Пути образования октадеканоидов в высших растениях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ



МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОИ ТЕХНОЛОГИИ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА

Специализированный совет Д 063.41.01

На правах рукописи

ГРЕЧКИН АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ

ПУТИ ОБРАЗОВАНИЯ ОКТАДЕКАНОИДОВ В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ

С02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Казанском институте биологии АН СССР

Официальные оппоненты:

член-корр. АН СССР, доктор химических наук, профессор

Р.П.Евстигнеева доктор химических наук, профессор Юл.Г.Молотковский доктор биологических наук, профессор Е.Б.Бурлакова

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова

Защита состоится "30 "марта 1992 г. в 15 ч. та заседании специализированного совета Д 063.41.01 по защите диссертаций на соисканий ученой степени доктора наук при Московском институте тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова (117571, Москва, пр. Вернадского, 86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.Ломоносова С119831, Москва, ул. Малая Пироговская, Д. 1).

Автореферат разослан " 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических, наук, старший научный сотрудник

//

А. И. Лютик

__

! ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

„Постановка проблемы, ее актуальность. В результате исследова-^ертдний/последних десятилетий в тканях животных был открыт новый класс универсальных биорегуляторов, получивших нзвание "эйко-заноиды". Эти соединения являются оксигенкрованными жирными кислотами, образующимися при окислительном метаболизме арахи-доновой и родственных ей С4о-полиеновых жирных кислот. Эйкоза-ноиды контролируют многие жизненно важные функции в организме животных, в частности, сокращение гладкой мускулатуры, регуляция кровяного давления и температуры, воспалительные и бронхо-спазматические процессы. Ввиду особого фундаментального и прикладного значения открытия простагландинов кошггет по Нобелевским премиям присудил премию по физиологии и медицине за 1982 г. профессорам Бергстреыу и Самуэльссону (Швеция) и профессору Вейяу (Великобритания).

Успехи в области исследования эйкозаноидов животных привели к попыткам поиска простагландинов и родственных им соединений в растениях. В некоторых опубликованных работах сообщается об обнаружении простагландинов в растениях [At.tr ер & а1., 1980;- Левин с соавт., 1984]. Однако эти работы нуждаются в серьезной проверке ввиду недостаточного экспериментального обоснования содержащихся в них выводов. Достаточно основательно выполненные работы других авторов [Паносян с соавт., 1979; С1ауез е1 а1., 1986], посвященные скринингу простагландинов в высших растениях, привели к отрицательным результатам. При этом в обоих случаях вместо простагландинов Г и Е были выделены С в-тригидроксихислоты.

Отрицательные результаты, полученные при попытках скрининга простагландинов в растениях, очевидно, не случайны. Для оценки целесообразности поиска простагландинов или их аналогов в растениях необходимо приникать во внимание относительную распространенность различных полиеновых жирных кислот в растите-

Сокращения: ХИМС - масс-спектр химической ионизации; ЭУМС -масс-спетр электронного удара; Н(Р)0Б - гидроСперо)ксиокта-декадиеновая кислота; Ш)НСР)0Т - (ди)гидро(пероЗксионтаде-катриеновая кислота; (01)НСР)ЕТЕ - (ди)гидроС п е ро)ксиэ йкоз а-тетраеновая кислота; ЛКК - липоксигеназа клубней картофеля; 12-оксо-ФДК - 12-оксо-10,15-фитодиеновая кислота.

льных тканях. Преобладающая часть имевшихся литературных данных свидетельствует о том, что цветковые растения не содержат арахидоновой и эйкозопентаеновой кислот, а 8 -эйкозотриеновая кислота содержится в них в очень малых количествах [Pohl et' al., 1972; Von Kunau, 1976]. В связи с отсутствием или малым содержанием метаболических предшественников эйкозаноидов, их участие как класса биорегуляторов в системе эндогенной регуляции у цветковых растений представляется маловероятным.

Приведенный выше анализ привел нас к выдвижение концепции. явившейся предпосылкой данной работы. Согласно этой концепции, в тканях цветковых растений содержатся в малых количествах многочисленные продукты окисления линолевой и линоле-новой кислот. Эти С4 в-соединения, а также некоторые проду; ты укорачивания цепи выполняют в высших растениях роль эндогенных регуляторов типа эйкозаноидов.

Актуальность проблемы систематического изучения окислительного метаболизма линолевой и линолеьовой кислот в высших растениях определяется следующим:

- отрывочным характером имеющихся в литературе сведений по этой проблеме;

- необходимостью построения максимально полной модели метаболических путей окисления С|в-полиеновых кислот в высших растениях;

- достаточно высокой вероятностью обнаружения новых природных физиологически активных соединений.

Настоящая работа выполнена в рамках координируемой АН СССР программы "Физико-химические основы биологии и биотехнологии", раздел N 13: "Молекулярные основы метаболизма, его регуляция, биологическая подвижность". Название темы; "Пути окислительного метаболизма полиеновых жирных кислот в высших растениях. Роль оксигенированных продуктов в регуляции анаболизма".

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение путей окислительного метаболизма линоленовой и линолевой кислот в высших растениях, выделение и идентификация основных метаболитов.

Для достижения поставленной цели был разработан и применен новый подход, включавший: - использование меченых '*С линоленовой и линолевой кислот;

- разделение и очистку недериватизированных продуктов окисления методом высокоэффективной жидкостной радиохроматографии;

- изучение молекулярного строения очищенных соединений (также недериватизированных} методом масс-спектрометрии химической ионизации и электронного удара, а также 1Н-ЯМР.

В задачи исследования входило

- исследование метаболизма линолевой, коронаровой и верноло-вой кислот в проростках гороха;

- изучение окисления а-линоленовой кислоты липоксигеназой из клубней картофеля;

- поиск новых метаболитов линолевой и линоленовой кислот, образуемых гидропероксиддегидразой из некоторых однодольных растений.

Научная новизна работы. Обнаружено два неизвестных ранее пути окисления полиеновых жирных кислот в растениях, а именно, мо-нооксигеназный путь, контролируемый цитохромом Р-450 и путь липоксигеназного двойного диоксигенирования.

Существенно расширены представления о гидропероксидлиаз-ном и гидропероксиддегидраэном путях метаболизма. Показано, что при расцеплении 13-гидроперехисей гидропероксид-дегидразой наряду в первичными продуктами, С12-альдегидами. образуется 12-гидрокси-9(£)-додвценавая кислота. Превращение 12-оксо- в 12-гадроксетсислоту контролируется ЯАВРН-зависимой редуктазой оксокислоты.

Впервые обнаружена зависимость направленности гидроперок-сид-дегидразного пути от величины рН. Идентифг лровано два неизвестных ранее смеетола. Предложена модель гидролиза аллен--оксада, объяснявшая рН^эависимость направленности реакции и образование всех кетолов. Обнаружены новые продукты, образуп-циеся При липоксигеназном окислении а-кетолов.

Доказана способность различных ляпохсигеназ катализировать окисление 1-гидрокси-2-оксо-4С2Э-пентенияьного фрагмента вместо обычного 10,4< г) -пентадиенильного. В растениях с де-гидразным путем метаболизма гидроперекисей а-кетолы являются субстратами для этой необычной липоксигеназной реакции.

Идентифицирован минорный 15Ш-изомер 12-оксофитодиеновой кислоты. Предложена модель механизма циклизации окисей алле-нов, объяснявшая как образование 15СП-изомера, так и необходимость наличия определенных структурных элементов » молекулах

гидроперекисей для образования циклопентэнонов.

Впервые обнаружены в природных источниках следующие кислоты: 12-гидрокси-9СI)-додеценовая; С9,10),(12,13)-диэпоксиок-тадекановая; 9,10-дигидрокси-12,13-зпоксиоктадокановая; 9,10--эпокси-12,13-дигидроксиоктадекановая; 9-оксо-16-гидроперокси-т10(£), 12(г), 14Ш-октадекатриеновая; 9-гидроперокси-16-оксо--ЮСЮ, 12СЮ, 14(£)-октадекатриеновая; 9-гидроперокси-12-оксо--13-гидрокси-10(£),15(2)-октадекадиеновая; 9-гидрокси-Ю-оксо--13-гидроперокси-11 (Е), 15СЮ -октадекадиеновая; 11-гидрокси-12--оксо-9(г), 15СЮ-октадекадиеновая и 12-оксо-10,15СП-фитодиеновая.

Некоторые из изученных соединений проявляет ростстимули-рупщую активность в низких концентрациях (10~в-10™" М), в частности, 9,16-дигидрокси-10(Е), 12(2),14(0-октадекатриеновая и 12-гидрокси-9СЮ-додеценовая кислоты. Практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание фундаменальных закономерностей окислительного метаболизма полиеновых жирных кислот в высших растениях.

Предложенный метод анализа смесей недериватиэированных оксигенированных жирных кислот и родственных соединений высокоэффективной жидкостной хроматографией с последупцим исследованием молекулярного строения отдельных компонентов масс-спек-трометрией химической ионизации и электронного удара с прямым вводом образца ыолет быть использован в различных лабораториях биохимического профиля. В КИБ КНЦ СССР метод используется не только для анализа оксигенирован? мх жирных кислот, но и терпеноидов.

Материалы диссертации использовались для чтения лекций по биохимии растений в Казанском государственном университете. Автор защищает:

- представления об основных путях окислительного метаболизма полиеновых жирных кислот в цветковых растениях;

- структуры ряда неизвестных ранее октадеканоидов;

- оксигенирование аллильных кетонов - новый тип липоксигеназ-ной реакции;

- новые данные-и представления о механизмах гидролиза и циклизации жирнокислотных окисей алленов.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на V Всесоюзном биохимическом схезде (Киев, 1986), итоговых научных

конференциях КНЦ АН СССР СКазань, 1987-1991), I Всесоюзном рабочем совещании по растительным липидам (Казань, 1989), 8-ом (Будапешт, 1988) и 9-ом (Уай, Англия, 1990) Международных симпозиумах по биохимии растительных липидоь, на научных семинарах в Делийском университете и Университете Джавахарлала Неру (Дели, Индия, 1990), на I Всесоюзной конференции по биохимии и физиологии растительных липидов СКазань, 1991). Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 20 работах, опубликованных в отечественных ("Доклады АН СССР", "Биоорганическая химия", "Биохимия") и иностранных ("Biochimi-са et Biophysica Acta", "Plant Science", "European Journal of Biochemistry") журналах, а также в сборниках трудов международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация содержит 298 страниц машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 414 ссылок. Представленные в работе данные проиллюстрированы 75 рисунками и 18 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Краткое рассмотрение литературных сведений по химии и биохимии эйкозаноидсзв животных, включая простагландины, тромбоксаны, лейкотриёны, липоксины и так далее свидетельствует о необычайном разнообразии биорегуляторов - продуктов каскада арахидоновой кислоты. Значительные открытия в этой области совершаются до настоящего времени, например, недавнее выделение и идентификация гепоксилинов.

Успехи исследований по эйкозаноидам животных привели к попыткам поиска простагландинов и родственных соединений в растениях. Однако, как показывает анализ литературных сведений, цветковые растения в отличие от низших не содержат арахидоно-вув кислоту. Эти сведения ставят под сомнение целесообразность поиска эйкозаноидов в растениях.

Основная чаоть главы 1 посвящена рассмотрению литературных данных о путях окислительного метаболизма линоленовой и линолевой кислот в растениях. Приводятся сведения, касающиеся эпоксикислот. Кратко рассматриваются основные особенности ли-поксигеназ растений, вторичные превращения, гидроперекисей ли-поксигеназами, включая анаэробные реакции и двойное диоксиге-

нирование. Описаны основные направления метаболизма, контролируемые гидропероксидлиазой и гидропероксиддегидразой, а также некоторые редкие ферментативные реакции гидроперекисей.

Рассмотренные в главе 1 литературные сведения позволяют сделать заключение, что окислительный метаболизм полиеновых жирных кислот в растениях изучен совершенно недостаточно. Практически не изучена физиологическая роль оксигенированных жирных кислот Сза исключением жасмоноидов) в регуляции роста и развития растений. Сопоставление литературных данных по растительным и животным объектам позволяет сделать предположение о том, что в эндогенной регуляции у цветковых растений участвует широкое разнообразие биорегуляторов, оксигенированных Cig-кис-кислот, отдаленных аналогов эйкозаноидов животных. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. [1-''С]линолевая и [1-,чС]линоленовая кислоты были получены от "Amersham International" (Англия). Приведены методы получения меченых "*С оксигенированных жирных кислот. Описаны использованные в работе химические реактивы и препараты ферментов, хроматографические материалы, системы растворителей для разделения оксигенированных жирных кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе.

Анализ жирнокислотного состава почек тополя. Часть липидного экстракта из почек тополя CPopulus balsmifera L.) омыляли, суммарные жирные кислоты экстрагировали из подкисленного гид-ролизата и разделяли методом ОФ-ВЭЖХ, отбирая при этом фракции, соответствующую по времени удерживания арахидонату. Выделенную фракцию свободных кислот анализировали методом масс--спектроыетрии прямого ввода (химическая ионизация, изобутан).

Остальную часть суммарных липидов подвергали метанолизу и метиловые эфиры жирных кислот анализировали методом ГЖХ на кварцевой капиллярной колонке с привитой фазой. Окисление [1-'*СЗлкнолевой кислоты в бесклеточных препаратах из листьев гороха. Листья семидневных проростков гороха ((Ьорт Превосходный) гомогенизировали. Фильтрат гомогената или попользовали для инкубации, или выделяли из него микросомальнус фракцию дифференциальным центрифугированием. Гомогенат или суспензию полученных из него микросом инкубировали с [I-14С]ли-нолевой или [1-' линоленовой кислотами. В отдельных вариантах к среде инкубации добавлялись метирапон и NADPH. В экспе-

риментах по выяснению влияния СО инкубация проводилась в атмосфере С0/0г (20:80 по объему}. Реакцию проводили в течение 30 мин. начиная с внесения меченой кислоты в 10 мкл 96Н этанола. Метаболизм экзогенных Cl-"*СЗ коронаровой и С1-'4С]верноговой кислот в гомогенате эпикотилей гороха. Эпикотили 3-х дневных проростков гороха С8 г.) гомогенизировали в буфэре. Фильтрат гомогената инкубировали с [1-14С]коронаровой или [ 1-' *С]вер-ноловой кислотами в течение 30 мин в присутствии 1 мМ NADPH. Окисление [1*СЗ линоленовой кислоты липоксигоназой из клубней картофеля. Фильтрат гомогената клубней картофеля (.Solarium tu-berosm. L. ), или полученный из него очищенный препарат липок-сигеназы инкубировали с [ 1 -' 4С]линоленовой кислотой в течение 30 мин при постоянном пропускании 0г. Метаболизм [1-'*СЗлиноленовой кислоты и [1-14СИЗ-НР0Т в проростках пшеницы по гидропероксиддегидразному пути. К свежеприготовленному гомогенату проростков пшеницы добавляли этано-льный раствор [1-14С]линолената или [1-14С]13-НР0Т и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Методы исследования образования кетояов и 12-оксо-10.15-$ито-диеновой кислоты гидропероксиддегидразой из семян льна и кукурузы. Для приготовления препаратов дегидразы семена льна или кукурузы измельчали и полученный порошок экстрагировали холодным ацетоном. Осанок сушили в вакууме и хранили при - 20°С. Для получения раствора фермента ацетоновый порошок экстрагировали буфером непосредственно перед использованием.

Для полупрепаративных целей [1-14С]13(5)-Р°0Т получали инкубацией {1~,4С]линолената с соевой липоксигеназой в течение • 15 мин в Трис/HCl, рН 8 0. в атмосфере чистого кислорода. Реакционную смесь подкисляли до рН 5.8 сухим MES буфером и использовали как раствор [1-,4С]13-НР0Т без дальнейшей очистки. Свежий раствор гидропероксиддегидразы объединяли с препаратом {1-|4С]13-НР0Т и инкубировали при 23°С в течение 40 мин. Инкубации препаратов гидропероксиддегидразы из- семян льна и кукурузы с ГÎ-'4СИЗ-КР0Т с целью изучения влияния рН среды на направленность метаболизма.

а) "Продолжительные" инкубации. Для изучения образования хетолов при кислых и щелочных значениях рН очищенный препарат {1-,4С]13-НР0Т в этаноле добавляли к раствору фермента в Трис/ /НС1 буфере, рН 7,4, или MES/NaOH буфере, рН 5,8. Продолжите-

льносгь инкубации составляла 30 мин.

б) "Кратковременные" инкубации. Инкубацию начинали с иньек-ции [1-14С]13-НР0Т в этаноле в холодный (0°С) раствор фермента. Реакция продолжалась 15 сек при 0°С при интенсивном перемешивании. Одну половину объема реакционной смеси фиксировали HCl, а вторую - NaOH. Перед экстракией обе части оставляли на 5 мин при 0°С. '

в) Метанольное улавливание окиси аллена. Холодный (0°С) рас твор [1-14C]13-HP0D быстро вносили шприцем в суспензии фермента в Трис/HCl буфере, pH 7,4, энергично перемешиваемую при 0°С. Спустя 10 сек к смеси добавляли избыток чистого метанола или смеси метанол/уксусная кислота 100:1 (по обьему) и реакция продолжалась еще 30 мин при комнатной температуре. Затем осадок белка осаждали центрифугированием, надосадочную жидкость декантировали и концентрировали в 4-5 раз. Остаток трижды экстрагировали смесь» гексан/зфир 1:1 (по объему). Препаративное получение 12-оксо-Ю. 15-$итодиеновой кислота и изучение ее стереохимии. Раствор натриевой соли {1-,4С]яиноле-новой кислоты объединяли с суспензией гидропероксуддегидразы из семян льна и инкубировали при 23°С е. течение 3-х часов. После подкисления реакционной смеси ледяной уксусной кислотой продукты экстрагировали этилацетатом. 12-0ксо-10,15-фитодиено-вую кислоту выделяли с помощью полупрепаративной ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой. Часть полученной 12-оксо-ФДК подвергали цис-пранс-изокеризации в присутствии глутатиона и L10H как описано (Ким с соавт., 1988).

Разделение 15С2)- и 15(D -изомеров выполнялось методом 0Ф-ВЭМ с ионами серебра в подвижной фазе. Для определения 15(£)-изомера использовался также метод фурье-ИК спектроскопии. Спектры (600-4000 см"') снимали в пленке при 150-200-кратном накоплении. Производные спектров и разностные спектры рассчитывались с помощью системы обработки данннх ¿«pect. Методы исследования образования гидроперекисей д-кетолов в системах in. vitro. Свежеприготовленные растворы фермента инкубировали с !1-,4С]13гНР0Т, [1-14С]9-НР0Т, [ 1 -*4 С Jлиноленатсм или с {,4С}оисетолами. -Продукты разделяли методом 0Ф-ВЭЮС.

Число гидроперокои-групп в очинённых полярных метаболитах определяли путем колориметрического измерения (оптическое поглощение при 410 нм) количества свободного иода, образуюцегося

при реакции KI с раствором анализируемого вещества как описано ранее [Grechkin et al., 1991].

Очищенные метаболиты восстанавливали избытком НаВН^ в изопропаиоле при комнатной температуре. Для определения числа двойных связей изопропанольные раствори образцов, восстановленных NaBH4, гидрогенировали над 5у. Pt/Al203. Продукт восстановления НаБН4 полярного метаболита, образующегося из 13-НРОТ, обрабатывался избытком РЬСОАс)^ в бензоле при 30°С в течение 1 часа для определения локализации йац-диольного фрагмента. Методы изучения кето-енольной таутомерии а-кетолов и их превращений в окислительно-восстановительных реакциях. Раствор 12--оксо-13-гидрокси-9СZ)-октадеценовой кислоты в Трис/HCl СрН 7,5) смешивали с 2 мМ раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола. Реакция продолжалась 3 или 16 часов при комнатной температуре. Экстракция продуктов и их анализ методом радио-ВЭЖХ. После по-дкисления реакционной смеси продукты инкубаций экстрагировали этилацетатом или другими растворителями, несмешивающимися с водой и разделяли методом ОФ-ВЭЖХ с детектированием проточным сцинтилляционным счетчиком. В некоторых случаях для детектирования одновременно использовался быстрый спектральный детектор LKB 2140 Сдиапазон 190-370 нм).

Применение молекулярной спектроскопии для исследования строения оксигенированных жирных кислот.

а) Ультрафиолетовая спектроскопия. Ультрафиолетовые спектры отдельных метаболитов извлекались с помощью программы Wavescan из хранящихся файлов с изограммами, зарегистрированными быстрым спектральным детектором LKB 2140 в процессе хроматографи-ческого разделения. В отдельных случаях спектры регистрировались также с помощью спектрофотометра М40 ("Carl Zeiss", Германия) в метанояьном растворе.

б) Масо-спектроыетрия. После очистки свободных оксигенированных жирных кислот методом ВЭЖХ их масс-спектры химической ионизации (ХИМС) и электронного удара (ЭУМС) высокого разрешения стшали в режиме прямого ввода в ионный источник спектрометра.

в) Ядерный магнитный резонанс. Спектры 'Н-ЯМР (250 МГц, CDC13 или CD3CN) регистрировались с помощью импульсного спектрометра Bruker WM-250. Спектр 13С-ЯМР 12-оксо-10,15-фитодиено-вой кислоты (62,9 МГц, CDC13) был зарегитрирован на приборе Bruker MSL-400.

ГЛАВА 3. ЭВОЛЮЦИЯ АНАБОЛИЗМА ПОЛИЕНОВЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПОИСКА ОКТАДЕКАНОИДОВ И ЭИКОЭАНОИДОВ В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ. Арахидоновая кислоте (20:4ue), один из наиболее распространенных ацильных компонентов мембранных липидов в тканях животных, является предшественником ряда высокоактивных биорегуляторов, таких как простагландины, тромбоксаны, лейко-триены и липоксины. В этой связи вопрос о наличии 20:4»в в высших растениях представляет значительный интерес. .

Им циеся обзорные работы [Smith, 1971; Pohl et al., 1972; Kunau, 1976; Gunstone et al., 1986] свидетельствуют об отсутствии 20:4ив в цветковых растениях. Напротив, 20:4«° была обнаружена лишь в растениях, находящихся на низких уровнях эволюционного развитая: в водорослях, мхах, папоротниках. Вместе с тем, недавно появились публикации, свидетельствующие о присутствии 20:4»" в масле зародышей пшеницы [Janistyn, 1982} и в почках тополя бальзамического [Исаева с соавт., 1987}. Две последние работы имели своей особой целью именно обнаружение 20:4и". В связи с принципиальным значением вопроса о присутствии 20:4» * в цветковых растениях, наш было проведено исследование, описанное в настоящем разделе.

Как показали результаты исследования методом капиллярной ГЖХ, арахидонат отсутствует среди суммарных жирных кислот почек тополя. Преобладающими компонентами являются лаурат (SO,5JÖ, линолеат (13,5X3 и линоленат С10%).

Часть липидного экстракта была подвергнута омылению. Из смеси полученных при этом свободных кислот методом ОФ-ВЭЖХ была выделена фракция, соответствовавшая по времени удерживания арахидонату. В ХИМС этой фракция не было обнаружено какого-либо превышения фона при m/z 305, соответствующем квазимолекулярному иону [М+Н)+ арахидоновой кислоты. Таким образом, 20:4«6 не содержится в почках тополя в количествах, детектируемых такими высокочувствительными методами как капиллярная газовая хроматография и масс-спектрометрия. Из данных масс-спектра следует, что если 20:4»" вообще содержится в почках, то его количество не превышает 0,01й суммарных жирных кислот.

Приведенные результаты полностью согласуются со сведениями о жиркокислотном составе высших растений из цитированных выше обзоров и расходятся с данными работы Исаевой с соавт. (1987), в которой сообщается об обнаружении 20:4и® кислоты в

почках Populus ba.lsan.ifer а. Ошибочные результаты работы Исаевой с соавт. определяются, по нашему мнению, рядом допущенных в ней серьезных методических ошибок.

Имеющиеся в литературе данные о филогенетических различиях жирнокислотного состава позволяют предложить общую модель эволюции систем образования полиеновых жирных кислот в растениях. В прокариотах, таких как представители Cyanophyta, Сао--полиеновые кислоты отсутствуют; основными компонентами чаще всего являются 18:2 и а-18:3 [Pohl et al., 1972]. При формировании эукариотической растительной клетки липидный метаболизм значительно усложнился по сравнению с Cyanophyta. Представители Euglenophyta, зеленые и некоторые другие водоросли, мхи и папоротники содержат не только линолеат и а-линояенат, но также r-линоленат, эйкозатриеноат (20:3»") и 20:4«° [Smith, 1971; Pohl et al., 1972; Kunau, 1976]. В процессе эволюции эукариот происходили дальнейшие изменения. Хвойные растения не содержат 20:4«* [Jamieson et al., 1972]. По-видимому, это обусловлено потерей активности Ав-десатуразы. Так, при отсутст! л 20:4»® хвойные растения содержат 5,11,14-эйкозатриеноат и 5,11,14,17--эйкоэатетраеноат [Jamieson et al., 1972; Pohl et al., 1972; Gunstone et al., 1986]. Такой же особенностью отличаются некоторые другие голосеменные [Smith, 1971; Pohl et al., 1972; Kunau, 1976]. До сих пор отсутствуют достоверные сведения, подтверждайте присутствие 20:4»® и 20:5 у цветковых растений, основный жирнокислотным компонентом которых является а-линоленат.

Приведенный выше анализ наших собственных данных и литературных сведений позволяет заключить, что поиск эйкозаноидов в цветковых растениях нецелесообразен. Роль биорегуляторов, подобных эйхооаяоидам, в растениях, вероятно, выполняют окта-деканоиды, продукты метаболизма С|а-полиеновых кислот. В этой связи, настоящая работа посвящена изучению окислительных превращений линолевой и линоленовой кислот в высших растениях. ГЛАВА 4. ОКИСЛЕНИЕ ЛИНОЛЕВОЙ И ЛИНОЛЕНОВОИ КИСЛОТ В БЕСКЛЕТОЧНЫХ ПРЕПАРАТАХ ИЗ ЛИСТЬЕЬ ПРОРОСТКОВ ГОРОХА. При инкубации [1-*4С]линолеата и [1-,4С]линолената с гомогенатом листьев в присутствии NADPH происходит активное окисление субстрата. Выло обнаружено, что наблюдаемое окисление полиеновых кислот зависит от NADPH. В отсутствие зкзогенно:о NADPH выход продуктов окисления линолеата в гомогенате значительно снижен.

Поскольку наблюдаемое окисление зависело от NADPH, представлялось вероятным, что оно может быть в определенной степени опосредовано активностью цитохрома Р-450. Для более точного выяснения локализации ферментов, контролирующих наблюдаемый путь окисления, изучали метаболизацив линолеата в суспензиях изолированных микросом. При этом выяснилось, что линолеат эффективно окисляется.в микросомальных суспензиях в присутствии NADPH. Инкубация линолеата с микросомами и гомогенатом приводит к образованию практически идентичных наборов продуктов.

В отсутствие NADPH не только замедляется окисление, но и изменяется направленность метаболизма, в частности, в 10 раз уменьшается включения в 12-гидрокси-9( Z)-додеценовую кислоту.

В присутствии метирапона, ингибитора окислительных реакций с участием цитохрома Р-450. метаболизация линолеата в суспензиях изолированных микросом снижалась на 41%. Окись углерода, ингибитор активности моносксигеназы, сильно подавляет окисление линолеата в изолированных микросомах. Эти данные свидетельствуют od участии в окислении цитохрома Р-450. Метаболизм полиеновых жирных кислот в растениях по монооксигеназному пути ранее не был известен.

Одним из основных продуктов окисления линолеата в гомоге-нате было соединение I С{М+Н]+ при m/z 213. CiaHaJOa), 'Н-ЯМР--спектр (250 МГц, CDCljt б, м.д.): 1,31 (м, 4-Н - 7-Ю, 1,62 (м, 3-Н , J г 7,2; J = 7,1 Гц). 2,06 (дт. 8-Я.. J, „= 7,4;

т 9 t я i • 4 2 7|1

JB e= J,0 7,5 ГЦ), ¿,34 (дт. 11-На, Jit |аг 6,6). ¿,35 (т. 2-Й). З.Й (т. 12-На). 5.33 (дт. 10-Н, 10,6 Гц), 5,50

(дт, 9-Н). Метаболит I был идентифицирован по данным ХИМС, УФ-, ПК- и 1 Н-ЯМР-спектров, а также периодат-перманганатного окисления как как 12-гидрокси-9С Z)-додеценовая кислота. Это соединение не было выделено из природных источников.

Помимо кислоты I, среди продуктов окисления линолеата в гомогенате листьев гороха обнаружен компонент, который по времени удерживания при анализе методом ОФ-ВЭЖХ совпадал с синтетическими зпоксидами линолеата. Дальнейший анализ этого продукта методом НФ-ВЭЖХ выявил два компонента III и IV. Соединения III и IV ([М+Н]* при т/г 297,243; С „Н^О^) была идентифицированы по данным ХИМС, ЭУМС, УФ- и 'Н-ЯМР-спектров соответственно как 12,13-эпокси-9(2)-октадеценовая (верноловая) и 9,10--эпсжси-12(Z)-октадеценовая (коргнаровая) кислоты. Основным

эпоксидом, образовывавшимся в наших экспериментах, была коро-наровая кислота. Вероятно, это объясняется позиционной специфичность» контролирующей окисление оксигенаэы.

Коронаровая и верноловая кислоты давно известны как природные соединения. Они обнаружены в семенах многих видов растений, в частности, у представителей Composttae [Smith, 1971; Pohl et al., 1972]. В то же время, физиологическое значение присутствия эпоксикнслот в семенах не выяснено. Согласно недавно опубликованным данным, верноловая и коронаровая кислоты могут выполнять роль природных фунгицидов. Обе эпоксикислоты были обнаружены в растениях риса сорта, устойчивого к грибковому патогену Pyricularia oryzae [Kato et al., 1983].

Проведенные эксперименты с гомогенатом эпикотилей проростков гороха не выявили отношений предшественник-продукт между

ООН

соон

ГЕКСАНАДЬ

НС

соон

II

о

о

Рис. 1. Метаболический путь образования 12-гидрокси-9СЙ-до-деценовой кислоты.

[1-'4С)вернолоатом и кислотой I. Напротив, наши результаты показывают, что [1-14C]13-HP0D и [1-14С]12-оксо-9С2)-додеценовая кислоты являются предшественник ми 12-гидрокси-9СЭ-додецено-вой кислоты. После инкубации с гомогенатом листьев гороха в присутствии 1 ыМ NADPH, метка из [1-' "С)12-оксо-9СЮ-додецено-вой кислоты почти полностью включалась в соединение I. Таким образом, 12-гидрокси-9(Ю-додеценовая кислота (I) образуется в результате ^эрментативного восстановления 12-оксо-9(.2)-додеце-новой кислоты, как показано в схеме на рис. 1.

Как следует'из схемы на рис. 1, первичным продуктом расщепления цепи 13-HP0D является 12-оксо-9(Z)-додеценовая кислота. В дальнейшем эта альдокислота может либо претерпевать спонтанную аллильную перегруппировку с образованием 12-оксо-10--CD-додеценовой кислоты (травматина), либо восстанавливаться (ферментативно, с NÀDPH в качестве кофактора) до соединения I.

Уместно отметить близкое структурное и метаболическое родство 12-гидрокси-9(2)-додеценовой кислоты с 2СЮ-додецен--1,12-диовой Стравматиновой) и 12-оксо-1ОСЕ)-додеценовой Стра-вматином) кислотами, являющимися'раневыми гормонами растений [Vick et al., 1987). Так хе как травматин и травматиновая кислота, 12-гидрокси-9(ZD-додеценовая кислота обладает ростотиму-лирующей активностью [Панкратова с соавт., 1988)..

Полученные данные показывают, что метаболическим предшественником верноловой и коронаровой кислот является линолеат. Ранее было установлено, что арахидоновая кислота эпоксидирует-ся препаратами цитохрома Р 450 из печени животных [Capdevila et al., 1981]. Наблюдаемый нами тип окисления также, как было упомянуто выше, контролируется цитохромом Р-450. То, что коро-наровая кислота является основным эпоксидом линолеата среди образующихся метаболитов, свидетельствует об определенной позиционной специфичности монооксигенаэы проростков гороха.

Как упомянуто выше, эпоксикмслоты является лишь минорными продуктами окисления [1-,4С]линолеата в проростках гороха. Одной из причин их низкого выхода могут быть вторичные реакции. Для проверки этого предположения и с целью поиска новых метаболитов нами было изучено превращение экзогенных [1-,4С]коронаровой и [1-,4С]верноловой кислот в гомогенате эпикотилей гороха. С этой целью неселективным окислением [I-14С]линолеата были по. учены рацемические препараты обеих кислот.

Метаболизм обеих эпоксикислот приводит к трем основным продуктам. Экзогенные {1~1ЧС}коронаровая и [1-* *С]верноловая кислоты через 30 мин после внесения в гомогенат превращались в продукты практически полностью.

Наименее полярный продукт V ([[Ч+Н]+ при т/г 313,238; СвН„04>, образующийся из обеих эпоксикислот, был идентифицирован по данным ХИМС и ЭУМС как С9,10),(12,13)-диэпоксиоктаде-кановая кислота. Как природное соединение кислота V ранее не была описана. Очевидно, соединение V образуется в результате эпоксидироваиия двойных связей в моноэпоксидах линолеата.

Более полярные метаболиты коронаровой и верноловой кислот, соответственно - VI и VII С(М+Н]+ при т/г 315,254; С,,НЗВ04), идентифицированы по данным ХИМС и ЭУМС как 9,10--дигидрокси-12(2)-октадеценовая и 12,13-дигидрокси-9 С Z)-окта-деценовая кислоты, соответственно. Вероятным путем образования виц-диолов VI и VII является ферментативный гидролиз. Ранее

"9 »«

/—--------

У^Ч------

-------—'

IV

III

----------

MO OH

IX

Рис. 2. Пути метаболизма верноловой и коронаровой кислот в гомогенате эпикотилей гороха.

эти соединения были идентифицированы среди продуктов окисления линолеата в микросомах из печени кролика (Ollw, 1983].

На основании данных ХИМС и ЭУМС наиболее полярным метаболитам коронаровой и верноловой кислот, соединениям VIII и IX С[М+Н]+ при т/2 331,S48; С1вН3„Ов) приписано строение соответственно 9, Ю-ДИГидрокси-12,13-зпоксиоктадекановой и 9,10-эпок-си-12,13-дигидроксиоктадекановой кислот.

Полученные результаты позволяет предложить схему основных путей метаболизации коронаровой и верноловой кислот в проростках гороха (рис. 2). Согласно схеме, вицинальные диолы VI и VII образуются при гидролизе коронаровой и верноловой кислот, соответственно. Окисление обеих изомерных эпоксикислот приводит к образованию диэпоксида V. Соединения VIII и IX, по-видимому, образуются двумя путями - в результате эпоксидирования вицинальных диолов, или частичного гидролиза диэпоксида.

Данные настоящего исследования свидетельствуют о кратковременности жизни эпоксикислот. В этой связи, проявляемая эпок-сикислотами физиологическая активность может быть обусловлена не только ими самими, но и их метаболитами.

Описанный в настоящей главе монооксигеназный путь, приводящий к образованию эпоксикислот и их вторичных продуктов, расширяет•представления об окислительном метаболизме ненасыщенных жирных кислот в растениях. Остальная часть настоящей работы, описанная в нижеследующих разделах« посвящена различным направлениям липоксигеназного пути в высших растениях, ГЛАВА 5. ОКИСЛЕНИЕ tI-14С1ЛИНОЛЕНОВОИ КИСЛОТЫ ЛИП0КСИГЕНА30И ИЗ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ.

а) Двойное диоксигенирование линолената. Липоксигеназный путь окисления Сго~полиеновых жирных кислот в тканях животных является источником высокоактивных биорегуляторов, в частности, лейкотриенов и липоксинов. В растениях подобные оксигенированные сопряженные жирные кислоты до сих пор обнаружены не бали.

Ранее была доказана способность липоксигеназ из клубней картофеля (ЛКЮ и семян сои превращать арахидоновур кислоту соответственно в 5,6-лейкотриен А4 и 5,12-DiHETE [Shinizu et al., 1984] и в-липокешш А и В [Sok et al., 1988]. Активность ЛКК в клубнях очень высока. В то же время, клубни картофеля так же как ткани других цветковых растений не содержат арахи-лочата. метаболического предшественника зйкозаиоидов [Preisig,

1985]. В этой связи представляет значительный интерес физиологическая роль ЖК. Поскольку этот фермент является типичной 9--липоксигеназой, нам представлялась весьма вероятной возможность превращения 9-НРОТ (первичного продукта окисления а-ли-нолената) в продукты двойного диоксгенирования.

Среди продуктов инкубации сх-линолената с ЖК была обнаружена единственная моногидроперекись (рис. 3 а,б), 9-НРОТ, продукт восстановления которой раствором NaBH4 был идентифицирован как 9-Н0Т (М+ при m/z 284; к 235 нм).

г пах

Наряду с пиком 9-НРОТ, анализ продуктов методом радио-ОФ-

-ВЭЖХ выявил несколько более полярных метаболитов (рис. За).

Два полярных компонента СХ ь XI) характерные для триенов УФ-

-спектры 267 нм, плечи при 259 и 279 нм). Небольшой пик,

элюируюцийся между этими двумя компонентами (время удерживания

около 34,5 мин, рис 3 0) имеет меньшую экстинкцию при 280 нм,

9-НРОТ X . ^ XI lüta l i

Б 1 XIV«XV. 1 O-HPOl Jf 9—KOT /

..................................................'"" " 1 " ........... "

_Л

о-кат /

Ю 20 ЭО ЛР SO ÖO 70 DPEMH УПЕРЖИОПНИЯ (МИН)

10 20 за 40 SO 60 7 0 ПРСГМП t/аЕРЖМОДНИЯ (МИН J

Рис. 3. Разделение продуктов окисления [1-,4С]линоленовой кислота липоксигеназой из клубней картофеля (ОФ-БЭГО. (а) Радяохроматограмма; Ш Хроматограммы с ультрафиолетовым детектированием при 235 и 310 нм. XIV+XV, пик метаболитов с пах 309 нм. (б) Детектирование тех же самых продуктов при 280 нм. (г) Анализ методом ОФ-ВЭЖХ (детектирование при 280 нм) соединения XII, продукта восстановления метаболитов X и XI боропшридои натрия.

□

X

г

к

но доминирует в хроматограмме при 310 нм.

Восстановление соединений X и. XI раствором 11аВН4 приводило к кислоте XII <[М+Н]+ при т/г 311,222 CCtоНа|0^3; X(ia< при 267 нм>. времена удерживания соединений XII и XI При анализе методом ОФ-ВЭЖХ совпадали (рис. 3 г по сравнений с рис. 3 в). Каталитическое гидрирование соединения XII приводило к кислоте XIII {(M+HJ+ при w/z 317.367 (С eIlj794)>. Таким образом, соединение XII содержит три двойные связи. По данным ХИМС и ЭУМС соединение XIII было идентифицировано как 9,16-дигидроксиокта-декановаа кислота. '

На Основании упомянутых выше данных, а также спектра 'Н--НМР U, М.Д.Э: 0,04 Ст. 18-Нэ, JiT 1Л* 7,4 Гц}, 1,36 См, 4-Н - 7-1», 1,43-1,68 (м, 3-Нг, 8-Н^, 17-На>, 2,31 Ст, 2-Ha, J J = 7,4 Гц). 4,10 См, 9-Н и^16-Н, J = J ■ J , ■

2,3 J.4 ■ 0,»0 10,1«

J.e 6'3 Гц3' 3'78 (ДД' 10"Н И 15"Н' J,o J14 ,»Я 15Л

Гц)! 6,03 CA И В в АЕММ', 12-Н и 13-Н, J ' т Jit J ■ И.5; J, » J » -1,2 Гц5. 6,74 'М и Й' в АВМЙ'. 11-Н'и

1 I 1>1 (2|14

14-10 соединение XII било идентифицировано как 9,16-дигидрок-си-ЮСЕ), 12CZ) ,14(D-октадекатриеновая кислота.

Колориметрическое определение показало, что продукты X и XI содержат соответственно одну и две гидроперокси-группы. Таким образом, метаболит XI идентифицирован кале ЭДб-дигидропар-окси-ЮСЕ) Д2СДД4СЕ)-октадекатриековая кислота, а продукт X является смесью двух позиционных изомеров, 9-гидрокси-16-гид-роперокси-10(£) ,12CZ),14СЕ)-октадекатриеноЬой и 9-гидроперо-кси-l6-гидрокси-1 ОСП, 12CZ), ШЮ-октадекатрненовой кислот.

Дополнительным подтверждением идентификации продуктов X и XI служат данные экспериментов по окислению [1-,4С]9-Н0Т и [1-'4С]9-НР0Т картофельной липоксигеназой. Оба субстата с высокими выходами превращались в продукты двойного диоксигениро-вания. В случае [1-14С}9-Н0Т образования дигидроперекиси XI не наблюдалось, единственным продуктом была кислота X. С другой стороны, {1-14С]9-НР0Т в тех же условиях является предшественником обоих метаболитов X и XI. Окисление [1-,4С]9-Н0Т существенно стимулировалось добавлением немеченой 13-HP0D.

Приведенные выше результаты позволяют заключить, что контролируемое ЛКК образование сопряженных триенов происходит по схеме, изображенной на рис. 4. Первичный продукт окисления а--линолената, 9CS)-HP0T, вновь подвергается атаке ЛКК. При атом

лкк

9-НОТ лкк|оа

ООН

(-О)

<-нао) ^

сЬ

9-НРОТ'

ч-нот

лкк

лкк

о2

_______'МаОН»

Рис. 4. Пути превращения а-линояеновой кислоты лшкжсигеназой из клубней картофеля С ЯКЮ. Обозначения: С-03 - восстановление гидроперекисей за счет гидропероксидазной активности ЛКК; С-Н„05 - превращение гидроперекисей в оксоднеш; К = -ССН2)7СООН. Восстановление продуктов Ха, ХЬ, XI, XIV и XV борогидридом натрия с образованием ЮШОВ СХШ обозначено пунктирными стрелками.

отсутствие в молекуле 9-ПР0Т прохирального центра С-11 дола<?т невозможным окисление по С-13. Остается единственная возмояп-сть - отрыв П-14 с последутаей перегруппировкой рздикала и присоединением 0з'по С-16 с образование« 9,16-В1!1Р0Т. Кроме»

9,.16-DiHPOT образуются продукты ее частичного восстановления.

Ранее было описано двойное диоксигенированке арахидоновой [Bild et al., 1977; Van Os et al., 1981] и г-линоленовой кислот [Bild et al., 1977.; Kim et al, 1988] соевой липоксигенаэой. Окисление арахидоната приводило к 5,13- и 8,15-DiHETE [Van Os et al., 1981]. Было обнаружено, что соевая липоксигеназа 1 неспособна образовывать дигидроперекись из а-линоленовой кислоты [Bild et al, 1977].

Помимо описанных опытов с ЛКК мы так&е проводили эксперименты с липоксигеназами из семян сои и проростков пшеницы. Однако наблюдавшиеся сри этом выходы продуктов двойного диокси-генирования были значительно нкте, чем с ЛКК. б) Образование сопряженных оксотриенов. Как отмечалось выше, среди продуктов инкубации а-линолената с ЛКК помимо сопряжеь-ных триенов X и XI 267 им) был выявлен элюирующййся

между ними пик с х 309 нм. После очистки ОФ-ВЭЖХ эта фрак-

ШАХ

ция была разделена методом НФ-ВЭЖХ на два компонента XIV и XV

(оба имеют хМв0В 309 нм). шах

Восстановление продуктов XIV и XV NaBH^ приводит к образованию одного и того же соединения XII, которое было также продуктом восстановления метаболитов X и XI. Как описано выше, соединение XII C9,16-DiH0T) и продукт его каталитического гид-.рирования XIII были идентифицированы по данным ХИМС, ЭУМС, УФ-и 'Н-ЯМР-спектров.

Максимум поглощения метаболитов XIV и XV 309 им) в

непОлярном растворителе Сгексан) претерпевал гипсохромный сдвиг до 302 нм. В спектрах ХИМС соединений XIV и XV (спектры регистрировались после обработки XIV и XV трифенилфосфинои) присутствовали квазимолекулярные ионы [М+Н]+ при m/z 309,207 (СвНае04). Продукты гидрирования соединений XIV и XV (соответственно, XVI и XVII) также образуют протонированные квазимолекулярные ионы [М+Н]+ при п/е 315,254 (С flHai04). .

• На основании данных ХИМС, ЭУМС и УФ-спектров соединения XVI и XVII идентифицированы как 9-оксо-16-гидроксиоктадекатри-еновая и 9-гидрокся-16-оксооктадекатриеновая кислоты, а соединения XIV и XV - как 9-оксо-1б-гидро(перо)кси-10(£),12(Z),14-(D-октадекатриеновая и 9-гидро(перо)кси-16-оксо-10(Ю ,12CZ),. 14(D-октадекатриеновую кислоты. Необходимо отметить, что структура оксотриена XV подтверждена съемкой его 'Н-ЯМР спектра

С«, м.д.): 0,77 (т, 18а-Н, J = 7,4 Гц), 0,83 (т, 18Ь-Н), 1,00 (т, 18с-Н), 1,20 (м, 4-Н - 7-Н), 1,52 (м, 3-На и 8-Н2), 2,18 (т, 2-Ha, Ja 3= J3 4= 7,5 Гц), 2,45 (м, 17-На), 4,06 См, Н-9, Ja 10= 6,6),'5,81 Ы, Ю-Н, Jo Ii, 15,4 Гц), 6,06 (дд, 15-Н, j't4 |(>= 15,4; Jta |e= - 2,9), б',22 (АВ, 12-Н и 13-Н АВ), 8,46 (м, il-H), 7,05 См! 14-Ю.

Оксотриенолы XIV и XV не были обнаружены ранее в природных источниках. Наши результата показывают, что образование оксотриенолов происходит в результате липоксигеназного окисления сопряженных оксодиенов (рис. 4). 1гк, согласно полученным данным, 9-оксо-10(0,12(2),15(2)-октадекатриеновая кислота является предшественником оксотриенола XIV. Сопряженные оксодие-ны образуются эа счет липогидропероксидазной активности липок-сигенаг [Vick et al., 1987]. Эта реакция является в большинстве случаев анаэробной. Однако известны примеры аэробной липогидропероксидазной активности [Jolivet et al., 1988].

Структурное сходство идентифицированных метаболитов с ле-йкотриенами я родственными биорегуляторами, образующимися по липоксигеназному пути в тканях животных позволяет предположить, что сопряженные триеновые жирные кислоты могут также иметь определенную регуляторную роль в растениях. Соединение XII, полученное при восстановлении суммарных метаболитов X, XI, XIV и XV, стимулировало дыхание корней пшеницы.

Описанные выше результаты касаются нескольких различных путей окислительного метаболизма полиеновых жирных кислот в высших растениях, включая монооксигеназкый путь и несколько направлений липоксигеназного пути: двойное диоксигенирование и реакции, контролируемые гидропероксидлиазой. В следующем разделе описаны новые результаты, касасчиеся гидропероксиддегидра-зного пути. Это направление метаболизма гидроперекисей в растениях было открыто ранее всех других. Вместе с тем, многие вопросы, касающиеся гидропероксиддегидразного пути, оставались невыясненными до последнего времени. Недавнее открытие окисей ал-ленов привело к полному пересмотру существовавших ранее сонцеп-ций и к значительному прогрессу в данной области исследований. ГЛАВА 6. МЕТАБОЛИЗМ ЛИНОЛЕВОИ И ЛИНОЛЕНОВОИ КИСЛОТ ГИДРОПЕРОКСНЯЛРТИДРАЯПИ ИЗ НЕКОТОРЫХ ОДНОДОЛЬНЫХ РАСТЕНИИ.

Ранее был описан фермент гидропероксидизомераза, превращающий 13-HP0D 3 12-оксо-13-гидрокси-9(2)-октадеценовую кисло-

ту (а-кетол) [Zimmerman, 1966; Zimmerman ei al., 1970]. Впоследствии было показано, что продуктами гидропероксидиэомеразы наряду с а-кетолаыи являются r-кетолы [Gardner, 1970}. Так, 13-HP0D наряду с а-кетрлом превращается в 12-оксо-9-гидрокси-10(£)-октадеценовую кислоту (r-кетол). Затем было обнаружено, что фермент из семян льна превращает 13-НРОГ наряду с кетолами в замещенный циклопентенон, получивший название 12-оксо-9,15--фитодиеновой кислоты (12-оксо-ФДК) [Zimmerman et al., 1978]. В этой связи было выдвинуто предположение, что циклизация 13--НРСТ в 12-оксо-ФДК контролируется отдельным ферментом, названным гидропероксидциклазой [Zimmerman et al., 1978],

Недавно некоторыми авторами [Hamberg, 1987; Brash et al., 1988] было обнаружено, что ферменты из семян льва в кукурузы катализируют дегидратацию 13-HP0D, сопровождающуюся образованием нового метастабильного продукта, 12,13-anoxcH-9(Z),11,15-СZ)-октадекадиеновой кислоты (окиси аллена). Выло доказано, что как кетолы, так и 12-оксо-ФДК образуются через окись аяяе-на [Brash et al., 1983]. В этой связи, фермент, называвшийся прежде "гидропероксидизомеразой", получил название, соответствующее его истиной функции, а именно, "гидропероксиддегидраза". а) Идентификация продуктов гидропероксиядегядразиого пути.

При инкубациях II-1*С]тнолевовой кислоты й [1-,4С]13--НРОТ с гидропероксид-дегидразой из семян льва в ваших экспериментах образовывалось три основных продукта (в порядке увеличения полярности); ХШГ, XIX и XX (рис. 3), идентифицированных по данным ХИНС, ЭУМС, УФ-спектроскошш соответственно как 12-оксо-ФЖ, а-кетол и r-кетол. Идекткфиаацзя . 12-оксо-ФДК подтверждена также дакшаса Фурье-Ш-, 'Н- и 13С-ЯМР-спектрэв.

Как следует из представленных на рте. 3 дашшк анализа продуктов инкубации [ I-1 "CJкшолеяата ггщзопероксЕДдегидразой из семян льна, помимо кетояоз л 12-оксо-ФЖ, в смеси присутствовал некий более полярный метаболит XXI. При переходе от основных СрН 7,5) к кислым СрН 5,8) условиям направленность ме-таболиэации гидроперекиси изгоняется (ркс 5 б по сравнению, с-рис. 5 с). При этсы уцекьиается включение метки в а-кетол и увеличивается выход г-кетола. Особенно существенно стимулируется в кислых условиях образование полярного продукта XXI (хах при 228 нм) со временем удерживания 31 мин (рис. 5 б).'

В ХИМС соединения XXI присутствовали основные пики [М-

а ы и \ с 2 S

а ш и \ с 2 S

й

XIX

XX

jvJjül

XYIII

1А

13-НРОТ

I I 1 I 1 I ' 'I' I

XIX I

XX

XXI

_лЛ

XYIII

13-НРОТ

1А л

а

т ю

20

г

ЗО 40 SO 6D 70 ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ(МИН)

Рис. 5. Анализ продуктов инкубации [1-,4С] 13-НРОТ с препаратом гидропероксид-дегидразы из семян льна СОФ-ВЭЖХ). Инкубации при pH 7,4 Ca) и 5,8 (б). Обозначения: 13-НРОТ, XVIII, XIX, XX и XXI - пики 13-НРОТ и продуктов XVIII. XIX, XX и XXI, соответственно.

-На0в-На0+С4Нв)* при т/г 347, [М+Н-Нг0]4 при т/г 325, [М*Н-На08]+ при m/z 309 и [М+Н-Нг02-Нг0]+ при т/г 291. Схема фраг-

ментации кислоты XXI по данным ЭУМС приведена на рис. В.

На основании приведенных выие данных, а также 1Н-ЯМР-спе-ктра Св, м.д.): 0.93 Ст, 13-у , |в = 7,5 Гц), 1,35 Сы. 4--Н - 7-Ю, 1,61 См, 3-Н, 8-Нг), 2,61 См," 17-Нг, |7= 7,5 Гц). 2,33 (т. 2-На, ^ 3= 7,3 Гц), 2,44 См, 14а-Н, 2.56 См. 14Ь-Н), 4,47 См, 13-ГО! 4,54 Сдт, 9-Н, ^ „= 10= 6,3 Гц), 5,30 Сдт. 15-Н, 7|4 = 7,1), 5,53 Сдт 16-Н. ^ >в= 11,0 Гц). 6,46 Сд, 11-Н,'^10>||= 15,9 Гц), 6,92 Сдд. 16-Ш. соединение XXI приписано строение, изображенное на рис. 6. Структура соединения XXI подтверждена также его встречным знзиматиче-схим синтезом при инкубации а-кетола с ЛКК'.

12?.D7e|197.110 1B3.1CI2 (1) 1G7.107 (5)

(■7) ; (з,а)

|-HaO

(13) i-HaO tCtoHi7a4]jlA3,lD2

(loo) I (CJ.3)

COOH

97,0 <5S f£claha;asJ 1S3.0921 [c„h„oJ

(5Л) J-H2O <s> |-Hao-

227.12b 211,133 171.ЮЗ 135д07

(S) (21) (s.2) (-7,9)

Рис. 6. Основные направления фрагментации соединения XXI при электронном ударе. Приведены измеренные значения массы и соответствующие им интенсивности (в скобках).

При восстановлении кислоты XXI в растворе НаВН4 образуется соединение XXII (хВЛХ при 303 нм, идентифицированное по данным ХИМС и ЭУМС как 9,12,13-тригидрокси-10(D,15(Z)-октаде-кадиеновая кислота. В результате реакции соединения XXII с РЬ(ОАс)4 образовывался единственный меченый продукт XXIII, идентифицированный по данным ХИМС <[М+Н]+ при т/2 229) как 9--гидрокси-12-оксо-10(Е)-додеценовая кислота. Таким образом, результаты реакции с РЬ(ОАс)+ подтверждают наличие в соединении XXII 12,13-диольной группировки.

При инкубации [1-'*С]9-НР0Т с гидроперокисиддегидразоЯ из семян льна помимо соответствующих а- и у-кетолов, 9-гидрохси--10-оксо-12(Z),15(Z)-октадекадиеновой (XXIV) и 10-оксо-13-гид-рокси-11(D,15(Z)-октадекадиеновой (XXV) кислот, метка включалась в ролярный продукт XXVI (*пах при 228 нм). Спектр химической ионизации соединения XXVI был очень сходен с описанным выше ХИМС метаболита XXI. На основании данных ХИМС, ЭУМС и УФ-спектра соединение XXVI было идентифицировано как 9-гидрокси--10-оксо~13-гидроперокси-11(П, 15(г)-октадекадиеновая кислота. Структура подтверждена встречным энзиматическин синтезом в результате инкубации 9,10-кетола с соевой липоксигеказой.

Полученные данные свидетельствуют о том, что липоксигена-

аы способны окислять а-кетолы. Окисление аллильных кетонов вместо обычных метилен-разделенных полиенов представляет собой необычный и неизвестный ранее тип липоксигеназной реакции. При окислении сс-кетолов липоксигеназы проявляют такую же стереоспе-цйфичность, как при оксигенировании обычных полиеновых кислот.

Фракция а-кетола, полученная инкубацией 13-НРОТ с ферментом из семян льна, после двукратной очистки методом ОФ-ВЭЖХ была проанализирована с помощью НФ-ВЭЖХ. При этом наряду с собственно а-кетолом (XIX) были обнаружены метаболиты XXVII (х„.„ 230 нм) и XXVIII а.„ 211 нм).

гааХ 1ЯАХ

Соединение XXVII было идентифицировано по его УФ-, масс-и 1 Н-ЯМР-спектрам как 9-оксо-12,13-эпокси-10(£),15(2)-октаде-кадиеновая кислота. Это соединение известно как продукт гемолитической перегруппировки гидроперекиси.

Соединение XXVIII идентифицировано как 11-гидрокси-12-ок-co-9(Z),15С2)-октадекадиеновая кислота С11,12-а-кетол) по данным ХИМС {[M+HJ+ при т/г 311), ЭУМС Ссхема фрагментации на рис. 7) и 'Н-Я№-спектра Сл. м.д.): 0,94 Ст. 18-На, J17 1в= 7,5

ГЮ, 1,33 Си, 4-Н - 7-Ю, 1,64 См, 3-На), 2,06 См, 17-На, J,m ,7я 7,5 ТпУ' 8_Нв и 14-Нг), 2,34 Ст. 2-Нг.

J, '%а 7,4 Гц), 2,43 См. 13а-Ю, 2,57 См, 13Ь-Ю. 4,87 Сд, 11-Н,

Jtc »." 9'® Гц'' 3,18 Сдя' 10"Н' Je »•* 10'3 Гц}' 5,23 Сдт> 15-Й, J|B |в» 10,6; J,4tte° 7,3 Гц)', 5,40 Сдт, 16-Ю, 5,76 (дт,

9-Н, J '% 7,3 Гц). Этот кетол или какие-либо подобные струк-

4,0

Б9.07П (223,128 (*») (31)

12ЗО01)1в9.122

и

вЗ.ОВб (22CI.13S (20) (69)

in,nooli99,i33 (62) (23)

210.12G (Зв)

101,173 (ШО)

Рис. 7. Основные направления фрагментации соединения XXVIII при электронном ударе. Приведены измеренные значения массы и соответствующие им интенсивности Св скобках).

туры, содержащие 2-гидрокси-3(2)-бутен-1-онильные фрагменты и образующиеся по гидропероксиддегидразному пути из другой поли-еновой кислоты, не были известны до настоящего времени. 63 Щелочной и кислотный механизмы гидролиза окиси аллена.

Включение метки в r-кетол заметно увеличивается после изменения значения pH инкубационной среды от 7,5 до 5,8. Такая закономерность была подтверждена во многочисленных экспериментах по метаболизму [1-,4С]13-НР0Т и [1-,4C]13-HP0D гидроперок-сиддегидразой из проростков пшеницы и семян льна.

Различная рН-регуляция образования а- и r-кетолов может быть объяснена разными механизмами гидролиза окиси аллена. Для проверки этого предположения мы провели дополнительные серии экспериментов/результаты которых описаны ниже.

В первой серии экспериментов раствор [1-,4С]НР0Т вносили при 0°С в суспензию гидропероксиддегидразы из льна. Реакция продолжалась 15 сек, после чего одна половина объема реакционной смеси фиксировалась добавлением раствора NaOH, а вторая -HCl. После щелочной фиксации единственным образующимся кетолом был 12,13-а-кетол. При этом не наблюдалось образования ни г--кетола, ни 11,12-а-кетола. После кислотной фиксации преобладающим продуктом гидролиза окиси аллена был г-кетол.

Для выяснения вопроса о том, является ли окись аллена непосредственным предшественником кетолов независимо от величины pH, были проведены эксперименты по метанольному улавливанию. После 10 сек инкубации (1-I4C]13-HP0D с гидропероксиддегидра-зой из семян льна при 0°С СрН 7,5) реакционную смесь разбавляли избытком чистого метанола или смеси метанол/уксусная кислота 100:1 (по объему). Затеи продукты экстрагировали в анализировали методом ОФ-ВЭЖХ.

Наряду с некоторым количеством кетолов в присутствии метанола наблюдалось образование нескольких менее полярных продуктов, элюирующихся близко к пику 13-HP0D. Основным продуктом улавливания чистым метанолом было соединение XXIX (хах при 211 ни, М+ при n/z 326,246 (CieHj404)>, идентифицированное по данным фрагментации в ЭУМС как 12-оксо-13-метокси-9(Z)-октаде-ценовая кислота,.

После прерывания ферментативной реакции добавлением смеси мстано/г/уксусная кислота 100:1 (по объему) наряду с соединением XXIX образовывались продукты XXX при 225 нм) и XXXI

(х при 211 нм). оба с M+при m/z 326,246 (С Н 0 ). Наибо-

nax r r lo з+ «

лее интенсивные пики в ЭУМС метоксипроизводного XXX соответствуют ионам, образующимся при фрагментации между С-8 и С-9. По данным ЭУМС соединения XXX и XXXI были идентифицированы как 9--метокси-12-оксо-10Ш-октадеценовая и 11-метокси-12-оксо-9-С2!)-октадеценовая кислоты, соответственно (простые метиловые эфиры r-кетола и 11,12-кетола). Соотношение продуктов XXIX, XXX и XVXI при улавливании подкисленным метанолом составляло приблизительно б:3:1.

Пытаясь объяснить наблюдаемые различия в пропорции а- и r-кетолов, образующихся при щелочных и кислотных условиях, мы выдвинули предположение о двух различных механизмах гидролиза окиси аллена: а) нуклеофильный гидролиз, инициируется ионами гидроксила; б) кислотный гидролиз, инициируется протонировани-ем оксирана. В соответствии с предполагаемыми механизмами гид-

о'

соон

н®

Hl

соон

о

соон

ф

о

соон

но®

но®

он

Рис. 8. Схема кислотного механизма гидролиза окиси аллена.

ролиза, наряду с ранее известными 12,13-а-кетолом и г-кетолом должен образовываться новый кетола XXVIII. Описанные выше результаты, представленные в предыдущем разделе подтверждают, что 11,12-сх-кетол (XXVIII) действительно образуется наряду с 12,13-а-кетолом и г-кетолом.

Вышеописанные серии экспериментов с Ca) кратковременными инкубациями 13-НР0Т с дегидразой и последующей фиксацией NaOH или HCl; Сб) улавливанием окиси аллена метанолом или смесью метанол/уксусная кислота 100:1 (по объему) твердо доказывают, что образование r-кетола и 11,12-а-кетола зависит от кислоты. С другой стороны, 12,13-а-кетол является единственным продуктом кратковременных инкубаций, завершаемых фиксацией NaOH. Кроме того, результаты метанольного улавливания подтверждают, что все три кетола образуются в результате сольволиза коротко-живущего интермедиата, идентифицированного ранее как окись аллена [Hamberg, 1987; Brash et al., 1988].

Нуклеофильный механизм гидролиза окиси аллена, инициируемый нуклеофильной (SN2 или SH1) атакой гидроксила на С-13, приводит к образованию а-кетола. Образование г-кетола и 11,12--а-кетола CXXYIII) инициируется протонированием оксирана Срис. 8). Затем следует раскрытие оксирана, сопровождающееся переносом протона с кислорода на С-13 (рис. 8). Одновременно, п-эле-ктроны одной Ci") или двух Ca1 1 и а") двойных связей мигрируют по направлении к оксирану. Образующиеся два изомерных кар-бониевых иона в заключение гидроксилируются с образованием г~ -кетола и 11,12-а-кетола.

в) Стереохимия и механизм образования 12-оксо-10.15-$итодиено-вой киолоты. Как свидетельствуют результаты наших экспериментов по метаболизму [1-'*C]-13-HP0D и [l-t4C]-9-HP0T гидроперо-ксиддегидразой, обе гидроперекиси в отличие от 13-НР0Т не являете/: предшественниками щштопентенонов. В то же время, все гидроперекиси с высокой скоростью превращаются в о- и г-кето-лы. Этот результат полностью согласуется с ранее опубликованными данными [Vick et al., 1979; Vick et al., 1980], подтверждающими необходимость присутствия аялильного заместителя в молекуле гидроперекиси для образования циклопентенока. Так, д1 "-двойная связь является структурным элементом, определяющим способность 13-НР0Т превращаться в 12-оксо-ФДК. Поскольку циклизация окисей алленов может происходить не только фермеатати-

—Л/ч/

соон

соон

■•соон

Рис. 9. Образование 15С23- и 15(E)-изомеров 12-оксо-ФДК через окись аллена.

вно, но и спонтанно, очевидно, что наличие аллильного заместителя не может бить структурным требованием циклазы, как предполагалось ранее [Vick et al., 1980].

Циклизация окисей алленов, по общему мнению заинтересованного круга специалистов, протекает по эяектроциклическому механизму. Предлагаемая нами гипотеза об участии перициклическо-го аниона 2 Срис. 9) как интермедиата обосновывается ниже. Анализ наших собственных и литературных данных привел нас к предположению о том, что при циклизации окиси аллена и-элект-роны двойкой связи в аллильном заместителе вовлечены в гомосо-пряжение с "-орбиталью перицюслической системы (структура 2 на рис. 9). Анхикерный эффект гомосопряжения определяет значительное ускорение реакции циклизации. В лишенных аллил*чого заместителя окисях алленов, образующихся из 13-HP0D и 9-HP0D, скорость гидролиза значительно превышает скорость циклизации. Если гомосопряжение в перициклическом интермедиате имеет место, его следствием должно быть частичное обращение конфигурации двойной связи в аллильном заместителе. Для проверки этого предположения мы провели поиск 15(E)-изомера 12-оксо-ФДК.

Существование 15(E)-изомера было подтверждено методами "Гтрье-ИК-спектроскопии и ВЭЮС. Оба геометрических изомера, 15-(Z) и 15(E), были разделены методом ОФ-ВЭЖХ с ионами Ад* в подвижной фазе. Определенное при этом количество 15СЕ) изомера составляло около 254, Полученные данные позволяет заключить,

что, как показано на рис. 9, при циклизации интермедиата 2 действительно происходит изомеризация двойной связи, приводящая к образованию минорного 15СD-изомера (4) 12-оксо-ФДК наряду с основным 15CZ)-изомером (3).

Количество выделенной 12-оксо-ФДК позволило впервые зарегистрировать ее 13С-ЯМР-спектр. Данные спектра свидетельствуют о том, что непосредственным продуктом циклизации является цис--дизамещенный циклопентенон, что согласуется с данными (Hamberg, 1987; Baertschi et al., 1988]. В то же время, съемка спектра в CDC13-растворе сопровождалась цис-вракс-изомеризацией. Наиболее заметно изменялись химические сдвиги С-9 и С-13, с 47,29 до 49.81 и с 52,33 до 53,77 м.д., соответственно. Очевидно, цис-иранс-изомеризация является результатом кето-еноль-ной таутомерии.

Пентадиенильный катион Срис. 10 а), содержащий пять атомов углерода (кратно 4n + 1) и 4 я-электрона, является антихюкке-левской перициклической системой [Dewar, 1971]. Таким образом, согласно правилам сохранения орбитальной симметрии Вудворда--Хоффмана, циклизация пентадиенильного катиона должна быть ко-нротаторной. Компьютерный расчет энергетически оптимальной стереомодели окиси аллена позволяет заключить, что в результате раскрытия оксирана наиболее вероятно образование пентадиенильного катиона с "син-ориентацией" заместителей Rf и Ra:

"К

О +

Конротаторное замыкание кольца при такой ориентации приводит к яранс-дизамещенным цшслопентенонам.

Образование шракс-изомера действительно наблюдалось при метаболизме 13-HP0D гидропероксиддегидразой из семян кукурузы (Hamberg, Hughes, 1988]. По данным (Brash et al., 1990], содержащая аллильный заместитель (двойная связь при С-17) окись аллена, образующаяся из 8-гидрокси-НРЕРЕ, при циклизации дает преимущественно цис-циклопентенон. И наоборот, окись аллена, образующаяся при дегидратации 8-гидрокси-НРЕТЕ (аллильный за-

Рис. 10. Гипотетические механизмы циклизации окисей алленов, лишенных аллильного заместителя (а) и содержащих его С0). МКЗК - медленное конротаторное замыкание кольца; БДЗК -быстрое дисротаторное замыкание кольца.

меститель отсутствует), была предшественником только иранс-ци-клопентенона. Браш с соавт. из полученных ими результатов делают вывод, что аллильный заместитель необязателен для образования вранс-циклопентенонов. Этот вывод является лишь формальной констатацией экспериментальных наблюдений, причины явления Брашем с соавт. не объяснены.

В соответствии с предлагаемой нами гипотезой, гомосопря-жение не только определяет анхимерный эффект, проявляющийся в ускорении раскрытия оксирана, но и приводит к изменению знака заряда на перициклическом кольце. Оксопентадиенильный анион претерпевает быстрое дисротаторное замыкание кольца с образованием цис-циклопентенона Срис. 10 б). В отсутствие аллильного заместителя циклизация образующегося оксипентадиенильного катиона происходит очень медленно по конротаторному механизму, с образованием иракс-циклопентенонов Срис. 10 а).

Участие перициклического аниона в циклизации, помимо данных кинетики и стереохимии, хорошо согласуется с полученными нами сведениями о влиянии рН среды на образование продуктов гидропероксиддегидразного пути. Изменение рН от 7,5 до 5,8 приводит к 2-кратному подавлению образования 12-оксо-ФДК. Этот эффект, вероятно, обусловлен неблагоприятностью кислотных условий для образования карбаниона.

Предложенная гипотеза объясняет следующие экспериментальные факты: (1) цис-геометрию боковых цепей'в непосредственных

продуктах циклизации окисей алленов с алллльныыи заместителями (в частности, 12-оксо-ФДК и пре-клавулон А); (25 транс-геометрию заместителей & продуктах циклизации природных окисей алленов, несодержащих аллильного заместителя (в частности, 12-ок-со-10-фитеновая кислота [Hamberg, Hughes, 1988]); (3) очень медленное протекание реакций циклизации окисей алленов, лишенных аллильного заместителя. Так, 13-HP0D, 9-НРОТ и 13-гидропе-рекиси r-ликоленовой кислоты практически не образуют циклопен-тенонов в водных средах; (4) существование 12-оксо-15(Е)-ФДК наряду с 12-оксо-15(2)-ФЛК (в растениях) и 5(£)-ПГАа наряду с S(Z)-nTA3 (в кораллах); (5) образование циклопропильного кето-ла [5-<2'-(1"-оксо-2"£,6"2-додекадиенил)-циклопропил-Г>]--5-гидроксипентан-1-овой кислоты из 8-НРЕТЕ гидропероксиддеги-дразой из кораллов Plexaura homomIIa.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты, описанные в главе 4, свидетельствуют о том, что в проростках гороха наряду с липоксигеназой в окислении экзогенных линолеата и линолената участвует цитохром Р-450. Основными продуктами монооксигеназного окисления являются гидроперекиси и гидроксикислоты. Субстраты, несодержащие 1,4-пен-тадиенильного фрагмента, такие как коронаровая кислота, эпок-сидируются в гомогенате эпикотилей гороха с высокой скоростью.

Обнаружено, что эпикотили гороха содержат высокую активность эпоксид-гидролазы, превращающую экзогенные верноловую и коронаровую кислоты в вицинальные диолы [Гречкин с соавт., 1990]. Кроме того, обе эпокоикислоты превращались в диэпоксид и эпоксидиолы. Диэпоксид, полученный полным эпоксидированием линолеата, проявлял противовирусную активность при испытаниях на животных. Эпоксикнслоты, как упоминалось выше, представляют значительный интерес как физиологически активные соединения. При испытаниях на каллусной культуре сои в нашей лаборатории было обнаружено, что верноловая и коронаровая кислоты стимулируют рост каллуса. В этой связи представляет интерес роль эпо-ксикислот, депонируемых в семенах многих видов растений. Вполне вероятно, что при мобилизации запасных липидов эти кислоты освобождаются и выполняют роль эндогенных регуляторов на ранних стадиях дифференциации.

Образование Св~ и С -альдегидов при расщеплении 13-HP0D г: 13-НРОТ является одним из основных направлений липок: игеназ-

ного пути э растениях. Ранее было установлено, что 3CZ)-reKce~ наль восстанавливается алкогольдегидрогеназой до ЗСЮ-гексенола [Hatanaka et al., 1987]. Этот фермент, по всей вероятности, катализирует и превращение 12-оксо-9С Z) -додеценовой кислоты во впервые обнаруженную нами 12-гидрокси-9С2)-додеценовую кислоту. Восстановление Cta-альдегида до гидроксикислоты, по нашим данным, является фактором* контролирующим активность липоксигенаэы в проростках гороха. Кроме того, 12-гидрокси-9С2)-додеценовая кислота отличается высокой ростстимулируюией активностью, как показали испытания яа каллусяой культуре сои.

Эксперименты по метаболизму а-лийоленовой кислоты некоторыми липоксигеназами, в первую очередь, ЛКК, показывают, что в высших растениях образуются отдаленные аналоги лейкотриенов. Оксотриенолы XIV и XV идентифицированы впервые. Аналогичных соединений в оксотриеновыш хромофорами не было обнаружено ранее и среди продуктов липоксигеназного окисления арахидоновой кислота в животных объектах. Предварительные испытания в Казанском институте биологии АН СССР показали, что 9,1Б-дигидрок- ' си-ЮСD,12CZ),14CD-октадекатриеновая кислота в концентрации 100 мкМ стимулирует дыхание корней пшеницы.

По имеющимся сведениям, эндогенное содержание кетояов в проростках кукурузы и подсолнечника, имеющих высокую активность гидроперсксиддегидразы, невелико [Vick et al., 1682]. Результаты настоящей работы позволяет кайти новое объяснение низкого содержания кетояов в проростках in vivo, Вторичные превращения кетояов ранее не были известны (Vick et al., 1987]. Обнаруженное вами лтюксигеяазяое окисление приводит к быстрому превра- . пенив а-кеголов в гидроперекиси, Второе направление превращений смсетолов связано с их кето-енольяой таутомерией и окисли-теяьяо-восстановнтеяьяыш реакциями енольных форм.

Образование гидроперекисей а-кетолов представляет интерес и с другой точки зрения, как пример необычной липоксигеназной реакции. а-Кетояы представляют собой пример "неклассических" субстратов липоксигеказы. Способность липокси.еназ окислять аллильные кетоны ранее не была известна.

После открытия Хамбергом окисей алленов сохранялась точка зрения, что оба кетояа Ca- и гО образуются в результате пук-леофильного гидролиза окиси аллена [Hamberg, 1987; Crombie et al., 1988]. Наблюдаемая достоверная стимуляция образования г-

-кетола при кислотных значениях рН привела нас к предположению о кислотном и щелочном механизмах гидролиза окиси аллена. Выделение и идентификация нового кетола полностью подтвердили нашу рабочую гипотезу. Окончательные доказательства кислотного механизма образования у-кетола и 11,12-кетола были получены в экспериментах с короткими экспозициями и опытах с метанольным улавливанием окиси аллена.

Предложена гипотеза о том, что при циклизации жирнокисло-тных окисей алленов 5-членная перициклическая ароматическая система интермедиата находится в гомосопряжении с двойной связью аллильного заместителя. Это сопряжение, изменяя знак заряда на пентадиенильном кольце, имеет определяющее значение в контроле скорости ракции и стереонаправленности замыкания цикла. Гипотеза объясняет целый ряд сделанных в настоящей работе и описанных в литературе экспериментальных наблюдений, которые до сих пор не были удовлетворительно интерпретированы.

Результаты настоящей работы и опубликованных трудов других авторов позволяют заключить, что метаболизм гидроперекисей жирных кислот в высших растениях происходит по нескольким основным направлениям: (1) гидропероксидлиазный путь; (2) гидропероксид-дегидразный путь; СЗ) двойное диоксигенирование а-линолената.

■ Итак, результаты настоящей работы в контексте с имеющимися литературными данными свидетельствуют о том, что в цветко-'вых растениях существует каскад окислительных превращений С -полиеновых кислот. Идентифицирован ряд новых метаболитов лино-левой и линоленовой кислот. Октадеканоиды, продукты каскада С(в-кислот, по некоторым литературным данным и сведениям, полученным в нашей лаборатории, физиологически активны. Вместе с тем, особенности физиологической активности октадеканоидов растений изучены совершенно недостаточно. Есть данные о том, что оксигенированные жирные кислоты могут выполнять функцию ростовых веществ, природных фунгицидов и репеллентов, аллелохимичес-ких соединений. Несомненный интерес представляет и изучение действия октадеканоидов растительного происхождения на животных тест-системах. Все это определяет актуальность дальнейших исследований в области химии и биохимии октадеканоидов растений.

- 35 -ВЫВОДЫ

1. Обнаружен неизвестный ранее в растениях путь окисления по-лиеновых жирных кислот, опосредованный цитохромом Р-450. Основными продуктами окисления линолевой кислоты являются гидрокси- и гидроперокси-производные.

2. Выделен и идентифицирован неизвестный ранее метаболит - 12--гидрокси-9С2)-додеценовая кислота. Установлено, что 12-ги-дроксидодеценоат образуется в результате ферментативного восстановления 12-оксо-9С2)-додеценовой кислоты, продукта расщепления 13-гидроперекисей линолеата и линолената гидро-пероксидлиазой.

3. Изучен метаболизм экзогенных [I-14С]верноловой и [I-1"С]ко-ронаровой кислот в эпикотилях гороха. Высокая активность эндогенной эпоксидлиазы приводит к превращению эпоксидов в вицинальные диолы. Помимо вицинальных диодов, образуется диэпоксид линолеата и эпоксидиолы.

4. Обнаружено, что лиггаксигеназа из клубней картофеля катализирует двойное диоксигенирование ос-линоленовой кислоты. При этом кроме дигидроперекиси и гидропероксигидрокси-производ-ных образуются неизвестные ранее соединения оксотриенолы.

5. Впервые выделены и идентифицированы гидроперекиси сс-кетолов, продукты пути, контролируемого липоксигеназой и гидро-пероксид-дегидразой.

6. Окисление а-кетолов является примером необычной и неизвестной ранее реакции, контролируемой липоксигеназами. Мишенью для атаки липоксигеназы при этом является аллильнкй оксое-новый фрагмент вместо обычного 1,4-пентадиенильного фрагмента, окисляемого в полиеновых жирных кислотах.

7. Впервые выделен и идентифицирован 11,12-кетол. образующийся наряду с известными ранее а- и r-кетолами при метаболизма 13-гидроперекиси а-линоленовой кислоты гидропероксид-дегид-разой из семян льна.

8. Показано, что в противоположность а-кетолу, продукту нукле-офильного гидролиза окиси аллена, r-кетол и 11,12-кетол являются продуктами электрофильного гидролиза, инициируемого протонированием оксирана.

9. Обнаружено, что 12-оксо-10,15-фитодиеновая кислота содержит наряду с обычным 15CZ)-изомером минорный lSCD-изомер.

fa) Частичное обоащение геометрии Ьа -двойной связи и

- 36 -

(б) полная зависимость циклизации от ее наличия позволяют заключить, что л1 "-двойная связь в процессе циклизации вовлечена в гомосопряжение с *-орбиталью перициклического ин-термедиата.

10. Циклизация окисей алленов, лишенных аллильного заместителя <2CZ)-пентенкл в случае 18:3-окиси аллена), таких как

18:2-окись аллена, происходит по конротаторному механизму, приводя к иранс-дизамэЕэнным циклопентенонам. Напротив, ь случае 13:3-окиси аллена и других окисей алленов! содержащих а.ллильный- заместитель, циклизация идет через ароматический перициклический анион, по дисротаторному механизму. Непосредственными продуктами циклизации при этом являются цис-дизамещенные циклопентеноны.

11. Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что окислительный метаболизм а-линоленбвой и линолевой кислот в высших растениях приводит к большому разнообразию окта-деканоидов, представляющих интерес как потенциальные биорегуляторы, подобные эйкозаноидам животных.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Гречкин А.Н., Панкратова С.И., Тарчевский И.А. Биосинтез глицеролипидов in uiuo в субклеточных фракциях зеленеющих проростков пшеницы.//Биохимия. 1980. Т. 45. N 10. С. 1804-1809.

2. Гречкин А.Н., Тарчевский И.А. Об участии полярных липи-дов в образовании полиеновых жирных кислот в зеленеющих проростках пшеницы.//Биохимия. 1982. Т. 47. N 6.

С. 1007-1014.

3. Гречкин А.Н. 0 направленности биосинтеза жирных кислот и ' глицеролипидов в изолированных хлоропластах из листьев'

гороха.//Биохимия. 1983. Т. 48. N 2. С. 259-262.

4. Гречкин А.Н. Методические варианты газожидкостной радиохроматографии и их применение в метаболических исследованиях. //Хроматография в биологии и медицине. Тез. докл. I Всес. конф. Москва, 1983. С. 284-285.

5. Grechkin A.N. On the mode of polar lipid participation in a-linolenic acid synthesis in plant leaves.//Proc. Ill International Youth Symposium on Plant Metabolism Regulation. Varna, Bulgaria, 1983. P. 39.

6. Гречкин А.Н. Пути метаболизации экзогенных 'чС-фосфолипи-дов в изолированных хлоропластах из листьев гороха.//Докл. АН СССР. 1983. Т. 270. N 4. С. 1017-1019.

7. Grechkin A.N., Gafarova Т.Е., Tarchevsky I.A. Linoieate a'"-desaturase of pea leaf chloroplasts is localized in thylakoids.//Structure, Function and Metabolism of Plant Lipids./Eds Siegenthaler P. A., Eichenberger W. Amsterdam.: Elsevier. 1984. P. 51-54.

8. Гречкин A.H., Гафарова Т. E.. Тарчевский И. А. Обнаружение активности линалеат-Д1 "-десатураэы в тилакоидах хлороплас-тов из листьев гороха.//Биохимия. 1984. Т. 49. N 11.

С. 1887-1889.

9. Гречкин А. Н., Гафарова Т.Е. Зависимость активности лино-леат-десатуразы хлоропластов от фотосинтетического транспорта электронов.//Тез. докл. V Всес. биохим. съезда. Т. 3. Москва. 1986. С. 103.

10. Grechkin А. N., Gafarova Т. Е., Tarchevsky I. A. Effect of light and inhibitors of photosynthesis on linoleate desa- ' turation in pea leaves.//Proc. 7th International Symp. Plant Lipids. Davies, CA, USA. 1986.

11. Гречкин А.Н.. Королев O.C., Курамшин P.A., Ефремов Ю.Я., МусинР.З., Ильясов A.B., Латклов Ш.К., Тарчевский И. А. Новый физиологически активный продукт окисления линолеата в гомогенате листьев - 12-оксидодец-97-еновая кислота.// Докл. АН СССР. 1987. Т. 2S7. N 3. С. 1257-1260.

12. Гречкин А.Н., Тарчевский И.А. Неякпоксягенапный путь окисления полиеновых жирных кислот в бесклеточных препаратах из листьев гороха. //Биохимия. 1988. Т. 53. N 9.

С. 1363-1368.

13. Панкратова С. И., Ярин А. £>., Гречкин А. Н., Тарчевский И. А. Влияние полиеновых жирных кислот и их оксигенированных производных на рост каллуса сои. //Деп. рукопись ВИНИТИ. 1988.

N 7591-1388.

14. Grechkin A.N., Gafarova Т.Е., Kc-olev O.S., Kuramshin R.A., Tarchevsky I. A. The monooxygenase pathway of lino-leic acid oxidation in pea seedlings.//Biological Role of Plant Lipids./Eds Biacs P.A., Gruiz K., Kremmer, T. Budapest, New York and London.: Akademiai Kiado and Plenum Publishing, 1989. P. 83-85.

- 38 -

15. Tarchevsky I.A., Grechkin A.N. Perspectives of search for eicosanold analogs In plants.//Biological Role of Plant Lipids./Eds Blacs P.A., Gruiz K., Kremmer T. Budapest , New York and London.: Akademiai Kiado and Plenum Publishing, 1989. P. 45-49.

16. Гречкин A.H., Курамшин P. А., Кухтина H.B., Сафонова Е.Ю., Ефремов О.Я.. Тарчевский И.А. Образование 9,10-эпокйиокта-дец-12г-еновой кислоты из экзогенного [1-"*С]линолеата в гомогенате листьев гороха.//Докл. АН СССР. 1989. Т. 30?.

N 3. С. 740-742.

17. Tarchevsky I.A., Grechkin A.N. Metabolization of linoleic acid epoxides in homogenate of pea epicotyls://Proc. 19th FEBS Meeting. Rome. Italy, 1989.

18. Tarchevsky I.A., Grechkin A.N., PankratoYa S.I.,

Yarin A.U., Andrianova J.E. Physiologically active products of chloroplast components degradation.//Physiol. Plant. 1989. V. 76. N3. P. A186.

19. Кучин А.В., Толстиков А.Г., Горобец E.В., Гречкин A.H., Одиноков В.И., Толстиков Г.А. Синтез 12-оксидодец-92-ено-вой кислоты - нового стимулятора роста растений.//Докл. АН СССР. 1989. Т. 308. N 2. 384-386.

20. Гречкин А.Н., Королев О.С., Курамшин Р.А. Об отсутствии арахидоновой кислоты в прорастающих почках тополя CPopultts baLscmifera L.) /Биохимия. 1990. Т.55. N 4. С. 653-658.

21. Гречкин А.Н., Курамшин Р. А,, Ефремов Ю.Я., Латыпов Ш.К., Сафонова Е.Ю., Ильясов А. В. Новы продукты окисления а-ли-ноленовой кислоты липоксигеназой из клубней картофеля.// Докл. АН СССР. 1990. Т. 314. N 5. С. 1247-1249.

22. Гречкин А.Н., Кухтина Н.В., Курамшин Р.А., Сафонова E.D., Ефремов С. Я., Тарчевский И. А. Металлизация (1-'*С]корона-ровой и [1-"*С)верноловой кислот в гомогенате эпикотилей гороха.//Биоорган, химия. 1990. Т. 16. N 3. С. 413-418.

23.. Gafarova Т.Е., Grechkin A.N., Tarchevsky I. A. Biosynthesis of 13-oxo-9CZ),llCD-tridecadienoic acid in pea leaf homogenate.//Plant Lipid Biochemistry, Structure and Utilization. /E(ls Quinn P.J., Harwood J.L. London: Portland Press, 1990. P. 301-303.•

24. Grechkin A.N., Pankratova S.I., Yarin A.Yu., Kuchin A.V. Effects of oxygenated idtty acids on greening and increase

- 39 -

of biomass of soybean epiootyl callus.//Proc. of Soviet--Indian Symposium on Regulation of Photosynthesis. Pushchino, 1990. P. 49.

25. Grechkin A. H., Kukhtina N. V.. Gafarova Т. E.. Kuramshin R.A. Oxidation of [l-,4C]linolenic acid in isolated microsomes from pea leaves.//Plant Sci. 1990. V. 70. N 2. P. 175-180.

26. Grechkin A.N., Kuramshin R.A., Tarchevsky I.A. Minor isomer of 12-oxo-10,15-phytodienoic acid and the mechanism of natural cyclopentenones formation.//Plant Lipid Biochemistry, Structure and Utilization./Eds Quinn P.J. , Harwood J.L. London: Portland Press, 1990. P. 304-306.

27. Tarchevsky I. A., Kuramshin R.A., Grechkin A.N. Conversion of a-linolenate into con'ugated trienes and oxotri-enes by potato tuber lipoxygenase.//Plant Lipid Biochemistry, Structure and Utilization./Eds Quinn P.J., Harwood J.L. London: Portland Press, 1990. P. 298-300.

28. Grechkin A. N., Kuramshin R. A, Safonova E. Y.. Yefremov Y. J., Latypov S.K., Ilyasov A.V., Tarchevsky I. A. Double hydro-peroxi'dation of a-linolenic acid by potato tuber lipoxygenase. //Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1081. N 1.

P. 79-84.

29. Grechkin A.N., Kuramshin R.A, Latypov S.K.,

Safonova E. Y., Gafarova Т.E., Ilyasov A.V. Hydroperoxides of a-ketols. Novel products of the plant lipoxygenase pathway.//Eur. J. Biochem. 1991. V. 199. N 2. P. 451-457.

30. Гречкин A.H., Курамшин P.А., Тарчевский И.А. Образование нового а-кетола гидроп роксид-дегидразой из семян льна.// Биоорган, химия. 1991. Т. 17. N 7. С. 997-998.

31. Grechkin A.N., Kuramshin R.A, Safonova E.Y.,

Latypov S.K., Ilyasov A.V. Formation of ketols from linole-nic acid 13-hydroperoxide via allene oxide. Evidence for two distinct mechanisms of allene oxide hydrolysis.// Biochim. Biophys. Acta 1991. V. П86. N 2. P. 317-325.