Разработка методов автоматизированной ЭПР-спектроскопии для оценки состояния организма по парамагнетизму крови тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.01 ВАК РФ

МНО „ФОРУМ"

АГЕНТСТВО БИОИНФОРМАТИКИ И ЭКОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

На правах рукописи

БЕРДИЕВ Урал Буранович

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АВТОМАТИЗИРОВАННОЙ ЭПР-СПЕКТРОСКОПИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ОРГАНИЗМА ПО ПАРАМАГНЕТИЗМУ КРОВИ

(01.04.01—техника физического эксперимента, физика приборов, автоматизация физических исследований)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва —1991

Габота аылолнеяа в Ордени Ленина Институте хиыичзской дкек кы. Е Н. Семенова АН СССР

Научный руководитель - доктор физико-математических наук профессор Л. П, Кашин

Офищталъшэ оппоненты: д. т. в. Олейников А. Я.

к. ф. -и. и. Усатый А. б.

Ведущая организация: Еиолог^гческий факультет ИГУ кы. и. 3. Ломоносова кафедра 0110^135005

[ " С' «/¿'^'^Й.дд!

Защита диссертации состоится " у-71991 года

о час. шн. на заседании Специализированного Совета Д. 170. С1.01 при Агентстве биоинформзтики и экологии человека 15Ю "Форум" по адресу: 117342, Цэсква, ул. Бутлерова, 1Б.

С диссертацией кшшо ознакомиться в библиотеке Агентства биоинформатики и этологии человека.

Автореферат разослан

К ^ >1 1991 г>

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор физ. -шт. наук

Добряков С. Е

Актуальность. Успешное решение многих эадач приборостроения для

Ч г !

ил?ии в последние годы стало возможным благодаря использованию цств ЭШ и развитию методов вычислительного моделирования. Сфор-эвалосъ новое направление экспериментальной биофизики, связанное ¡пользованием спектральных методов и микро-ЭВМ в исследова-ьских и практических целях. Появилась возможность проводить в ла-аторных условиях вычислительные эксперименты и при удачно выбран-

модели явления существенно уменьшить трудности при проведении жных исследований, выполнение которых без ЭВМ в полном объеме не->.юхно.

На основе машинных методов созданы предпосылки ускоренного ре-:ия одной из главных задач прикладной биофизики: разработка новых вмов оценки состояния организма на основе физических методов. |ди них видное место ванимает метод электронного парамагнитного юнанса (ЭПР).

Спектры ЭПР содержат уникальную информацию как об электронном :тоянии парамагнитной структуры, так и о динамике молекулярной >ды. Использование методов квантовой механики и вычислительной слики позволяет во многих случаях извлечь ату информацию. К сожа-яш, такой подход редко используется при анализе парамагнитных эйств биологических объектов.

Отметим, что парамагнетизм биологических структур может быть цогенного и экзогенного происхождения. В первом случае он Еозника-благодаря обмену веществ и связан прежде всего с окислитель-восстановительными реакциями метаболизма. Во втором - парамагне-вм возникает в структуре иэ-за действия ионизирующего излучения, вдвняя в биологический объект специальных парамагнитных маркеров, мельче кия, действия к.гакой температуры, паргмагнитных продуктов ружающэй среды (нитраты, нитриты, некоторые пестгтэды, мелко-

- г -

дисперсные металлические частицы), солнечная радиация, изменение!, парамагнитного состояния таких ионов как железо, медь, марганец, кобальт, молибден, ванадий.

Метод ЭПР пока не нашел широкого распространения в медико-биологической практике. Это вызвано, главным образом, сложностью обработки данных, их интерпретации, недоступностью для неспециалистов. Имеется значительный, задел и в теоретическом и техническом аспектах, позволяющий считать перспективным применение ЭПР-спектроскопии для анализа спектров ЭПР тканей и биологических жидкостей, например, крови человека и животных, а также для создания новых тест-систем.

С появлением персональных ЭВЫ и минианалиэаторов ЭПР положение изменилось - стало возможным автоматизировать всю процедуру измерения и анализа сигналов ЭПР от ввода пробы в прибор до вывода на ЭВ1 конечного результата. Последнее обстоятельство является решающим е системах экспресс-оценки состояния объекта. Актуальным является решение задачи об' использовании ЭПР-спектроскопии для оценки состояния организма здорового человека методом автоматизированной ЭПР-спектроскопии. Однако, главной задачей остается создание удобных машинных программ, доступных неспециалисту, который при помощи персонального компьютера может перевести данные . анализа на доступный язык для исследовзтедя-практика.

Тема диссертационной работы соответствует плану научно-исследовательских работ, проводимых в ИХФ АН СССР им. Н. Е Семенова и выполнена по темам 01.12 Црограммы 0Ц..027 (Постановление ГКНГ СССР N 472 от 12.12.80г.) и 0.74.05 п. 22 Щ (Распоряжение Президиума АН СССР К 10103-987 от 19.06.87г.) и задания 26.3 Проблемы 2.2.2 Комплексной Программы научо-технического прогресса стран-членов СЭВ.

Цель работы состояла в разработке методов машинного анализа спектров ЭПР парамагнитных центров, часто встречающихся в медико-биологических исследованиях, и оценки возможности использовать магнитно-резонансные характеристики вещества для определения функционального состояния организма.

Задачи исследования:

- разработать и создать программно-технический комплекс анализа данных ЭПР крови;

- создать пакет прикладных программ (ППП) вариационного поиска формы линий ЭПР для определения магнитно-резонансных параметров парамагнитных центров на примере стеклообразных матриц, облученных ионизирующей радиацией;

- предложить методы применения ЭПР-спектроскопии при массовых медицинских осмотрах персонала на предприятиях ядерно-топливных центров (ЯТЦ);

- оценить информативность парамагнитных свойств крови для оценки состояния здоровья человека;

- изучить влияние пестицидов, используемых в сельском хозяйстве Среднеазиатского региона СССР, на парамагнитные свойства крови. Научная новизна Разработаны машинные методы вариационного поиска формы линий спектров ЭПР парамагнитных центров в стеклообразных матрицах, которые могут быть использованы в качестве модели некоторых Сиологическиэ систем. Впервые установлено, что парамагнетивм крови можно использовать для оценки состояния здоровья работающего человека. Анализ с помощью персональных ЭВМ IBM РС/ХГ/АТ позволил установить информативность содержания парамагнитных центров крови для диагностики состояния здоровья при массовых профилактических осмотрах.

Разработаны оригинальные ШШ для ЭШ типа 1Ш РС/ХГ/АТ, удобных для пользователей неспециалистов.

Выявлено влияние большой группы пестицидов, используемых в Среднеазиатской регионе СССР, на спектры ЭПР крови.

Практическое значение работы заключается в разработке методов оценки состояния здоровья работающего человека при помощи автоматизированного ЭПР-спектрометра. На основе примеров, приведенных а диссертации, показана эффективность статистического корреляционного машинного анализа данных клинических и радиоспектральных измерений. Разработанные в диссертации программно-технический комплекс анализа данных ЭПР крови может быть использован для анализа широкого класса объектов.

Впервые показано влияние пестицидов на спектры ЭПР крови животных, а также выявлено, что спектры ЭПР крови существенно зависят от наличия нитритов в окружающей среде. Таким образом, обнаружены усиления сочетающего действия пестицидов и нитритов, позволяющее организовать службу контроля действия вредных факторов'окружающей среды.

Апробация работы. Основные результаты и отдельные положения работы доложены на конференции молодых ученых и специалистов Тер-мезского ГШ (Термез, 1987); на XXI Всесоюзной школе по автоматизации научных исследований (врунзе, 1987); Всесоюзной конференции "Применение магнитного резонанса в народном хозяйстве" (Казань, 1988); на УП Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Черноголовка, 1989).

Публикации. Ш материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит га введения, У1 глав, выводов и списка литературы.

- Б -

ГЛАВА I. Исследование крови человека методом электронного парамагнитного резонанса (обзор литературы)

В первой главе дан обзор данных литературы по исследовании крови человека методом электронного парамагнитного резонанса. Кровь является одной из важнейших тканей организма, которая доступна для лабораторных, клинических и биологических анализов.

Кровь удобно рассматривать в виде двух компонентов: плазмы и форменных элементов - эритроцитов, белых кровяных клеток. В плазме крови основными парамагнитными центрами являются церуллоплаэмин, со-держалзй медь, трансферрин, содержащий лелезо, сеиихинонные формы коферментов крови и аскорбиновой кислоты. В обворе дана детальная характеристика парамагнитных свойств этих центров. Отмечено, что в литературе рассмотрены, главным образом, спектры ЭПР крови больных лодей.

Нэтод ЭПР очень широко применялся для исследования гемоглобина. Расшифровка структуры и функции этого белка и особенно его простети-ческой группы была достигнута благодаря применению метода ЭПР.

В большом числе биохимических работ с применением метода ЭПР использухггся восстановленная форма ИО-гемоглобин или окисленный мет-гемоглобин. Оба эти формы можно наблвдать в цельной крови или взвеси эритроцитов, которые либо были обработаны соответствующими агентами, либо выделены у животных или человека при аномальных условиях.

Таким образом," анализ литературных данных позволяет сделать вывод о перспективности применения ЭПР-спектроскопии парамагнитных центров крови: свободных радикалов, церулоплазмина, трансферр1ша, гемоглобина для оценки состояния организма.

- В -

ГЛАВА II. Штоды и материалы

В медико-биологических исследованиях метод ЭПР-спектроскопии активно применяется на протяжении почти четырех десятилетий. Однако только на рубеже 70-80-х годов стали использовать ЭВМ для моделирования и анализа спектров ЭПР.

В нашей работе мы соединили ЭПР-спектрометр с персональной ЭВМ "Оливетти М-28" (рис.1).

Рис» I, Блок-схема автоматизироваинрго ЭПР-спектрометра

Поскольку персональные ЭВМ (ПЭВМ) представал ют новый класс средств высокой надежности, с большим объемом оперативной памяти (не менее 640 к/байт), компактностью, малым потреблением анергии. Эти свойства позволяют применить их при автоматизации научных исследований.

ПЭВМ дает возможность построения систем нового типа, отличающихся, с одной стороны, разнообразием средств отображения информации, с другой - интеграцией этих средств и обеспечением максимального удобства и простоты работы пользователей, не обладающих специальной подготовкой.

Эта система (в совдании "ШШ ЭПР-спектр" принимал участие автор диссертации) позволяет провести эксперименты, весьма эффективно обрабатывать данные ЭПР, а также осуществлять их статистический анализ.

При создании программно-математического обеспечения для "ГОШ ЭПР-спектр" особое внимание обращали на получение предельной необходимой точности обработки экспериментальных данных при минимальных затратах машинного времени и ресурсов оперативной памяти. Программы организованы так, что легко позволяют как совершенствовать существу-щие программы, так и добавлять к ним новые.

В нашем исследовании АСНИ "ЕЭВМ ЭПР-спектр" была применена для моделирования и синтеза спектров ЭПР. Для записи спектров ЭПР использовали 3-сантиметровый радиоспектрометр "Рубин" с высокочастотной модуляцией магнитного поля (100 кГц) и разверткой магнитного поля, управляемой персональным компьютером "Оливетти М-28", связанной со спектрометром при помощи специального интерфейса (лаборатория радиоспектроскопии ИХФ АН СССР).

Нами исследовалось и проводилось моделирование электронных центров щелочно-силикатных стекол в диапазоне от 14,37. до 33, ЗХ составов и вида щелочного иона. Щелочными ионами были И, На, К и Са, Sr, Еа. Состав стекол менялся в пределах от 14 до 33 молярных процентов Ма-0 и от 86 до 67 процентов SiOj соответственно.

Основным источником облучения исследуемых стекол являлся источник У-иэлучения Со"активностыэ БО Г. экв Ra, средняя анергия излучения 1.25 Шв. Максимальная мощность дозы 10 Р/мин. Облучение проводилось при комнатных температурах. Спектры ЭПР снимались при 300 К и 77 К.

Для точного определения положения линий и е~фактора, спектры записывались вместе с эталоном lin*1.

Клинический материал. Кровь брали у 380 человек, работающее в Институте атомной анергии им. Курчатова. Кровь (0,6 мм) получали пункцией из пальца и немедленно замораживали в жидком азоте в специальных тефлоновых пресс-формах. Для записи спектра ЭПР замороженный препарат крови выдавливался из пресс-формы и помещался в кварцевый сосуд Дьюара. В качестве антикоагулянта использовали гепарин.

При изучении влияния пестицидов на парамагнитные свойства, крови млекопитающих, в качестве объекта исследования использовали донорскую кровь человека и чювь крысы линии Вистар и гемоглобина.

В экспериментах были использованы следующие пестициды: базаг-ран, дикват, прометрин, гидрел, которая, атразин, зенкор, девринол, теноран (любезно предоставлены д. х.н. Гольдфельдом Ц.Г.).

Влияние пестицидов (в первой серии опытов) изучали на 120 крысах линии "Вистар" весом 190-200 г.

В первой серии опытов выделил:: 40 крыс, их разделили на четыре группы. Шрвой, второй и третьей группе животных внутрибрюшинно вводили 282 мг/кг, 2500 мг/кг, 1100 мг/кг - диквата, .-идрела, базаграна соответственно. Четвертая группа служила контролем.

fio второй серии опьггов, первую группу 20 крыс (животных) внутривенно, в разных дозах вводили NaNC^ns расчета 15 мг/мл, 7,5 мг/мл. Второй группе животных вводили внутрибрюшинно 0,5 мг NaN0¿H одновременно 0,5 мл (1/2 ДЦд) раствора базаграна. Четвертая группа животных служила контролем. Животных забивали декапитацией после введения указанных выше вещэств через 40 мин. Кровь помеирли в 0,6 мл тефло-новые патроны и замораживали в жидком азоте. Значения амплитуды сигналов ЭПР относили к весу влажного образца и затем усредняли для об-равцоо, велтых от равных животных одной группы.

Гемоглобин получали по методике Антонини и Брунори (Antonini runori, 1971).

В опытах in vitro кровь и гемоглобин инкубировали с■ указанными ьппе пестицидами (при разных концентрациях).

ГЛАВА III. Вариационный анализ формы линий спектров ЭПР пара-агнитных центров стеклообразных матриц с помощью ЭВМ типа IBM С/ХТ/АТ

Спектры ЭПР содержат значительный объем информацш! о строении арамагнитных центров. К сожалению, спектры ЭПР биологических объеге-эв нечасто ькшго использовать для квантовохимического анализа. Од-зко, для парамагнетизма, возникающего в биологических струотурах эд влиянием внесних воздействий: измельчение, ионизирующее излуче-яе, при включении в структуру объектов различных добавок мохет быть роизведен детальный расчет параметров спектров ЭПР.

Как правило, спектры ЭПР биологических структур могут бить объ-:нены в рамках теории спектроз ЗПР твердых тел. Это связано с тем, го нет каких-то особых чисто биологических парамагнитных центров, со обстоятельство позволяет анализировать данные спектроскопии ЭПР галогических объектов с общефизической точки зрения.

С реиепием такого рода задач часто сталкиваются исследователи зи анализе спектров ЭПР парамагнитных центров индуцированных нони-трующэй радиацией в стеклообразных матрицах или образованных в раэ-юбразных биоорганических материалах при использовании спиновых мэ-зк. Разница состоит толыга в том, что в первом случае парамзгнитный !нтр возникает благодаря яесткоку облучению объекта, а в другом -гагодаря "посадке" спиновой метки в структуру вецэства. Несмотря ка jpoma использование ЭВМ для. изучения спектров ЭПР, п~иыенениз

простых и аффективных программ для персональных компьютеров еще далеко отстает от потребностей возможных пользователей. Сложившаяся ситуация является тем более "обидной", учитывая, что теория ЭПР развита детально и только отставание разработок в области автоматизированной ЭПР-спектроскопии не позволяет в полной мере использовать могучие возможности метода ЭПР, раскрыть его перспектива

В нашей работе была предпринята попытка показать на нескольких примерах применение анализа формы линии спектра ЭПР, используя вариационные методы. В качестве модели, на которой проверялась система расчета, были выбраны стеклообразные структуры. Такого рода структуры весьма распространены в природе, широко используются в хозяйственной деятельности.

Для проверки применимости разработанной программы были использованы спектры ЭПР облученного технического стекла. Как известно,в атом случае образуются два типа парамагнитных центров с различными значениями е-фактора и формой спектров ЭПР.

Для нахождения спектра ЭПР парамагнитной част.шу в твердом теле необходимо использовать выражение для спин-гамильтониана. Задача определения формы спин гамильтониана для ионов переходных групп подробно рассмотрена в монографиях (Альтшулер, Козырев, 1972; Абрагам, Елини, 1972). Наиболее общим выражением, пригодным для анализа спектров радикалов, ионов и триплетных молекул, является спин-гамильтониан в виде:

р р

ЗД9СЬ S - ПОЛНЫЙ электронный спин парамагнитной частицы, ИНД8КС Р нумерует магнитные ядра. В общем случае главные оси тензоров Ти.а- , Dul> не совпадают. Форма (1) является достаточно общей для 3 - 1/2 и S - 1.

Дырочные центры в облученных стеклах обычно с изотропной или гочти изотропной формой линии шириной 1.25 мТл имеют ^-фактор вблизи фактор вблизи g~2.0077, и их структура достаточно хорошо известна. Электронные центры, обусловленные неспаренными электронами, локали-юзанными на нескольких центрах, изучены недостаточно. Форма спектсь ibbkckt от состава и варьируется от слабоанизотропного синглета ЭПР : g-фактором, лежащим в больших полях, для стекол состава до ярко )ыраженного спектра, обусловленного аксиальной анизотропией g-факто->а 1.97 и 94) для стекол состава 1Наа0 - 2Sl0j,. Если оценка траметров спектра мояет быть произведена в хорошо разрешенном :пектре прямо из спектра, то определение параметров спектров вХ-об-тученном стекле требует применения ЭВМ. Мы осуществили полный анализ :пектров ЭПР на компьютере типа IBM РС/ХГ/АТ.

В результате проведенной работы была составлена и отлажена фограмма для расчета спектров ЭПР с аксиальной симметрией и шсиально-угловой зависимостью ширины линии.

В результате расчета по описанной программе моделирования слож-*ых спектрбз ЭПР были получены точные значения аксиально-симметрич-гаго g-фактора для" двух парамагнитных центров каждого спектра, анизотропные значения ширины линии для каждой компоненты и относитель-гаэ концентрации 2-х парамагнитных центроз.

Основным моментом являлось точное определение е-фактора систолы. Как известно, неспаренныэ электроны находятся на сильно делока-шзованных молекулярных орбиталях и практкческ: пе взаимодействуют с

орбитальный движением электронов, е-фактор свободного электрона 2 •> 2.0023. Отклонение величины g-фактора служит мерой добавочного магнитного момента, обусловленного орбитальным движением электрона, и в данном случае это отклонение достаточно велико.

В общем случае выражения для е-фактора можно записать в виде:

где Я- параметр, характеризующий величину спин-орбитального взаимодействия, а Л- разность энергий между основным состоянием и более высоким орбитальным состоянием атома в конкретной конфигурации молекулы. функция £ (обычно имеет линейный характер вида ■ Для спектров ЭПР парамагнитных центров в технических стеклах, содержащих щелочные металлы, е-фактор по оси Z:

откуда величина разности энергий:

olX

Az

должна оставаться постоянной для ряда металлов Li, Na, К, Rb, Cs. В то же время, если парамагнитный центр, дапций сигнал ЭПР, относится к атомам Si или О , то Д2= Дг (А) . Это обстоятельство позволяет (при достаточном количестве экспериментального материала) определить, на каких атомах локализуются'исследуемые парамагнитные центры.

Разработана программа для анализа анизотропных спектров ЭПР в режиме диалога персонального компьстера 1Ш PC/AT.

Разработанная программа применена для анализа спектров ЭПР -облученных щелочных и щелочно-земельных стекол, а также стекол, содержащих растворенные ионы хрома и молибдена.

ГЛАВА IV. Технические и программные средства анализа спектров ЭПР крови с помощью ЭВМ IBM РС/ХГ/АТ

Важнейшей составной частью экспресс-систем анализа различных проб методом ЭПР является достаточно моирая ЭШ типа персонального компьютера. В нашем случае мы использовали ЭШ типа IBM РС/ХТ/АТ. Кипя разработана система алгоритмов моделирования спектров ЭПР парамагнитных "комплексов типа церулоплазмин", "трансферрин" и Hb-fíO комплексов.

Технические и программные средства. Для решения задач были использованы ЭШ типов 1Ш РС/ХГ/АТ (США), 123 PC/AT "Оливетти U-28" (Италия), обладающие высокой вычислительной скоростью, большими объемами оперативной памяти (3 Мб) и долговременной памятью (80 145), развития! графическими средствами.

Операционная система на IBM PC 1Б DOS 3.3, в рамках которой созданы дополнительные системные модули, обеспечивающие совместную работу автоматизированного комплекса (радиоспектрометр ЭПР-спецпро-цессор-IEií PC).

Для регистрации, обработки и анализа экспериментальных спектров ЭПР работают пакеты прикладных программ EPR0/PC и LÍARK/SA, составленные соответственно па FORTRAN-77 и BASIC плюс MACROASSEMBLER.

Кошфетно для решения поставленных задач по обработке, анализу, моделированию и синтезу спектров компонентов крови создан программный комплекс на языйе FORTRAN-77 (графика через TURBO С).

Единицей обрабатываемой информации служит "зсперимент", являющийся логической совокупностью спектра (массив числовых значений) и его паспорта (таблицы числовых значений приборных и посчитанных параметров, имя спектра и дата его регистрации, моделирования или синтеза) .

Все программные пакеты и комплексы имеют возможность обмениваться информацией вне зависимости от того, является ли спектг экспериментальным или теоретическим.

функции программного комплекса. Качественный анализ исследуемые спектров.

ППП содержит архив спектров эталонных образцов (спектров-эталонов), которые регистрировались при разных условиях, в частности, пр} различных концентрациях белков. Для любого исследуемого спектра 5 могут бьггь выполнены операции качественного сравнения со спектрами-эталонами Б соответствующего архивного набора, фи атом сравнение может быть произведено как визуально по графикам на экране (на основе "знаний" исследователя), так и по минимуму среднекгадратичногс

Оценка приближения исследуемого и эталонного спектра, строгс говоря, может производиться только в том случае, если первый спект! приведен к масштабу второго. Для этого ППП содерЛлт процедуру масштабирования спектров по спектрам-эталонам. В результате ее работ! исследуемый спектр масштабируется по паспортным параметрам вызванного спектра-эталона.

После масштабирования исследуемого спектра по спектру-эталону I в случае удовлетворительной оценки их приближения (подобие структуры, формы) может бьггь проведено нормирование по площади. Поскольку для спектра-эталона известна концентрация вещества (например, топ или иного белка), то в результате нормировки площади исследуемоп спектра по площади спектра-эталона в отношении I : I автоматичесга вычисляется концентрация этого же вещества и в образце, от которой получен исследуемый Спектр.

отклонения:

Таким образом, в целом ряде случаев можно просто (с точки зрения исследователя) и быстро идентифицировать изучаемое вещество и оценить значения его концентрации в анализируемом образце.

Моделирование спектров.

При нашей постановке задачи моделирование спектров с помощью соответствующих программ имеет своей целью оказание конструктивной помощи исследователю в дешифрации исследуемых спектров в тех случаях, когда их форма отлична от форм спектров-эталонов, имеющихся в архивных наборах. Следовательно, необходимо определить такой теоретически рассчитанный спектр, который будет удовлетворять условиям приближений к экспериментальному исследуемому спектру.

В том случае, когда спектр-модель достаточно правильно описывает образ экспериментального спектра, он может быть записан в архив и в дальнейшем использоваться как эталон.

Синтез спектров.

Здесь понятия "моделирование" и "синтез" спектров имеют различный смысл.

Моделирование - расчет спектра по некоторым формулам, раскрывающим с теми или иными приближениями спиновый гамильтониан.

Синтез - это способ получения теоретических образов экспериментальных спектров, основанный на первоначальном моделировании спектров и применении к ним различных видов преобразований. Преобразовать спектров позволяет сформировать из отдельных смоделированных заготовок образ экспериментального спектра, состоящим из суммы спектров от нескольких невзаимодействующих парамагнитных центров.

Например, если стоит задача нахождения теоретического образа экспериментального спектра, состоящего иэ суммы двух спектров (сво-

бодный радикал плюс, желевосодержащий белок), то первоначально моделируются отдельно два спектра. При атом в качестве опорных берутся вначения параметров, которые могут быть получены при анализе экспериментального спектра. Затем полученные спектры масштабируются взаимно так, чтобы их сумма наилучшим образом приближалась к экспериментальному спектру.

Модели и алгоритмы. Изотропный случай. фи синтезе композиционных спектров возникает в ряде случаев необходимость моделирования изотропных и анизотропных спектров. С этой целью разработаны специальные алгоритмы.

При предварительной обработке экспериментальных спектров важной процедурой является удаление искажающего фона. Под фоном здесь определяется интегральный образ базовой линии спектра производной.

В оборы виде уравнение базовой линии можно представить как

где возможное смещз!ше базы по ординате,о(( Н) - возможный наклон ба?ч к Н-оси, (54 Щ - нелинейные члены, искажающие форму базовой линии. Природа уо, о^(Н), у (Ю молит бьггь различной (приборной и проч.). В частности, ^(Н) может быть обусловлено наличием в спектре фрагментов некоторых линий, которые находятся справа или слева от интервала регистрации спектра по Н, или наличием некоторых "широких" линий (в спектре поглощения) от "посторонних" парамагнитных центров. Как правило, искажение, вносимое (Н) и видимое на спектре первого интеграла, не обладает известной закономерностью (в отличие от у„ и оС(Н), которые "ликвидируются" ва счет поворота базы и приведения . ее к нулевому уровгао по среднему вначвшао спектре).. Поэтому фоновая

кривая может бьггь вычтена из спектра поглоцэния по ее задании исследователем.

Кроме того рассмотрены такие задачи по аппроксимации спектров с помощью полиномов Чебышева и Форсайта, а также по интерполяции данных.

В следующем разделе диссертации мы рассмотрели ряд основных положений, связанных с созданием пакета прикладных программ на ЭВУ типа IBM PC, ориентированного на специальные виды обработки экспериментальных спектров ЭПР парамагнитных центров компонент крови (ме-таллосодержзщие белки) и поступающих в кровь нитритных ионов, а также на моделирование спектров ЭПР в предположении наличия указанных центров.

Показана его практическая ценность. Имеется возможность оперативной оценки (экспресс-анализ) наличия и соответствующей концентрации трансферрина, церрулоплазмина и комплексов типа НЬ-НО в пробах крови, а через эту оценку - определенные заключения (диагностика) состояния здоровья человека. Еажную роль играют процедуры моделирования, имеющие смысл доказательств гипотез о структуре и форме спектров компонент крови. Разработанные алгоритмы и программы по трансформации спектров, их моделировании и синтезе привели к ряду практически интересных результатов.

ГЛАВА V. Оценка состояния здоровья организма человека по парамагнетизму крови при массовых профилактических осмотрах

Задача экспресс-оценки состояния здоровья операторов предприятий ЯГЦ возникает в связи с проблемой повыиения безопасности установок и увеличения эффективности использования трудовых ресурсов..

С целью выяснения возможностей ЭПР в промышленных системах экспресс-оценки состояния организма были проведены исследования, в ходе которых, во-первых, отрабатывалась методика применения ЭПР в условиях массовых медицинских осмотров операторов предприятий ЯГЦ; во-вторых, изучалась информативность параметров крови с точки 8рения решения задачи оценки состояния организма.

Необходимо было определить возможность кспольвовать парамагнитные свойства крови для оценки характеристик организма, снимаемые менее технологичными (с точки зрения возможности автоматизации, скорости, точности и т. д.) методами. С этой целью единовременно с характеристиками ЭПР проводили традиционные клинические анализы, иммунные тесты, психофизиологические тесты. Решали задачу о их взаимосвязи и возможности судить о характеристиках организма по ЭПР спектрам.

Работники, кровь которых анализировали с помощью метода ЭПР, были предварительно отобраны из общего числа обследуемых по признаку отсутствия заболеваний. То есть, они относились к категории клгаш-чее и здоровых с точки зрения действующее сегодня в медицине принципов оценки.

Параллельно у тех же работников в ходе углубленного осмотра определялись развернутые психофизические характеристики, их иммунный статус, а такиэ другие характеристики, устанавливаемые обычно в ходе профосмотрэ

Спектры ЭПР записывали на магнитных дисках, что позволяло хранить данные в компактной форме до их обработки. Анализ спектров ЭПР заключался в определении значений их фактора и количества парамаг-тггных центров иеташюсодержасщ белков крови- черулоплазмина (С - 2.05), трансфвррина (е - 4.3), а также свободных радикалов (е ' 2.00).

Данные анализа обрабатывали при помощи пакета прикладных программ '^а^гарШсв".

Интегральная интенсивность сигналов ЭПР отражает содержание в крови каждого отдельного типа парамагнитных соединений и общее содержание парамагнитных веществ крови. Вариации г-фактора могут быть полезными при выявлении тонких начальных отклонений от нормы, не улавливаемых традиционными методами.

Анализ результатов определения распределения содержания парамагнитных центров в крови (церулоплазмин, трансферрин, свободные радикалы) в группе из 380 практически здоровых людей (персонала предприятия ЯТЦ) позволяет считать возможным применение радиоспектроскопии для оценки состояния организма. Объем выборки составляет 380 наблюдений и несмотря на флюктуации по таким показателям как возраст, стаж работы и другие получены статистически достоверные результаты. В диссертации приведены гистограммы распределения числа обследуемых людей по содержащимся в их крови парамагнитных центров со значениями фактора 2.00; 2.05; 4.3 - свободные радикалы, церул-лоплазмин и трансферрин соответственно. Содержание этих центров по численным значениям группируется в рамках достаточно узкого диапазона. Это обстоятельство позволяет выдвинуть предположение о возможности использования нормативных параметров здоровья по парамагнитной активности крови.

Следует отметить, что наблюдавшийся спектр ЭПР крови не исчерпывается спектрами ЭПР, соответствующими церуллоплазмину, трансфер-рину, но имеет более сложный вид, так как содержит ряд неопознанных парамагнитных структур. Это обстоятельство позволяет надеяться на эффективное решение ряда задач распознавания состояний организма

здорового человека по структуре ЭПР спектра крови.

Эксперимент по использовании анализа парамагнетизма крови для оценки состояния здорового человека показал пригодность метода ЭПР для массовых осмотров. Подготовленный специалист может в течение рабочего дня с помощью автоматизированного ЭПР - радиоспектрометра снять ЭПР-спектр с Б0-70 проб в день с последующим хранением данных на машинных носителях. Заметим, что пробы крови для ЭПР-алализа могут долго храниться в жидком азоте.

ГЛАВА VI. Влияние пестицидов на парамагнитные свойства крови млекопитающих'

В организм человека и животных пестициды могут поступать вместе с водой, пшзэвыми продуктами и воздухом. Проникая в кровь, эти вещества взаимодействуют с плазматическими мембранами форменных элементов крови и модифицируют их структурно-функциональную организацию. Известно также, что пестициды обладапг токсическим, аллерги-чесгаш и мутагенным действием на организм млекопитающих (Гендель, 1988; Асроров и соавторы, 1986).

Однако до сих пор остается не наученным механизм воздействия пестицидов на транспортные белки крови, ферменты и на гемоглобин. Остаются также не ясными механизмы образования ряда свободных радикалов, входящих в состав мембран форменных элементов крови. В связи с ЭТ1М задачей нашей работы явилось изучение влияния пестицидов на парамагнитной свойства крови млекопитающие.

Пестициды часто применяют вместе с азотными удобрениями. В состав азотных удобрений, как известно, входят нитросоедипения (нитраты). яти нитросоединэкил, поступая в организм человека и животных, могут превратиться в шггрити, которые, вваимодейств}.. с гемоглоби-

ной, способны окислять его в метгеюглобин.

Второй задачей нашей работы явилось изучением одновременного влияния пестицидов на фоне нитритной метгемоглобинемии.

Исследовали изменение содержания свободных радикалов, а также парамагнитных центров церуллоплазмина и трансферрина в крови крыс после внутрибрюшинного введения растворов диквата, гидрела, базагра-на, прометрина, которана, атразика, тенорана, зенкора и девринола. Показано, что пестищда атразин, теноран, зенкор, девринол с умственно не влияит на содержание и состав парамагнитных центров крови. В то же время внутрибршинное введение диквата, прометрина, гидрела и которана в дозах ДЦ , приводило через 30-60 мин. к увеличению содержания свободных радикалов в 2-6 раз. Наибольшее изменение в содержании свободных радикалов было отмечено при введении диквата (в 4-6 раз) и прометрина (3-5 раз). Шньшее изменение-в содержании свободных радикалов было отмечено при внутрибрютинном введении гидрела (2-4 раза) и которана (2-3 раза).

Исследование интенсивности сигнала ЭПР се- 2.05, до и после .введения диквата, прометрина, гидрела и которана не выявило сколько-нибудь заметных влияний на содержание церуллоплазмина.

Одна:со, были обнаружены изменения в интенсивности сигнала ЭПР с е > 4.3, который, как известно, обусловлен трансферрином, находящимся в связанной с ионами Те форме. При внутрибрюиинном введении дг'свата, прометрина и гидрела интенсивность сигнала ЭПР с 2-4.3 увеличивалась в 1,5 -1,8 раза по сравнению с контролем. В то же время при внутрибрюшинном введении которана в дозе Щ!0 изменивй в интенсивности сигнала ЭПР с в - 4.3 отмечено не было.

Наиболее заметное влияние на содержание парамагнитных центров

крови крыс было отмечено при внутрибршинном введении базаграна и при инкубации этого вещества с кровью. В опытах in vitro было отмечено, что в первые минуты взаимодействия наблюдается увеличение содержания свободных радикалов в .2-5 раз. Однако спустя 5 мин. после начала реакции взаимодействия базаграна с кровью наблюдали постепенное уменьшение сигнала ЭПР с g « 2.00. Причем спустя 15 мин. содержание свободных радикалов стабилизировалось и составляло 150Х от уровня контрольных животных. '

При внутривенном введении базаграна, а также при инкубации этого вепдзства in vitro (Щю - 110 иг/100 г) было отмечено появление нового сигнала с шириной линии 5-6 ыТл и е - 2.28-2.29 (рис.2).

1

3

Спектпы ЭПР крови контрольных животных (а} и после действия базаграна (б)

Рис. 2.

Природа этого сигнала была не ясна. Для того, чтобы понять характер влияния базаграна на парамагнитные центры крови и природу ноеого сигнала, нами были предприняты опыты по изучению влияния этого ве-прства на парамагнитные НЬ-Ш комплексы. Было показано, что добавление базаграна в дозе 5-100 мг/мл к раствору гемоглобина, содержащего НЬ-ЫО комплексы модифицирует сигнал ЭПР этих комплексов. В результате действия базаграна бьшз отмечено уменьшение интенсивности сигнала ЭПР НЬ-ЫО комплексов. Кроме того, в ряде случаев наблюдалось появление триплетной СТО, характерной для Т-конформеров НЬ-ЫО комплексов.

Поскольку ранее (Кон, 19Б8) было показано, что вещества, денатурирующие белок, способны вызывать Й-Т - переходы НЬ-Ш комплексов, сопровождающиеся появлением в спектре ЭПР триплетной СТО, можно было предполагать, что одной из причин появления триплетной СТО под влиянием базаграна может явиться денатурирующэе действие базаграна.. В связи с этим нами были проведены опьггы по изучению влияния тепловой денатурации белка на спектр ЭПР (крови) гемоглобина (рис.3).

1

1 1

Рис.3. Спектры ЗПР крови колттэольгшх киеотных после теплою.";

Рис.

дэнатурац:

Результаты этих экспериментов показали, что под влиянием тепловой денатурации происходят такие же изменения, как и после действий базаграна.

Сделан вывод, что токсическое действие некоторых пестицидов связано с их денатурирующим действием на белки.

ВЫВОДЫ

1. Анализ литературных и собственных данных показал перспективность применения ЭПР-спектроскопии крови при массовых профилактических осмотрах работающего человека. ■

Цагщггно-рееонансные параметры крови человека при массовых профилактических осмотрах являются информативными для определения состояния его здоровья.

2. Создан программно-алгоритмический пакет для ЭВМ типа IBU PC/XT/AT, ориентированный на специальные виды обработки и моделирования экспериментальных спектров ЭПР парамагнитных центров компонент крови и поступающих в кровь нитритных ионов.

3. Для ЭВЫ IEM PC/XT создан пакет программ для вариационного определения формы спектров ЭПР парамагнитных центров в стеклообразных матрицах. Программа апробирована на примере расчета параметров спектров ЭПР 2Г -облученных стекол и малемидных спиновых мэток.

4. Показано влияние ряда пестицидов на парамагнетизм крови: дикват, прометрин, гидрел и которая при внутрибрюшном введении ди-вотным в 2-6 раз увеличивают содержание свободно радикальной фракции крови:

токсическое действие некоторых пестицидов свяваво с их денатурирующим действием;

при введении базаграна в кровь животных выявлен новый парамагнитный центр с е - 2,28 и шириной 6-6 мТл.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бердиев У. Б., Комаров А. Ц., Голощапов О. О., Шекшеев Э. М. Автоматизированная обработка анизотропных спектров ЭПР поликристалли-чзских образцов. //Тезисы докладов конференции молодых ученых и специалистов Термезского ГПИ, Термез, 1987, С. 33.

2. Добряков С. а , Комаров А. М., Туровская К. Е , Киладзе И. Ы,, Бердиев У. Б., Шэкшеев Э. 11, Каюшин Л. Е Разработка и применение автоматизированной магнитно-резонансной спектроскопии спиновых меток в мэдико-биологических исследованиях. // Тезисы докладов Всесоюзной школы по автоматизации научных исследований. <Ерунзе, 1987,' С. 63.

3. Бржевская О. Е , Бердиез У. В., Бекмурзаев Е11, Вишневский Е. С., Резничэнко Л. А., Фаизов Р. И. , Катин Л. Е Применение автоматизированной ЭПР-спектроскошш для анализа крови при массовых профилактических осмотрах. // Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Применение магнитного резонанса в народном хозяйстве", Казань,

1988, Т. 2, С. 12.

4. Бердиев У. Б., Реутов Е Е , Еишневский Е. С., Катин Л. Е , Гольдфельд ЕГ. Изучение влияния пестицидов на парамагнитные свойства крови млекопитающих. // Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Магнитный ревонанс в биологии и медицине", Черноголовка,

1989, С. 143.

Б. Реутов Е Е , Ааоша ЕЙ., Каюшин Л Е , Вишневский Е. С., Бердиев У. Б. О факторах, влияющих на образование НЬ-Ш комплексов, при взаимодействии гемоглобина с нитритами. // Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Черноголовка, 1989, С. 60.

6. Бердяев У. Б., Кузнецов Ю. IL , К/клин М. Г., Реутов Е П., Шэкшеев Э. U. Моделирование спектров ЭПР парамагнитных центров крови на персональных ЭВМ типа IBM PC/XT/AT. // Препринт, Москва, 1989, С. 31.

7. Бердиев У. Б., Реутов В. П., Вишневский Е. С., Шэкшеев Э. М., Кашин JL Е Использование автоматизированного метода ЭПР для исследования влияния пестицидов и нитритов на парамагнитные свойства крови млекопитающих. // деп. в ВИНИТИ N 7723-В89 28.12.1989.

8. Бердиев У. Б., Кашин Л. Е Методика расчетов и моделирование сложных спектров ЭПР. // Сб. науч. труд. Термезского ГПИ, Термез, 1991, С. 1-4.

9. Реутов ЕIL , Бердиев У. Е , Вишневский Е. С., Кашин Л. Е О некоторых механизмах токсического действия пестицидов. // I съезд детских врачей Туркменстана. Тез. докл., Ашхабад, 1991.