Синтетический полиморфизм ферментов, катализирующих метаболизма некоторых лекарственных средств в организме человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА., ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Р Г £ л П ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

и {

1-.На правах рукописи

УДК 557.21: 577.175.6

КРЫНЕЦКИЙ Евгений Юрьевич

¡НЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ ФЕРМЕНТОВ, КАТАЛИЗИРУПЦИХ МЕТАБОЛИЗМ НЕКОТОРЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва 1995

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Государственного НИИ

стандартизации и контролю лекарственных средств (Москва), кафедре

мии природных соединений Химического факультета МГУ им.М.В.Ломонос (Москва).

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

академик РАН, доктор химических наук,

профессор А.А.Краевский

доктор химических наук А.Б.Вартапетян

доктор биологических наук, профессор С.С.Шишкин

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биологической

Защита состоится "26" декабря 1995 г. в 16 часов на заседании специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам цри Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу 119899, Москва В-234, Воробьевы горы, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " ноября 1995 г.

и медицинской химии РАМН

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность проблемы

Экзогенные соединения, в том числе лекарственные препараты, попадая в организм человека, подвергаются превращенияы в ходе химических реакций, катализируемых особой группой ферментов. Наследуемые нарушения метаболизма лекарственных средств во многих случаях вызваны мутациями в генах ферментов, катализирующих биотрансформацию ксенобиотиков. Два важных обстоятельства характеризуют феномен полиморфизма ферментов метаболизма ксенобиотиков: во-первых, высокая частота аллельных вариантов, и во-вторых, то, что в отсутствие соответствующего ксенобиотика носитель мутантного аллеля фенотипически неотличим от дикого типа. В эволюционном плане, существование полиморфизма этих ферментов, видимо, является благоприятным фактором, повышающим шансы популяции на выживание при воздействии разнообразных химических соединений, например, компонентов пищи.

Фундаментальная проблема взаимодействия организма с экзогенными соединениями, поступающими из окружающей среды и обладающими физиологической активностью, тесно связана с прикладными вопросами: полиморфизм ферментов, катализирующих метаболические превращения ксенобиотиков, часто лежит в основе изменения фармакологических характеристик и физиологических последствий применения лекарственных средств. Поэтому наследуемые вариации активности ферментативных систем, катализирующих такие превращения, в ряде случаев определяют терапевтический эффект лекарственных препаратов. Известны многочисленные примеры, когда подобные вариации вызывают серьезные токсические эффекты и даже приводят к гибели больного. Необходимость получить ясное представление о роли полиморфных ферментов метаболизма ксенобиотиков вызвана возрастающим числом экзогенных соединений, поступающих извне в организм человека в виде лекарственных препаратов, компонентов пищевых продуктов, индустри-

альных токсинов.

Хотя к настоящему времени накоплены данные о роли индивидуальных изоформ ферментов метаболизма в биотрансформации некоторых классов лекарственных соединений, о строении генов ме-таболизируюцих ферментов (в том числе цитохромов Р450, И-ацетилтрансфераз, глюкуронозилтрансфераз), все еще не выработано единого взгляда на роль и функции основных вариантов и минорных форм в метаболизме ендо- и екзогенных соединений в организме человека. Поетому создание общего молекулярно - биологического подхода к изучению данного круга вопросов является актуальной задачей.

1.2. Цель и задачи исследования: Цель работы состояла в изучении механизмов, приводящих к снижению активности ферментов, катализирующих метаболизм ксенобиотиков. При етом были поставлены и решались следующие задачи:

1. Создание единого молекулярно-биологического подхода к изучению индивидуальных изоформ и аллелей метаболизирукщих ферментов.

2. Выявление особенностей биохимической трансформации лекарственных препаратов (на примере синтетических стероидных гормонов) у експериментальных животных по сравнению с человеком.

3. Создание систем гетерологической экспрессии двух классов ферментов метаболизма - мембран- связанных белков (индивидуальных изоформ цитохрома Р450 - СУР21)6 и С¥РЗА4), и цитозольного белка (тиопурин - метилтрансферазы, ТРМТ).

4. Выяснение механизмов, лежащих в основе нарушения активности ферментов, участвующих в метаболизме лекарственных средств, на примере тиопурин Б-метилтрансферазы. Выявление и характеристика инактивирующих мутаций. Характеристика ТРМТ- подобных последовательностей в геноме человека.

5. Разработка методов генотипирования больных для выявления

нарушений биотрансформации конкретных лекарственных средств. Изучение распространенности аллелей (ТРМТ). Создание диагностических систем для обнаружения мутантных аллелей ферментов метаболизма перед началом лекарственной терапии.

1.3. Научная новизна и практическая ценность работы:

В данной работе получило развитие новое направление в исследовании ферментов метаболизма ксенобиотиков, базирующееся на синтезе индивидуальных ферментов человека и их мутантных форм в клетках низших еукариот (Saccharomyces oerevisiae).

Разработана высокоэфффективная система экспрессии функционально активных ферментов метаболизма человека в дрожжах S.oerevisiae. С использованием разработанной системы получены данные об участии изоформы цитохрома Р450 CYP3A4 в метаболизме синтетического лекарственного препарата анаболического действия метандростенолона в организме человека. Изучены кинетические особенности метаболических превращений субстратов - прототипов изоформ цитохрома Р450 CYP2D6 и CYP3A4» в монооксигеназ-ной системе окисления in vitro под действием соответствующих ферментов человека, синтезированных в клетках дрожжей. Проведено изучение метаболизма лекарственных препаратов стероидной структуры у экспериментальных животных (крыс). Показано существование значительных межвидовых отличий метаболизма этого класса лекарственных препаратов у человека и животных. Предложен метод выявления больных с нарушением синтеза изоформы цитохрома Р450 CYP2D6 путем анализа РНК, выделенной из периферических клеток крови. Обнаружен молекулярный дефект, приводящий к нарушению метаболизма противоопухолевых препаратов -меркаптопурина и тиогуанина в организме. человека. Путем клонирования и секвенирования кДНК из крови пациентов, дефицитных по активности тиопурин 5- метилтрансферазы (ТРМТ), выяснен механизм инактивации этого фермента - обнаружены точковые мутации, приводящие к снижению активности белка. Разработаны методы выявления инактивирунщих ТРМТ мутаций путем генотипирования

больных до начала лекарственной терапии. Проведено изучение распространенности соответствующих аллелей в популяции белого и черного населения Северной Америки. Соответствующие неактивные аллели были охарактеризованы в гетерологической системе, показано влияние мутаций на каталитическую активность и стабильность белков. Обнаружено присутствие ТРМТ - подобных последовательностей в геноме человека, в том числе процессирован-ные псевдогены. Экспрессия ТРМТ дикого типа в дрожжах дала возможность получить данные о субстратной специфичности фермента и определить кинетические параметры реакции метилирования тиопуринов и их производных. Полученные результаты использованы при лечении больных с острым лимфобластным лейкозом в Детском Исследовательском Госпитале Св.Иуды (Мемфис, США).

Личный вклад автора. В цикле исследований, составляющих диссертацию, автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве , личный вклад автора заключался в непосредственном участии во всех этапах исследования - от постановки задачи, проведения молекулярно- биологических и физико- химических экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.

Публикации. По материалам исследований, обобщенных в диссертации, опубликовано 34 работы.

1.4. Апробация работы.

Материалы работы доложены и обсуждены на 4 Международном симпозиуме Международного общества по изучению ксенобиотиков (Сиеттл, США, 1995), 10 международном симпозиуме по микросомам и окислению лекарственных препаратов (Торонто, Канада 1994), 6 Североамериканском симпозиуме международного общества по изучению ксенобиотиков (Ралей, США, 1994), Третьей конференции

"Геном Человека - 93" (Черноголовка, 1993), Международной конференции по цитохромам Р450 (Москва, 1991)» Международном симпозиуме по хроматографии (Москва 1988) , V Всесоюзном съезде биохимиков (Киев, 1986), а также на семинарах в МГУ и Детском Исследовательском Госпитале (Мемфис, США.).

Главные результаты работы и сделанные на их основе выводы изложены в обобщенном виде в настоящем докладе. Работа выполнена в 1984 - 1995 гг.

Тезисы защиты. На защиту выносятся следующие положения:

- создание и развитие теоретических и экспериментальных подходов к изучению полиморфных ферментов метаболизма ксенобиотиков в организме человека;

- молекулярные механизмы, лежащие в основе нарушений метаболизма меркаптопурина и его производных - важных препаратов антипролиферативного и иммуносупрессивного действия;

- гетерологические системы на основе 5асс5паготусез сеге71з1ае, експрессирующие ферменты метаболизма человека, с целью получения функционально активных индивидуальных ферментов метаболизма ксенобиотиков;

- диагностикумы для выявления нарушений метаболизма лекарственных црепаратов, с целью предотвращения токсических побочных эффектов химиотерапии;

- совокупность идей, теоретических подходов, экспериментальных методов и результатов, которую можно сформулировать как новое научное направление "Молекулярно-биологические подхода к изучению биотрансформации лекарственных средств в организме человека".

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 52 страницах и включает общую характеристику работы, экспериментальную часть, описание основных результатов и выводы. Работа содержит 14 рисунков, 4 схемы, 4 таблицы.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

кДНК, содержащие открытую рамку считывания (ОРС) цитохро-мов Р450 21)6 и ЗМ, были любезно предоставлены Др. Ф.Гонзалесом (Национальный Институт Здоровья, США). Экспресси-рующий вектор рУеБР, был любезно предоставлен Др.Д.Помпоном (Национальный центр научных исследований, Франция). Антитела к цитохрому Р450 2Бб были предоставлены Др. У. Майером (Биоцентр Университета Базель, Швейцария), и антитела к цитохрому Р450 ЗА4 были предоставлены Др.Ф.Генгричем (Университет Вандербильта, США). Образцы венозной крови отбирались у пациентов о пониженной активностью тиопурин Б- метилтрансферазы (менее 1 ед.акт./мл эритроцитов). Образцы крови были также получены у здоровых добровольцев и членов семей пациентов, у которых предполагалась наследственная недостаточность ТРМШ. Тотальную РНК из клеток печени и периферической крови пациентов выделяли гуанидиний - изотиоцианатным методом. Трансформация дрожжевых клеток проводилась литий-ацетатным методом. Синтез белков в клетках дрожжей индуцировали путем выращивания клеток в присутствии галактозы.

3. ГЕНЕТИЧЕСКИМ ПОЛИМОРФИЗМ ФЕРМЕНТОВ, КАТАЛИЗИРУЮЩИХ МЕТАБОЛИЗМ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ В ОРГАНИЗМЕ ЧЕЛОВЕКА

3.1. Молекулярно-биологические подходы к изучению процессов метаболизма ксенобиотиков в организме человека.

Выделение и анализ аллельных вариантов ряда монооксигеназ человека, включая СУР2д6 и СУТ2С19, заставил по-новому взглянуть на проблему изучения ферментов метаболизма ксенобиотиков. С помощью классических биохимических методов не удается изучать множественные изоформы метаболизирующих ферментов, поскольку разделение структурно и функционально сходных белков часто представляет трудную задачу. Крайне проблематична и возможность получения таким путем редких и мутантных форм фермен-

тов.

В цикле работ, составляющих настоящую диссертацию, предложен новый подход к изучению метаболизирующих ферментов (и их редких и мутантных форм), основанный на получении и экспрессии кДНК этих ферментов в клетках низших эукариот (ЗассЬаготуоез сегеу1в!ае).

Схема исследований включает выделение тотальной РНК, например, из периферической крови человека, синтез кДНК и клонирование в експрессирукщем векторе. Затем полученной рекомби-нантной плазмидой трансформируют клетки дрожжей и выращивают их в условиях, приводящих к синтезу гетерологичного белка. При таком подходе устраняются ограничения, связанные с приготовлением индивидуальных изоформ, поскольку сами дрожжевые клетки не синтезируют подобных ферментов. Во многих случаях даже грубо очищенный препарат клеточного лизата пригоден для исследований. Мутации, выявленные в ходе экспериментов по клонированию, несложно обнаружить в геноме пациентов и таким образом заранее выявить возможные нарушения метаболизма ксенобиотиков.

3.2. Особенности процессов биохимической трансформации синтетических стероидных гормонов в организме экспериментальных животных (крыс).

Для сравнительной характеристики процессов биохимической трансформации синтетических стероидных препаратов в организме человека и экспериментальных животных в настоящей работе проводилось изучение процессов метаболизма анаболического препарата метандростенолона и препаратов глюкокортикоидного действия дексаметазона и преднизолона в организме белых крыс.

3.2.1. Экспериментальные подхода.

Для проведения исследований процессов биотрансформации метандростенолона (МА) в организме крыс был разработан метод получения высокомеченого [ Н] МА методом тритиевого обмена на

катализаторе (авт.свид.). Одновременно были разработаны условия определения количества МА в биосубстрате методом ВЭЖХ (авт.свид.). Использование методов ВЭЖХ и радиоактивных индикаторов позволило показать, что после внутримышечного введения МА. происходит его быстрая биохимическая трансформация. Наличие заметных количеств радиоактивных соединений в мышцах при практически полном отсутствии свободного МА. указывает на то, что анаболический еффект МА в организме крыс следует связывать с продуктами его метаболизма.

3.2.2. Выделение и идентификация метаболитов МА и преднизолона.

Предварительные данные указывали на то, что наиболее вероятными продуктами метаболического превращения МА в организме крыс являются его восстановленные производные. Сравнение хроматографических свойств выделенных метаболитов с химически синтезированными восстановленными стероидами методами одно-и двумерной хроматографии, а также высокоэффективной жидкостной хроматографии позволило установить природу продуктов метаболизма МА (см. схему 1).

Выяснилось, что в процессе биотрансформации в организме крыс линии Вистар происходит восстановление системы двойных связей МА с образованием всех четырех возможных изомеров (соединения 1-4 на схеме 1). Полученные данные подтвердили опубликованное ранее сообщение об образовании двух из обнаруженных нами соединений: 5 сс- андростан-3(3- и 5(3- андростан-За- изомеров (соединения 1 и 4 на схеме 1, Тетр1е1;оп et а1., 1979). Помимо етого, установлен факт образования еще двух ранее не обнаруженных метаболитов - продуктов полного восстановления МА (5(3-андростан- 3(3- и 5ос- андростан- За- изомеров (соединения 2 и 3 на схеме 1). Продукты гидроксилирования МА, например, 6(3- гид-роксиметандростенолон, не были обнаружены.

Сопоставляя полученные данные о биотрансформации МА в организме крыс с опубликованными сведениями о его метаболизме в

но

н

н

н

чОЬ

н

(1)

(2)

(3)

(4)

он

°чрн3

о'

НО

(5)

Схема 1. 1- дегидро-17а- метилтестостерон (ИА.) и продукты его биохимической трансформации в организме белых крыс (I) и человека (II). (1) - 17а- метил-5а- андростан-3{3>17Р~ диол; (2)-17а- метил-5(3- андростан-Зр, 17р— диол; (3)- 17а- метил-5а-андростан-За,17(3- диол; (4) - 17а- метил-5р- андростан-За,17(Э-диол;(5) - 6(3- гидроксиметандростенолон.

организме других видов экспериментальных животных и человека, следует отметить существенное различие спектра метаболитов. Особенностью метаболизма МА в организме крыс является, во-первых, большая интенсивность процесса восстановления кольца А, и во-вторых, отсутствие заметных количеств продуктов гидроксилирования. Напротив, в организме человека основным цродуктом метаболизма, как и в случае монооксигеназной реакции In vitro с использованием микросомной фракции печени, является 6(3- гидроксиметандростенолон (соединение 5 на схеме 1). Таким образом, в данном случае использование экспериментальных животных или гомогенатов тканей метаболизирующих органов не позволяет получить данные, коррелирующие с процессами метаболизма у человека. Изоформа цитохрома Р450 крыс, катализирующая 60-гидроксилирование стероидов, недостаточно активна в этой реакции либо вообще неспособна использовать метандростенолон в ка-

честве субстрата.

Аналогичный подход был использован для изучения процессов биотрансформации двух других синтетических стероидных препаратов - дексаметазона (ДМ) и цреднизолона (ПЗ). ДМ в организме крыс и в микросомной системе окисления in vitro проявлял высокую метаболическую стабильность. Тем не менее, структурно сходное с ним соединения - ПЗ- црактически полностью подвергался метаболическому превращению. Микросомное окисление ПЗ in vitro приводило к образованию преднизона в ходе НАДФН-зависимой реакции. Видимо, ета реакция катализируется одной из изоформ 11(3-дегидрогеназы. Измерение скорости накопления преднизона в ходе реакции микросомного окисления показали, что фенобарбитал является мощным индуктором активности соответствующего фермента. Интересной особенностью такой индукции является ярко выраженный половой диморфизм - индукция соответствующей активности у самцов в несколько раз выше, чем у самок (Рис.1).

Рис.1 Накопление преднизона (нмол/мин) в микросомной системе окисления в присутствии микросом, выделенных из печени: (1) самцов после введения фенобарбитала; (2) самцов контрольной группы; (3) самок после введения фенобарбитала; (4) самок контрольной группы.

50 100 150 200 250

Время, мин.

Проведенные исследования свидетельствовали в данном случае о сходстве процессов метаболизма глюкокортикоидных препаратов в организме крыс и человека - так же, как в организме крыс, дексаметазон оказывается метаболически стабильным в организме человека, тогда как преднизолон претерпевает быстрое превращение в преднизон. Однако эти результаты ярко иллюстрируют другую особенность процессов биотрансформации у экспериментальных животных, по сравнению с человеком: системы регуляции активности ферментов метаболизма ксенобиотиков также обладают видрспецифическими особенностями. В частности, в отличие от человека для крыс характерен половой диморфизм - часть ферментов индуцируется гораздо сильнее у самцов, чем у самок, тогда как некоторые изоформы цитохромов Р450 у самок не вкспрес-сируются вообще или лишь в малой степени.

3.3. Гетерологические экспрессирувдие системы в изучении ферментов метаболизма ксенобиотиков.

Приведенные выше данные свидетельствуют об ограничениях моделирования процессов биохимической трансформации лекарственных средств на экспериментальных животных. Как видно из результатов исследования метаболизма синтетических стероидных гормонов, даже для структурно близких соединений возможны различия как в механизме реакций, так и регуляции активности ферментов метаболизма ксенобиотиков у человека и животных. Одним из путей решения втой проблемы является изучение метаболических процессов в реакциях In vitro, катализируемых ферментами человека, синтезированными в рекомбинантных клетках других организмов, например, дрожжей Saocharomyces oerevisiae.

3-3.1. Конструирование экспрессируицих систем на основе Sac-сЬагошусев cerevisiae.

Из предложенных к моменту начала работы гетерологических вкспрессирущих систем особый интерес представляли системы на основе дрожжей S.oerevisiae (P.P.Guengerioh et al., Methods

Enzymol. 1991: 206, 130-145). Выбор дрожжевых клеток S.oerevi-siae определялся несколькими факторами. Прежде всего, дрожжи представляют собой достаточно простой эукариотический организм, генетика которого хорошо изучена. Дрожжевая клетка содержит достаточно сложный аппарат процессинга и транспорта белков, а также компоненты, обеспечивающие функциональную активность цитохромов Р450, одного из главных классов ферментов, участвующих в метаболическом превращении ксенобиотиков. С другой стороны, собственный цитохром Р450 дрожжей представлен единственной изоформой (CYP51), субстратная специфичность которого весьма отличается от специфичности цитохромов Р450 млекопитающих и человека (Kalb et al., DNA 1987: б, 529-537). Кроме того, клетки дрожжей не содержат многих ферментов, катализирующих биотрансформацию ксенобиотиков в организме млекопитающих и человека (в частности, тиопурин - метилтрансферазы), что обеспечивает нулевую фоновую активность этой системы, в отличие от клеточных культур высших организмов. Используя векторы на основе криптической плазмиды, были сконструированы -плазмиды для экспрессии в клетках дрожжей функционально активных ферментов метаболизма человека.

3.3.2. Экспрессия индивидуальных изоформ цитохрома Р450, катализирующих биотрансформацию лекарственных средств.

Надсемейство цитохромов Р450 является одной из наиболее важных групп ферментов, катализирующих окислительный метаболизм ксенобиотиков. Из 13 семейств Р450, обнаруженных у человека, 4 участвуют в детоксикации экзогенных соединений, в т.ч. лекарственных препаратов. В настоящей работе с помощью цитохромов Р450 человека (изоформы CYP2D6 и CYP3A4) была показана принципиальная возможность изучения особенностей метаболизма лекарственных средств с помощью рекомбинантных дрожжей, оптимизированы условия экспрессии и определены кинетические параметры реакций монооксигеназного окисления лекарств in vitro.

В табл.1 приведены соответствующие векторы, штаммы Б.се-

revisiae и синтезированные с их помощью ферменты метаболизма лекарственных препаратов.

В работе использовали два типа экспрессирующих еписомаль-ных векторов, сконструированных на основе 2|Л плазмиды S.cere-visiae. В векторе YepMFahGH экспрессия кДНК находилась под контролем фосфат-чувствительного промотора РН05, активного в среде с низким содержанием фосфата. Плазмида pYeDP содержала галактозочувствительный промотор GAb10CYC1, индукция которого происходила при замене на галактозу источника углерода в питательной среде. При индукции промотора путем изменения состава питательной среды в клетках дрожжей,

Табл.1 Компоненты систем гетерологической экспрессии на основе кле ток Б.сегеу1з!ае, использованные для синтеза индивидуальных изоформ цитохромов Р450 человека

Вектор/промотор Маркер Штамм S.cer. Изоформа Уровень Р450 экспрессии (пмол/мг белка)

YepMFahGH/PH05 TRP1 DBY747 CYP2D6 не опр.

20В12 CYP2D6 не опр.

pYeDP/GAL10CYC1 URA3 Y1153 CYP2D6 50

Y1153 CYP3A4 120

2805 CYP3A4 330

pYeDPÍ/GAL10CYC1* URA.3 Y1153 CYP2D6 130

2805 CYP2D6 250

#

- 5'-нетранслируемая область кДНК модифицирована как описано в разделе 3.3.3.

трансформированных обеими рекомбинантными плазмидами, наблюдалось резкое усиление синтеза мРНК, гибридизовавшейся со специфическим зондом. Попытки обнаружить синтез цитохрома Р450 в

интактных клетках, используя спектральные свойства этой группы белков после обработки восстановленной формы цитохрома Р450 моноксидом углерода, привели к получению аномальных спектров, хотя и на фоне возрастания оптической активности. Видимо, обнаружению цитохромов Р450 в интактных клетках препятствует наличие в дрожжах других белков, оптически активных в данных условиях, скорее всего цитохром-с-оксидазы. Поскольку плазмида YepltFahGH с маркером ауксотрофности TRP1 не обеспечивала стабильной экспрессии CYP2D6, в дальнейших экспериментах по гете-рологической экспрессии использовалась плазмида pYeDP с другим генетическим маркером, обладающим пониженной частотой реверсии - URA3. Клетки - продуценты изоформы CYP2D6, выращенные до поздней логарифмической фазы, либо непосредственно использовали для экспериментов по биотрансформации лекарственных препаратов (спартеина), либо лизировали и выделяли из них микросом-ную фракцию для использования в реакциях in vitro (при изучении метаболизма дебризохина и декстрометорфана). Для обнаружения метаболической активности интактных клеток дрожжей, трансформированных плазмидой с кДНК CYP2D6, клетки выращивали в присутствии спартеина, специфического субстрата данной изофор-

Рис.2. Анализ продуктов метаболизма спартеина трансформированными клетками дрожжей методом ГЖХ. Стрелками отмечено время удерживания метаболитов спартеина.

Т I I I I I г з а и

Время, мин.

мы цитохрома. Анализ культуральной жидкости методом ГЖХ позволил обнаружить в экстракте наличие дегидроспартеинов (М^ и Mg на рис.2), нормальных продуктов метаболизма спартеина в организме человека, тогда как в контрольном штамме, трансформированном плазмидой pYeDP без вставки, соответствующие продукты не обнаруживались (см. рис.2).

Полученные данные позволили сделать вывод о том, что CYP2D6 синтезируется в дрожжах в функционально активной форме, т.е. что существует сопряжение между цепью переноса электронов в эндоплазматическом ретикулуме дрожжевой клетки и цитохромом Р450 человека.

3.3.3. Оптимизация условий экспрессии гетерологичных белков в клетках S.cerevlsiae.

Анализ полученных результатов и сравнение с литературными данными привели к предположению, что уровень синтеза целевого продукта может быть увеличен путем редактирования контекста инициаторного ATG-кодона кДНК и подбором подходящего штамма S.oerevisiae (Baim and Sherman, Mol.Cell Biol.1988: 8, 15911601). С этой целью проводился сайт-направленный мутагенез кДНК CYP2D6 в области, примыкающей к инициаторному ATG-кодону. Целью вводимой мутации было укорочение длины 5'-нетранслируемой области синтезируемой мРНК и введение короткой пуриновой последовательности, непосредственно предшествующей ATG-кодону. Сайт-мутагенез проводили методом ПЦР с использованием праймеров, частично комплементарных кодирующей области кДНК CYP2D6, и содержащих участки узнавания рестрикта-зами BamHI и EcoRI, а также последовательность AAA, предшествующую инициаторному ATG-кодону. Поскольку количество цитохрома Р-450, синтезируемого в клетках дрожжей, можно было легко определить спектральными методами после восстановления и насыщения СО, удалось оценить влияние контекста ATG-кодона на эффективность трансляции.

Спектральные измерения и оценка количества белка методом

иммуноблотинга показали, что количество цитохрома Р-450, синтезируемого в плазмиде с измененным контекстом инициаторного кодона, возрастало примерно в два-три раза и достигало 250 пмол на мг микросомного белка (Рис.3).

Рис.3. Спектральный анализ микросомной фракции дрожжевых клеток, експрессирующих (ЛР2В6 человека. 1- микросомы, выделенные из клеток штамма 2805, трансформированных плазмидой рУеВР/(ЛР2Ъ6\ 2- микросомы -кле ток, трансформированных плазмидой рУеБР1/(7УР2й6; 3-микросомы клеток, трансформированных плазмидой рУеБР, не содержащей кДНК СУР2В6;

Методом Норзерн-гибридизации был обнаружен сходный уровень содержания мРНК СУР2В6 в клетках с исходным вариантом и измененной кДНК. Поскольку последовательности плазмид рУеБР и рУеШ>1 идентичны, за исключением вставки ААА непосредственно перед инициаторным АТй-кодоном, влияние этой мутации очевидно. Использование штамма, дефицитного по пептидазе А приводит примерно к двухкратному увеличению содержания цитохрома Р-450, видимо, за счет снижения деградации синтезируемого белка. Вместе взятые, эти приемы позволяют достичь 5-кратного увеличения экспрессии С¥Р21)б, по сравнению с полученными ранее в дрожжевых системах. Цитохромы Р450 млекопитающих представляют собой мембран- связанные белки, причем II- концевой пептид в них служит для прикрепления к ендоплазматической мембране.Для выяснения влияния природы Ы-концевого пептида СУР2Б6 на его функцио-

Длина волны, нм

нальную активность и внутриклеточную локализацию, была сконструирована рекомбинантная плазмида, в которой кДНК CYP2D6 была укорочена на 66 нуклеотидов с 5'- конца, что приводило к синтезу укороченной на 22 аминокислотных остатка с N- конца полипептидной цепи. Результаты анализа клеточных фракций дрожжевых клеток показали, что общее внутриклеточное содержание укороченной формы CYP2D6 было примерно на порядок ниже, чем соответствующей полноразмерной формы белка, хотя содержание мРНК для обеих форм было практически одинаково. Затем, внутри клетки белок обнаруживался как в составе цитозольной, так и микросомной фракции. Укороченная форма CYP2D6 не обладала характерным спектром с максимумом поглощения 450 нм после восстановления и насыщения моноксидом углерода. Последнее наблюдение указывает либо на неспособность укороченного белка связывать гем, либо быструю денатурацию белка в процессе выделения. В соответствии с первым предположением находятся данные об отсутствии связывания гема укороченной формой другого цито-хрома Р450 (Clark and Waterman, J.В.С.1991: 266, 5898-5904).

Таким образом, увеличения синтеза цитохромов Р450 человека в клетках дрожжей можно достичь путем модификации 5'- не-транслируемой области кДНК и подбора штаммов с низким уровнем протеазной активности. Далее, интактный N- концевой пептид в молекуле цитохрома Р450 необходим для правильной внутриклеточной локализации и формирования функционально активной формы. Выводы из этой части работы были использованы при конструировании штаммов - продуцентов CYP2D6, ТШТ*1, TPUT*2, ТРИ'.Г*3 (см.разделы 3.3.3«. 3.3.7.)•

3.3.4. Изучение кинетики монооксигеназной реакции окисления дебризохина и декстрометорфана, катализируемой CYP2D6.

Хотя CYP2D6, синтезированный в клетках дрожжей, обладал ферментативной активностью по отношению к спартеину, необходимо было убедиться, что каталитические характеристики моноокси-геназного комплекса, включающего, помимо CYP2D6 человека, и

дрожжевую цитохром Р450-редуктазу, не меняются. С этой целью для изучения каталитической активности экспрессированного СУР2д6 были использованы лекарственные средства дебризохин и декстрометорфан - прототипы данной изоформы(т.е. соединения, преимущественно окисляющиеся именно этой изоформой). Известно, что генетически обусловленные нарушения синтеза каталитически активного (ПР21)6 приводят к резкому снижению скорости биотрансформации дебризохина, а это в свою очередь, вызывает опасные побочные реакции у больных с такими нарушениями. Хроматографи-ческий анализ продуктов монооксигеназной реакции в присутствии дрожжевых микросом показал, что СУР2Б6, синтезированный в клетках дрожжей, катализирует метаболизм дебризохина и дек-строметорфана (см.схему 2).

Он

(2) COyNH2 ЦкД ,

NH "

n NH

Схема 2. Реакции О-деметилирования декстрометорфана (1) и гид-роксилирования дебризохина (2), катализируемые CYP2D6.

Интересно отметить, что реакция микросомного окисления in vitro дебризохина приводила к образованию по крайней мере двух продуктов. Один из них был идентифицирован как 4- гидроксидеб-ризохин, нормальный метаболит, образующийся в организме человека. Образование второго, неидентифицировэнного продукта также отмечалось в организме человека и гетерологической експрес-сирупцей системе на основе линии клеток человека. Природа этого продукта неисследована. Возможно, этим продуктом является

карбоксипроиззсгкс«. обраьгсЕеэся в результате раскрытия zzt.z.3 после тадроксглирсээния г'--"р.-гзохина в 1 или 3 ^гдожение. венным подтвержглЕйем преиг.:.-.эжения об участи 7YP2D6 в Сизова нии этого zp.cz;."?:та яз.::пггоя данные о том, ттс образогаст.е этого метаболита у Зольных : нарушением актиззсс-rz CYP2Di xs резко снижено Tucker f- il., Lanoet 1977: XI. 718). Хтсм:>— тографический ss^.—дз прс^'тттз реакция In Uitrc с декстрозе-торфаном показал о-Зразовгзге его О- деметилирсвгкзого npc-zyxra дехстрорфана, с-гргзующего:« г в результате метаболизме дет-строметорфана в .:трганизме ^елззека.

Кинетические параметр* реакций монооксиген.гзного окисления дебризохинг ж лекстрс»«т=рфана, катализируемьэс CYP2Dt. переделяли, анализгруя прод^тх реакции методом ЗЗЗЕХ. Концелтр;*-циээ CYP2D6 оценив&ли спектральным методом, регистрируя п:глощение при 450 ад. как выше. Определение и Kn :грс-водили в услсвияз, при тше кинетика резхпязг описыылзсь уравнением Михгзлгса-Мент* • Рис.4). Полученные кинетис-гсяэса данные показали, что субстратная специфичность т. кэталитп;:-кие характерна,m CYP2L6. ггнтезированного з дрожжах, н? изменились существенным образе« по сравнению с —-епаратаы! гз клеток печени человека. и Ушах реаг-сгизс образеззнгя 4-гидроксидебргзс.хина (5С \c-ii и 7.5 пмол/мг/мин) были ь.гяз:<зг таковым для С'£?2-~ъ (33.6 и 0.62- 1.27 гмел/.иг/мин) и CYP2D6(С) (12.1 \«кМ и 3.£'-3.80 пмол/мг/мин), сзнтезироБзнннх в культуре человеческих меток (Tyndale et al., Pharma, о genetics 1991: 1, 55-32). Кзэетнческий анализ искажал также, что реакция 0-деые ти.тнрования де к с троме торфана, хатглизируеиая дрожжевыми шссроссмами, характеризуется величинами Km vodi и Vmax 700 пиол/мт/мин сравнению с 2.5-15.2 мкМ и 21-500 пмол/мг/мин, спрегеленнкли в препаратах макросом из печена человека (Le Guellr-c et al.. Cancer Chem. Pharmacol. 1993: 32, 491 -495/.

Вышеприведенные даннх>? показывают, что субстратная сгегз-фичность и кинетические параметры ферментов, синтезировантх з дрожжевых клетках. оказал2\-ь сходными с соответствующими

Рис.4. Каталитические свойства CYP2D6, ггнтезированного в клетках лроквей, в реакциях гидроксилгрсзангд дебризохгн верхняя ланель) и О- деметилирования деке—сызтсрфгна (нижня ланзль;. '¿-I; и (A-II) - хроматографиче;:-з2 гнг."зз продукте шдрокс2.-зрсз2Ния дебризохина и О- üeueTz^zzcзангя лекстроме торфанг в присутствии дрожжевых микросом, z; сслерхглих CY?22 .контроль}; S-I) и (B-II) - анализ продттггез реакции в zrzz. сутствzz '.икросом, выделенных из дрожжег- продуцентов CYP2Z человека; 'С-I) и (C-II) - определение кинеггчеекгх параметре реакции ггдрсксилирования дебризохина и Г- леметглирования лгкстрсмэгсрфгна в координатах Лайнувера-5е—-:а.

характеристиками ендогеннкх цитсхромоз ?450, полученными для препаратов печени человека. Это заключение послужило основанием для использования сконструировавши системы при изучении метаболизма лекарственных препаратов стероидной структуры в реакциях in vitro.

3.3.5. Конструирование штаыиа- продуцента основного цитохроиа Р450 печени человека CYP3A4.

Для экспрессии CYP3A4, который представляет собой наиболее обильно синтезируемый цитохром Р450 в печени человека (общее содержание около 30&, Shimada et al., J.Pharm.Exp.-(Eher. 1994: 270, 414-423), использовали плазмиду pYeDP с г а лгу.-тозочувствительным индуцируемым промотором GA110CYC1. При выращивании клеток S.cerevisiae, трансформированных плазмидой со вставкой кДНК CYP3A4, в среде с галактозой, в клетках происходило накопление соответствующей мРНК длиной около 2 т.о. Клетки, выращенные в условиях индукции промотора, лизировали и использовали для приготовления микросомной фракции. Дифференциальный спектр микросомной фракции дрожжей, зарегистрированный после восстановления дитионитом и насыщения моноксидом углерода, показал наличие пика поглощения при 448 нм, характеризующий присутствие активной формы цитохрома Р450. В контрольном препарате микросом, выделенных из дрожжей без вставки кДНК CYP3A4, соответствующая полоса поглощения не выявлялась. Удельное содержание CYP3A4 для штамма 2805, дефицитного по пептидазэ А, составило около 330 пмол/мг глссросомного белка. Это значение существенно превышало достигнутые ранее величины(Guengerich et al.,1991). Для прозерки каталитической активности цитохрома CYP3A4, синтезированного клетками S.cerevisiae, проводили монооксигеназную реакцию in vitro прототипа изоформы CYP3A4. В качестве прототипа нами было использовано лекарственное средство нифедшшн. На рис.5 приведены результаты хроматографического анализа реакционной смеси.

Как видно из профиля хроматографического разделения, з

результате реакции образуется соответствующее пентазамещеяное производное дкршпша. Этот продукт не появлялся при инкубации ни.¿вдипина с микросомами из дрожжевых клеток, трансформированных контрольной плазмидой (т.е. без вставки кДНК СТРЗА4).

£ сн3о2с

Н3С

СУРЗА4 сн302с ->

Н3С

Время, мин.

Рис.5. (А)-реакция окисления нифедипина,■катализируемая СУРЗА4 в гепатоцитах человека. (Б) - анализ продуктов микросомной реакции окисления нифедипина, катализируемой микросомами: 1 -выделенными из клеток - продуцентов С¥РЗА4 ; 2 - выделенным! из контрольных клеток, трансформированных плазмидой без кДНБ С7РЗЛ4. Стрелкой отмечено время выхода продукта окисления нифедипина .

3.3.б. Идентификация изоформы цитохрома Р450 человека, участвующей в окислительной метаболизме МА.

Феномен фармакогенетического полиморфизма наблюдается I тех случаях, когда биотрансформация лекарственных средств I организме человека осуществляется одним или ограниченным набором изоформ ферментов метаболизма. Поэтому при введении в

зактику нсвкх лекарственных препаратов Heoixczz«:: знать, ка-ie именно гзоформы принимают участие в их izo трансформации-. 5щим подходом для решения этой проблемы явлл=7-;я создание нз-эра моделъннх систем, построенных на базе г-у .'-дуэльных изо-зрм метабо;ззирующих ферментов и способных загалгзировать со-гветствуюшзэ реакции биотрансформации.

Такой подход был реализован при выясненгг з:—юса о кон-ретной изотерме цитохрома Р450 человека, npznziisrnei участие окислительном метаболизме синтетического ;:-spczzsoro прэпэ-эта MA. Известно, что CYP3A4 катализирует 65- ггзрохеилировэ-ie эндогенных стероидов,-тестостерона и когггзолг. Поскольку зновным продуктом метаболизма MA в организме -=л:ззка являет-

4 6(3- гидрсксиметандростенолон, было выдвинугс —едположение

5 участии CÎP3A4 в этом метаболическом процессе. Г целью про-зрки этого предположения микросомная фракпгл дргзжевых кле-зк, экспрессирузвдих CYP3A4, была использована з £ермзнтатив-эй реакции гздроксилирования стероидов MA. и "Лз. - метилтесто-герона. Хрсмзтографический анализ методами 3SXC, едно- и дву-зрной ТСХ показал образование в реакции микрссоыного окисле-ля in vitre, катализируемой микросомами рекембннгнтяых дрож-эй, 6f3- гидроксиметандростенолона. Это соединэзие не образовалось в контрольных экспериментах с микрссоиаии дрозгкей, рансформирсзанных плазмидой без вставки кДНН СГРЗА4 (Рис.6).

Микроссмы дрожжей, экспрессировавших другую гзоформу ци-эхрома Р45С, а именно CÏP2D6, также не катаззгреззли гидро-силирование МН. Известно, что CYP2D6 не участвует з биотранс-ормацки стероидов.

Таким образом, с использованием рекомбннгатнкх дрожжей, родуциругацих цитохромы Р450 человеке, показгне участие кон-ретной изоформы монсюксигеназы в мэтаболизиг синтетического екарственного препарата - анаболического стзгснхнсго гормона А. Интересно отметить, что лекарственный npezrapsr сходной труктуры - 17а- метилтестостерон - не мет&5©ззнруется этой зоформой со сравнимой скоростью (см.схему 3).

h

I_______

OS 15 25

Время, мин.

Рис.6. Хроматографический анализ продуктов реакции in vitro: 1- экстракт реакционной смеси после окисления метандростеноло-на в присутствии микросом печени человека; 2- продукты реакции в присутствии микросомной фракции дрожжей, синтезирующих CYP3A4; 3- продукты реакции в присутствии микросомной фракции дрожжей, синтезирующих CYP2D6;

CYP3A4

CYP3A4

гСН,

Схема 3. (А) Гидроксилирование МА под действием -изоформы CYP3A4; (В) 17а- метилтестостерон.

Поскольку единственным различием между двумя этими соединениями является наличие у МА двойной связи в кольце А, можно предположить влияние конформации кольца А стероидного скелета на связывание с активным центром фермента. Решение вопроса об

час таи СУРЗА4 в метаболическом превращении МЛ открывает путь выработке оптимальной стратегии использования этого препара-а в зависимости от индивидуального уровня экспрессии изофор«ы УРЗА4 в печени пациентов.

Таким образом, предложенная система гетерологическсй ехс-рессии для моделирования метаболизма лекарственных соединений организме человека показала свои применимость, позволгз выя-ить специфическую изоформу цитохрома Р450 (СУ73А4), катализи-ующую биотрансформацию метандростенолонэ, лекарственного ггре-арата анаболического действия.

.3.7. Синтез тиопурин-цетилтрансферазы в клетках Б.сегеу!-1ае.

Тиопурин-метилтрансферазз катализирует метилирование ато-а серы в меркаптопурине и других пуриновых тиопроиззодных см.схему 4).

оль этого фермента з жизнедеятельности клетки и его эндоген-ые субстраты остаются неизвестными. Необходимость детального зучения факторов, определяющих активность этого фермента в канях и органах человека, связана с вагной ролью, которую он грает в метаболизме меркаптопурина (МР), тиогуанина (Ю) г ругих противоопухолевых и иммуносупрессорных препаратов. Как дин из эффективных препаратов при лечении острого лимфобласт-ого лейкоза, меркаптопурин составляет существенную долю от сех лекарственных средств, используемых при лечении этого за-олевания и его применяют ежеднезно в течение 2,5 лет. Саи еркаптопурин не обладает антилролдферативной активностью, и

его активация происходит в ходе анаболических реакций внутри клеток. Конечные продукты етих реакций, тиогуанозин- и де-зокситиогуанозинтрифосфат способны включаться в ДНК и РНК, нарушая их биологические функции (G.B.Elion, Science 1989: 24, 441-447). с другой стороны, внутри клеток проходит инактивация меркаптопурина вследствие реакции метилирования под действием ТРМТ, что приводит к образованию нетоксичного продукта. Вследствие узкого терапевтического индекса этого и родственных препаратов (тиогуашша и азатиоприна) низкий уровень активности ТРМТ может привести к тяжелой лекарственной интоксикации.

Фрагмент кДНК ТРМТ, содержащий открытую рамку считывания, был синтезирован методом ПЦР с использованием продуктов обратной транскрипции тотальной РНК из лимфоцитов человека в качестве матрицы (см.раздел 3.5. )• Полученный фрагмент был затем встроен в дрожжевую экспрессирующую плазмиду pYeDP, и полученной рекомбинантной плазмидой трансформировали дрожжевые клетки 2805. Цитозольную фракцию дрожжевых клеток, синтезирующих ТРМТ и мутантные формы ТРМТ (см. разделы 3.3.8., 3.5.2.) использовали для изучения каталитических характеристик и субстратных свойств ферментов.

3.3.8. Изучение субстратной специфичности и кинетических параметров ТРМТ человека, экспрессированной б клетках дрожжей.

Используя описанную выше эффективную систему синтеза мэ-таболизирующих ферментов человека в дрожжевых клетках, была приготовлена цитозольная фракция дрожжевых клеток - продуцентов ТРМТ человека, с помощью которой проводили изучение субстратных свойств и кинетических параметров реакции метилирования тиопуриновых соединений. Поскольку в дрожжевых клетках отсутствуют ферменты, способные метилировать тиопурины, дальнейшего фракционирования субклеточных фракций не проводилось. В табл.2 приведены значения Vmax, Km для MP, TG и для соединений, образующихся из меркаптопурина и тиогуанина в ходе анаболического процесса метаболизма. Для измерения кинетических па-

раметров были использованы спектрсфотометрический метод непрерывной детекции и анализ реакционной смеси методом ВЭЖХ. Есе производные тиопурина оказались субстратами для ТРШ), причем выяснилось, что оба исходен соединения (меркаптопурин и тио-гуанин) и их основные метаболиты (тиоинозинмонофосфат, ТШР и тиогуанозинмонофосфат, ТОМ?) обладают довольно похожими субстратными свойствами (см. табл.2).

Табл.2. Кинетические параметры реакции метилирования тиопури-нов и их производных, катализируемой ТРМТ человека, експрес-сированной в клетках дрожжей.

Тиопроизводное Vmax Km

нмол/мин/мг ТРНТ ЦМ

меркаптопурин 48 10,6

ТШР 31 25,7

тиогуанин 55 18,1

TGMP • 59 27,1

тиоинозин 89 55,1

дезокситиоинозин 22 12,7

тиогуанозин 32 26,1

дезокситиогуанозин 120 131,4

Таким образом, из сравнения кинетических параметров следует, что ТРМ'Т с одинаковой эффективностью взаимодействует как с тиопуриновыми гетероциклическими основаниями, так и соответствующими нуклеотидами, исключение составляет только дезокси-тиогуанозин. Следует отметить, что метилирование тиопуриноз под действием ТРШ) требует присутствия косубстрата S-аденозил-метионина (SAM) в качестве источника метальной -группы. В наших экспериментах концентрация SAM составляла 1шЫ.

Однако б условиях in vivo лимитирующим фактором этой реакции может являться SAM.

Поскольку при использовании и меркаптопурина, и тиогуани-на образование TGMP является ключевой реакцией, непосредственно ведусег к образованию предшественников ДНК и РНК, способность Т5Я? участвовать в реакции метилирования под действием ТРМТ весьте существенна.

Данные, полученные в кинетических экспериментах in vitro, получили подтверждение при анализе цитозольной фракции культуры лейхсгных клеток человека. При обработке клеток меркапто-пурином znz тиогуанином было отмэчено накопление в цитозоле как метилированного производного TIMP, так и метилированного производного TGMP. Таким образом, результаты анализа продуктов метаболизм» тлопуринов в клеточных системах согласуются с данными о субстратной специфичности и кинетических параметрах реакции из'.z—¿рования, катализируемой ТРИ из рекомбинантных клеток дрсзгзй.

3.4. Генетически обусловленные вариации активности ферментов метаболизма лекарственных средств.

Генетический анализ особенностей метаболизма ксенобиотиков, в той числе лекарственных средств, позволил выявить высокую степень изменчивости генов, кодирующих соответствующие ферменты у человека. Это, в• частности, приводит к существованию фармаког-енетического полиморфизма, т.е. проявлению различающихся фензтипических реакций на одни и те же лекарственные препараты. Одним из малоизученных ферментов, обуславливающих проявление фармакогенетического полиморфизма, является тиопу-рин-метилтразсфераза. Ранее было показано (Weinshirboum and Sladek, Ал.J.Hum.Genet. 1980: 32, 651-662), что для TPMT характерен г-енетический полиморфизм, причем около 89$ популяции белой расы проявляют высокую актизность етого фермента, примерно промежуточную (предполагаемые гетерозиготы) и 0,3% - являются медленными метаболизерами (ЫМ), т.е. активность

\

ТРМТ в тканях у них крайне низка.

К момеиту начала работы была клонирована кДНК из клеток карциномы прямой кишки человека и еъ нуклеотидная последовательность была определена (Honchel' et al., Mol.Pharmacol. 1993: 43, 878- 887), однако молекулярные механизмы, ответственные за снижение активности ТРМТ, не были известны.

3.4.1. Идентификация инактивирущих мутаций у больных с пониженной активностью ТРМТ.

Тотальная РНК была выделена из лимфоцитов 8-летней больной, закончившей курс терапии по поводу острого лимфобластно-го лейкоза, у которой ранее была обнаружена врожденная недостаточность ТРМТ (0,8 ед. акт./мл еритроцитов). У этой больной

развилась острая интоксикация при 'лекарственной терапии обыч-

о

ными дозами меркаптопурина (75 мг/м в день). Образцы крови были получены также у отца и матери больной, активности ТРМТ у которых указывали на гетерозиготный фенотип в отношении ТРЫШ (соответственно 5,6 и 3,6 ед.акт./мл эритроцитов). Основываясь на опубликованных данных о нуклеотидной последовательности кДНК ТРМТ из клеток карциномы прямой кишки человека, были синтезированы праймеры для амплификации кодирующего района кДНК ТРМТ (см. Табл.3).

Фрагмент кДНК ТРМТ из печени человека (соответствующий основаниям -44 - 806) был синтезирован с помощью праймеров 1 и 2 и использован в качестве зонда для анализа экспрессии мРНК ТРМТ в лимфоцитах больной и ее родителей, а также в лимфоцитах здоровых добровольцев с нормальным уровнем активности ТРЫТ в крови (11 и 19 ед'.акт./мл эритроцитов).

Нуклеотидная последовательность кодирующей области кДНК ТРМТ из тотальной РНК печени человека, равно как и выделенной из лейкоцитов больного с активностью ТРМТ 8,3 ед.акт./мл эритроцитов, полностью совпала с опубликованной ранее нуклеотидной последовательностью кДНК ТРМТ из культуры клеток

Габл.З. Первичная структура олигонуклеотидных драйверов, использованных для изучения мутантных аллелей ТРЬЕГ.

}Го Последовательность праймера Положение

в кДНК*

ос^-саа-ААО-АСА-ТАТ-аст-гат-ОАС-АС -44/-19

СА:-0СТ-'т-аСА-ТАА-Г1"Т-ТСА-АТ"Т-СС1'-С 779/ 806

3 а"5~-аа-1;ас-£ас-'1;са-с1а-гаА-СС1-й0А-

ТСА-АТО-ОСА-АС 466/ 483

1 АПк-АСк-аАа-таа-аоА-йас-иас (**)

= с^-агс-саа-аАТ-СОА-ТСО-ТАС-ААС-ААС-

Т-1С'-АСТ-ТОА-САТ-те 1/ 31

г с^-аа^'ЬсАСОС-ИЭ-АОС-АТА-АТШ-таС 787/ 805

^Остаток А в гнициаторном кодоне имеет положение (+1); строчными буквами обозначены последовательности, не имеющие гомологии в гене

Ж*

Последовательность праймера 4 комплементарна фрагменту ин-трона 5 и не представлена в кДНК;

карциномы прямой кишки (далее обозначена как Т?ЫТ*1). Этот факт находится в согласии с известными данными о том, что активности ТРКГ в прямой кишке, лейкоцитах и печени коррелируют (?ас111с1 еъ а1., 1993).

Анализ РНК методом гибридизации показал, что в крови больной и ее родителей синтезируются транскрипты ТРИ! такой же длины, что и у здоровых добровольцев, хотя и в меньшем количестве (Рис.7).

Эти результаты позволили предположить, что и у больной, и у ее родителей происходит транскрипция и процессинг РНК, а на-

с небольшими делзпиа).

^IIIVI

■ щ т • т

ёшш»**

I 2 з ' 5 -:

41 ' ¡f "

у sb. i ■

EL

2 3 4 5 i

/.////у

/ / ✓ / i <f

Анализ образцов генсинс; каких-либо изменений в рг~: тов. Это навладение также го: ствии значительных изменензЗ Анализ нуклеотиднс2 го о. с дефицитом Г?ЫТ позволгл о:: той тзамке считывания ТИП

Рис.7. Отноггсгельный уровень синтеза мРН! 7У1С z зктгнность ТРМТ у индгнз^тт^оз с различным фенотипом -PjC. (А) - гибридизация РНК о радиоактивно -*ечезоЗ кДНК ГРМТ (гшжнее фэто з; о.-зтонуклзсти-дом, компле)£2!ггг2Нм 285 рлбо-сомной РНК зетгсее фоте.. 1 -тотальная EES аз пзчени человека; 2,3 - тегглъная РНК из лейкоцитов чзлезека (контроль); ; — остальная РНК из лейкоцитоз "слънзй с низкой активностью Z71SZ: 6 - тотальная РНК 13 лг2к:эцитсз ее отца и матерт. 3) - относительный уроэтнь J3JTC ОСЕОЗНЫХ полос мРНК ITifH го еле нсгыгли-зации относгте.т~-~~ интенсивности 28S рибогеиЕТй РНК. :) -Активность ZT!S1Г з эритрезггах у тех же инлзззеттмов. ICi. -данные отсутгтз™7тт.

! ДНК. по методу Ггу-з-гонз не вкязил сложении рпнтртгт- у --„-г фрагигн-:держивало предгелеззазз об стоут-в структуре ген=.

лгдовательности ?2?Е:~. сольной

Еаружить точковуг ^ттз'зпп в с~<ры-S38C) (см.рис.8 . что ^ривс^ло к

аминокислстзг2 х1а.='*—>?го в аминокислотной последова-

тельностз й'ТШ.

Обн£руга~г.; куг-—г.=. была единственной во всех четырех независимо выхг-гнЕза: —епарагах кДНК из крови этого пациента. Выявленная иуггнтЕгя ^сриа 'ГРИГ ( далее обозначенная как ТРИТ*2) гнла сггргзг^гргзсзгна в гетэрологичэской экспрессирую-щей системг 3.5 .

X

■с гея титалг

ТСОТТТССАйАС •гзе

Шш

— РЬ( А1> А$р

«С-УСК .Т53 ТТТ ЭСА вАС....З'

1

тзтт Т53 ТТТ ССА САС

Рто

Рис.8. ТЕМГ -С тг-7^ :1?М1*1) и мутантной формы (ТРМТ*2). (А) анализ -г зг-с^здсзательности фрагмента ОРС ТРМТ,

полученного з рг-зу^т^Гг клснгрования продуктов обратной транскрипции 2 игз^гдттсег амплификации методом ПНР тотальной РНК из лейксгггтз - Эпгг-тгк 1 з инициаторном кодоне имеет положение (-1). '2 нут-Лг-г^ггнгя последовательность фрагмента (232-243) хЛН?. лззсгс ггпа и мутантной формы и соответ-

ствующая р.у;--:.--*/ --тг'тнг.; гс-следозательность фрагмента кодируемого белка. ьптагзл подчеркнута.

р8зр£:о:°~^ z^тг~z был использован для выявления молекулярных Ы5хаюг=г«с5, ¿гэглсс з основе недостаточности ТРШ), у других па^гентсз, ~ т- 1 ' на лечении по поводу острого

лиифобластного лейкоза в клинике Детского исследовательского госпиталя. У второго из пациентов в ходе исследований го разработанной методике было выявлено два мутантных аллеля ШР1С, один из которых оказался идентичен Т?!Тж2. Второй мутантн^й аллзль содержал две точковке мутации G460A и A719G, призодгз-шие к аминокислотным заменам Ala"'—>Thr z Шуг^®—>Cys. Этот аллель получил обозначение ТРМТ^З. 3 ходе дальнейшего обследования больных, поступивших на лечение в госпиталь, i-c¡-тактзый аллель ТРМТ*3 был обнаружен ese у одной больной, фено-тишчески проявлявшей непереносимость меркаптопурина. Белка, соответствующие обоим мутантным аллелям, были экспресснровгны в гзтерологической системе с использованием клеток Б.сегет!-sias.

3.5. Механизм снизгения активности,белков, кодируемых мутантами аллелями TFMT.

Обнаружение точковых мутаций в локусе TFÜT у пациентов : низкой активностью ТРЫТ позволило предположить, что именно chz лежат в основе ннрушения метаболизма меркаптопурина в организме гтих пациентов. Для проверки этого предположения были сконструированы рекомбинантные штаммы дрожжей, 5кспрессирутт~де как TFMT дикого типа, так и мутантные аллели- Для детального анализа влияния точковых мутаций на активность ТРЫШ были также получены варианты кДНК, содержащие одну из мутаций GicQA, A719G.

3.5.1. Конструирование экспрессирупцих рекомбинантных плазмгг.

кДКК, кодирующие тиопурин-метилтрвзсферззу, были синтегг-ровезы методом ПНР после реакции обратной транскрипции тотальной РНК, выделенной из лимфоцитов и гепатоцитов больных ки Нэтского исследовательского госпиталя (Мемфис, ;Ж).

Конструирование соответствующих зкслрессируюиих вектсрсз проводили методом ПЦР, причем одновременно проводилась мсдифг-

кация 5"- и З'-концевых посл-г^озательзоогей с целью введеззи сайтов рестрикции ВатН1 и Есс?1 и модзйекзция нуклеотидной пг-следоветьхьяости, примыкапцег к иницгггс.-рзому АТС-кодону (за'., раздел 3-3-)• При выращивания :<--еток £.:.егеУ1з1ае, трансфоризс-ровантгет ~екомбинантными экс—ессиругшмх плазмидами, в срелн , содержаш± галактозу, в клетках происхгхгло накопление спе=с-фическо£ к?НК. Анализ тотальз;2 РНК шпдсм Норзерн- гибрзсгх-зации гслззердил гомологичноегь синтеззггуеыой РНК соответетзт-ззщей кЛЗ. введенной в плазшглу (см.рзк. 5 ).

Е зиетках, трансформированных вектором без вставки, зетствут.г.я мРНК не синтезирсзглась.

В

I? <1

H

о. S

- 18

iy'iS;

— 0.5 <э (ТРОТ)

1

Г г 1

I "II

о*

Рис.S Анализ тотальной дрсяг-жевой УгУ. и ферментативной ак тивногти ï?MT в клетках дрожжей, трансформированных рексм бинантной плазмидой с кДНК ТРМТ хгзеого типа (левая дсрс.а: ка ), ыутаятной кДНК ТРМТ*2 ' (центральная дорожка) и экс-прессгрувсим вектором без вставгзг (правая дорожка). (А ) - гибридизация с 18S рРНК-специничным зондом; (В) - гж5-ридизалия с кДНК ТРМТ; (С) -активность ТРМТ в лизате дрсас-жевых клеток, wt- дикий тип; mut- ыутантная форма; cont-контрель;

3-5-2. гзучение влияния точковых иутацай на активность ТРМТ.

Для изучения влияния мутзигй на каталитическую активность ТРМТ презе лились эксперимента по экспрессии аллелей ТР!£Т*2 н ТРШТ*3 з клетках дрожжей. Кроме того, были сконструированы дрожжевые экспрессирующие плазмады, в которых кДНК ТРМТ содер—

3 i

жала лишь одну из двух мутаций, присутствующих в аллеле ТРМТ*3. Ферментативная активность белка, кодируемого ТШТ*1 (дикого типа) оказалась равной 113-123 ед.акт./мг растворимого белка, тогда как активность мутантной формы ТРМТ*2 была менее 1 ед.акт./мг (1 ед.акт. катализирует метилирование 1 нмол мер-каптопурина за 1 час) В контрольных клетках, трансформированных плазмидой без вставки кДНК, активности ТРМТ зарегистрировать не удалось (Рис.9). Сравнение количества синтезированных в клетке мутантного белка (кодируемого ТШТ*2) и белка дикого типа (кодируемого ТРМТ*1) методом иммуноблотинга показало примерно двадцатикратное снижение уровня мутантного белка. Такое снижение стабильности может быть вызвано разворачиванием полипептидной цепи в результате замены относительно подвижного аминокислотного остатка аланина на жесткий пролин, в котором пятичленный боковой цикл вызывает дополнительный поворот полипептидной цепи. Любопытно отметить, что каталитическая актив-

80

ность фермента с заменой Ala —>Рго хотя и резко снижается, все же остается доступной измерению. Это может говорить о том, что нарушение пространственной структуры белка, вызванное мутацией, очевидно, не приводит к полному разрушению активного центра фермента.

Анализ кинетических параметров ТРМТ*2 показал, что значения Km и Vmax в реакции метилирования 6-меркаптопурина увеличены (соответственно 160 мкМ и 150 нмол/мин/мг белка) по сравнению с диким типом (11 мкМ и 48 нмол/мин/мг белка). Увеличив Km в мутантном белке может отражать слабое связывание субстрата с ферментом.

Гетерологическая экспрессия кДНК ТРМТ*3 в клетках дрожжей приводила к примерно такому же уровню синтеза соответствующей мРНК, что и экспрессия ТРМТ*1 (дикого типа). Другими словами, наличие точковых мутаций не оказывает заметного влияния на транскрипцию мРНК ТРМТ в клетках дрожжей. Однако уровень белка ТРМТ был снижен в 400 раз, что указывает на посттранскрипционный механизм снижения активности ТРМТ. Анализ экспрессии ТРМТ в штаммах, кДНК которой содержала лишь одну из мутаций

(соответственно, G460A или A719G), показал, что уровень мРНК в втих штаммах также был примерно одинаков. Однако уровень белка в варианте был снижен по сравнению с диким типом в 4

раза, тогда как в варианте ТРМТу^^ примерно соответствовал уровню белка в диком типе. Эти данные указывают, что присутствие лишь одной из мутаций (G460A, A719G) в небольшой степени снижает уровень белка, тогда как присутствие обеих мутаций приводит к значительному уменьшению уровня ТРМТ. Активность аллеля ТРМТ*3 не удалось зарегистрировать , однако мутантные формы 1РМТ4б0 и ЕРМТ^д проявляли небольшую метилтрансферазную активность. Количество метилированного тиопурина определяли методом ВЭЖХ, при этом было обнаружено, что мутантная форма TPM'T^gQ характеризуется повышенной Утах (в 4 раза) по отношению к б- меркаптолурину и S- аденозилметионину, однако Km для белка с данной мутацией была существенно выше (в 46 раз для меркаптопурина, 208 раз для S- аденозилметионина). Соответствующие кинетические параметры для мутантной формы ШРМШ^^ несущественно отличались от таковых для ТРМТ дикого типа. Таким образом, наибольший эффект на метилтрансферазную актив-

154

ность оказывает замена Ala —>Thr. Поэтому в дальнейшем был разработан метод обнаружения этой инактивирующей мутации в геноме больных (см.раздел 3•4.6.).

Было обнаружено существенное различие в стабильности активной формы синтезированных мутантных форм ТРМТ по сравнению с диким типом: обе мутантные формы, TPMT^gQ и ТРМТ^д, быстро теряли каталитическую активность цри 37° (за 4 часа инактиви-ровались практически полностью), тогда как около 30% активности ТРМТ дикого типа сохранялось после 12 часов инкубации в тех же условиях. Анализ методом иммуноблоттинга показал, что при инкубации не наблюдается образование цродуктов деградации белка. Можно предположить, что инактивация ТРМТ связана с нарушением пространственной организации белка в условиях инкубации.

3.6. Молекулярная диагностика нарушений метаболизма лекар ственных средств.

Низкая активность метаболизирующих ферментов у ряда больных обусловлена наличием в геноме аллелей, несущих точковые мутации. Данные о природе и положении мутаций дают возможность обнаружить их еще до начала лекарственной терапии и таким образом предупредить возможные токсические эффекты. Наиболее важным элементом систем диагностики для выявления аллелей является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), использующий в качестве образца ДНК или РНК из различных тканей организма.

3.6.1. Транскрипция гена СУР2Б6 в лимфоцитах.

Наибольшее количество СТР2256 синтезируется в печени, основном органе, осуществляющем метаболизм ксенобиотиков. Уровень синтеза этой изоформы цитохрома в других тканях, в частности, лимфоцитах периферической крови, весьма низок. Тем не менее, высокая чувствительность метода ПЦР позволяет обнаружить синтез соответствующей мРНК в лимфоцитах и таким образом дает принципиальную возможность выявить больных с нарушением синтеза С7Р2Б6 путем анализа легкодоступных клеток крови.

Для выявления транскрипции изоформы цитохрома Р450 СУР2В6 нами было предложено использовать в качестве объекта исследования суррогатные клетки, т.е. вместо клеток печени с высоким уровнем транскрипции этого фермента использовать более доступные клетки периферической крови. Этот подход был использован при изучении транскрипции мРНК СУР2В6 у пациентов Института профилактики неинфекционных заболеваний (Москва) с фенотипом БМ (быстрый метаболизер) и ММ (медленный метаболизер) дебризо-хина, лекарственного средства антигипертензивного действия. Это лекарственное соединение метаболизируетоя изоформой цитохрома Р450 СУР2Бб, и пациенты со сниженной активностью этого фермента могут испытывать серьезную лекарственную интоксикацию. Биохимические тесты не позволяют тестировать уровень ак-

тивности СУР2Б6 в лимфоцитах. Для обнаружения мРНК СУР21>6 мы использовали праймеры, комплементарные участкам 2070-2090 и

2912-2930 в экзонах 4 и б хромосомного гена СУР2Б6 (см.рис.10)

(а)

ехоп 4 ехоп 5 ехоп 6 —| 432 Ьр (" | 189 bp (--

26 bp intron 4 177 bp intron 5 35 ьр

(б)

С¥Р2В6 tgaAGGAGGAGTCGGGCTTTCTGCGCGagg

(ЛР2Ш ...................С.......7ТТ (1)

СУР2Ш ...........СШ......Т.. .Т.А.. .а

СУР2Б6 ооотоАаАасАастасААтаАшаАйаа

(НР2Ш ........................Т.. (2)

(ЛР2Ш ...........................

Рис.10, (а) - фрагмент гена СУР206. Сплошной линией изобра жены интроны, прямоугольниками - екзоны. Заштрихованные области акзонов соответствуют последовательности, амшгифицируемой в ходе ПЦР при использовании в качестве матрицы кДНК; (б) - нук-леотидные последовательности генов СТР2В6, СУР2Ш и СУР21)8Р, соответствующие участкам связывания праймеров 1 и 2. Нуклео-тида, совпадающие в разных генах, обозначены точками (приведено по Кшига е1; а1., 1989).

Участки связывания цраймеров были выбраны таким образом, чтобы амплификация данного участка ДНК давала возможность обнаружить аномальный сплайсинг в районе 4 и 5 интронов, поскольку это может являться цричиной фенотипа ММ (Skoda et al., Ргос. Natl.Aoad.Soi.USA 1988: 85, 5240-5243). Затем, в случае контаминации препарата ДНК хромосомной ДНК продукт амплификации должен был отличаться по длине от продукта амплификации кДНК, вследствие присутствия интронов. Наконец, выбранный состав праймеров должен был обеспечить специфическую амплификацию кДНК продукта гена CYP2D6, но не псевдогенов CYP2D7 и CYP2D8P.

Подобранные условия реакции привели к синтезу фрагмента, соответствующего по длине расстоянию между участками связывания праймеров. Амплификация с использованием в качестве матрицы ДНК из того же источника привела к синтезу фрагмента длиной 859 п.о., что соответствует сумме длин интронов 4 и 5 (Kimura et al., Am.J.Hum.Genet. 1989: 45, 889- 904). Далее с использованием подобранных условий в реакцию амплификации вводили кДНК, полученную обратной транскрипцией тотальной РНК из лимфоцитов пациентов с фенотипом Ш и ММ по дебризохину. Результаты анализа показали, что в случае БМ в лимфоцитах удается обнаружить синтез мРНК CYP2D6, тогда как в клетках крови ММ соответствующая мРНК не была обнаружена. Аутентичность синтезированного фрагмента была подтверждена методами гибридизации и определения нуклеотидной последовательности. Отсутствие амплификации мРНК CYP2D6 пациента ММ может быть связана с наличием у него мутации типа CYP2D6-D (полная деления гена). Другой возможной причиной может служить какая-то не описанная мутация, например, в области связывания праймеров либо нарушающая транскрипцию мРНК. Таким образом, использование указанных праймеров позволяет избирательно амплифицировать фрагмент кДНК CYP2D6, используя в качестве анализируемого материала клетки периферической крови. Разработанный подход может быть использован для изучения экспрессии етой изоформы цитохрома Р450 in vivo.

3.6.2. Детекция аллелей ТРШТ*2 и ТРМТ*3 в геноме человека.

Полученная информация о природе мутаций в неактивных аллелях ТРМТ была далее использована при разработке методов молекулярной диагностики нарушений метаболизма меркаптопурина. К настоящему времени структура хромосомного гена ТРЫТ*1, локализованного на хромосоме 6 (6р22.3, Czumlanski et al., Ргос. 4th ISSX Meeting, 1995 p.102) известна лишь частично. Разработка метода детекции мутантных аллелей затруднена тем, что в геноме человека присутствует несколько (по приблизительным оценкам,

5-6) гомологичных последовательностей, представляющих собой цроцессированные псевдогены. Обнаружены также две интрон-содержащие последовательности, гомологичные ТРМТ. Одна из етих последовательностей, видимо, представляет собой функционально активный ген ТРМТ, тогда как црирода второй интро-нированной последовательности остается неизвестной. Присутствие высокогомологичных ТРМТ последовательностей в геноме человека затрудняет разработку методов выявления инактивирующих мутаций. В табл.4 суммированы сведения о природе точковых мутаций, соответствующих им аминокислотных замен и соответствующих рестриктаз, которые могут быть использованы при анализе кДНК пациентов с дефицитом ТРМТ.

Обнаруженная инактивирующая мутация 0238С (ТШТ*2) приводила к нарушению сайта узнавания рестриктазой Си{ЯГ, что давало возможность обнаруживать эту мутацию методом анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Однако вследствие низкой активности данной рестриктазы не удалось добиться

Табл.4. Инактивирухщие мутации, обнаруженные в кДНК ТРМТ больных с пониженной активностью ТРМТ.

Аллель Нуклеотидная Аминокислотная Изменения в

замена замена сайте рестрикции

ТРМТ*1 шt ТРМТ*2 02380

ТРМТ*3 0460А

А719й

wt

А1а->Рго Си{й1 нарушение

. .ТССА..->..ТССА.

А1а->Т11Г ^ Шю1 нарушение

..ее(п)7ас..->..АС(п^йс.

Туг->Суз Асс1 возникнов.

..АТСТАС..->..О^СТАС.

полного гидролиза фрагмента - дикого типа. Это в свою очередь не позволило дискриминировать гомо- и гетерозиготное состояние аллеля ТМТ*2.

Данные о присутствии аллеля ТРМТ*2 были получены в результате определения первичной структуры кДНК после клонирования продуктов амплификации. В результате анализа трех пациентов с низкой активностью ТРМТ были обнаружены два пациента - носителя аллеля ТРМТ*2. Геномная ДНК одного из етих пациентов содержала два мутантных аллеля - ТРМТ*2 и ТРМТ*3. Анализ второго пациента выявил наличие только аллеля ТРМТ*2.

Обнаруженные мутации 6460А и А719С1 также приводили к изменению длины продуктов рестрикции соответствующих фрагментов: мутация 0460А нарушала сайт узнавания рестриктазы Мию1, а наличие мутации А7190 приводила к возникновению сайта узнавания рестриктазы Асо1, что позволяло использовать метод анализа длины фрагментов рестрикции для обнаружения аллеля ТРМТ*3 (табл.4). Как было показано выше, наличие мутации 0460А приводило к наиболее существенному снижению активности ТРМТ, поэтому был разработан метод детекции этой мутации в геноме человека. Используя полученные данные о структуре хромосомного гена, были синтезированы праймеры, комплементарные соответственно участкам интрона 5 и екзона 6 гена ТРМТ (см.табл.3). Амплификация геномной ДНК из лимфоцитов пациентов приводила к синтезу фрагмента длиной 304 п.о. Последующий гидролиз продукта амплификации рестриктазой Мшо1 приводил к образованию фрагментов 267 и 37 п.о. в случае отсутствия мутации 0460А (т.е. дикого типа ТРМТ*1). Фрагмент ДНК, полученный в результате амплификации мутантного аллеля, не гидролизовался рестриктазой. У пациентов с промежуточной активностью ТРЫТ (предполагаемые гетеро-зиготы) наблюдалось црисутствие двух полос, соответствующих наличию фрагментов длиной 267 и 304 п.о.

3.6.3. Определение частоты аллеля ТРМТ*3

Полученные данные о наличии мутантных аллелей у больных позволяют предположить, что, подобно другим генам ферментов метаболизма лекарственных средств, существует ограниченное чи-

ело аллельных вариантов ¡ГРИГ. В пользу етого говорит то, что при анализе 3 неродственных пациентов с низким уровнем активности ТРМТ аллель ТРМТ*2 обнаружен у двух пациентов (пациент 1 и пациент 2), а аллель ТРМТ*3 - также у двух пациентов (Пациент 2 и пациент 3). Проведение генотипирования у 24 неродственных больных белой расы с пониженной активностью ТРМТ (т.е. у предполагаемых гетерозигот и мутантных гомозигот) в клинике Детского исследовательского госпиталя позволило выявить 17 пациентов - носителей аллеля ТРМТ*3. Таким образом, учитывая, что большинство обследованных больных имели промежуточную активность ТРМТ (предполагаемые гетерозиготы), частота етого аллеля среди всех аллелей, кодирующих неактивный белок ТРМТ у населения Северной Америки, составляет примерно 70%.

Далее, был обследован больной, активность ТРМТ у которого свидетельствовала об инактивации обоих аллелей. Анализ геномной ДНК и кДНК етого пациента выявил, что оба аллеля являются аллелями ТРИТ*3. Таким образом, в настоящее время выявлены пациенты с генотипом ТРМТ*2/ТРМТ*3 и ТРМТ*3/ТРМТ*3. Хотя несомненно, дополнительные мутации в локусе ТРМТ будут обнаружены, основным мутантным аллелем у популяции белой расы является -ТРШТ*3. Учитывая важность препаратов меркаптопурина для лечения острого лимфобластного лейкоза и возрастающее применение азатиоприна для иммуносупрессии при пересадке органов, метод анализа геномной ДНК представляет собой перспективный путь выявления пациентов с пониженной активностью ТРМТ.

3.7. Экспрессия ТРМТ в организме человека.

Используя в качестве зонда радиоактивно меченый фрагмент ТРМТ, соответствующий открытой рамке считывания, определяли уровень синтеза мРНК ТРМТ в различных тканях организма человека (см.рис.11).

Как показал анализ методом Норзерн-гибридизации, синтез специфической мРНК происходит во всех исследованных тканях, цричем максимальное количество вкспрессируется в печени и поч-

кь

9.57.54.42.41.35-

123456 78 9

Р7Ч

ic.11. Анализ ро1у(А)+ РНК, выделенной из различных тканей зловека, методом Норзерн-гибридизации. В качестве зонда ис-зльзовалась кДНК ТРМТ. В кавдую дорожку нанесено цриблизи-гльно 2 мкг РНК. Образцы: 1, сердечная мышца; 2, мозг; 3, -нацента; 4, легкие; 5, печень; 6, скелетные мыппда; 7, почки; , поджелудочная железа; 9, лейкоциты периферической крови.

зх. Во всех тканях наблюдается синтез транскшггов длиной око э 1 т.о., 1,7 т.о. и 3,2 т.о. Относительное содержание транс-риптов длиной 1,7 т.о. и 3,2 т.о. составляет примерно 1:2, эличество транскрипта длиной 1 т.о. значительно меньше. Эти элосы проявлялись также при гибридизации поли(А)+-фракции, зделенной из разных тканей организма и, следовательно, не яв-эются артефактом гибридизации. Образование транскриптов разиной длины можно, видимо, объяснить наличием нескольких сиг-элов полиаденилирования в 3'-нетранслируемой области мРНК -?МТ. Вторым вероятным объяснением следует считать альтерна-авный сплайсинг. В пользу етого предположения говорит обнару-зние нескольких последовательностей, полученных в результате тонирования продуктов обратной транскрипции мРНК ТРМТ и со-зржащих делеции, точно совпадающие с границами екзонов/ ин-ронов хромосомного гена ШРМГ. Следует отметить, что уровень ранскрипции различается в разных тканях, т.е. находится под

контролем тканеспецифических факторов. Присутствие ТРМТ в столь различных и высокодифференцированных клетках как клетки мозга, мышц и поджелудочной железы, указывает на важную биологическую роль этого фермента.

3.7.1. Синтез слитого белка GST-TPMT в клетках E.coli.

Поскольку выделение чистого препарата ТРМТ, пригодного для приготовления антител, было затруднено в связи с нестабильностью белка в высокоочищенном состоянии, нами была сконструирована рекомбинантная плазмида pGî для синтеза слитого белка GST-TPMT. В продукте экспрессии такой плазмида ТРМТ синтезировался в составе непрерывной пептидной цепи, в которой N-концевоЙ пептид представлял собой глутатион-З-трансферазу (GST) из Schistosoma ¡japonicum. Синтезированный клетками E.coli слитой белок выделяли методом аффинной хроматографии на глутатион-сефарозе в практически гомогенном состоянии за одну стадию очистки. Такой слитой белковый продукт ТРМТ оказался неактивным и не катализировал реакции метилирования меркапто-пурина. Однако GST в таком слитом белке сохраняла ферментативную активность, которая была использована для тестирования синтеза целевого продукта. После расщепления тромбином аутен-

-GTT-CCG-CGT-GGA-TCC-AAA-ATG-GAT-GGT-ACA-AGA-ACT-TCA-CTT-GAC--Val-Pro-ArK-Gly-Ser-Lys-Met-Asp-Gly-Thr-Arg-Thr-Ser-Leu-Asp-* mël; asp gly fhr arg £Er ser leu asp

-ATT-GAA-GAG-GAG--Ile-Glu-Glu-Glu-ilè glu glu glu

Рис.12. Частичная нуклеотидная последовательность pGT и соответствующий ей фрагмент аминокислотной последовательности слитого белка. GST-TPMT, синтезированного в клетках E.coli. Подчеркнуты аминокислотные остатки, обнаруженные на N-конце фрагмента слитого белка после расщепления тромбином. Строчными буквами показаны аминокислотные остатки, находящиеся на N-конце ТРМТ. Звездочкой указано место расщепления тромбином.

ггшость полипептидной цепи ТРМШ доказывали путем определения щшокислотной последовательности N-концевого пептида методом эградации по Эдману (см. рис.12).

Полученный слитой белок был выделен в препаративных коли-эствах и в дальнейшем использован для иммунизации кроликов с элью получения антисыворотки. Поскольку поливалентная сыворо-<а, полученная в результате иммунизации слитым белком, могла авать перекрестные реакции с другими белками, проводили очис-ху антител методом аффинной хроматографии последовательно на элонках с иммобилизованными GST, а затем слитым белком GST-РМТ. Полученные в результате такой очистки антитела проявляли ясокую специфичность по отношению к ТРМШ человека и в даль-зйшем были использованы для изучения экспрессии этого белка в рови новорожденных (см. раздел 3.7.2.).

.7.2. Определение уровня синтеза ТРМТ в организме человека.

Используя поликлональные антитела, полученные к слитому злку GST-TPMT, проводили параллельное сравнение уровня синте-э белкового продукта в различных тканях организма человека зм.рис. 13).

Рис.13. Анализ белковых фракций из различных тканей человека методом иммуноблоттинга, с помощью очищенных антител к слитому белку ОБШ-ТРМа!. (1 )-мозг; (2)- сердечная мышца; (3)- почки;(4)- легкие; (5)-скелетные мышцы; (6)- печень;

Анализ методом иммуноблоттинга также позволил подтвердить

экспрессию ТРМТ в различных типах клеток организма человека, причем максимальное содержание белка опять-таки наблюдалось в основных органах метаболизма - печени и почках. Эти данные, помимо информации о регуляции синтеза ТРМТ в разных типах клеток, также важны для понимания фармакологического действия меркаптопурина на различные органы человека.

Помимо экспериментов по выяснению тканеспецифической экспрессии ТРМТ, изучался также вопрос о влиянии онтогенетических факторов на синтез этого белка. Хорошо известно, что в неона-тальном периоде активности многих ферментов резко измененены по сравнению с активностями в фетальных и постнеонатальных тканях. Поэтому нами была изучена экспрессия ТРМТ в эритроцитах новорожденных с использованием антител против слитого белка СБТ-ШРМТ.

Рис.14. Анализ лизатов эритроцитов из крови трех взрослых и четырех новорожденных пациентов методом иммуноблот-тинга. Стрелкой отмечено положение, соответствующее подвижности рекомби-нантного белка ТРМТ. Цифры под каждой дорожкой соответствуют активности ТРМТ (ед. акт/ мл еритроцитов) Нижняя панель показывает

корреляцию между активностью ТРМТ и содержанием белка ТРМТ, определенного методом имму-ноблоттинга. Кружками отмечены данные, относящиеся ко взрослым, квадратиками - к новорожденным.

Средняя активность ТРМТ в эритроцитах новорожденных оказалась равной 25,3 ед/мл эритроцитов, что на 50% выше чем у

Взрослые Новорож.

а Ь с <3 е ( д

ТРМТ-

АКТИВНОСТЬ ТРМТ 15 23 17 15 30 25 21

8 9 10

ТРМТ белок

зрослых той же расы (р<0,001). Анализ лизатов эритроцитов ме-эдом иммуноблоттинга показал, что содержание белка ТРМТ у но-эрожденных младенцев действительно выше, чем у взрослых, призм это увеличение коррелирует с повышенной активностью ТРМТ г =0.63; р=0,03). При том, что активность ТРМТ в новорожден-

о

IX существенно выше, распределение активности коррелирует с знетическим полиморфизмом, ранее замеченным у взрослых рис.14).

ВКЛЮЧЕНИЕ

Используя метод обратной транскрипции и полимеразной цеп-эй реакции, удается получить кДНК ферментов метаболизма чело-зка из легкодоступных клеток периферической крови (а не, на-зимер, образцов печени), что делает возможным изучение редких

мутантных форм таких ферментов. Синтезируя редкие и мутант-1е формы ферментов метаболизма в гетерологической системе, дается выяснить механизмы нарушения процессов биохимической рансформации ксенобиотиков в организме человека. В результате равнения ряда ферментов метаболизма, относящихся к разным 1ассам (например, мембран- связанные монооксигеназы и июкуронозилтрансферазы, цитоплазматические Ы- ацетилтрансфе-ззы и тиопурин- метилтрансфераза) выявлены общие закономерно— ги: полиморфизм активности ферментов вызван существованием ,гтантных аллелей, содержащих единичные замены в кодирующей эсти гена или на границе интрон-екзон. Для каждого из таких элиморфных ферментов обнаружено ограниченное число мутантных ялелей, причем часто один из аллелей оказывается доминирую-1М. Так, в случае СТР2В6 около 75% процентов мутантных алле-зй представлены аллелем СУР2Т)6-В, а у ТРМТ более 10% неактив-IX аллелей представляют собой ТРМТ*3.

Факторы, способствующие возникновению и поддержанию в шуляции мутантных аллелей ферментов метаболизма, в настоящее ремя неясны. Видимо, пролить свет на это явление поможет ана-13 гомологичных ферментов в других организмах Еилогенетический анализ) и сравнение с ферментами, катализи-

ругацими однотипные реакции с эндогенными субстратами. Например, при изучении тиопурин- метилтрансферазы особый интерес для сравнительного анализа представляют метилтрансферазы других классов.

В заключение следует отметить важный прикладной аспект разрабатываемой проблемы: моделирование отдельных стадий биохимической трансформации ксенобиотиков и создание диагностику-мов для выявления нарушений их метаболизма существенно снижают риск осложнений при использовании лекарственных препаратов в медицине.

выводи

1. Разработана новая стратегия изучения полиморфизма ферментов метаболизма ксенобиотиков человека, основанная на использовании индивидуальных форм метаболизирующих ферментов и их мутан-тных вариантов, синтезированных рекомбинантными клетками Sac-charomyces cerevisiae.

2. Функционально активные ферменты метаболизма, относящиеся к двум различным классам (мембран-связаные, гем-содержащие .белки -изоформы цитохрома Р450 и цитозольный белок - тиопурин- ме-тилтрансфераза) были синтезированы в гетерологической системе на основе Saccharomyces cerevisiae. Полученные таким образом ферменты проявляли субстратную специфичность и каталитические характеристики, близкие препаратам из тканей и органов человека.

3. Выявлен молекулярный механизм инактивации тиопурин- метилтрансферазы человека. Показано, что дефицит тиопурин - метилтрансферазы у ряда индивидуумов обусловлен наличием полиморфных аллелей, несущих точковые мутации в кодирующей части гена. Определена нуклеотидная последовательность кодирующей части аллелей ТШТ*2 и ТРМТ*3.

4. Методом направленного сайт-мутагенеза и гетерологической экспрессии в клетках Saccharomyces cerevisiae показано, что обнаруженные мутации приводят к снижению активности тиопурин-ме талтрансферазы.

5. Исследованы свойства тиопурин- метилтрансферазы человека,

репрессированной в клетках Б.аегеу!в1ае. Определены кинети-:еские характеристики реакции метилирования тиогруппы тиопури-юв и их производных (в том числе тиоинозинмонофосфата и тио-•уанозинмонофосфата), катализируемой тиопурин- метилтрансфера-юй человека.

>. С помощью индивидуальных изоформ цитохрома Р450, синтезиро-¡анных в гетерологической системе, изучены реакции биотранс-рормации лекарственных препаратов - субстратов изоформы цито-:рома СУР2Б6. Определены кинетические параметры реакции гидро-:силирования дебризохина и 0- деметилирования декстрометорфа-га. Проведено изучение метаболизма анаболического стероида ме-?андростенолона. Показано, что метандростенолон является суб-5тратом изоформы СУРЗА4 цитохрома Р450.

Для выявления нарушений метаболизма меркаптопурина и род-:твенных лекарственных средств предложены методы обнаружения «утантных аллелей тиопурин- метилтрансферазы в геноме челове-са. Проведено изучение распространенности мутантного аллеля РРМТ*3 среди белого и черного населения Северной Америки. По-сазано, что аллель ТРМТ*3 является основным инактивирующим ал-нелем и встречается у 10% носителей неактивных аллелей.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Ю.Ф.Крылов, Е.Ю.Крынецкий, Б.С.Прохоров, А.Ф.Рылин - Исследование многокомпонентных лекарственных средств методом ВЭЖХ йям.фарм.журнал (1986) 12 с. 1504-1508.

I. Ю.Ф.Крылов, Е.Ю.Крынецкий, Б.С.Прохоров, А.Ф.Рылин - Определение количественного содержания цитохрома С методом ВЭЖХ цеп.ВИНИТИ Д10154-86 МРЖ XXII N1 публ. 52 (1986).

3. Н.Ф.Мясоедов, Г.В.Сидоров, Е.Ю.Крынецкий, В.И.Крамеров -Способ получения меченых тритием стероидов изотопным обменом -к/о ВНИИГПЭ на заявку № 4151633 от 21.05.87.

4. Ю.Ф.Крылов, Е.Ю.Крынецкий, Б.С.Прохоров, Г.А.Сапожникова, П.А.Смирнов, А.Ф.Рылин - Динамика распределения метандростено-лона в организме белых крыс - Фармакология и токсикология (1987) 5 с. 48-51.

5. Ю.Ф.Крылов, Е.Ю.Крынецкий, Б.С.Прохоров, Т.С.Орецкая - Способ определения 3- и 17- оксистероидов в субстанциях лекарст-

венных средств - А/с ВНИИГПЭ 4118781/25 от 23.04.87.

6. Ю.Ф.Крылов, Е.Ю.Крынецкий, Б.С.Прохоров, Г.А.Сапожникова, П.А.Смирнов, А.Ф.Рылин - Изучение продуктов метаболизма метан-дростенолона в организме белых крыс методом ВЭЖХ - Фармакология и токсикология (1988) 50 с. 74-78.

7. Г.А.Сапожникова, А.В.Титова, Е.Ю.Крынецкий, Б.С.Прохоров, М.А.Чепыжова - Солюбилизация биологических тканей для измерения радиоактивности в фармакологическом эксперименте - Фармакология и токсикология (1988) 50 с. 102-103.

8. Ю.Ф.Крылов, Е.Ю.Крынецкий, Б.С.Прохоров, Т.С.Орецкая - Многомерная высокоэффективная жидкостная хроматография растительных стеринов с использованием УФ-детекции - Хим.прир.соед. (1988) вып.6 с. 831-836.

9. Е.Ю.Крынецкий, Д.С.Маруженков, Б.С.Прохоров, А.Ф.Рылин -Анализ структуры продуктов метаболизма метандростенолона в организме белых крыс - Фармакология и токсикология (1990) 53 с. 51-53.

10. E.Yu.Krynetski, I.E.Kovaleva, A.M.Kopylov, V.N.buzikov, M.A. Eldarov - Expression of human cytochrome P450db in S.oe-revisiae Proc. 7th Int.Conference "Biochemistry and Biophysics of Cytochrome P450" Mosoow 1991 p.403-405.

12. E.Yu.Krynetski, I .E.Kovaleva — Study of the transoription of the human cytochrome P450 gene (CYP2D6) by PCR - Proc. 7th Int. Conference "Biochemistry and Biophysios of Cytochrome P450" Mosoow 1991 p.400-402.

13. L.A.Novikova, L.V.lBaeva, E.Yu.Krynetski, V.N.buzikov -Import of the in Vitro bovine adrenodoxin precursor into yeast mitochondria - Proc. 7th Int. Conference "Biochemistry and Biophysios of Cytochrome P450" Mosoow 1991 p.419-421.

14. Е.Ю.Крынецкий, Д.С.Маруженков, Б.С.Прохоров, А.Ф.Рылин -Импринтинг метаболизма стероидных гормонов под действием анаболического препарата метандростенолона - Проблемы эндокринологии (1991) 37 с. 45-47.

15. Д.С.Маруженков, Е.Ю.Крынецкий, Б.С.Прохоров, Ю.Ф.Крылов -Изучение метаболизма синтетических глюкокортикоидов преднизо-лона и дексаметазона в организме белых крыс и реакциях in vitro - Эксп.и клин.фармакология (1992) 55 с. 51-53.

16. E.Yu.Krynetski - Mimicking human drug metabolism by S.ce-revisiae expression system - J.Basio and Clinioal Physiology and Pharmacology (1992) 3 p.172 Speoial issue:Proo. 9th Int.-Symposium on Micro somes and Drug Oxidations - Jerusalem 1992.

17. Л.А.Новикова, Л.В.Исаева, Е.Ю.Крынецкий, В.Н.Лузиков -

Синтез предшественника адренодоксина быка и его импорт в дрожжевые митохондрии - Мол.биология (1992) 26 с. 136-142.

18. Е.Ю.Крынецкий, И.Е.Ковалева - Изучение транскрипции гена цитохрома Р450ИВ6 человека методом цепной полимеразной реакции - Мол.биология (1992) 26 с. 943- 948.

19. Е.Ю.Крынецкий, И.Е.Ковалева, М.А.Эльдаров, В.Н.Лузиков -Гетерологическая экспрессия функционально активных цитохромов Р450 человека. I. Синтез цитохрома P450IID6 трансформированными клетками Sacch.cerevisiae. - Мол.биология (1993) 27 с. 1094- 1099.

20. E.Yu.Krynetski, V.L.Drutsa, I.E.Kovaleva, V.N.Luzikov, V.Yu. Uvarov - Effects of amino-terminus truncation in human cytochrome P450IID6 on its insertion into the endoplasmic reticulum membrane of S.oerevisiae. - FEBS bett. (1993) 336 p.87-89.

21. Е.Ю.Крынецкий, И.Е.Ковалева, А.Н.Лузиков. - Гетерологическая экспрессия функционально активных цитохромов Р450 человека. Синтез цитохромов P4502D6 и Р4503А4 трансформированными клетками Б. cerevisiae. - Третья конференция "Геном человека -93". Черноголовка 1993 с.46.

21. Е.Ю.Крынецкий, И.Е.Ковалева. - Изучение транскрипции гена цитохрома P4502D6 человека методом цепной полимеразной реакции. - Третья конференция "Геном человека -93". Черноголовка 1993 с.47.

22. Е.Ю.Крынецкий, И.Е.Ковалева, В.Н.Лузиков - Гетерологическая экспрессия функционально активных цитохромов Р450 человека. II. Моделирование метаболизма ксенобиотиков с помощью клеток S.oerevisiae, експрессирующих цитохром P450IIIA4 Мол.биология (1994) 28 с. 96-101.

23. E.Yu.Krynetski, I.E.Kovaleva, V.L.Drutsa, Y.N.Luzikov -Recombinant yeast cells with increased expression of human liver cytochromes P450 provide a useful system for drug metabolism studies - Proc. 10th Int.Symposium on microsomes and drug oxidations - Toronto 1994 p. 260.

24. Е.Ю.Крынецкий, И.Е.Ковалева, В.Н.Лузиков - Гетерологическая экспрэссия функционально активных цитохромов Р450 человека. Цитохром P450IIIA4 катализирует биотрансформацию анаболического стероидного гормона метандростенолона. - Биохимия (1994) 59 с. 282- 286.

25. E.Yu.Krynetski, M.V.Relling, W.E.Evans - Heterologous expression of human drug metabolizing enzymes in yeast - Proc. 6th North American ISSX Meeting, Raleigh 1994 p. 67.

26. E.Yu.Krynetski, V.L.Drutsa, I.E.Kovaleva, Y.N.Luzikov -

High yield expression of functionally active human liver CYP2D6 in yeast cells - Pharmacogenetics (1995) 5 p.103-109.

27. E.Yu.Krynetski, J.D.Bchuetz, A.J.Galpin, C.H.Pui, li.V.Helling, W.E.Evans - A single point mutation leading to loss of catalytic activity in human thiopurine S-methyltransferase. Proc. Natl.Acad.Sol.USA (1995) 92 p.949-953

28. E.Yu.Krynetski, J.D.Schuetz, M.V.Relling, W.E.Evans - Genetic basis for loss of thiopurine S-methyltransferase activity in a child developing severe mercaptopurine toxicity - -Proc. IBC USA Conference on Pharmacogenetics, Bethesda, 1995 p. 1-8.

29. E.Yu.Krynetski, N.F.Krynetskaia, Y.Yanishevski, W.E.Evans - Methylation of mercaptopurine, thioguanine and their nucleotide metabolites by heterologously expressed human thiopurine S- methyl transferase - Mol. Pharmacology (1995 ) 47 p. 11411147.

30. H.Ii. Mcleod, E.Yu.Krynetski, J.A.Wilimas, W.E.Evans Higher activity of polymorphic thiopurine S-methyltransferase in erythrocytes from neonates compared to adults - Pharmacogenetics (1995) 5 p.287-293.

31. E.Yu.Krynetski, H.b.Tai, N.P.Krynetskaia, W.E.Evans - Molecular mechanisms of the genetic plymorphism of thiopurine methyltransferase - Proc. 4th Int.ISSX Meeting, Seattle, 1995 pp. 103. 109.

32. Е.Ю.Крынецкий - Полиморфизм ферментов, участвующих в метаболизме ксенобиотиков: структура генов и ферментативная активность (обзор) - Мол.биология (1996) 30 о.69-80.

33- H.b.Tai, E.Yu.Krynetski, N.P.Krynetskaia, C.R.Yates, W.E. Evans - Genetic basis for thiopurine S-methyltransferase deficiency: two nucleotide transitions define the most prevalent mutant allele (ТРШВ) in Caucasians - Am.J.Human Genetics (1995) in press.

34. E.Y.Krynetski, W.E.Evans - Pharmacogenetics of thiopurine S- methyltransferase (review) - Pharmacogenetics (1996) in press.

Заказ М 56 от 16 ноября 1995 г. Тираж 100 экз. Отпечатано в отделе печати МГУ