Синтез биосовместимых полиамидов взаимодействием 2,2'-П-фенилен-БИС (оксазолин-5-ОН)ов с диаминами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

ТБИЛИССКИЙ ГОСУДАРСТВШНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. ИВ.ДХАБАХИШВШШ

На правах рукописи

КИШЕЛАШВИЛИ Лариса Иосифовна

УДК 678.664.678.675

СИНТЕЗ ЕИОСОВМЕСТИМЫХ ПОЛИАМИДОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕМ 2,2-П-ФЕНИЛЕН-БИС(ОКСАЗОЛЙН-5-ОН) ОВ С ДИАМИНАМИ

02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Тбилиси - 1990

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии и биологической физики АН ГССР.

Научный руководитель - доктор химических наук

КАЦАРАВА Р.Д.

Научный консультант - кандидат химических наук

ХАРАДЗЕ Д.П.

Официальные оппоненты: доктор химических наук

ВЫГОДСКИЙ Я.С.

доктор химических наук,профессор САМСОНИЯ Ш.А.

Ведущая организация - Институт физической и органической

химии им. П.Мелшашшили АН ГССР.

Защита диссертации состоится аЙп ебклс&л 1990 г. в / ^ • часов на заседании специализированного совета К 057.03.04 химического факультета Тбилисского государственного университета по адресу: 380028, г.Тбилиси, проспект И.Чавчавадзе.З

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан " /3" 1990 года.

Ученый секретарь специализированного Совета К 057.03.04 кандидат химических наук,доцент

Н.В.ЛОРИЯ

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ . .

Актуальность проблем;;. Одной из наиболее вахных задач современной ыакромолекулярной химии является конструирование полимеров медицинского назначения, среди которых особое место занимают биосоЕместимые полимеры, предназначенные для контакта с живым организмом. Такие полимеры, используемые в качестве временных имшшнтантоЕ, носителей лекарственных или иных физиологически активных веществ и т.д., должны обладать ещё одним важным качеством - подвергаться фрагментации под воздействием активных сред организма (биодеструкции) и выводиться из него без последствий.

Создание полимерных материалов с биодеградируемой основной цепью ведется по нескольким направлениям, среди которых особо перспективно введение в мекромолекулярную цепь ферменгосдецифи-ческих групп, обеспечивсщих деструкции полимеров до легко удаляемых из организма нетоксичных (желательно ассимилируемых организмом) низкомолекулярных фрагментов с заданной скоростью под воздействием данного класса ферментов (гидролэз).

С этих позиций интерес представляют гетероцеоные полимеры на основе оС -аминокислот, содержащие ферментоспецифические пептидные связи в осноеных цепях макромолекул. Большинство таких покдимеров, известных в настоящее Еремя е литературе, получается сложным цутеы, включающим полимеризьцию N —карбоксиангидридов.

Поэтому актуальным является создание новых, удобных методов синтеза гетероцепных полимеров на основе сС-аминокислот.

Цель работы. Целью настоящей работы является разработка простого метода синтеза гетероцепных полиамидов, содержащих в основных цепях макромолекул остатки <± -аминокислот, заключающегося во взаимодействии 2,2-п-фенилен-бис-оксазолинонов с диаминами, изучение основных закономерностей и выявление особенностей процессов полимерообразования. Важной составной частью работы является синтез бифункциональных мономеров электрофиль-ной природы - 2,2-п-фенилен-бис-оксазолкнонов. получаемых циклизацией соответствующих N, К11 -терефталоил-бис- (¿-аминокислот, исследование их реакционной способности. В цель работы входило также изучение физико-химических свойств полученных полимеров и оценка их биосовместимости и биодеструктируемости.

Научная новизна. Впервые синтезированы Ы.м'-терефталоил--бис-¿(.-аминокислоты и соответствующие 2,2-п-фешмен-бис-окс8-золиноны на основе c¿-аминокислот: валина, норвалина, изолей-цина, норлейцина, енилзлзнина, ыетионина, ацамантил-1-глицина, $~адамантил-1-аланина; Усовершенствованы способы синтеза 2,2-п--фенилен-бис-оксазолинонов на основе глицина, аланина и лейцина. Впервые изучена реакционная способность синтезированных 2,2-п--фенилен-бис-оксазолинонов. Проведено систематическое исследование основных закономерностей поликонденсации 2,2-п-фенилен-Ьис--оксазолинонов с диаминами и получены высокомолекулярные, плен-ко- и волокнообразуодие полиамиды к сополиамиды. Впервые показана возможность синтеза полиамидов взаимодействием 2,2-п-фени-лен-бис-оксазолинонов с мХ-бистркметилсилильными производными алифатических диаминов, в том числе N^ N6 -бис-траметааси-лил-L -лизином. Ка основе последнего впервые подучены функциональные полиамиды, содержащие в основных цепях дипептидные фрагменты, е результате поликонденсации, в которой рост цепи макромолекулы одновременно является реакцией образования пептидной связя; взаимодействием 2,2-п-фенилен-бис-оксазолинонов с теле-хелическими олигопептидами на основе L-фенилаланина и Ь-лей-цина синтезированы сегментированные полиамиды, содержащие поли-пептицные блоки в осноеных цепях макромолекул. Впервые проведено исследование биосовместимости, биодеградации в экспериментах In vitro и In vivo полученных гомо- и со полиамидов.

Научная и практическая ценность работы. Научная новизна заключается в разработке простого и доступного метода синтеза ге-тероцепных гомо- и сополиамидов на основе et -аминокислот, синтезе и изучении реакционной способности электрофильных мономеров - 2,2-п-фенилен-бис-оксазолинонов, исследовании биосовместимости и биодеградации синтезированных полимеров. Практическую ценность представляют полученные высокомолекулярные, пленко- и волокнообразуодие, биосовместимые полиамиды. Биосовместимый со-полиамид на основе N.N1-терефталоил- "DL-фешшзланина, м, >;' --терефталоил-Еалина и гексаметиленциамина был успешно опробован в эксперименте в качестве покрытия при обширных повреждениях кояи, при нейрохирургических операциях для закрытия твердой оболочки мозга ( dura mater ). Монофилаыентные волокна из этого сополиамида способствуют направленному росту нервных клеток. Сополиамид успешно прошел испытания (в эксперименте) в хирургии

паренхиматозных органов (в вице пористых пленок, гранул и твмио-' нов), проявляя при этом высокий гемостатический эффект и рекомендован для клинического испытания.

Личный вклац автора. Непосредственно самим автором осуществлен и усовершенствован синтез всех приведенных в диссертационной работе М'-гсиацил-бис-аминокислот и 2,2-п~фенилен-бис-ок-сазолинонов,N -триметилсилшшроЕанных диаминов, проведена и изучена поликонденсация с участием указанных мономеров, а также телехеличвскнх олигопептидов, изучены свойства полученных полимеров.

Адаычнтил-1-глицин и £-адамантил-1-аланин любезно были предоставлены профессором Ц.А.Красуцким (Киевский политехнический институт), телехелические олигопептиды - профессором П.Чефелиным (Институт макромолекулярной химии ЧСАН, г.Прага) при выполнении совместных работ в рамках многостороннего сотрудничества АН соц-стран. ■

Рентгеноструктурный, элементный и термоыеханический анализы проведены в ИНЭОС АН СССР.

ЫосоЕместимость и биодеграцируемость полученных полимеров изучались автором совместно с биологической группой лаборатории биоактивных полимеров и полипептидов Института молекулярной биологии и биологической физики АН ГССР, а также с. отделом биосов-ыестщ.ш полимеров Института органической химии АН УССР (г.Киев). Экспериментальное изучение образцов в хирургических ситуациях про водилось совместно с Институтом клинической и экспериментальной хирургии и Институтом неврологии ЫЗ ГССР. Направленный рост нервных клеток изучался в Институте физиологии АН ГССР.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на 1У Республиканской конференции молодых ученых,Тбилиси, 1979 г., IX и X Международных микросимпозиуыах по пеликон-денсации (Будапешт, 1983 г., Солнечный Берег, 1985 г.), У1 Всесоюзном симпозиуме "Полимеры медицинского назначения", Алма-Ата, 1983 г., ХХП Всесоюзной конференции по высокомолекулярным соединениям, Алма-Ата, 1985 г., У Всесоюзном симпозиуме по инженерной энзимологии, Кобулети, 1985 г., Международной конференции "Полимеры в медицине", Варшава, 1988 г., Международной конференции "Полимеры в медицине и хирургии", Голландия, г.Лииувенхорст, 1989 г., ХУЛ Всесоюзной конференции "Синтез и реакционная способность органических соединений серы", Тбилиси, 1989 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ и 9 тезисов докладов.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 159 страницах машинописного текста. Она включает 20 таблиц н 19 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, результатов работы и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, списка использованной литературы (194 наименований) и приложений.

Во введении цяно обоснование актуальности диссертационной работы, основные цели и задачи исследования.

В первой главе - обзоре литературы - в соответствии с темой диссертации рассмотрены поликонденсационные методы синтеза линейных гетероцепных полимеров с участием бифункциональных гетероциклических соединений.

Вторяя глава - результаты работы и их обсуждение состоит из трех разделов. В первом разделе исследованы реакции получения N,N1-терефталоил-бис-аминоклслот и 2,2-п-фенилен-бис-оксазоли-нонов, изучена кинетика модельной реакции анилинолиза последних, а также биодеградация модельных субстратов in viiro .

Второй раздел посвящен изучению закономерностей поляконден-сации, синтезу функциональных полиамидов, содержащих в основной цепи ди- и полипептидные фрагменты. В третьем разделе исследованы строение и физико-химические свойства, биосовместимооть и биодеструктируемость подученных полиамидов в опытах !n víiro и in vivo .

В третьей главе - экспериментальной части диссертации приведены характеристики растворителей и исходных веществ, методы проведения экспериментов и исследования физико-химических свойств полимеров.

Диссертация завершается выводами, списком использованной литературы и приложением.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Синтез и исследование мономеров. Модельные реакции.

I.I. Синтез N,N*-диацил-бис-©t-аминокислот

Для получения -диацил-био-<i-аминокислот (1 и 2) наш бшш использованы гидрофобные аминокислоты, многие из которых содержат ферментоспециЗические боковые группировки (схеыа I):

►носшдаго-я-шнснсоон

' I

Я Я

(I и 2)

А) гн2ыснсоон+ сесо-й'-сосе^0^"^0'^

К Метод „А"

б) 2на^нсоош-сесо-я-сосе 6 е< 8 -

К МЕТОД „Б"

где:Е= а) -Н (глицин), б) -СНд(аланин), е) -СН(СНд)2(валин), г) -(СН2)2СНз (норвалин), д) -С^СЩСНз^ (лейцин), е)-СН(СН3)С112СН3 (изолейцин), ж) -(СН2)3СН3 (норяейцин),

в) -СН2~\0) (фенилаланиа), я)-(СЕ^^-З-СНд (метионин),

(адамантил-1-глицкн), I) Н» —{О)-

2) В'= ~(СН2)4-

ГСН^- (^ -адамактил-1-аланин) Схема I.

Методика синтеза (I) в водно-диоксановой смеси в присутствии окиси магния приводила к неудовлетворительным выходам. Поэтому мы видоизменили ее и синтез проводили по Шсттен-Бауману (метод "Б"). В результате (I) были получены с выходами, близкими к количественным (табл.1). Полученные соединения были охарактеризованы данными ИК-спектроскошш (1640-1665 см~^(амид), 1710-1725 см-1 (СОШ), 3300 (N11) и элементного анализа. По методу "Б" получали и очищали соединения (2), характеристики которых также приведен» в табл.1.

Для синтеза I и 2 использовали рацемические оС-аминокислоты. Ряд экспериментов проведены также на оптически чистых Ь-аминокислотах ( Ь-валин, ¿.-лейция, Ь-фенялаланин), однако, оыли получены рацемические бис-оксезолиноны. Это обстоятельство определило использование в дальнейшем менее дорогих Т)Ь-аминокислот. Были использованы также адамантансодержащие аминокислоты (кил), обладавшие высокой антивирусной активностью. Интерес представляет включение адамантавсодержащих сС -аминокислот в основные цепи макромолекул как с целью пролонгации их свойств, гак и с целью конструирования полимеров с потенциальной физиологической активностью. Одним из простых и удобных методов реализации этой задачи представляется бис-оксазолиноновый метод.

1.2. Синтез 2,2-п-4енилен-бис-оксазолинонов

Циклизацию (I) осуществляли при выдерживании е среде уксусного ангидрида при 100°С в течение 20-30 мин (схема П):

, ССНэС0)г0,100°С —N /_л N-

НООС-СН^НСО-^СОЫН-СН-СООН-—

(I и 2) (За - Зл)

1?,в'- см. на схеме (I) // >• при. Й= "(СН^Ь,

Схема П

Таблица Т

Услоеия синтеза и некоторые характеристики соединений I и 2

Соединение Выход Л Т.дл °С Соединение Выход,% Т.пл.^ °С

Метод "А" Метод "Б" Метод "А" Метод "Б"

1а 80 90 250(разл.1 1и 72 95 199-200

16 50 80 291-292 1к - 29 240-242

1в 70 86 268-270 1л - 39 229-231

1г . 60 88 242-243 2а - 90 179-180

1д 55 93 261-262 2ж - 94 175-176

5е 60 91 244-246 2з - 97 140-142

I* 63 85 248(разл.! 2и - 95 ПО-Ш

1з 27 • 93 239-240

После перекристаллизации из ледяной уксусной кислоты и сушки в вакууме при П0-120°С.

Реакция протекает гомогенно или гетерогенно (в последнем случае меняется внешний вид осадка) в зависимости от природы Н . Условия циклизации и некоторые характеристики порченных 2,2-п-фенилен-бис-оксазолинонов (бис-азлактонов) (3) приведены в табл.2. При циклизации (2) вместо кристаллических бис-оксазо-линонов образуются маслообразные продукты, разлагающиеся при попытках перегонки в вакууме.

Структура соединений (3) была подтверждена данными элементного анализа и ИК-спектрально отсутствием полос, характерных для (I) и появлением новых полос в области 1650-1680 см~ЧС=М) и 1810-1820 см--'- (С=0 оксазолинонового цикла). Была предпринята

такте попытка циклизации уксусным ангидридом ы,н'-терефтвлоил--бис-р~аминокислот ($-аланина и £ -фенил-£-аланина).'Вместо ожидаемых шестичленных бис-азлактонов е этих случаях, однако, были выделены соответствующие полиангидриды.

Таблица 2

Условия синтеза и некоторые характеристики соединений (3)

Соединение Выход % Т.пл., °С Соединение Выход?; % Т.пл., °С

За*30 57 220-222 Зж**30 60 158-159

36 44 179-180 Зз 80 180-181

Зе 60 163-164 Зи 70 145-147

Зг 71 152-154 Зк . 50 227-230

ЗД €0 168-169 Зл 75 2Д4-246

ЗеХЮ1) 50 156-158

Выход после очистки,Большинство бис-оксазолиноног пере-кристаллизовивали из бензола.

Очищали суспендированаем в кипящий диоксан.

ПерекристаллизоЕШзали из диоксана.

1.3. Оценка реакционной способности 2,2-п-фенилен-бис--оксазолинонов

Сведения о реакционной способности бис-оксазолинонов по отношению к нуклеофилам, в частности аминам, в литературе отсутствуют. В то же время, знание реакционной способности (3) с различными I! в положениях 4 и 41 необходимо для более глубокого понимания поликонденсационных процессов, в частности, для прогнозирования закладываемой микроструктуры при синтезе сополимеров с использованием двух или более бис-оксазолинонов. Изучение реакционной способности (3) представляет такхе теоретический интерес в плане взаимного влияния двух оксазолиноновых циклов.

Для выяснения перечисленных вопросов исследоЕали реакцию анилинолиза вести бис-оксазолинонов (Зб,в,д,ж,з,и) в среде диме-тилацетаыида (ДМАА), при 30°С в условиях реакции псевдоперЕого порядка (табл.3). Текущую концентрацию (3) определяли по изменению оптической плотности полосы карбонильного валентного колебания (Л)со) оксаволинонового цикла в области 1810-1820 см"1,

прозрачной для ДМАА. Взаимодействие (3) с анилином протекает по ступенчатой схеме с образованием промежуточного моноашда (4) и конечного бис-амида (5): н н

н

N-

Uo-

-R

н у (ТО

PRMHCQCHNHCQ-®-^* -ÜM^. ст

HjNPR (Tt)

fe

R

(4)

PF, N HCOCH N HСО СО N H CH CON H PR

R (5) R

Таблица 3

Наблюдаемые константы реакции анилинолиза (3) в среде ДМАА при 30°С

Бис-окса-золинон Мольное соотношение. (3) :анилин*' и мол 'С л бх Е° s F

36 I 20 3 S,8±0,I 0,00 0,00 0,00

I 20 3 3.7Í0.3

Зв I I 30 40 2 2 3,3±0,1 3.8Í0.3 -0,19 -0,85 2,12

Зд I 20 3 9,5^0,5 -0,123 -1,13 0,82

Зж 1 20 3 10,IÍ0,5 -0,13 -0,59 0,66

Зз I 20 3 9.3Í0.4 0.21 -0,72 -

Зи I 20 3 13,QÍO,3 - 0,77 -

л-число параллельных опытов. Исходная концентрация (3) 0,05 моль/л.

Было найдено, что экспериментальные точки во всех исследованных случаях спрямляются в координатах реакции первого порядка (коэффициент корреляции г = 0,994-0,999) еплоть до 80-85$--ной конверсии, причем независимо от мольного соотношения (3) : анилин, что говорит в пользу отсутствия взаимного влияния

оксэзолиноноеых циклов ( &г=&2) и позволяет отнести бис-оксазо-линоны к категории мономеров с независимой реакционной способностью функциональных групп.

Из экспериментальных данных определяли наблюдаемую константу реакции исевдоперЕого порядка . Далее из уравнения = г [ А1 (ГА7 - концентрация анилина) рассчитывали значения наблюдаемой константы реакции Еторого порядка Совпадение значений (табл.З) при разных исходных концентрациях анилина свидетельствует об отсутствии потока реакции, катализируемой самим амином.

Исходя из полученных кинетических данных, заместители Е по уменьшении реак:зюнной способности соответствуй«!« бис-оксазоли-нонов образуют ряд: -(СНг)25СНз>-(СНг)3Сн3 >^-СН3>,

^-сн?сн(сн3)2^-сиа~<§>>-снссн3)2 •

Какая-даОо корреляция реакционной способности бис-окдазолино-нов с индукционными (61 ) или стерическшк (Е| ) константами заместителей В не наблюдается (табл.3): некоторая связь прослеживается с константой Р , учитывающей "водородное напряжение" -наибольшее экранирующее влияние оказывает изоиропильная группа.

Более высокую активность бнс-оксазолкнока на осноес метионина (й = — (СН^^г^^^^ ожидаемой, исходя из значения Ед,можно

связать, например, с увеличением алектрофкльности карбонильной группы за счёт её -координации с атомом серы через пространство

1.4. Изучение биодеградируемости производных м.^'-тере-фталоил- тх-аминокислот

Известно, что протеазы, в частности с£-химотрипсин, расщепляют пептидную связь, образованную аминокислотой, содержащей гидрофобную боковую группу И, со стороны карбоксильной группы. Известно также, что увеличение гидрофобносга группы Я (характеризуемо:: константой гицрофобности Ганша) в ряду -СН3 < -СК(С113)2< -СИ2СН(СН3)2< -С^%—^^ приводит как к росту скорости иротео-лиза, так и повышению энантиоселективности Ы, -химотриптического гидролиза. С этих позиций наиболее аффективны производные фенил-аланина (в ряду аминокислот, использованных наш). Поэтому оценку химотриптического гидролиза проводили на примере производных

М^Ы1 -тере$талоил-Т>Ь-фенилалаш1на.

С точки зрения задач, поставленных в настоящем исследовании, представлялось необходимым проследить Елияние остатка терефтале-вой кислоты и "удвоенных" производных тзи-аминокислоты (возможны изомеры: Ь-и,Т)-Т) и Ь-Т>). Для этой цели были выбраны: исходный бис-оксазолинон ( Зз), продукт его взаимодейстЕия с н-бутнл-амином (6) и бис-п-нитрофзниловый эфир N,14'-терефталоил-ТИ,-фе-нилаланина (7):

(нС^Н^НСОСН-цн-со>2п-СД (о2Ы -^(о^ососимнсо^п-сд

(6) (7)

Было установлено, что суспензия диэ^ира (7) актиЕно подвергается гидролизу, к а т али з иру е м ому химотрипсином (изучали по выделению п-нптрофенола, фосфатный буфер рН 6,2). Через 30 мин. раствор становится прозрачным (и чистом фосфатном буфере раствор гомогенизируется лишь спустя 24 ч.).

об-химотриптический гидролиз суспензии амидного субстрата (6) с заметной скоростью не наблюдается в течение 6 часоЕ (далее фермент инактивируегся), что можно связать как с гетерогенностью процесса, так и с большей стабильностью ашдной связи к протеог-литическому расщеплению. Неожиданную стабильность по отношению к Л-химотрилтическому расцеплению проявил бис-оксазолинон ( Зз) сопоставимый по активности с (7). Возможно это связано со спецификой строения и невозможностью жесткого гетероциклического субстрата взаимодействовать одновременно как с активным центром Зерлента, гак и с его "гидрофобным карманом". В результате скорость расцепления (измеряли потенциометрическим титрованием) (Зз) в присутствии и е отсутствии фермента (рН 8,5) практически одинаковая.

Полученные данные позволили заключить, что субстраты на основе N .И'-терефталоил-бис-Т^-фенилаланина не вызывают инактивации протеазы (сС-химотрипсина), способны расщепляться под воздействием ферментов (с высокой скоростью - в случае субстратов слож-ноэфирной природы, значительно медленее - в случае амидных субстратов) и представляют интерес в качестве структурных звеньев для конструирования полимеров с биодеградируемой основной цепью

макромолекул.

2. Поликонцексацшт

2.1. Поликонденсация (3) с диаминами

Полкконденсацию (3) с диаминами, протекающую по полиадди-ткеной схеме

П(3)- пНеЫ-р'^Не^^МН-Я-МН-С0-СН-ЫН-С0-^О)-С0-ЫН-СН-С0}п

я я

. С:сема Ш

проводили в амцугюс растворителях - якмегалацетамиде Ш.1АА) и N -метшширролидоне (N-МП). Процесс осуществляли добавлением (3) е ТЕерцом Еиде к раствору диамина. При этом наблюдалось сильное разогреЕание реакционной смеси и появление интёнсивной красно-оранжевой окраски, которая связана с образованием системы сопряженных связей в результате енолизации (3):

основание .. ¡о_

(з)

Со Бременем окраска исчезает, образуется вязкий светло-желтый раствор, что может служить удобным критерием завершенности реакции.

Взаимодействие (3) с алифатическим гексаметилендиамином (1ВДА.) в гомогенных условиях протекает с еысокой скоростью при комнатной температуре и завершается за 1-2 ч; в случае же гетерогенного течения процесса (Еыпадает полимер) реакция заметно тормозится. После введения Ь% Ь; СВ , в при необходимости при нагреЕч до 80°С, реакционный раствор гомогенизируется, красно-орачжевая окраска исчезает и образуется прозрачный светло-желтый, вязкий раствор. Максимальные значения вязкости полиамидов бкли достигнуты при эквиыольком соотношении исходных мономеров и концентрации 0,6 моль/л. Услоеия синтеза и некоторые характеристики полиамидов, полученных взаимодействием (3) с ИЩА, приведены в табл.4.

С ароматическим 4,4-диаминощ1фенилметаном (ДЦМ) (3) реагирует лишь при 80-100°С (табл.4). При атом образуются полиамиды с

ММ ( &пр= 0,5-0,6 дл/г), недостаточной для получения пленок и волокон на юс основе. Это можно связать со сравнительно высоким вкладом конкурентных реакций обрыва цепей.

При использовании различных (3) в качестве сомономеров можно в широких пределах регулировать качественный и количественный аминокислотный состав сополимеров (табл.5). .

Таблица 4

Условия синтеза и некоторые характеристики полиамидов,синтезированных по схеме Ш, С = 0,6 моль/л, X = 4 ч.

Л» Мономеры Растворитель Температура, °С Выход, % Ъ25*! L пр ' дл/г Т.пл. °С

Еис-окса-золинон Диамин

I За ША ДМАА (гетерог. 80 97 0,66 310

реакция)

2 .36 То хе ДМАА+5$ШСе 20 96 1,25 220

3 Зв п То же 80 99 1,20 212

4 Зг И 80 100 0,80 260

5 Зд « 20 100 1,10 280

6 Зе « 80 99 1,40 240

7 3* 80 ' 97 1,20 260

8 Зз и 20 97 0,73 215

9 За и Шкк 20 98 0,95 220

10 'Зд ддм П-Ш1 100 95 0,58 240

II Зи То же То же 80 92 0,60 230

Здесь и далее ^пр полиамидов определена в смеси

С2Н2С14:РШ1 = 3 : I.

2.2. Поликонденсация (3) с N .м'-трйметилсилилированным диамином

N .м'-бис-триметилсилильные производные удобны при использовании в качестве мономеров диаминов, содержащих дополнительные функциональные группы, склонные к внутри- и межмолекулярным взаимодействиям с собственными аминогруппами. Такие диамины перспективны для конструирования функциональных полиамидов. Поэтому нами была изучена возможность синтеза полиамидов взаимодействием (3) с N .Ы'-бистриметилсилилированным диамином, в частности N , Ы'-бис-тримстилсилил-ЩЦА. (ТМС-ГЗДА).

Таблица 5

Условия синтеза и некоторые характеристики сополиамидов С = 0,6 моль/л, "1= 20°С, % = 4 ч

№ Бис-оксазолиноны (50мол£:50мол.>) Растворитель Выход, % Ч пр., ДЛ/г Т.пл., °С

I. 36 : Зз ДМАА 99 1,15 195

2. Зв : Зз То же 99 1,20 180

3. Зг : Зз Ы-МП 98 1,12 200

4. Зд : Зз ДМАА 99 0,98 210

5. Зе : Зз м-ш 99 1,36 190

6. Зж : Зз м-мп 98 1,24 195

7. Зе : Зи ДМАА 99 0,87 190

8. Зж ; Зи То же 97 0,96 200

9. Зз : Зи 98 0,90 170

Были установлено, что взаимодействие (3) с ТМС-1МДА протекает значительно медленее, чем со свободным основанием и завершается лишь за 24-36 ч.

Невысокую скорость взаимодействия ТМС-ХЩА с (3) можно связать как с пониженной нуклеофильностью ТМС-аминогрупп, так и стерическим взаимодействием ТМС-грушш с заместителем И в положении "4" азлактонного цикла.

Поликонденсация ТМС-1ОДА с (3) заметно ускоряется при повышении температуры до 90-100°С и завершается за 7-8 часов. При атом образуется полиамиды с неплохими вязкостными характеристиками (табл.6). В дальнейшем данная реакция успешно была использована нами для получения функциональных полиамидов, содержащих дипептидные фрагменты в основных цепях макромолекул.

2.3. Синтез пептидеодержащих полиамидов

а) Дипептидсодержащие функциональные полиамиды на основе (3) и лизина.

Используя реакцию, описанную в разделе 2.2, осуществлен синтез полиамидов взаимодействием (3) с метиловым эфиром №* -бис-триметилсилил-Ь-лизина по схеме:

п (3) + пМе в» N нсн (сна\ NНЭ1 Ме

Лмпептид

СООСНз

^СОСНЫНСО -(о)-СОМНСНСОМНСНССНе^Ми}п

К К СООСНз

Схема 1У

В результате образуются полиамиды, содержащие дипептиднне фрагменты в основных цепях макромолекул (табл,7). Примечательной особенностью данной схемы синтеза является то, что реакция роста цепи одновременно является и реакцией формирования пептидной связи, в результате чего отпадает необходимость многостадийного, дорогостоящего синтеза соответствующего дапептида.

Таблица 6

Синтез полиамидов поликонденсацией (3) с ТШ-ЩЦА

Бас-оксазолинон Растворитель т,°с Время,ч Выход, % гор..ля/т

Зи ДМАА 90 7 95 0,51

Зз ДМАА+5/» иС6 90 8 97 0,68

Зв То же 100 7 89 0,32

Зж «1 100 7 97 0,41

Таблица 7

Синтез дипептидсодержащих полиамидов (8) по схеме 1У

Бис-оксазолинон Растворитель шход, % £пр., ад/г

36 ДМАА 97 0,44

Зв То же 88 0,23

Зд __ 91 0,35

Зе м 94 0,42

Зж N-№1 88 0,40

Зз ДМАА 87 0,19

Зз То же 80 0,16

Зи Т1 УО 0,37

Зи я 85 0,19

б) Синтез полиамидов на основе олигопептидов

¿ведение п основную цепь макромолекулы ферметативно расщепляемых олигопептидных фрагментов представляется перспективным способом

управления окоростыз биодеградации полиамидов. Дм получения таких полимеров при поликонденсации (3) с диаминами в качестве со-мономеров использовали телехелические олигопептиды с концевыми аминогруппами. Характеристики исходных олигопептидов приведены в табд,8.

Таблица 8

Характеристики олигопептидов

Исходные Л-аминокислоты Олигопептиды

кор-81 кор-82

фенилаланин лейцин [МНе] ммоль/г 1С00Н) ммоль/г 1 (42)ж) Ь(51>*) 1,22 0,07 Ь(80)х) ОЬ (13)х 1,25 0,00

^Конфигурация и содержание аминокислот, %.

Поликонденсацию олигопептидов с (3) проводили используя в качестве удлинителя цепи 1ОДА. Условия синтеза и характеристики подученных полиамицопептицов приведены в табл.9.

Таблица 9

Синтез и характеристики полиамидов, содержащих олигопеп-тидные фрагменты

Бис-оксазолинон Олиго-*^ цептид , [Щад/г , (м-крезол) М1 Содерж., % Вычислено Экстрагирующаяся бензолом фракция %

Найдено

I Эд кор-81 0,35 - - 8,9

2 Зв кор-8.1 0,31 12000 9,22 8,83 6,1

3 Зв кор-82 0,15 ' — 9,23 8,87 10,3

Исходное соотношение (в ммолях): кор-81:1ВДА.:бис-оксазоли-нон = 0,61:4,39:5,0; кор-82 :ЩШбис-оксазолинон = 0,625:4,375: :5,0; поликоцценсация в ДМАА+5$ УСЕ. при 80°С, С = 0,6 моль/л (по бис-оксазолинону).

Данине элементного анализа, значения и. количество экстрагируемой бензолом фракции (олигопептидн при 70-75°С растворимы в бензоле) свидетельствуют о получении сополимеров.

Указанные сополимеры подвергаются ферментативному расщеплению со значительно более высокой скоростью, чем гоыополиамиды (ил.ниже), однако, их молекулярная масса (12000) недостаточна для получения на юс основе пленок и волокон. Указанные полимеры более перспективны в качестве полимерных депо лекарственных веществ, где необходимым условием является высокая скорость деструкции полимера.

3. Свойства полимеров

3.1. Строение и физико-химические свойотва полимеров

Строение полиамидов было доказано данными элементного анализа, а также изучением их ИК-спектров, в которых наблюдаются полосы в'области 1640-1660 см-1 (амид Г), 1550 см~* (амвд Л) я 3300 см-1 (ЫН-амида).

Синтезированные полиамиды (с учётом того, что ферментами "узнаются" лишь Ь -аминокислотные фрагменты) в среднем на элементарное звено содержат две потенциально ферментатавно расщепляемые связи:

•г Ь и

мн-я-мн-сосн-^-со-@-со-мн-сн-со

+ ь

\"

прсгеазы аципазы

Полиамиды хорошо растворимы во многих органических растворителях (табл.10) и легко могут быть переработаны в изделия.

Согласно данным ренггеноструктурного анализа синтезированные гомополиамиды обладают аморфной структурой, что можно объяснить разнозвенным строением полимеров, обусловленным статистическим распределением Т> и Ь аминокислотных фрагментов. С точки зрения биодеструкции это благоприятное обстоятельство, поскольку известно, что кристаллические полимеры разрушаются труднее, чем их менее упорядоченные аналоги.

Исходя из близкой реакционной способности (3) с различными К, можно предположить, что микроструктура сополимеров на их основе близка к статистическому распределению триад.

Таблица 10

Растворимость полиамидов на основе (3) и ГВДА, синтезированных по схеме

Поднанял ША ДМАА N-Ш ДМС0 CFsCOOH CFgCHgOH Ж) ГХЭФ

За +(L;Ci) _ + + _

3d + + + +

Зв + ±(ua) + + +

Зг + + 0.Л) ±N + + + +

Зд + +M + + +

Зе + ЦШ) + + +

Зж + ■ + (Ut) ±M + + + +

Зз + + + + + +

Зи + + + + + + +

Растворимость 0,2 г полимера в 10 мл растворителя. в} ТХЭФ - смесь С2Н2С14:Р№ -3:1.

"+"- растворим при комнатной температуре,

" 1"- растворим при нагревании, на растворим,

(ЫСС) - растворим в растворе, содержащем 5% Ь» СБ .

3.2. Изучение биодеструкции полиамидов 1п уНго

С целью выяснения влияния химической структуры полиамидов ва их склонность к ферментативной деградации был изучен химотрип-тический гидролиз рада полиамидов и сополиамидов, содержащих специфические для указанного фермента гидрофобные аминокислоты (фенилаланин, ыетионин, лейцин, валин). Установлено, что инкубированные образцы не влияют на активность фермента. Было также установлено, что возможные продукты деградации - N , И1- терефта-лоил-бис-ж-с*.-аминокислот; также не оказывают ингибирущего влияния на фермент.

Изучалось изменение характеристической вязкости полиамидов. Как следует из полученных данных (рисЛ), практически все исследованные образцы в той иди иной степени подвергаются ферментативной деградации. С высокой скоростью разрушаются полиамиды,содержащие олигопептидаые блоки на основе фенилаланина и лекцина,

что подтверждает справедливость высказанного предположения о возможности управления скоростью биодеградации введением в основную цепь макромолекулы олигопептидныг фрагментов. Полиамиды, не содержащие олигопептицов, подвергаются биодеструкции значительно ыедленее, что можно связать, о одной стороны, с физической струя-турой образцов (пористые пленки, в отличив от порошкообразных пептвдсодержалдах образцов), с другой стороны, с большей жесткостью цепи из-за большего числа остатков терефталевой кислоты, затрудняицего взаимодействие с ферментом. Однако, склонность указанных образцов подвергаться химотриптическому расцеплению является достаточно надежной гарантией их биодеструкции !n vivo » где набор прогеаэ кесралнено богаче.

РисЛ. Химотриптический гидролиз полиамидов. Первая цифра соответствует номеру образца, вторая (в скобках) номеру таблицы.

3.3. Оценка биосовместимости и биодеструктируемости полиамидов ia vivo

После проведения скриннинга на биосоЕместимость (пористые пленки имплантированные внутримышечно собакам), наилучшие характеристики (среди синтезированных полиамидов на основе (3) и ГИДА) оказались у сололиамида № 2 аз табл.5, т.е. содержащего в цепях макромолекул производные валина и фенилаланина. Биосовместимость данного сополиамида была исследована более подробно.

Исследовались образцы в виде пористых пленок, размером 1x1 сир. Пленки имплантировали кроликам шиншила, в мышцу в область бедра. Гистологические исследования иоказали, что вокруг полимерного имплантанта через 4 Месяца после операции отмечается тонкая соединительная капсула, состоящая из продольно ориентированных коллагеновых волокон, включаицих 3-4 ряда фибробластов веретенообразной формы. Соединительнотканная капсула плотно спаяна с полимерным имплантантом. Встречаются тяжи грануляционной ткани, уходящие вглубь полимера и заполняющие его поры. На внутренней поверхности капсулы, граничащей с имплантантом, а также в порах полимера обнаруживаются единичные макрофаги, по-видимому, активно участвующие в процессе деструкции образца. Признаки,указывающие на раздражающее или токсичное действие полимера, не выявлены. Через 8 месяцев толщина капсулы со всех сторон одинакова и представлена 3-4 рядами фибробластов. Под соединительнотканной капсулой отмечается прорастание клеточных элементов в полимер. Отмечаются многочисленные узуры, которые заполнены круг-лоялеточнкм инфильтратом и соединительной тканью. В дефектах полимера клеточный инфильтрат представлен в основном макрофагами. В центральной части имплантанта поры заполнены фибринозно-гемор-рагическим экссудатом. Отмечается также прорастание соединительной ткани в поры полимера и наличие в них гигантских клеток инородного тела, что говорит об ослаблении фагоцитарной функции макрофагальных элементов к данному сроку исследования (8 месяцев). Площадь имплантата, подвергшаяся деструкции, приблизительно равна IAO всей поверхности имплантата. Поры большего диаметра способствуют разрушению полимера за счёт более активного Ерастания соединительной ткани в имплантат. На более поздних сроках исследования (S месяцев) гистологическая картина почти идентична вышеописанной.

Оценку гистотокичности проводили методом тканевой культуры. В качестве объекта культивирования использовали подкожную клетчатку белых беспородных крыс. Было найдено, что влияние вытяжек из полимера помещенных в среду культивирования, практически не меняет характера роста и развития тканевой культуры и не отличается от контроля. Показатель гвстотоксичности равен 0,82^0,01, что свидетельствует о нетоксичности полимера.

Таблица II

Биодеструкция -in vivo образцов сополиамида Jé 2 из табл.5 при имплантации беспородным собакам

Орган имплант. Длительность имплант. (месяцы) [£] исходного полимера (контроль) ^имплантированного полимера

Перитониум I 1,05 1,05-

То же 2 1,05 0,94

3 1,05 0,34

Мышца 5 1,05 0,47

Подкожно 5 1,05 0,57

Пористые пленки и тампоны на осноЕв изученного сополиамида успешно были использованы при операциях на паренхиматозные органы (печень, почки, селезенка), причем помимо высокой биосов-местим'ости у материалов оказались также гемостатические (кроео-останавлиЕащие) свойства.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован способ синтеза терефталоил-бис-^-аминокислот и на их основе подучены поликонденсационные мономеры -циклические активированные диэфиры - 4,4'(К) замещенные 2,2-п--фенилен-бис(оксазолин-5-он)ы. Для синтеза указанных мономеров использованы следующие с*.-аминокислоты: глицин, аланин, лейцин, Еалин, норвалин, изолейцин, норлейцин, фенилаланин, метио-нин, адамантил-1-глицин, ^-адамантшг-1-аланин, причем бис-окса-золиноны на основе последних 8 аминокислот получены впервые.

2. С целью оценки реакционной способности полученных бис-оксазолинонов изучена кинетика анилинолиза. Показано, что природа радикала К в азлактонном цикле не оказывает решающего влияния на скорость аминолиза и наиболее реакционноспособный среди них (В = -(О^^СНд) всего в 3,5 раза активнее наименее реак-ционноспособного (В = -СН(СНд)2). Установлено, что 4,4(К)заме-щенные 2,2-п-(!енилен-бис-оксазолиноны относятся к категории мономеров с независимой реакционной способностью функциональных групп.

3. Исследованы основные закономерности поликонденсации бис-

оксазолннонов с диаминами. Получены высокомолекулярные пленко-и волокнообразущие полиамида и сололиамиды, содержащие в основных цепях макромолекул остатки tí, -аминокислот, многие из которых относятся к категории незаменимых.

4. Впервые показана возможность синтеза полиамидов взаимодействием 2,2-п-фенилен-бис(оксазолин-5-он)ов с И.и'-блс-триые-тилсилилироизводными алифатических диаминов. Изучены основные закономерности этого процесса. Разработанная реакция была распространена на алкиловые эфиры ,Ме-бис-триметилсилил-Ь-лизина. В результате ваерте быт подучены функциональные полиамиды,содержащие в основной цепи дипептидные фрагменты, осуществлена поликонденсация, где рост цепи одновременно является реакцией формирования пептидной связи.

5. Впервые для синтеза полиамидов были использованы телехе-лические олигопептиды с различным содержанием Ь -фенилаланина и L -лейцина с концевыми аминогруппами (Mw=~800); получены сегментированные сополиамиды, содержащие полипептздные блоки в основных цепях макромолекул.

6. Изучена биодеградация ln v'ilro амидных и эфирных производных N,И'-терефталоил-Тэи-фенилаланина <±-химотрипсином.Показано, что эти субстраты ие вызывают инактивации фермента,способны подвергаться специфическому гидролизу, причем гидролиз эфирных субстратов протекает со значительно более высокой скоростью, чем амидных. Изучена также биодеградация in vivo подученных полиамидов и показано, что полиамиды, содержащие олиго-пептидные фрагменты деградируют с наибольшей скоростью.

7. Изучена биосовместимость сополиами.да N , N'-тереф/галоил--DL.-фенилаланина и N .Ы'-терефталоил-'ОЬ-Еалина (50:50 мол.*) с гексаметилендиамином методами имплантационного теста и тканевой культуры. Сделано заключение.о высокой биосовместимости этого сополиамида. Указанные данные, в совокупности с данными хирургических, иммунологических, токсикологических экспериментов, высокой гемостатичностью дают основания рекомендовать вышеуказанный сополиамид для клинических испытаний в качестве хирургических материалов.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

I. Кацарава Р.Д., Харадзе Д.П., Кирмелашвили Л.И., Бен.циа-еешш Т.И., Заалишвили М.М. Синтез полиамидов, содержащих фер-

ментатиЕно расщепляемые связи пептидного тина в основных цепях макромолекул //Сообщения АН ГССР. - Тбилиси. - 1984. - Т.114. -№ 2. - С.321-324.

2. Кацарава Р.Д., Харадзе Д.П., Кирмелашвили Л.И., Заалипти-ли М.М. Гетероцепные полимеры на осноЕе природных аминокислот. Оксазолиноновый метод синтеза полиамидов, содержащих фермента-тивно расщепляемые связи в основных цепях макромолёкул // Acta

Polymeries . - 1985. - Т.36. - № 1а. - С.29-38.

3. Чефелин П., Масарж Б., Харадзе Д.П., Кирмелашвили Д.И., Омиадзе Т.Н., Бурчуладзе М.Г., Эдилашвили Л.А., Кацарава Р.Д. Синтез и исследование биодеструкции полиамидов, содержащих фер-ментативно расщепляемые пептидные сеязи е осноеных цепях макромолекул (аэлактонный метод). В кн.: Поликонденсационные процессы. - София, изд-во Болгарской АН. - 1986. - С.66-76.

4. Бурчуладзе М.Г., Галатенко Н.А., Буфиус Н.Н., Кирмслашзи-ли Л.И-., Харадзе Д.П., Пхакадзе Г.А., Эдилашвили Л.А., Кацарава Р.Д. Оценка биосовместимости полиамида на осноЕе производных

Ч -аминокислот //Известия АН ГССР, сер.биол. - Тбилиси. - 1989. - Т.15. - № 6. - С.375-379.

5. Хосруашвили Т.А., Кирмелашвили Л.И., Харадзе Д.П., Каца-раЕа Р.Д. О реакционной способности 4,4^-дизамещешшх 2,2-п-фени-лен-бис(оксазолин-5-он)ов //Сообщения АН ГССР. - Тбилиси. -1989. T.I36. - С.329-332.

/буЬдо

vboçobo Î0i6