
Vе 52 118 10.3 Сар-С связи, определя-
щие степень конденси-рованности лигнина
Сар-°Н 37 29 12.0 Фенольные ОН-группы
Б.ё' 0 58 10.3 Сирингильные звенья
о,с 86 28 12.0 Гваяцильные звенья
Н,Н' 0 14 9.5 пара-Дигидроксифениль-ные звенья
С" 14 0 9.3 3,4-Диоксифенильные звенья
Б с О.С0 0 15 9.1 Б с са=0 группой
С с аСО 33 0 9.1 й с Са=0 группой
Сбок 85 556 9.5 Сумма атомов углерода в боковой цепи без ОС!
структурных звеньев в молекуле ЛО:
^.ОО^.^З.ЗЭ^^О.вб'- (1) С9.35Н7.27°3.25(0С%)0.87" (3) ^.га^.Э^З.б?*001^!.^" (2) С11.54Н10.81°4.32(0СН3)1.44-(4)
Свойства и образование лигноуглеводных связей. Наличие химических связей лигнина с углеводами (лигноуглеводные - ЛУ связи), формирующих лигноуглеводную матрицу древесины, долгое время было дискуссионным вопросом. Одна из причин этого заключается в трудности исследования ЛУ связей, а именно, в отсутствии методов избирательного воздействия на них. В настоящее время признано существование нескольких типов ЛУ связей, доминирующими среди которых являются
сложноэфирные, простые эфирные и фенилгликозидные. Учитывая вал ность знаний характера ЛУ связей в процессах делигнификации, ь изучили их свойства в препаратах лигноуглеводных комплексов ост (ЛУКО) и лиственницы (ЛУКЛ).
В условиях кислотного и ще лочного катализа происходит ги; ролиз гликозидных и сложноэфирж ЛУ связей, присутствующих в Ш и ЛУКЛ, о чем свидетельствус уменьшение
и 1000-12(
2'
1400
1600
1400
1С00
О, си"
Рис. 1. Фрагменты ИК спектров (КВг) лигнина лиственницы (1), лигнина осины (Г), ЛУКЛ (2), ЛУКО (2') и осадков, выделенных из щелочных (3, 3') и кислотных гидролизатов (4, 4').
интенсивности поле поглощения 1730 см~^ см-"* в ИК спектрах негидролизус мых остатков ЛУК (рис. 1). В о< разовании сложноэфирных ЛУ связ< участвуют фенолокислоты, в ЛУ1 еще и глюкуроновая кислота, обн; руженные в гидролизатах ЛУК нар; ду с моносахарами.
Идентифицировать фенил-, б нзилгликозидные связи в этих у ловиях гидролиза практически н возможно. Об этом свидетельств вал подобный эксперимент, выпо ненный нами с лигнановыми глик зидами, моделирующими фенил-, б нзил-, алкилгликозидные связ
Фенил- и бензилгликозидные связи с различной скоростью гидролизу» ся в условиях кислотного и щелочного катализа. Отличаются лишь а килгликозидше связи. Они остаются устойчивыми в щелочной среде следовательно сохраняются в негидролизуемом остатке ЛУК после щел чного гидролиза. Это подтверждают и гель-хроматограммы остатк ЛУКО и ЛУКЛ после щелочного гидролиза, в которых регистрируют синхронными пиками лигнин и углеводы (рис. 2). Очевидно нельзя о рицать присутствия в ЛУК также трудногидролизуемых алкилэфирных С-С ЛУ связей. Фенилгликозидные ЛУ связи удалось обнаружить толь
в ЛУКЛ при ферментативном гидролизе с р-глюкозидазой, в результате которого в ЛУКЛ увеличивалось содержание фенольных гидроксильных групп (от 0.26% до 0.90%).
Рис. 2. Гель-хроматограммы (Г}~75; ДМСО) ЛУКО (а), ЛУКЛ (а') и продуктов их превращения после щелочного гидролиза (б, Ь'); - лигнин, ---- углеводы.
Дифференцированное определение лигноуглеводных связей, как показали наши исследования, выполненные на модельных соединениях, можно провести в условиях электрохимического окисления в присутствии переносчиков . электронов с различным окислительно-восстановительным потенциалом (табл. 3).
Исследование ЛУКЛ этим методом позволило доказать наличие у него фенил-, бензил- и алкилгликозидных связей.
Синтез алкилгликозидных связей. Существование сложноэфирных и простых эфирных ЛУ связей доказано и подтверждено встречным синтезом. Данные же об алкилгликозидных связях отсутствуют. В связи с этим, мы исследовали возможность образования алкилгликозидных ЛУ связей при электрохимическом окислении фенилпропановых соединений изоэвгенола (1), ацетата изоэвгенола (2) и гваяцилпропана (3) в присутствии 2,3,4,6-тетраацетата глюкозы (ТАГ). а,р-Алкилгликозид-ные связи (5, 6) образуются лишь в том случае, когда гликозилирова-нию подвергается изоэвгенол (1), в структуре которого сочетаются
Условия
Таблиц
и продукты электроокисления лигнановых гликозидов
Тип гли-козидной связи
Т? С Количест- Лигнано-во элект- ' вый гли— ричества, козид Р/моль
Продукты окисления Углеводы
до гидролиза
после гидролиза
Переносчик 0.025 н К.1 (Е = 0.35 В); рН 8
бензил- 60 6 + -
фенил- 60 14 - +
алкил- 60 14 - +
Переносчик 0.2 н КВг (Е = = 0.43 В); рН 11
бензил- 20 10 + -
фенил- 20 18 + t
алкил- 20 14 - +
Переносчик 0.2 н КС1 (Е0 = 1.17 В); рН 8
бензил- 60 60 + -
фенил- 60 60 + -
алкил- 60 60 + —
фенольный гидроксил и двойная связь в алифатической цепи. Образ ние а-гликозидной связи происходит через ион феноксония (4):
СН?
р сн
»
а сн
а
СН3 ■СН
I
сн
С Нз СНз
I I
СН-0СБН705СДс.\ сн-осен7оЕс
осн.
-ге
Ф
-н
Л
Цч
осн
ТАГ
сн
л
»л
ТАГ
ОН
1
ОСНп
5
СН-ОСБН7ОеС
ОСНп
он
При участии других реакционных частиц, таких, как катионрадика. феноксирадикал, которые могут образовывать соединения (2иЗ), ледние тоже подвергались бы гликозилированш. Структуры, под
(1), в макромолекуле лигнина практически отсутствуют, поэтому есть основания считать, что алкилгликозидная Ш связь возникает при окислении мономерных предшественников лигнина и ее образование подобным путем происходит параллельно с процессом сшивания мономерных молекул в полимерную молекулу лигнина.
Лигнинразрушащие грибы и энзимология биодеструкции лигнина Выбор лигнинразрушающих грибов. Одним из основных требований к микроорганизму делигнификатору является избирательность разложения лигнина. Большинство грибов, в том числе наиболее изученный гриб Ph. chrysosporim, обладают довольно мощной целлюлазной активностью: наряду с деструкцией лигнина, они потребляют значительное количество целлюлозы. Поэтому первоочередной задачей исследований в данном направлении является поиск видов грибов, способных к селективной деструкции лигнина.
Критериями отбора базидиальных грибов послужила лигнинрузруша-щая способность. Среди 11 предварительно отобранных культур мы выбрали базидиальные грибы Phanerochaete sanguínea (Fr.) Bres. BKMF-2487D (предоставлен д.б.н. В.А.Соловьевым, ЛТА, г.Санкт-Петербург), Tramites (Corlolus) vlllosus (Lloyd) Krelsel 0276 (ВНПО Гидролиз-пром, г.Санкт-Петербург), обладающие наибольшей избирательстью деструкции лигнина.
Селективная лигниндеструктирующая способность грибов была подтверждена исследованием изменений клеточной структуры древесины осины и лиственницы, пораженной выбранными грибами, и для сравнения грибом Ph. chrysosporim, методом электронной микроскопии, которое показало, что Ph.chrysosporlum с большой скоростью утилизирует все компоненты клеточной стенки одновременно. В отличие от него, грибы Т.vlllosus и Ph.sanguínea осуществляют избирательную делигнификацию клеточных элементов древесины, что выражается в преимущественном разрушении лигнифицированных тканей срединных пластинок, пороЕых мембран и клеток лучевой паренхимы.
Ферментные комплексы грибов Phanerochaete sanguínea и Trametes vlllosus. В основе биотехнологий лежат ферментативные процессы. Поэтому нами был изучен состав внеклеточных ферментов, продуцируемых Ph. sanguínea и Т.vlllosus. Активность ряда энзимов, определенная в
бесклеточных культуральных фильтратах грибов, представлена в тас це 4.
Табдш
Активность внеклеточных ферментов грибов T.villosus и Ph.sanguínea (мкмоль/мин на 1 мг белка)
Активности T.villosus Ph.sanguínea
Лигниназная 0.10-0.20 нет
Лакказная 0.20-0.55 нет
Мп-пероксидазная нет 0.05
Арил-р-глюкозидазная 0.23-0.71 0.10-0.15
Ксиланазная 0.50-0.60 0.35-0.40
КМЦ-азная 0.01-0.03 0.01-0.03
По фильтровальной бумаге 0.02-0.04 0.03-0.05
Из лигнинолитических ферментов у T.villosus были тестиро лигниназа и лакказа, а у Ph.sanguínea - Mn-зависимая пероксид Активность Mn-пероксидазы значительно возрастает (0.75 ед/мг) увеличении содержания в питательной среде ионов Мп2+ (50 мг/л).
Как показали исследования последних лет, лигниназнзя ак ность коррелирует со способностью .гриба окислять вератровый спи вератровый альдегид. Эту реакцию мы зафиксировали при инкубиров Ph.sanguínea на среде с вератровым спиртом, т.е. в условиях 1п yo, хотя в фильтратах гриба ее не наблюдали. Такое несоответств опытах дало основание предполагать, что лигниназа Ph.sanguínea локализована в клетке, либо структурно включена или связана с бранами клеточной стенки. Последнее предположение было подтвер» тестированием лигниназной активности (3-4-10-3 ед/мг)в фермеь препарате, полученном после растирания мицелия.
Ph. sanguínea и Т. Ylllosus продуцируют высокоактивный к леке гемицеллюлазных ферментов. Ферементная активность грибов е сит не только от вида микроорганизма, но и от сроков культнЕИ!
ния (рис. 3). Это позволяет получить ферментные препараты, различающиеся качеством и активностью ферменТов.
Рис. 3. Активность внеклеточных ферментов Т. villosus: 1 - лигни-назная, 2 - лакказная, 3 - ксила-назная, 4 - целлюлазная.
ЬОЬРАСТ КЧАЬТЧРЫ( СУГ
Реакции и механизмы микробиологической деструкции лигнина и ароматических соединений
Изучение ферментативных превращений, происходящих с лигнином во время микробной деструкции, мы осуществили, используя два подхода:
- исследовали изменения химического строения и функционализа-ции лигнина (биолигнина), выделенного из биологически разрушенной древесины;
- моделировали биохимические реакции на ароматических соединениях, имитирующих фрагменты и связи лигнина.
Пути биотрансформации лигнина древесины осины и лиственницы грибами Phanerochaete saiiflulea и Trametes villosus. Биолигнины (114) были выделены из древесины осины (БЛО) и лиственницы (БЛЛ), предварительно подвергнутой с различной продолжительностью воздействию грибами Ph. sanguinea и Т. villosus. Степень разрушения древесины характеризовали потерей массы (ГОД, %).
Биолигнины (1-14) в отличие от ЛО и ЛЯ содержали от 7 до 25% химически связанных углеводов, подобно ЛУКО и ЛУКЛ. БЛЛ отличался от ЛУКЛ отсутствием фенилгликозидных ЛУ связей. Очевидно, внеклеточная ß-глюкозидаза грибов катализировала их гидролиз непосредственно в лигноуглеводной матрице древесины.
Количественный расчет фрагментов и связей биолигнинов (1-14) методом ЯМР ^С и % выполнили с учетом содержания углеводов (табл. 5; отнесение сигналов атомов углерода выполнено, как в табл. 1).
Анализ полученных результатов показал, что биовоздействие на лигнин является окислительным процессом: биолигнины (1-14) по срав-
Таблица 5
Количество функциональных групп, фрагментов и связей в биолигнинах осины (в расчете на 100 ароматических колец)
Структурный фрагмент Phanerochaete sanguínea Trametes villosus
осина лиственница осина Относительная ошибка, %
потеря массы древесины / номер лигнина
Биолигнин 1.5 2.3 G.4 9.6 13.0 17.2 23.0 2.1 4.5 6.9 14.5 4.9 3.3 15.9
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
СО 40 75 54 42 88 124 75
С00' 90 146 98 114 172 194 131
ОСН3 40 131 51 104 50 98 39 134 27 127 28 112 25 138
S.S' 54 43 48 52 54 47 49
G,G' 24 18 3 32 19' 35 39
Н,Н' 13 14 12 12 14 13 11
G' ' 9 25 37 6 13 5 0
S с Са=0 - 21 - 19 - - -
G с Са=0 - - - - - - -
Сар-° сар-°-с 2Сбок 90 81 113 84 106 78 126
98 117 82 73 131 130 76
536 460 569 541 601 704 586
CHgO 112 70 114 102 91 94 100
fa 0.44 0.46 0.47 0.46 0.44 0.42 0.42
46 23 35 51 38 25 24 9.3
97 42 90 94 56 79 '84 10.3
49 36 50 47 34 39 18 12.0
85 93 90 78 131 137 131 9.5
- - - - 50 59 49 10.3
85 93 91 79 30 18 32 ' 12.0
- - - - 10 11 14 9.5
15 7 9 21 10 12 5 ¡
- - - - 14 18 21 9.5
51 31 51 54 - - - 9.1
144 155 141 139 143 97 120 10.3
110 85 69 102 78 108 99 14.0
386 342 345 387 363 389 382 9.5
70 65 57 59 121 125 121 6.4
3.50 0.55 0.54 0.58 0.51 0.52 0.49 4.0
нению с ЛО и ЛЛ содержат больше СО, С00 и ОН фенольных груш (табл. 5, сравнить с табл. 1, 2). Окислительные процессы затрагивают как Са, так и С^, атомы пропановой цепи.
Окисление С^ атомов (уменьшение CHg-O групп) не приводит к появлению карбоксильных групп, следовательно сопровождается либо разрывом Ср-С^, связи, либо реакцией этерификации. Вероятность осуществления этих реакций требует дополнительных доказательств. Наличие большого количества сложноэфирных связей в биолигнинах, особенно БЖ), может служить только косвенным доказательством реакции этерификации.
При биологическом воздействии на лигнин происходят реакции де-метоксилирования. Деметоксилирование сирингильных структур ЛО протекает даже при небольших (1.5%) 1Щ, в то время как гваяцильных в ЛЛ - при ПМД не менее 14.5%.
Деструкция лигнина под действием Ph. sanguínea происходит за счет разрыва ариларильных и алкиларильных, в том числе Сар~Са связей, об этом позволяет судить более низкое количество атомов углерода ароматических колец, связанных с атомами углерода боковых цепей и других ароматических фрагментов (связь Сар-С), в БЛО (1-11), по сравнению с ЛО. Для большинства же базидиомицетов наиболее характерной является реакция деструкции Са-Ср связи. Ph. sanguínea не затрагивает эти связи (CÍ0K), их количество в БЛО (1-11) не уменьшается. Под действием же гриба Т. villosus происходит разрыв преимущественно алифатических С-С связей лигнина, о чем свидетельствует уменьшение в БЛО (13, 14) в ~ 1.3 раза длины боковых цепей.
Т. villosus и Ph. sanguínea не разрушают ароматические кольца в сирингильных структурах лигнина осины: степень ароматичности (1а) в БЛО (1-7) не изменяется по сравнению с Гд ЛО. В БЛЯ (8-11) TQ меньше, чем в ЛЛ, поэтому есть основание считать, что гриб Ph. sanguínea способен разрывать С-С связи ароматического кольца в структурах, имеющих гваяцильннй или 3,4-дигидроксизамещенный тип кольца. Последняя реакция подтверждена идентификацией цис-цис муконовой кислоты при окислении пирокатехина грибом Ph. sanguínea. Однако на более сложных модельных структурах эту реакцию воспроизвести пока не удалось.
Одновременно с реакциями разрыва Сдр-С связей в лигнинах под действием Ph. sanguínea протекают реакции, приводящие к образованию
простых эфирных связей (С -0-С). В присутствии Т. villosus прои! ходит образование не только Сар-0-С, но, в отдельных случаях (Е 12), и Сдр-С связей. Это приводит к поликонденсационным процессам
Молекулярные массы некоторых биолигнинов, определенные_метод гель-хроматографии, выше, чем ЛО и Ы (рис. 4). Изменения Mw в з; висимости от ПМД происходят не линейно и подтверждаются изменения! суммарного выхода продуктов нитробензольного окисления этих лиги нов (рис. 4).
Экстремальные вариации величин ttw можно объяснить двумя прич] нами. Одна из них - способность внеклеточных ферментов грибов да фундировать в клеточные стенки, деструктировать лигноуглеводную м, трицу и обеспечивать со временем более легкую экстракцию высоком^ лекулярного лигнина. С этих позиций увеличение выхода лигнина п извлечении его из древесины осины с ПМД > 10% и одновременное ув> личение Mw (рис. 4) можно рассматривать как свидетельство выделен из древесины более высокомолекулярного лигнина. Подобное заключен позволило объяснить отсутствие прямой зависимости между изменения; количеств структурных характеристик биолигнинов с увеличением П (табл. 5), которая нарушается в образцах с ПМД > 10Ж, т.е. с поя лением качественно нового лигнина.
Другая причина - непосредственная поликонденсация лигнина, к торая может быть следствием появления феноксирадикалов за счет де тельности фенолоксидаз грибов. Изменение молекулярно-массовых хар ктеристик ЛО, взятого в качестве субстрата (рис. 5), наглядно св детельствует о том, что воздействие грибов, в частности, Ph. sang inea, в начальный период инкубирования, до 5 суток, приводит к п ликонденсационным процессам.
Следовательно, при биоделигнификации древесины в условиях vivo, а не только In vitro, как было показано другими исследоват лями, наряду с деструкцией лигноуглеводной матрицы, способствуют более легкому освобождению высокомолекулярного лигнина, и окисл тельной деструкцией самого лигнина, на ранних стадиях биовоздейс вия происходят конкурирующие процессы, приводящие к увеличению м лекулярных масс лигнина. Однако превалирующими в конечном итоге я ляются процессы деструкции. Судя по появлению низкомолекулярн продуктов деструкции, в присутствии гриба Т. villosus ЛО разрушав ся быстрее (на 3 сутки), чем JUI (только на 6 сутки).
М 10-юь 19
Рис. 4. Зависимость изменения М^ биолигнинов (1-7) (1), продукте! их нитробензольного окисления (2) и выхода при экстракции (3) о1; ШД после воздействия гриба Р1г. зап£д1пеа на древесину осины.
биолигнинов после деструкции лигнина осины (ЛО) грибом Р1гапе:гос}га-еге зап£и1пеа с различной продолжительностью инкубирования: 1 •- Е сут, 2-15 сут, 3-17 сут, 4-25 сут.
Вопрос о том, когда происходит окисление лигнина в полимерн молекуле или после ее фрагментации все еще остается не выяснении Наши исследования, выполненные с использованием метода гел хроматографии, показали, что реакции окисления протекают как в ни ко-, так и высокомолекулярных составляющих лигнина. Биодеструкц ЛО грибом Р11. аап£и1пеа начинается с окисления низкомолекулярн компонентов полимера (рис. 6, кривая 1), но при продолжении инкуб рования на 15-25 сут окислению подвергается и высокомолекулярн часть полимера (рис. 6, кривые 2-4).
Рис. 6. Изменение степени окисления фракций лигнина осины (ЛО> noi ле деструкции грибом Phanerochaete sanguínea с различной продолж! тельностью инкубирования: 1 - 5 сут, 2-15 сут, 3-17 сут, 4 - : сут.
Т. Yillosus, в отличие от Ph. sanguínea окисляет одноЕремеи высоко- и низкомолекулярные .составляющие лигнина. Деструкция лигнз на грибом Т. Yillosus происходит быстрее: за 7 сут инкубирования < разрушает 57% ЛО, a Ph. sanguínea за 15 сут - только 38%.
Наиболее вероятные пути окислительной деструкции лигнина rpi бами Т. Yillosus и Ph. sanguínea представлены на рис. 7.
Реакции биотрансформации ароматических соединений грибами Тг; metes Yillosus и Phanerochaete sanguínea. Для подтверждения pe ai ций, происходящих с лигнином, и установления их механизма мы изуч! ли биохимические процессы, протекающие под действием Ph. sanguine и Т. Yillosus на модельных соединениях, репрезентативно представлг щих фрагменты и связи лигнина, отличающихся типом замещения колы (о-дигидрокси, гваяцильный, .вератрильный, сирингилъный), а тага
а лкиларильный н2сон
„ 1 / w
Ph.sanguinea нс-о-{
.Yilloa
он
н3сон T.ylllosua
не— о— О-1*-
НСОН ОСНа
' разрыв
а Р
НСО ОСНз
сно
осн.
Т. villosus
а
о- L
деметокси-лиров а нив Ph. sanguinea Т. villosus
осн3
О - L
OCH; о- L
L = н или ЛИГНИН
НаСОН
HC|"°"0"L4 ОН ОСНз
Са окисление
Ph. sanguinea Т. villosus
Н2СОН
I • f\
HC-О-( \-Lj_
СО о с н 3
?о
Н2С0Н
I
НС—о-
I
НСОН ОСН з
с
I
О- L
ОН
СН30'
I I
O-L o-u
ариларильное расщепление
Ph. sanguinea Т. villosus
OCH-
O-L
XL, • а
CH30' l "OH O-L
OH O-L
Рис. 7. Схема биодеструкции лигнина грибами Trametes villosus и Phanerochaete sanguinea.
замещением и степенью окисления атомов углерода пропановой цепи: о-дигидрокси-
НО-/ ) Н0-
но7 Н^СО
сиринг ильный
НоСО ¿5 Ч_
но-0
Е3С0/
гваяцильный ^-С-СН-С
вератрильный НдСО-^З-С-НдСС/
Н, ОН или =0 И9= Н; ОН;-0 или -0-
Н1Н2
НдСО7 (Р-0-4 )
НпСО7
И3= СНд или СН^Н ° (р_0.
Основным направлением деструкции вератрилпропзноЕых и ъерат рилзамещенных р-0-4 алкилариловых эфиров под действием гриба Т. у1 Ноэиз, как и лигнина, является разрыв алифатической цепи,, которы осуществляется по Са-Ср связи (Рис. 8,9).С меньшим выходом окислен ных интермедиатов (10) происходит Са окисление, С,'
100
г>о
60
40
го
снгон
,1-о-р
Т.СУГ
Рис. 8.Содержание в культуральных фильтратах Т. уШоэиз субстрат р- гваяцилового эфира вератрилпропандиола-1,3 (7) и метаболитов вератрового альдегида (8), вератрового спирта (9), р-гваяциловог эфира вератрилпропанон-1-ола-З (10).
Рис. 9. ВЭЖХ (БПазогЪ 5-С18) 8 сут культурального фильтрата Т. VI Ноэиа. Элюент метанол-вода, рН 3.7. Градиент: 500 мкл 50% и 160 мкл 60% метанола.
Сочетание подобных реакций, как известно, катализируется лиг-ниназой, присутствие которой в культуральных фильтратах Т. vlllosus мы доказали, поэтому для объяснения окислительных процессов, происходящих с соединениями [3-0-4 типа, мы использовали механизм реакций, предложенный для лигниназы. Согласно этому механизму под действием активированной пероксидом водорода лигниназы за счет одно-электронного переноса с субстрата (7) на гем фермента происходит образование катион-радикала (11) на кольце А субстрата. Основным направлением деструкции катион-радикала является фрагментация на катион (12) и радикал (13). Катион (12) стабилизируется с выбросом протона, образуя вератроЕЫй альдегид (8), идентифицированный нами. Возможен второй путь деструкции катион-радикалов через депротониро-вание с образованием радикала (14), а потом а-кетона (рис. 10). У субстратов, содержащих в пропановой цепи Сд=0 группу (^.проявляется резистентность к биотрансформации.
Биодеструкция вератрилпропановых субстратов грибом Т. yillosus сопровождается окислительно-восстановительными реакциями Са р=0
Сд р- ОН. Между реакциями устанавливается динамическое равновесие. Оно со временем сдвигается в сторону образования соединений с группой Са р-ОН,' которые подвергаются деструкции (рис. 11,а). Установление динамического равновесия подтверждается комплементарно-стью кинетических кривых окисления-восстановления вератрилметановых субстратов, например, вератрового альдегида (8) и вератрового спирта (9), сохраняющих молярное соотношение на начальных этапах биовоздействия (рис. 11,6).
Ph. sanguínea, так же как и Т. vlllosus, осуществляет окислительно-восстановительные реакции по Са> Ср положениям в вератрилпропановых и вератрилметановых субстратах, но не разрывает Са-Ср связь.
Восстановление карбонильной группы не характерно для лигниназы. Надо полагать, что в данном случае эта реакция катализируется алкогольдегидрогеназой, субстратная специфичность которой, проявляется не только к Са ( реакция отмечена ранее в случае восстановления вератрового альдегида в вератровый спирт), но и к Ср карбонильной группе в ряду вератрилпропановых субстратов. У р-0-4 соединений эту реакцию зарегистрировать не удалось.
Гваяцилпропановые субстраты и р-0-4 эфиры, содержа™-.'? свобод-
сн2он (сн3)
сн,он
о сн3 лигниназа/н
л
ОС Н з
осна
-е
' • ¡¡п
осн
осн3
О С Н з
С Н 2 ОН
нсчЛ^Х)
оснз -е , н
ОСН; ОСН-,
-Н
12
о н
V
ОСНа
ОСН з ОСНз
10
Оэ
л?
ОСН.
1 3
но'
ОСН3 СН2ОН
I ОСНз ОСНа 8
Рис. 10. Схема окисления (З-гваяци л о в о г о эфира вератрилпропандиола-1,3 (7)
| ОСНз
осн3
Рис. 11. Содержание в культуральных фильтратах Т. yillosus субстрэ тов вератрилпропандиола-1(15) (а) и Еерэтрового альдегида (3) (б) и метаболитов вератрилпропанон-1-ола-2 (16), вератрштропандио-ла (17), вератрового спирта (9)-
ный фенольный гадроксил, значительно быстрее, чем их гидроксилзаме-щенные аналоги подвергаются биотрансформации грибами, особенно в случае с Т. villosus - за 24-48 часов. Скорость включения субстратов в метаболизм грибов зависит от типа замещения ароматического кольца и коррелирует с величинами констант Михаэлиса-Ментен (К^, ммоль), рассчитанных для соединений, окисленных лакказой: вератрол - 0; гваякол - 0.39; пирокатехин - 0.33; сирингол - 0.13.
Биотрансформаидя фенольных субстратов происходит за счет конкурирующих реакций деструкции и поликонденсации. Преимущественным направлением биотрансформации фенольных субстратов грибами является поликонденсация. Методом гель-хроматографии было установлено, что образующиеся полимеры полидисперсны, содержат от 10 до 30 мономерных единиц. Рассчитанные величины М^ лежат в интервале 900-1600 Д.
В процесс поликонденсации вступают не только исходные субстраты, но и продукты их деструкции по Ca~Cß связи, содержащие феноль-ные гидроксильные группы (идентифицированы олигомеры ванилина из гваяцилпропанона-1, т/в 302 и 452).
Качественный и количественный анализ спектров ЯМР1Н и1ЬС по-
лимеров показал, что поликонденсация происходит за счет образовг ариларильных простых эфирных и С-С связей, которые реализуются С2(6)' с4 и ярбимУЩ60™61190 по с5 положению ароматического кол] При наличии двойной связи в пропановой цепи субстрата наблюдае образование а-0- и р-0- алкиларилъных эфирных связей:
Поликонденсация в присутствии гриба Т. villosus катализиру»
лакказой, a Ph. sanguínea - Mn-зависимой пероксидазой и происх*
за счет окислительного дегидрирования с участием феноксирадикал(
1 я
Сигнал ЭПР интенсивностью 10 сп/г и шириной линии &Н = Гс с g фактором 2.004, близким по значению с g фактором свобод электрона, был зарегистрирован в полимере гваякола. Мспользов ловушки радикалов 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-окс1 экспериментах ln vitro ингибировало реакцию поликонденсации, : твердив ее радикальный характер. Сочетание резонансных форм обр вдихся радикалов, с одной стороны, может привести к появлению ; личных по типу связывания димеров (полимеров) подобно тому, осуществляется ферментативная дегидрогенизационная поликонденс конифэрилового спирта под действием лакказы и пероксидазы до п мера, подобного лигнину, с другой - к разрыву алкиларильных свя
Таким образом, изучение реакций, протекающих с соединени моделирующими отдельные блоки и связи лигнина, изучение измен функционального и фрагментного состава лигнина и его молекуля массовых характеристик под действием грибов Ph. sanguínea и Т. losus позволило представить последовательность и механизм хими ких процессов, сопровождающих биодеструкцию лигнина.
Биодеструкция лигнина грибами Т. villosus и Ph. sanguínea ляется окислительным процессом, в результате которого происх окисление С^и С ¿ атомов пропановой цепи и -деметоксилирование матического кольца. Окисление происходит непосредственно в макр лекуле лигнина и затрагивает как низкомолекулярные, так и высок лекулярные составляющие лигнина. Одновременно в макромолекуле г
87 73 (м.д.)
72 83 (м.д.)
мера происходит окислительный разрыв алкилзрильных, ариларильных и алифатических С-С связей, в результате чего образуются низкомолекулярные фрагменты лигнина.
Конкурирующим с деструкцией является процесс окислительной по-ликонденсащш, который, как и деструкция, происходит в условиях 1п vivo. Поликонденсации подвергаются фрагменты лигнина, имеющие незамещенный фенольный гидроксил. Реакции протекают по типу окислительного сочетания фенолов. Сшивка в молекуле полимера происходит за счет Сп, Cg и преимущественно Cg положений ароматического кольца, а также с участием фенольного гидроксила с образованием С-С и С -0-С связей. Направленность реакций зависит от природы и положения заместителей в ароматическом кольце субстрата. Поликонденсация, вероятно, происходит до тех пор, пока в лигнине присутствуют свободные фенольные гидроксильные группы, лишь потом ее опережают процессы деструкции, сопровождающиеся разрывом С-С связей.
Биотрансформация лигноцеллюлозы грибами Fhanerochaete sanguínea и Trametes villosus Принимая во внимание наличие взаимной регуляции биохимических циклов разложения лигнина и целлюлозы, процесс делигнификации мы исследовали во взаимосвязи с биодеструкцией целлюлозы.
Оптимизация процесса делигнификации- Лигниназная активность у базидиомицетов проявляется во время вторичного метаболизма и регулируется содержанием в питательной среде азота и углерода. В связи с этим, мы изучили влияние содержания азота и глюкозы на проявление культурой гриба Ph. sanguínea лигнинолитической и целлюлолитической способности. Было установлено, что при содержании азота до 1.8 ммоль/л способность гриба к деструкции лигнина увеличивается (рис. 12). Введение вератрового спирта в питательную среду стимулирует лигнинолитическую способность, причем ее увеличение проходит через максимальное значение (рис. 13). Найдена оптимальная концентрация глюкозы (0.1%), тормозящая деструкцию целлюлозы (рис. 14).
Поскольку действие всех компонентов питательной среды взаимосвязано, то для поиска оптимальных условий проявления культурой лигниндеструктирумцей способности использовали метод математического планирования эксперимента. В качестве переменных факторов были выбраны время инкубирования Х^ (10-14 сут) и оодорж&тю в питательной среде азота X,(0.6-1.8 ммоль), микроэлементов Xr,(l-7 кратное),
LA •/.
10'
00
10
%
го
lo
. L
С
lo-
4
A
Рис. 12. Потери лигнина (Ь) и целлюлозы (С) при культивировг Р)1.зап£и1пеа на лигноцеллюлозном субстрате в течение 10 сут в зг симости от содержания в питательной среде микроэлементов, верач вого спирта -0.2 ммоль (а), 0.3 ммоль (б), 0.4 ммоль (в) и аг 0.6 ммоль (4), 1.2 ммоль (•), 1.8 ммоль (о).
¿А'/.
го 10 10
м
С
о,г ол о .а с.ммлоль о,» о,г о,ъ о.д
бератроьый с1шр1 ганж01д
Рис. 13. Влияние добавок Еератрового спирта на деструкцию лип (I) - 1 и целлюлозы (С) - 2 грибом Ph. sanguínea. Рис. 14,- Влияние добавок глюкозы на деструкцию лигнина (L) -целлюлозы (С) - 2 грибом Ph.. sanguínea.
вератрового спирта Хд(0.2-0.4 ммоль). В результате математиче> обработки полученных экспериментальных значений мы составили у; нения регрессии, описывающие деструкцию лигнина YL и целлюлозы ' процессе делигнификации:
Yb= 35,8+0,42X^+1,76X2+7,67Х4-2,15Х12-3,10Х22+1,85Х32+
+2,14Х2Х3-0(84Х3Х4. Yq= 7,67+2,15X2+1,22X3+2,99X4+1,10Х1 -0,45X2+2,05X3+2,85Х4+ +0,66Х1X3-1,21Х1Х4+1,79X2X3+1,11 XgX4
4
7
Методом крутого восхождения был найден оптимальный состав питательной среды, в условиях которой при заданном пределе деструкции целлюлозы 10% может быть достигнута степень делигнификации 45%. Эти оптимальные условия были использованы при дальнейшем изучении процесса Оиоотбелки.
Биологическая делигнификации - стадия пероксидной отбелки. Введение микробиологической стадии делигнификации в схему пероксидной отбелки позволяет повысить белизну сульфатной целлюлозы. С использованием 2% пероксида водорода при различных температурах было установлено, что биообработка в сочетании с пероксидной отбелкой приводит к более глубокой делигнификации сульфатной целлюлозы, чем пероксиднэя отбелка без обработки грибом (рис. 15).
1d 50 40 10 j0 40 го ьо 40 бо 60 ^' Рис. 15. Снижение содержания лигнина (L) -1 и целлюлозы (С)-2 в образце в зависимости от условий пероксидной отбелки {2% Н^Оп, 90°С (а), 80°С (б), 70°С (в); 1,2- после биообработки грибом; Г,2'- без биообработки.
В выбранном режиме (70°С, 60 мин) в присутствии гриба Ph. sanguínea была получена целлюлоза с большей белизной (662) и более высокой степенью полимеризации (1190), чем в присутствии гриба Ph. chrysosporium (белизна 48%, СП 840).
При отбелке по схеме биологическая стадия-щелочение- Нп09, в зависимости от вида древесины, получена хвойная целлюлоза с белизной 52-54% и лиственная - 57.5%. Вклад биологической стадии в процесс отбелки составил 5-6 и 2-3.5 ед. белизны соответственно.
Введение стадии предварительной биологической делигнификации ь более сложные схемы пероксидной отбелки с применением комплексооб-
разователя и катализатора, позволяющие достичь белизны 74-77%, да возможность получить лиственную целлюлозу с белизной 80-82% при с хранении достаточного уровня средней степени полимеризации.
Применение грибного мицелия в технологическом процессе сопр жено со значительными трудностями (создание специальных фермент ров, сохранение стерильности, длительность биообработки). В связи этим била рассмотрена возможность использования для биоотбелки фе ментных препаратов или культуральных фильтратов грибов рода Тгап tes и Phanerochaete sanguínea. Ферментная обработка целлюлозы ода значно приводит к увеличению белизны. Наибольший эффект биотрак формации небеленых целлюлоз достигается при действии 7-суточнс ферментного препарата из Т. vlllosus, обогащенного лигниназой. Ги ролитическое воздействие ксиланазных препаратов обнаруживается пс ле щелочной экстракции гидролизованных лигноуглеводных Фрагменте Ферментная обработка позволяет повысить белизну сульфатной листве ной целлюлозы на 4-7% и достичь такого же увеличения белизны, кэб с культурой гриба.
С целью снижения стоимости процесса' получения ферментов г культивировании грибов можно использовать предгидролизат, имеющий составе низкомолекулярные сахара и фенолы в качестве косубстрата индуктора лигншюлитической активности вместо глюкозы и вератровс спирта, и заменить аспарагин мочевиной.
■ Органосольвентная варка древесины с биопредобработкой исхода го сырья. Введение биологической стадии обеспечивает более легкук полную делигнификацию древесины при последующей водно-этанолы варке. Получение целлюлозы методом варки в органических растворш лях может обеспечить лучшую экологическую приспособленность и мен ший обьем рентабельного предприятия, дает возможность использовг в качестве сырья древесину и хвойных, и лиственных пород. В уело! ях водно-этанольной варки для того, чтобы достичь достаточно выс кой степени делигнификации (например, 10 ед. Каппа), требующе! для лучшей белимости, необходимо либо использовать высокие конце трации катализатора, либо увеличивать продолжительность варки. £ приводит к большой гидролитической деструкции целлюлозы, то есть потере выхода и снижению почти в 2 раза средней степени полимериг ции. При концентрации катализатора 0,2% НС1 получается целлюлоз? выходом 52-53% и жесткостью 19-20 ед.Каппа. Предварительная 6hoj
гическая обработка дреЕесины грибами позволяет уменьшить жесткость получаемой целлюлозы на 8-9 ед.Каппа при сохранении выхода на уровне контрольного опыта (табл. 6). Наиболее приемлемыми оказываются относительно короткие сроки биообработки. Лучшие результаты получаются при использовании гриба T.villosus, поскольку целлюлоза получается менее деструктированная.
Таблица б
Влияние биообработки древесины на свойства целлклозы, получаемой при органосольвентной Еарке (0.2% HCl).
Микроорганизм Время биообработки, сут Потеря массы, Выход цел-% люлозы, % Жесткость, ед. Каппа СП
Trametes 0 0 52.7 19.7 780
YillOSUS 15 4.8 52.8 15.1 770
30 5.2 52.1 14.8 780
60 13.2 50.0 10.4 770
Pfranerochaete 0 0 52.3 19.3 760
sanguinea 15 1.7 52.4 14.9 670
30 6.4 49.7 10.5 530
60 10.9 46.8 10.5 480
Phanerochaete 0 0 52.5 19.8 770
chrysosporium 15 8.5 50.7 12.9 480
30 16.4 47.4 15.6 440
60 27.3 44.5 15.9 400
0.4% HCl - - 46.5 10.5 390
В связи с этим была изучена возможность биоделигнификащта щет перед варкой секреторным комплексом ферментов Т. уШовиз вместс прямого культивирования микроорганизмов.
В ходе исследования было выявлено, что выход целлюлозы и степень ее делигнификации зависят от активности использованного куль-турального фильтрата и продолжительности обработки. Определяющая фактором при ферментативной обработке щепы является время, необходимое для диффузии фермента вглубь образца. При длительности обработки 6 сут была подобрана оптимальная активность культуральноп
фильтрата (соотношение лигниназа:лакказа: ксиланаза составило 20: 10.5:3.5 единиц активности на 1 г древесины). В этих условиях получена целлюлоза с выходом 50% и жесткостью 12 ед.Каппа.
Ферментативная обработка позволяет сократить продолжительности водно-этанольной варки в 1,5 раза (до 120 мин) для получения полуфабрикатов той же степени делигнификации.
вывода
Таким образом, среди широкого круга базидиальных грибов выбраны два, ранее не исследованных, высокоактивных лигнинолитическж штамма культур Phanerochaete sanguínea и Trametes villosus, отличающиеся составом продуцируемых внеклеточных ферментов. С использованием химических, спектральных, хроматографических методов анализа в том числе оригинальных методик количественного определения углеводов, функциональных груш, фрагментов и связей (ЯМР 1Н и молекулярно-массовых характеристик (гель-хроматография), количественного, и качественного состава метаболитов (ВЗЖХ), были выявлены во-первых, ранее неоднозначно показанные различия и особенност] функционализации исходных субстратов - лигниное осины и лиственницы, установлены некоторые типы связывания их в лигноуглеводной матрице древесины; во-вторых, установлены пути биотрансформации лигни нов и модельных соединений, репрезентативно представляющих лигнин под действием выбранных грибов, а также комплекс и механизм проте каюодах при этом химических реакций, . выявлено поведение лигноугле водных связей в условиях биологического воздействия; в-третьих, до казано сопряженное изменение лигнинолитической и целлюлолитическо: способности грибов при изменении биогенных факторов питательно: среды, найдены оптимальные условия избирательной биодеструкции лиг нина и биосинтеза ферментов лигнинолитического и гемицеллюлазног действия.
На основе полученных данных были разработаны практические ре комендации использования стадий биоделигнификации в технологии ор ганосольвентной варки и многоступенчатой пероксидной отбелки.
По результатам выполненной работы можно сделать следующие ос новные выводы.
1. На основании сравнительного анализа функционального, струк
турного состава, содержания внутримолекулярных С-О-С и С-С связей установлено, что лигнин лиственницы в отличие от лигнина осины является более окисленным, содержит карбоксильные группы, обладает более высокой степенью конденсированности. В лигнинах доказано присутствие сложноэфирных связей, рассчитано их содержание.
•2. Доказано, что лигнины лиственницы и осины образуют лигноуг-леводную матрицу в древесине за счет химического связывания с углеводами сложноэфирными, алкилгликозидными, фенилгликозидными связями. Присутствие последних обнаружено только в лигноуглеводных комплексах лиственницы. Сделано предположение о наличии устойчивых к гидролитическим воздействиям алкилэфирных и С-С лигноуглеводных. связей.
3. В результате скрининга среди базидиальных грибов выбрани ранее не исследованные культуры Phaneroehaete sanguínea и Trame tes villosus, перспективно отличающиеся высокой избирательностью деструкции лигнина.
4. Выявлено различие грибов в способности продуцировать внеклеточные ферменты лигнинолитического комплекса. Установлено, что Т. villosus продуцирует лигниназу и лакказу, a Ph. sanguínea -Mn-зэвисимую пероксидазу и лигниназу. Сделано предположение о том, что лигниназа Ph. sanguínea связана со структурой клеточной стенки гриба.
5. Установлено, что биодеструкция лигнина грибами Т. villosus и Ph. sanguínea является окислительным процессом. Окислению подвергаются CQ, С^ атомы пропановой цепи как в низко-, так и высокомолекулярных составляющих лигнина. Наряду с окислением происходит реакция деметоксилирования. Биодеструкция осуществляется за счет реакций разрыва алкиларилъных, ариларильных и С-С связей алифатическс-". цепи. Возможен разрыв С-С связей ароматического кольца. ШироккЛ спектр реакций объяснен с помощью пероксидазного механизма лигни-назного катализа.
• 6. Впервые установлено, что ln víyo, наряду с реакциями окислительной деструкции, происходят реакции поликонденсации радикального типа по 2, б и преимущественно 5 положениям бензольного кольца, в том числе, с участием свободных фенольных гидроксильных групп, а также Са, С^ атомов в случае пропениларильных фрагментов, с образованием С-С и С-О-С связей. Конкуренция процессов поликон-
денсации и деструкции происходит до полного замещения феноль гидроксилов, после чего преобладают процессы деструкции.
7. С использованием модельных соединений доказано, что фене ные субстраты более легко, чем их гидроксилзамещенные аналс включаются в метаболизм грибов. При этом отмечена резистентност деструкции субстратов, содержащих Са=0 группу. Впервые доказана акция восстановления Са ^=0 —> Са р-ОН у вератрилпропановых сое нений, предшествующая разрыву Ca-dp связи. Выдвинуто предположе о том, что реакция катализируется алкогольдегидрогеназой.
8. Установлено, что биодеструкция лигнинов осины и лиственн происходит за счет однотипных реакций. Выявлено, что более конд сированный гваяцилсодержащий лигнин лиственницы труднее разрушав микробиологическим путем.
9. Выявлены индивидуальные различия в действии грибов Т. v losus и Ph. sanguínea, заключающиеся в отсутствии способности' sanguínea разрывать связь Са-Ср в субстратах с замещенным феноль гидроксилом.
10. Доказано сопряженное изменение лигнинолитической и цел лолитической способности гриба Ph. sanguínea в зависимости от держания биогенных факторов в питательной среде. Найдены оптима ные условия селективной биоделигнификации лигноцеллюлозных субст тов.
11. Достигнуто повышение избирательности, сокращение длите ности процесса водноэтанольной варки и.увеличение выхода целлюл за счет предварительной микробиологической и энзиматической ста делигнификации.
12. Установлено, что введение предварительной стадии микроб логической и энзиматической деструкции лигнина в многоступенча схему пероксидной отбелки позволяет без использования хлорсодер щих соединений получить лиственную целлюлозу, близкую по бели (82%) к товарной беленой целлюлозе. Оценен вклад биологической с дли в увеличение белизны для лиственной целлюлозы 5.0%, для хвой - 3.5%. Установлена эффективность делигнификации с участием только лигниназных, но и ксиланазных препаратов.
13. Результаты исследований структуры лигнина, реакций, про ходящих с лигнином при микробиологическом воздействии на древес и небеленую целлюлозу, и условий, в которых они протекают, яеляю
теоретической основой для создания принципиально ноеых способов биоделигнификации. На их основе предложены практические рекомендации для ЦБП:
а) Способ отбелки сульфатной целлюлозы (А.с. N 1650835, 1989);
б) Способ получения целлюлозного полуфабриката (Патент РФ 93019492).
СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ, СОДЕРЖАЩИХ ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ
1. Медведева- С.А., Иванова С.З., Горохова В.Г., Вотинцева С.К., Бабкин В.А., Тюкавкина Н.А. Лигнановые гликозиды хвои некоторых видов семейства Plnaceae // Химия древесины. - 1983. - N 3. -С. 91-92.
2. Васильева Л.В., Янилкин В.В., Медведева С.А., Иванова С.З., Бабкин В.А. Электрохимическое окисление лигнановых гликозидов // Химия древесины. - 1986. - N 1. - С. 92-96.
3. Медведева С.А., Гольдапель И.А., Иванова С.З., Волкова И.В., Медведев В.А., Бабкин В.А. Устойчивость гликозидных связей в соединениях, моделирующих лигноуглеводные связи, в условиях кислотного и щелочного гидролиза // Химия природ, соедин. - 1987. -КЗ. - С. 68-70.
4. Янилкин В.В., Васильева Л.В., Бабкин В.А., Медведева С.А., Спиридонова Л.Н. О механизме образования лигноуглеводных связей // Химия древесины. - 1987. - N 4. - С. 68-72.
5. Васильева Л.В., Медведева С.А., Янилкин В.В., Бабкин В.А., Горохова В.Г., Никифоров В.П., Антонова Л.И. Устойчивость связей в лигноуглеводных комплексах древесины лиственницы и осины в условиях кислотного, щелочного гидролиза и электрохимического окисления // Химия древесины. - 1987. - N 4. - С. 59-67.
6. Медведева С.А., Бабкин В.А., Волчатова И.В., Антипова И.А., Спиридонова Л.Н., Павлинский В.Г., Соловьев В.А., Малышева О.Н. Изучение лигшшазной активности базидиомицета Phanerochaete sanguínea. Пути деструкции грибом фенольных соединений // 3 научн.. семин. "Превращения древесины при энзиматическом и микробиологическом воздействиях".- Рига, 1988.- С. 98-99.
7. Медведева С.А., Бабкин В.А., Соловьев В.А., Александрова Г.П., Малышева О.Н., Иванова С.З., Волчатова И.В. Исследование лиг-нинолитической активности Phanerochaete sanguínea с целью использо-
вания базидиомицета в биотехнологических процессах ЦБП // Bcecoi науч.-техн. конф. "Основные направления и координация работ в о< сти химии древесины и целлюлозы до 2000 года". - М., 1988. - Ч, - С. 115-117.
8. Medvedeva S.A., Babkln V.A., Alexandrova G.P., BalaW G.K., Malysheva O.N., Solovyev 7.A. Biological bleaching of ¡ phate pulp // Int. Symp. Wood and Pulp. Chem.- Raleigh., N, 1989.- P. 425.
9. Медведева С.А., Бабкин В.А., Волчатова И.В., Соловьев В, Малышева О.Н., Спиридонова JI.H., Александрова Г.П. Изучение лж назной активности базидиомицета Phanerochaete sanguínea // й древесины.- 1989,- N 6.- С. 75-76.
10. Александрова Т.П., Медведева С.А., Бабкин В.А., Соло! В.А., Малышева О.Н., Иванова С.З. Влияние состава питательной cj на лигниназную активность базидиомицета Phanerochaete sangulnes Химия древесины. - 1989. - N 6. - С. 77-80.
11. Александрова Г.П., Медведева С.А., Балахчи Г.К., Бас В.А., Соловьев В.А., Малышева О.Н. Оптимизация процесса биодели: фикации лигноцеллюлозных материалов грибом Phanerochaete sangu: // Химия древесины.- 1989.- N 6.- С. 81-83.
12. Медведева С.А., Иванова С.З., Волчатова И.В., Белоус И.А., Антипова И.А., Бабкин В.А. Окисление лигнина и фенольных с динений микроорганизмами // Всесоюзн. семин. "Проблемы окислите но-восстановительных превращений компонентов древесины",- Ар) гельск, 1990.- С. 79.
13. Медведева С.А., Хуторянский В.А., Иванова С.З., Спиридс ва Л.Н., Бабкин В.А., Барам Г.И. Анализ ароматических метаболите продуктов биодеструкции лигнина и моделирующих его соединений с пользованием ВЭЖХ // Химия древесины. - 1990. - N 3. - 0. 72-75.
14. Медведева С.А., Хуторянский В.А., Иванова С.З., Волчат И.В., Бабкин В.А., Барам Г.И. Анализ ароматических метаболите продуктов биодеструкции лигнина методом ВЭЖХ // 5 Всесоюзн. ci по молекулярной жидкостной хроматографии. - Рига, 1990. - С. 55.
15. Медведева С.А., Александрова Г.П., Бабкин В.А. Перспекч и трудности использования микроорганизмов в целлюлозно-бумал промышленности // Химия древесины. - 1991. - N 1. - С. 3-16.
16. Медведева С.А., Александрова Г.П., Бабкин В.А. Изголз} нето на микроорганизмами в целлюлозно-хартиената промишленость
Целлулоза и хартия. - 1991. - Bd. 21, N б. - S. 3-9.
17. Medvedeva S.A., Babkin V.A., Sinitsin А.P., Antlpova I.A., Volchatova I.V., Ivanova S.Z. Decomposition oí arylmethane'- and arylpropane- containing compounds by basidial fungi Corlolus villo-sus and Phanerochaete sanguínea // Russian Blochem. Biotechnol.-1991.- Vol. 1, N 2-3.- P. 97: ■
18. Медведева С.А., Бабкин В.А., Синицын А.П., Антипова И.А., Волчатова И.В., Иванова С.З. Деструкция арилметановых и арилпропа-новых соединений базидиальными грибами Corlolus vlllosus и Phanerochaete sanguínea // VII Всесоюзн. симпозиум "Инженерная энзимоло-гия".- Москва, 1991,- С. 156-157.
19. Медведева С.А., Волчатова И.В., Иванова С.З., Апрелкова Н.Ф., Хуторянский В.А., Антипова И.А., Середкина С.Г., Бабкин В.А. Превращения мономерных ароматических соединений вератрильного ряда базидиомицетом Corlolus villosus (Lloyd) Kreisel // Химия древесины.- 1991. - N 3.- С. 76-80.
20. Медведева С.А., Середкина С.Г., Хуторянский В.А-., Бабкин В.А., Соловьев В.А., Малышева О.Н. Изменение молекулярно-массовых характеристик лигнинов, выделенных из древесины осины,' деструктиро-ванной грибом Phanerochaete sanguínea // Химия древесины.- 1991.- N 5.- С. 61-67.
21. A.c. 1650835 СССР. Способ отбелки сульфатной целлюлозы / В.А. Бабкин, В.А. Соловьев, Г.П. Александрова, С.А. Медведева, О.Н. Малышева // БМ.- 1991.- N 19.- С. 121.
22. Бабкин В.А., Медведева С.А., Сердобольский E.H., Заказов А.Н. Электрохимический и органосольвентный способы делигняфикации древесины с биопредобработкой исходного сырья // Междун. симп. "Экологически безопасный завод будущего в целлюлозно-бумажной промышленности". - JI., 1991. - С. 16.
23. Каницкая JI.B., Калихман И.Д., Медведева С.А., Белоусова И.А., Бабкин В.А., Калабин Г.А. Количественная спектроскопия ЯМР 1Н и ^С лигнинов ели (Picea obovata), осины (Populus trémula) и лиственницы сибирской (Larix sibirica) // Химия древесины.- 1992.- N 4-5.- С. 73-81 .
24. Александрова Г.П., Буряченков М.М., Волчатова И.В., Полухина С.Д., Медведева С.А., Заказов А.Н., Бабкин В.А. Биологическая окислительная деструкция лигнина осины - экологически чистый метод получения целлюлозных материалов // Междун. конф. "Проблемы окисли-
тельно-восстановительных превращений компонентов древесины". -хангельск, 1992. - С. 82-83.
25. Медведева С.А., Волчатова И.В., Антипова И.А., Бабкин í Окислительная деструкция лигнина и фзнольных соединений базидиг ними грибами Phanerochaete sanguínea и Coriolus vlllosus // Ыуяу конф. "Проблемы окислительно-восстановительных превращений кои нентов древесины".- Архангельск, 1992.- С. 81-82.
26. Середкина С.Г., Медведева С.А., Бабкин В.А. Исследов; окислительных-процессов, происходящих с лигнином под действием зидиальных грибов // Мувдун. конф. "Проблемы окислител) восстановительных превращений компонентов древесины". - Ар: гельск, 1992. - С. 79-80.
27. Александрова Г.П., Медведева С.А., Бабкин В.А. Биологи' кая отбелка сульфатной целлюлозы грибами белой гнили // Регион; ная конф. "Комплексное использование древесного сырья и пути pi ния экологических проблем на целлюлозно-бумажных предприятиях С:
Братск, 1992.- С. 19.
28. Александрова Г.П., Медведева С.А.-, Бабкин В.А. Использ ние предгидролизата при культивировании дереворазрушающих гр Phanerochaete sanguínea // Региональная конф. "Комплексное исп зование древесного сырья и пути решения экологических пробле! целлюлозно-бумажных предприятиях Сибири". - Братск, 1992. - С.
29. Середкина С.Г., Медведева С.А., Хуторянский В.А., Ба В.А. Изменение молекулярно-массовых характеристик лигнинов, в леншх из древесины осины, деструктированной грибом Phaneroch sanguínea // Региональная конф. "Комплексное использование дре ного сырья и пути решения экологических проблем на целлюлс бумажных предприятиях Сибири". - Братск, 1992. - С. 49.
30. Буряченков М.И., Заказов А.Н., Волчатова И.В., Алексам ва Г.П., Медведева С.А., Бабкин В.А. Исследование влияния биoí ческой предобработки щепы на выход и свойства водно-спиртовой люлозы при водно-этанольной варке // Региональная конф. "Комш ное использование древесного сырья и пути решения экологичя проблем на целлюлозно-бумажных предприятиях Сибири". - Врг 1992. - С. 4.
31.. Медведева С.А. Середкина С.Г., Бабкин В.А. Механиз реакции деструкции лигнина и-моделирующих его ароматических с< нений грибами белой гнили // Химия древесины. - 1992. - N 2-3.
3-24.
32. Пат. 93019492/12 РФ. Решение о выдаче, 1993. Способ получения целлюлозного полуфабриката /Т.П. Александрова, С. А. Медведе-^ ва, А.Н. Заказов, И.В. Волчатова.
33. Александрова Г.П., Медведева СЛ., Бабкин В.А., Соловьев В.А., Малышева О.Н. Исследование некоторых факторов, влияющих на ферментативную активность гриба Phanerochaete sanguínea // Химия древесины.- 1993.- N 4,- С. 55-60.
34. Александрова Г.П., Медведева С.А., Бабкин В.А., Соловьев В.А., Малышева О.Н. Совершенствование биологической отбелки сульфатной целлюлозы // Химия древесины.--1993.- N 4.- С.14-17.
35. Александрова Г.П., Медведева С.А., Бабкин В.А., Соловьев В.А., Малышева О.Н. Изучение условий трансформации лигноцеллюлозно-го субстрата базидиомицетом Phanerochaete sanguínea в присутствии предгидролизата // Химия древесины.- 1993. - N 4. - С. 37-40.
36. Medvedeva S.A., Volchatova I.V., Seredklna S.G., Antlpova I.A., Belousova Г.А., Babkin V.A. Oxidative destruction of lignin and phenol compounds with basidial fungi Phanerochaete sanguínea and Coriolus vlllosus // 7-th Int. Sump, 'flood and Pulp. Chem.- Beijing, 1993.
37. Aleksandrova G.P., Buryachenkov K.I., Medvedeva S.A., Za-kasov A.N., Babkin V.A. Microbiological deligniflcatlon - the basis for ecologically sound pulping teclinology // 7-th Int. Symp. Wood and Pulp. Chem.- Beijing, 1993.
38. Kanitskaya L.V., Medvedeva S.A., Zakasov A.N., Rokhin
A.V., Babkin V.A., Kalabin G.A. Quantitative 1H, 13C № spectroscopy of lignin // 7-th Int. Symp. Wood and Pulp. Chem.- Beijing, 1993.
39. Александрова Г.П., Медведева С.Л., Заказов А.Н., Бабкин
B.А. Способ получения целлюлозы, вкльчзщий микробиологическую де-лигнификацию // Междун. науч.-техн. конф. РарРог-93. - Санкт-Петербург, 1983. - С. 22.
40. Волчатова М.В., Медведева ü..J., Бабкин В.А. Изучение состава внеклеточных ферментов грибов Phanerochaete sanguínea и Coriolus vlllosus // Биохимия.- 1994,- Т. 59, вып. 6.- С. 797-803.
41. Volchatova I.V., Medvedeva S.A., Babkin V.A. Extracellular enzymes oí the fungi Phanerochaete sanguínea .and Coriolus vlllosus // Blochem. Moscow.- 1994,- Vol. 59, К 6,- P. 587-591.
42. Каницкая JI.В., Медведева С.А., Бабкин В.А., Кушнарев Д Калабин Г.А., Деструкция древесины осины грибом Phanerochaete ; guinea: количественная спектроскопия 'к и ^С биологически ра; шенного лигнина // Химия природ, соедин. - 1994. - N 4. - С. ! 557.
43. Медведева С.А., Волчатова И.В., Бабкин В.А., Анти И.А., Каницкая Л.В., Иванова С.З., Ступина Э.С. Превращения ар тических соединений базидиомицетами Phanerochaete sanguinea и Ci olus villosus // Химия природ, соедин. - 1994. - N 6. - С. 808-;
44. Babkin V.А., Zakasov A.N., Medvedeva E.N., Yeiremova G Aleksandrova G.P., Medvedeva S.A. A process for chlorine-free b: chlng of kraft hardwood cellulose // Int. Pulp. Bleach. Conf. -ronto, 1994.
45. Медведева С.А., Александрова Г.П., Заказов А.Н., Медве, Е.Н., Бабкин В.А. Отбелка целлюлозы с использованием биологиче! агентов // Регион, конф. "Производство экологически чистой целл] зн". - Братск, 1995. - С. 26-31.
46. Александрова Г.П., Медведева С.А., Бабкин В.А., Зак; А.Н. Экологически чистый метод получения целлюлозы, включающий i робиологичэскую делигнификацию // Регион, конф. "Производство : логически чистой целлюлозы". - Братск, 1995. - С. 26-31.
47. Aleksandrova G., Medvedeva S., Kanltskaya L., Babkin Zakazov A. An ecologically sound pulping process Involving micri ologlcal deligniflcation // 8-th Int. Sym. Wood and Pulp. Cher Helsinki, 1995. - P. 273-278.
48. Chipanina N.N., Medvedeva S.A., Mlrskova Yu.R., Yolcha I.V., Babkin V.A. Quantitative determination of content of carbi 11c groups at biodestroying llgnins using IR-spectroscopy // 1 Int. Symp. Wood and Pulp. Chem.- Helsinki, 1995.- P. 73-78.
49. Kanltskaya 1.7., Medvedeva S.A., Babkin Y.A. Quantita' 1 1 ч
H and С Iflffl spectroscopy of biodegraded llgnins // 8-th : Symp. Wood and Pulp. Chem.- Helsinki, 1995.- P. 91-96.
50. Medvedeva S.A., Volchatova I.V., Kanltskaya L.V., Stu] E.S.," Babkin V.A. Oxidative biotransformation of phenol substr; by white rot fungus // 8-th Int. Symp. Wood and Pulp. Chem.- ] sinki, 1995.- P. 57-62.
