Структура ионофорных антибиотиков энниатинового и валиномицинового рядов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

Введение

Глава I. Строение линейных и циклических олигопептидов в кристаллах.

1.1 Введение.

1.2. Классификация пептидов.

1.3 Номенклатура конформационного состояния пептидов.

1.4 Строение линейных пептидов

1.4.1 Конформация основной цепи

1.4.2 Строение концевых групп незащищенных пептидов

1.5 Циклические пептиды.

1.5.1 Циклические дипептиды и дидепсипептиды

1.5.2 Циклические трипептиды

1.5.3 Циклические тетралептиды.

1.5.4 Циклические пентапептиды

1.5.5 Циклические гексапептиды

1.5.6 Циклические гептапептиды

1.5.7 Циклические октапептиды.

1.5.8 Циклодека- и ундекапептиды.

1.5.9 Циклододекапептиды.

1.6 Внутримолекулярные водородные связи в пептидах

1.7 Строение пептидной группы.

1.8 Боковые цепи.

1.9 Строение комплексов пептидов с металлами. Упаковка молекул.

Глава 2. Строение циклических дипептидов и дидепсипептидов

2.1 Введение.

2.2. Строение циклического дидепсипептида Т) -метил-валил- X) - Л -оксиизовалерила, цикл о

-Л - Ме Ма1 Нул - ] .НО

- з

2.3. Строение циклического дидепсипептида L -валил

L - at - оксиизовалерила, цикло \~L- У at

L-Hyi- ]

2.4. Строение циклического дипептида L -валилсаркозила, WBXbl-L-Vcii-Sar-]

2.5. Строение цис-амидной и цис-сложноэфирной групп в валил-содержащих циклических дипептидах и дипепсипептидах.

2.6. Сравнительная характеристика конформаций шести-членных валил-содержащих циклов.

Глава 3. Строение циклических стереоизомерных тетрадепсипептидов цикло [-(Mei/ad-Hyi)^]

3.1. Введение.

3.2. Строение UDJJL - стереоизомера тетрадепси-пептида цикло [-(MeVai-Hyiizrl

3.3. Строение JLLJ) - стереоизомера тетрадепси-пептида цикло \гШЫ-Нр)г\

3.4. Строение "тетраэнниатина" - LJJLU - стерео-изомера тетрадепсипептида цикло[-(MeVetС-Нул-Jz~] ^

3.5. Строение LJJDJ] - стереоизомера тетрадепсипептида щшо[-(Ме\/а£-Иу>с)2-}

3.6. Строение LLBU - стереоизомера тетрадепсипептида цикло [-(MeVat-Hyi )z-]

3.7. О строении DDBJJ и LLLL - стереоизомеров тетрадепсипептида цикло [-(MeVa£- Ну*

3.8. Сравнение конформаций молекул ряда стереоизомеров тетрадепсипептида цикло [-(MeVat-Hffih-i

3.9. Геометрические характеристики N -метилашдной и сложноэфирной групп в тетрациклах

Глава 4. Строение циклических гексадепсипептидов.

4.1. Введение.

4.2. Строение циклического гексадепсипептида цикло

-(L-MeVat-Jj-HyiJj-] -ионофорного антибиотика энниатина В. ¿

4.3. Строение Noc^hli - комплекса энниатина В -цикло [-{L-Meva t -])-Hu¿)3 -J ■ Met A(i (N03)y Y}SCH3OH-3HzO

4.4. Строение циклического гексадепсипептида цикло

LDLLJJL -аналога энниатина В.

4.5. Строение RS*- комплекса LULLUL -аналога энниатина В - цикло [-L-Me\¡af-])-H^- L-MeVal-L-Hyi -U -Me Va€-L-Hyi-]'R6 NCS

4.6. Сравнение конформационных состояний остатков

А/-метилвалина ( N-Me\fcd ) и -окси-изовалериановой кислоты ( HyL ) в изученных гексадепсипептидных циклах

4.7. Строение Д/ -метиламидной и сложноэфирной групп в изученных гексадепсипептидных циклах.

Глава 5. Строение циклических депсипептидов с большими размерами циклов.

5.1. Введение

5.2. Строение окта-мезо- - валиномицина цикло [~(1I-Va¿-L-Hif¿- L-Va€-J}-H¿f¿)z~]

5.3. Строение [М^ Йбг2'6] октавалиномицина mwol(]D-Va¿-L-Meeái~L-\/a¿-I}-Htfi)z-]

5.4. Строение [Me/í-diz2] валиномицина цикло [-л-Va í-L -Meß la -Ma t-JO-Hyi -(B-Vai-L'Lac-L-Vßtt-JJ-H^);].

5.5. Сравнение конформаций структурно изученных соединений октавалиномицинового и валиномицинового радов. О механизме взаимодействия молекулы валиномицина с ионом металла

5.6. Строение /У-метиламидной и сложноэфдрной групп в больших циклах; "стандартные" группы

Глава 6. Строение и активность антибиотиков энниатинового ряда. Структурные аспекты трансмембранного переноса ионов металлов этшли антибиотиками

6.1. Введение.

6.2. Связь структуры и активности антибиотиков энниатинового ряда и их аналогов

6.3. Строение мембран и механизмы трансмембранного переноса ионов металлов.

6.4. Структурные аспекты грансмембранного переноса ионов металлов антибиотиками энниатинового

Глава 7. Определение кристаллических структур.

7.1. Характеристика кристаллов. Получение и обработка экспериментальных данных.

7.£. Расшифровка кристаллических структур.

7.3. Уточнение кристаллических структур.

Основные результаты работы.

Циклические пептиды и депеипептиды представляют собой обширный класс как природных, так и синтетических биоорганических соединений, многие из которых обладают высокой биологической активностью. К этому классу соединений относятся также антибиотики энниатинового и валиномицинового рядов, которые по своей химической природе являются циклическими гекса- и додекадепсипептидами. Физиологическая функция этих антибиотиков, называемых ионофорными, состоит в индуцировании транспорта ионов щелочных и щелочноземельных металлов через биологические мембраны, приводящем к изменению равновесной внутриклеточной концентрации этих ионов и к гибели бактериальной клетки,

Энниатиновые и валиномициновые антибиотики находят широкое применение в качестве инструментов для исследования биологических и искусственных мембран, их строения и свойств, механизма трансмембранного переноса ионов металлов. С изучением же структуры и функции биологических мембран связаны в настоящее время многие важнейшие направления биологии, химии, физики. И это естественно, потому что мембранные системы ответственны за такие важнейшие биологические процессы, как, например, дыхание и биосинтез. Не будет преувеличением сказать, что прогресс, достигнутый за последние годы в изучении мембранных явлений, в значительной степени обусловлен широким использованием антибиотиков-ионофоров.

Одной из основных целей исследования строения и свойств макроциклических комплексонов, в число которых входят валиномициновые и энниатиновые антибиотики,является создание основ для синтеза широкого спектра веществ, необходимых медикам и биологам для направленного и избирательного увеличения ионной проницаемости биологических мембран. В то же время изучение конформационно-зависимого связывания ионов макроциклическими комплексонами создает предпосылки для выяснения строения ка-тион-связывающих центров в таких биологических системах, как, например, /<, АДх- зависимая АТФ-фаза.

Если до последнего времени макроциклические комплексоны использовались преимущественно в биологических исследованиях, то теперь все более и более ясными становятся перспективы их применения в других областях: в аналитической и неорганической химии - для разделения ионов металлов и солюбилизации труднорастворимых солей, в органической химии - для воздействия на направление, скорость и стереоспецифичность нуклеофильных реакций, в технике - для создания высокоселективных катион-чувствительных датчиков и различных ионообменных материалов.

В течение ряда лет в Институте биоорганической химии АН СССР большой группой ученых во главе с М.М.Шемякиным, Ю.А.Овчинниковым, В.Т.Ивановым, В.Ф.Быстровым проводились исследования строения антибиотиков валиномицинового и энниатинового рядов в растворах с помощью различных физико-химических и расчетных методов. В ходе этих исследований было установлено, что мембранная активность указанных антибиотиков связана с их ком-плексообразующей способностью. При этом ионная селективность комплексообразования зависит не только от числа и природы ли-гандных групп, но в значительной степени определяется конформ-ационными характеристиками молекулы в целом. Для большого числа соединений - нативных антибиотиков и различных их аналогов, было установлено строение в растворах как свободных молекул, так и комплексов с металлами. Полученные результаты легли в основу развитых учеными представлений о транспорте ионов через мембрану с помощью молекул-переносчиков.

В настоящей работе тот же класс соединений изучен в кристаллах с помощью метода рентгеноструктурного анализа, который характеризуется высокой степенью информативности, однозначностью и точностью результатов. Следует отметить, что этот метод имеет дело с кристаллическим веществом, а все биологические процессы протекают в растворах. Однако наши исследования, как и исследования других авторов показывают,что конформация, найденная в кристалле, близка к одной из энергетически возможных конформаций или конформаций, существующих в растворах. Если же молекула достаточно жесткая,то эти конформации просто совпадают.

Структурные исследования проводились, главным образом, с целью выяснения механизма действия ионофорных антибиотиков, в особенности антибиотиков энниатинового ряда, на атомно-моле-кулярном уровне. Для всестороннего изучения конформационных особенностей молекул антибиотиков, ответственных за биоактивность, исследовались как сами антибиотики, так и различные их аналоги - стереоизомерные, с измененным в большей или меньшей степени набором конфигурация (I или Ъ ) атомов С^; полимерго-мологи, т.е. аналоги с измененным на целое число остатков размером цикла; аналоги с заменой одних боковых радикалов на другие или отдельных (окси)аминокислотных остатков на другие . ок-си)аминокислотные остатки. Изучение аналогов позволяет выявить конформационные возможности остатков амино- и оксикислот, пептидной и сложноэфирной групп.

Ставилась также задача определения точных значений конформационных параметров молекул и отдельных остатков; эти значения могут быть использованы в качестве опорных при исследовании пептидных и депсипептидных систем в растворах и при теоретических расчетах таких систем.

Важным представлялось сравнение конформаций молекул в кристаллах и растворах для получения новых доказательств возможности использования криеталло-структурных данных для описания строения биомолекул в растворах, где эти молекулы живут и работают.

Наряду с исследованием молекул в свободном состоянии, проводилось определение строения комплексов этих молекул с ионами металлов. Это давало возможность проследить конформа-ционные изменения молекул при связывании катионов, зафиксировать активные в смысле связывания катионов позиции, определить стереохимические характеристики металл-лигандного комплекса.

Все перечисленные выше задачи решались на примере большого ряда соединений с различным размером цикла - от 6 до 36-членного. В их число входят, прежде всего, ионофорный антибиотик энниатин В, цикло и его ШИШ,- сте-реоизомерный аналог с измененной последовательностью конфигураций трех последних остатков; Nct.Ni- комплекс энниатина В и М -комплекс их ии -аналога; ионофорный антибиотик вали-номицин, с заменой только одного остатка молочной кислоты ('¿ас) на остаток метил-аланина (М£Й{&) или, иными словами, одного атома кислорода в основной цепи молекулы на метилированный атом азота; аналоги октавалиномицина, цикло с заменой остатков на остатки Ь-Нш. (мезо-Н(Л-ана.д О ¿¿Л лога), либо тех же остатков Ь-1(ХС на остатки -аналог). Исследовались также тетраэнниатин, цикло и РОД его стереоизомерных аналогов; дипептид цикло [-L-Mat- S СНГ-] и дидепсипептиды цикло [-[ - Mal- L-U^-J и uyimol-Jj-iieVûif-JJ-f-i^i-] , причем два последних соединения явились первыми структурноизученными циклодидепсипепти-дами. Диссертация состоит из семи глав. В первой главе обобщен материал по строению как линейных, так и циклических пептидов и депсипептидов в кристаллах; рассмотрены принципы классификации пептидов и номенклатура, принятая при их описании. Для линейных пептидов проанализированы конформационные состояния основной цепи, а также строение концевых групп.

При анализе структур.циклических пептидов и депсипептидов особое внимание уделялось принципам свертывания пептидной (депсипептидной) цепи при замыкании цикла, а также рассмотрению соотношения структура - свойство (биологическая активность). Отдельно рассмотрены строение пептидной группы (и получены точные ее геометрические параметры), боковых радикалов, охарактеризованы и классифицированы внутримолекулярные водородные связи, реализующиеся как в линейных, так и в циклических пептидах.

Глава 2 содержит результаты структурного исследования валил-содержащих циклических дипептидов и дидепеипептидов. Наряде с анализом конформаций всех изученных молекул в отдельности, проводится также сравнительный анализ конформаций структурно-изученных валил-содержащих циклов и рассматривается строение цис-амидной и цис-сложноэфирной групп в этих циклах.

В главе 3 приводятся данные по строению в кристаллах тетраэнниатина, цикло , и его стереоизомерных аналогов; проводится сопоставление экспериментальных конформационных параметров молекул с рассчитаными теоретически; изучается связь между симметрией цикла и симметрией в характере и расположении боковых радикалов, между напряженностью цикла и легкостью его образования из соответствующей линейной молекулы; и, наконец, приводятся средние характеристики N-метиламидной и сложноэфирной групп в твтрациклах.

Наиболее объемная четвертая глава посвящена строению в кристаллах гексациклов - энниатина В и его ЬЛЬЬЛЬ-аналога в свободном состоянии и в виде комплексов с металлами. В результате структурных расшифровок получены уникальные данные о конформационных изменениях в молекулах при вхождении их в комплексы, о типах связывания ионов металлов антибиотиками энниатинового ряда и местах локализации этих ионов. Все эти данные легли в основу развитых в главе 6 представлений о механизме ионного транспорта антибиотиками данного ряда. В главе 4 проводится сопоставление конформаций гексадепсипептид-ных молекул, реализующихся в кристалле, растворе и полученных путем теоретических расчетов. Эта глава содержит также сравнительную характеристику конформационных состояний остатков N-метиламидной и сложноэфирной групп в этих циклах.

В главе 5 анализируется строение структурно-изученных больших циклов: окта-мезо-/^-валиномицина, [Мейбг2'6]--октавалиномицина (24-членные циклы) и [МеШ2-} валиномици-на (36-членный цикл). Конформационные характеристики молекул ставятся в параллель с их биологической активностью. Для выявления генетической связи между на первый взгляд очень разными конформациями молекул в рядах октадепсипептидных и доде-кадепсипептидных циклах проведен сравнительный анализ конформационных состояний молекулярных циклов в каждом из этих рядов.

В этой же главе рассматриваются различные стадии взаимодействия иона с ионофорным антибиотиком валиномицином на атомно-молекулярном уровне. В одном из разделов этой главы анализируется строение /V-метиламидной и сложноэфирной шрупп в больших циклах и получению характеристик "стандартных" групп.

Глава 6 посвящена рассмотрению связи между строением и активностью антибиотиков энниатинового ряда, рассмотрению, которое базируется на структурных данных, собственных и литературных. Прежде всего, как это упоминалось ранее, фиксируются активные в смысле связывания ионов металлов "места" молекул. Затем анализируются существующие представления о механизмах транспорта ионов через биологические и искусственные мембраны и формулируются структурные аспекты этого транспорта на атомно-молекулярном уровне.

И, наконец, в главе 7 представлены методики получения и обработки экспериментальных данных, методы решения и уточнения структур, в большинстве своем значительно превышающих средний уровень сложности.

Материалы диссертации отражены в 61 публикации, в том числе в четырех больших работах обобщающего и обзорного характера, опубликованных в СССР и за рубежом (США, ШР), и многократно докладывавшихся на Международных и Всесоюзных съездах, симпозиумах и совещаниях.

Мне посчастливилось многие годы проработать под руководством академика Б.К. Вайнштейна. Постоянное внимание, консультации и советы Бориса Константиновича оказали неоценимую помощь при выполнении исследования.

Успех исследований, результаты которых представлены в настоящей работе, во многом определялся многолетним научным контактом с учеными из Института биоорганической химии - академиком К).А. Овчинниковым, чл.-корр. АН СССР В.Т. Ивановым и их сотрудниками, чьи выдающиеся достижения в области изучения мембрано-активных комплек-сонов в растворах послужили толчком и основой для изучения данного класса соединений и в кристаллах. Этим ученым я обязана своим становлением как специалиста в области стереохимии мембрано-активных соединений, им я благодарна за чрезвычайно полезные обсуждения результатов и ценные замечания, за тот великолепный набор кристаллов, без которого работа просто бы не состоялась.

В исследовании отдельных групп соединений принимали участие Н.Е.Жухлистова, В.И.Смирнова, Н.В.Назимова, З.Каримов, К.М.Поляков, А.М.Михайлов, В.В.Борисов, А.Д,Васильев, которым я благодарна не только за их вклад в работу, но и за радость человеческого общения.

Структурные расчеты в большинстве своем проводились по программам, написанным В.И.Андриановым, В.В.Борисовым, Л.А.Мурадян, А.Б.Товбисом; к этим ученым приходилось неоднократно обращаться за помощью и консультациями.

При съемках на дифрактометрах неоценимую помощь оказали Ю.В. Некрасов, Н.И.Сосфенов, Д.М.Хейкер с сотрудниками, В.И.Пономарев.

В оформление работы внесли свой вклад Н.Е. Жухлистова, Н.В.Назимова, В.И.Смирнова, К.М.Поляков, О.В. Мороз. Всем им приношу свою глубокую благодарность.

Выполнению работы способствовала обстановка творческого напряжения, царящая в лаборатории структуры белка Института кристаллографии, которой руководит Борис Константинович Вайнштейн.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в работе данные показывают, что циклопептиды обладают исключительно богатыми конформационными возможностями, принимая, в зависимости от первичной структуры, конформации, напоминающие складчатый лист, диск, савдвич, пропеллер, браслет и т.д. В кристалле, как правило, реализуется наиболее низкоэнергетическая расчетная конформация, близкая к одной из конформаций, существующих в растворе. Свойства такой конформации удивительно точно соответствуют выполняемой биологической функции.

Незамещенные амидные группы /УН циклопептидов проявляют ярко выраженную тенденцию к образованию ВМВС с атомами кислорода карбонильных групп. К числу наиболее устойчивых ВМВС относятся связи типа 4-^1, менее устойчивы связи типа 5

Конформационные ^, V -точки отдельных остатков чаще всего, располагаются вблизи соответствующих разрешенных областей, но для напряженных циклических систем могут смещаться из этих областей, либо перемещаться в несвойственные для данного типа остатков "чужие" области.

Получены геометрические характеристики цис- и транс-амидной и транс-сложноэфирной групп в циклах разного размера, а также прослежены изменения этих характеристик при образовании комплексов с металлами .