Выделение и характеристика рецептора нейротоксина каракурта и его составных компонентов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.М. ШЕМЯКИНА

Ва правах рукописи УДК 577.112.083.3:595.44-114,.52

СУРКОВА Ирина Николаевна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕЦЕПТОРА НЕЙРОТОКСИНА КАРАКУРТА И ЕГО СОСТАВНЫХ КОМПОНЕНТОВ

02.00.10 - Виоорганическая химия, химия природных ■ и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1990

Работа выполнена в проблемно-целевой группе химии рецепторов латротоксина

Ордена Трудового Красного Знамени Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина АН СССР

Научные руководители: академик Ю.А. Овчинников

доктор химических наук Е.В.Гришин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,.

П.М.Рубцов

кандидат химических наук Ю.Н.Уткин

Ведущая организация - Институт белка АН СССР

Защита состоится " нЛ^/с/ 1990 года в ^часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.Ы.Шемякина АН СССР по адресу: 117871 ГСП-7 Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР.

Автореферат разослан " 1990 года

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В.А. Несмеянов

Актуальность проблем. Генерация нервного импульса, его распространение и передача от одного нейрона другому - эти процессы, лежащие в основе функционирования нервной системы, являются предметом исследования современной физико-химической биологии и вейрохимии. Однако если первые два в настоящее время подробно изучаются уже на молекулярном уровне - достаточно сказать, что установлены первичные структуры и предложены модели пространственной организации ацетилхолино-вых рецепторов и потенциалчувствительных натриевых каналов - то механизм последнего, не смотря на впечатляющие успехи электрофизиологических, фармакологических и электронномикроскопических исследований, не выяснен до конца даже на функциональном уровне, а с точки зрения биоорганической химии является фактически "terra Incognita".

Передача нервного импульса осуществляется в синапсе - области близкого контакта двух возбудимых клеток, образованного пресинапти-ческой мембраной аксоналъного окончания нейрона, передающего сигнал, и постсинаптической мембраны воспринимающей клетки. Пресинаптичес-кая мембрана осуществляет секрецию нейромедиаторов, являющуюся важным звеном передачи нервного импульса. В настоящее время ведется интенсивный поиск белков, участвующих в выполнении этой специализированной функции нервного окончания.

Весьма плодотворными в этих поисках оказались иммунохимические, генноинженерные методы и исследования синоптических процессов фосфо-рилирования: благодаря им идентифицированы, выделены и частично охарактеризованы такие специфические для нервных окончаний белки, как синапсин, синаптофизин, синаптобревин, Р65, В-50. Установлены первичные структуры и некоторые функциональные свойства части из них, предложены модели их пространственной организации и высказаны гипотезы об их рож в выбросе нейромедиаторов.

Другим перспективным подходом в этом направлении явилось использование нейротоксинов, специфично воздействующих на секреторную функцию нервного окончания. Один из таких токсинов - а-латротоксин из яда паука каракурта - активирует нейросекреторный процесс в различных синапсах млекопитающих. С помощью меченного иодом-125 латроток-сина (ЛТ) были идентифицированы и изучены специфичные мембранные рецепторы из мозга ряда животных и культивируемых секреторных клеток PG-I2. Были получении данные, указывающие на локализацию рецептора ЛТ на внешней стороне пресинаптической мембраны, взаимосвязь с метаболизмом фосфоинозитидов, и возможную функцию к5тионного, преимущес-

твенно кальциевого, канала, а также на существование эндогенного ли-ганда к JIT-рецептору. Высказывались гипотезы о связи рецептора ЛТ с системой цитоскелетных элементов нервного окончания, регулирующих транспорт синаптических везикул. В 1985 году Meldolesl с соав. осуществили солюбилизацию рецептора и показали возможность использования аффинной хроматографии для выделения рецепторных молекул. Согласно данным этих исследователей, при хроматографии солюбилизирован-ных мембран из мозга быка на иммобилизованном ЛТ задерживаются белки с молекулярной массой 200 ООО и 54 ООО, причем первый после восстановления дисульфидных связей образует полипептиды с молекулярной массой около 66 ООО. Согласно другим данным, рецептор ЛТ в синапто-ссмзх из мозга крыс обладает молекулярной массой около 95 ООО (Ушка-рев и Гришин, 1936). Однако, поскольку эти работы носили аналитический характер, окончательный вывод о молекулярных характеристиках рецептора сделать было сложно.

Цель работы. Настоящая работа является частью комплексных исследований, проводимых в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина АН СССР, по изучению структуры и функции пресинаптического рецептора нейротоксина каракурта. Данная работа посвящена разработке метода препаративного выделения белков рецепторного комплекса, характеристике его состава, идентификации собственно рецептирующих компонентов, выделению отдельных белков комплекса в индивидуальном виде и их химическому анализу.

Научная новизна и практическая ценность работы. Предложен простой эффективный метод выделения пресинаптического рецептора нейротоксина каракурта из мембран коры головного мозга быка, позволяющий получать рецепторные белки з препаративных количествах. Впервые показано, что в состав рецептора входят белки с молекулярной массой 200 ООО, 160 ООО, 79 ООО и.45 ООО в соотнощении 1:1:2:2. Установлено, что функцию связывания с нейротоксином выполняют гликопротеины мол. массы 200 ООО и 160 ООО; определены параметры связывания и Д ■ С помощью пептидного картирования установлена существенная гомология в первичной структуре собственно рецептирующих белков. Впервые выделены в индивидуальном виде все компоненты рецептора, определены их аминокислотные и углеводные составы.

Разработка препаративного способа очистки рецептора и методов выделения его индивидуальных компонентов позволила приступить к иссле-

цованию первичной структуры этих белков и определению их эндогенных функций, что открывает широкие возможности для изучения и понимания зространственной организации и молекулярных механизмов функционирования как самого рецептора, так и пресинаптической мембраны в целом.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работ.

Апробация работы. Основные результаты докладывались на V и VI конференциях молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии ( Пущино, 1988; Бехель, 1989); I Испано-советском конгрессе по физико-химической биологии (Гранада, 1937); на V Советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функции" (Рига, 1988); на XIX конгрессе Международного союза биохимиков (Прага, 1988); на I Советско-японском симпозиуме "Рецепторы: структура и функции" (Москва, 1989); на 12 встрече Международного общества нейрохимиков ( Альгав, 1989).

Объем работы. Диссертация изложена на ¿¿5 страницах машинописного текста. Она состоит из введения, обзора литературы "Специфические белки пресинатических окончаний", главы, посвященной результатам к их обсувдению, из экспериментальной части и выводов. Список цитируемой литературы включает наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Выделение рецептора

В соответствии с литературными данными и на основании собственного .анализа содержания рецептора в различных отделах головного мозга быка, в качестве основного объекта для выделения рецептора был выбран наиболее доступный и богатый источник рецепторов латротоксина -мембраны из коры головного мозга быка, мембраны получали по стандартной методике, включающей гомогенизацию ткани в растворе 0,32 М сахарозы, осаждение грубой мембранной фракции, ее последующее дифференциальное ресуспендирование в растворе 20 мМ трис-НС1 и повторное осаждение. Выделение мембран, равно как и все последующие этапы очистки рецептора латротоксина проводили при 4°С в присутствии ингибитора сериновых протеиназ фэнилметилсульфонилфторида для предотвращения протеолитической деградации белковых компонентов рецептора.

Рецептор латротоксина является интегральным мембранным белком, а практически все методы выделения подобных белков неизбежно требуют их перевода в растворенное состояние путем разрушения мембранной структуры различными детергентами. При выборе солюбилизиругацего агента должны учитываться не только полнота извлечения рецептора из мембран, но и степень сохранения его тестируемой биологической активности. На основании анализа литературных данных, а также с учетом результатов собственных экспериментов по подбору солюбилизируыцего агента и условий солюбилизации, нами был выбран неионный детергент тритон Х-100. Согласно полученным ранее данным, солюбилизированная форма рецептора существенно отличается от мембраносвязанной появлением критической зависимости связывания [1251]ЛТ от присутствия ионов кальция. Поэтому выделение рецепторных компонентов и исследование их токсин-связывающей активности проводилось в присутствии солей кальция.

Поскольку абсолютное содержание рецептора латротоксина в выбранном объекте очень низкое - 0,3-0,5 пмоль/мг белка, самым эффективным способом очистки и препаративной наработки рецептора представлялась биоспецифическая хроматография солюбилизированного рецептора на сорбенте с ковалентно иммобилизованным латротоксином - метод, позволяющий достигать тысячекратных очисток (рис.1).

Солюбилизированные тритоном Х-100 мембраны после добавления хлорида кальция и хлорида калия (до конечных концентраций 2,5мМ и ОДЗМ соответственно) наносили на последовательно соединенные колонки с сефарозой 4В и с аффинным сорбентом, полученным иммобилизацией латротоксина на ВгСН-активированной сефарозе. При этом происходила полная сорбция рецепторной активности. Использование преколонки с сефа-розой-4В предотвращало механическое загрязнение аффинного сорбента оставшимися мелкими фрагментами мембран и уменьшало неспецифическуга сорбцию белков на матриксе с латротоксином. Поскольку необходимая степень очистки составляет порядка 10 ООО, особое значение имела тщательная промывка сорбента буфером, содержащим 0,15 М КС1 (не менее 20 объемов колонки). Уменьшение объема промывочного буфера приводило к увеличению количества фоновых белков, а также к нестабильности белковых компонентов рецептора.

Следует заметить, что десорбция рецептора с иммобилизованного ли-ганда является одной из основных проблем в аффинной хроматографии, а

Рис.1.

Схема выделения рецептора латротоксина.

данный случай осложнялся невозможностью использования самого токсина для конкурентного вытеснения вследствие трудности его последующего отделения в нативных условиях. При разработке способа элюции исходили из полученных ранее данных по влиянию ионной силы на диссоциацию комплекса [1251]ЛТ-рецептор и критической зависимости специфического связывания [1251]ЛТ солюбилизированным рецептором от присутствия ионов кальция. Повышение ионной силы среды в отсутствии Са2+ вызывало быстрый обратимый распад комплекса [1г51Ш-рецептор: диссоциация комплекса была заметна уже • при 0,2М хлорида калия, а при I М КС1 комплекс диссоциировал практически полностью за 15мин. Поэтому эффективная элюция рецептора осуществлялась буфером с 1М хлорида калия и 1СмЫ ЮТА. Таким образом, элюция рецептора была осуществлена в более мягких условиях, чем было предложено Ме1йо1еэ1 (1985) - с использованием 6М мочевины.

Таблица I

Выделение рецептора аффинной хроматографией на латротоксин-сефарозе

Количество белка Удельная

Этап выделения __связывающая

Рецепторная активность Выход Очистка № % активность пмоль*/мг %

пмоль* белка

Мембраны 6500 100 2100 0,3 100 I

Тритонный 2800 43 840 0,3 40 I

экстракт

IM KCl/1 OmiM EDTA

элюат 0,4 0,006 320 800 15 2700

* Приведено количество [1251]ЛТ, связываемого рецептором

Предложенный метод позволяет получать из 200г коры головного мозга быка за 20 часов 0,3-0,4 мг рецепторного препарата с удельной связывающей активностью 0,7-0,9 нмоль/мг белка, то есть 0,21-0,36 нмоль рецептора, что составляет 10-17% от теоритически возможного выхода (табл.1). Причины разброса удельного связывания препарата окончательно не ясны. Возможно, одна из причин - инактивация связывающего компонента в ходе выделения. Не очень высокий для одностадийного выделения выход рецептора, кроме предложенной выше причины, обуславливается прежде всего неполнотой его солюбшшзации из мембран, а также возможным недоопределением активности рецептора использованным методом анализа связывания ( см. далее).

Характеристика связывающей активности очищенного рецептора

В качестве основного метода анализа солюбилизированного рецептора в ходе его очистки и характеристики был использован разработанный ранее в Институте биоорганической химии твердофа&ный метод, использующий сорбционныэ свойства нитроцеллюлозы. Следует, однако, заметить, что часть молекул рецептора, сорбированных на нитроцеллюлозе, может не связываться с латротоксином вследствие стерических препятствий. Поэтому связывающая активность рецептора, определенная этим методом, может быть несколько занижена.

Использование аффинной хроматографии позволило получить препарат белков с высоким удельным связыванием ЛТ. Свойства очищенного рецептора ЛТ ( величина константы диссоциации токсин-рецепторного комплекса, Са-зависимость, чувствительность к нагреванию, действию про-текназ и денатурирующих реагентов, ингибирование связывания' лекти-ном) не отличаются от свойств рецептора в исходном детергентном экстракте мембран.

Препарат рецептора обладал способностью связывать [1251]ЛТ после диализа против буферов с низкой ионной силой в присутствии ионов Са2+ при рН 7,5. Анализ связывания [1251]ЛТ препаратами рецептора, сорбированными на нитроцеллюлозе, показал, что связывание очищенного рецептора характеризуется следующими параметрами: Яй=9х10_1ОМ и 5та==0,9 нмоль/мг белка. Кривая Скетчарда имеет характер прямой линии, что свидетельствует о налички участков связывания с одинаковым

В. нм/мг

О.С 0.3-

02г

0.1-

02 ОА 0.6 ¿8 1.0 г2 1.4 Р.НМ

Рис.2. Зависимость уровня специфического связывания 11г51]-ЛТ очищенным рецептором от концентрации [1251]-ЛТ.

Вставка: рецепция [1251]-ЛТ очищенным рецептором в координатах Скэтчарда ; В - количество связанного [1251]'-ЛТ; г - концентрация свободного [1251]-ЛТ.

сродством к латротоксину (рис.2).

Связывающая активность очищенного рецептора весьма стабильна, при 4° С связывание [1г51]ЛТ сохраняется на постоянном уровне более двух недель. При комнатной температуре рецептор сохраняет исходную активность в течение по крайней мере 10 часов. При повышеннии температуры до 50°С и больше происходит необратимая инактивация рецептора в течение 15-20 мин. Проведение нескольких циклов замораживания-оттаивания не вызывает инактивации рецептора. Полное подавление связывающей активности наблюдалось при действии 1% раствора БГБ, 4М гуани-дин-НС1, -8М мочевины. Так же как и в случае с мембраносвязанным рецептором, лехтин из зародышей пшеницы способен ингиоировать связывание [1251]ЛТ очищенным рецептором с К{=Зх10~7М. Обработка очищенного рецептора нейраминидазой не вызывает его инактивации, однако приво-

лит к исчезновению чувствительности связывающей активности к действию лектина из зародышей пшеницы.

Совокупность полученных результатов позволяет предположить, что полученный препарат представляет собой очищенную солюбилизированную форму мембранного рецептора латротоксина, который имеет гликопротеи-новую природу.

Белковый состав препаратов очищенного рецептора

Электрофоретический анализ полученных в результате биоспецифической хроматографии на ЛТ-сефарозе препаратов рецептора, проведенный как в отсутствие, так и в присутствии восстанавливавших реагентов, показал, что в состав рецептора входят белки с мол. массой 200 ООО, .160 ООО, -79 ООО и 43 ООО (рис. 3). Поскольку данный белковый состав

А500

1-

0.5-

м..

Л

V

г"

[-*200К

-*118К -С 94К

67К

40К

2 и 6 8 10 ЭЛЕКТРОТОРЁТИЧЕСКАЯ ПООЗИЖНОСТЬ.см

Рис.3. Электрофоретический анализ белкового состава очищенного рецептора.

А - денситограмма полиакриламидного геля с очищенным рецептором.

Б - очищенный рецептор. Приведены позиции белков-маркеров

сохраняется и в присутствии при выделении рецептора ряда ингибиторов протеиназ (0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида, I мМ о-фенантролина, 5 мкг/мл пепстатина и 10 мкг/мл лейпептина), а удельная связывающая активность очищенного рецептора составляет порядка 0,7-0,9 нмоль/мг белка, есть основания полагать, что он отражает истинный состав белкового комплекса рецептора латротоксина или по крайней мере его части.

Расчет стехиометрии белковых компонентов на основе денситограммы полиакриламидного геля с электрофоретически разделенным рецептором показал, что белки с мол. массой 200 ООО, 160 ООО, 79 ООО и 43 ООО образуют комплекс в соотношении примерно 1:1:2:2 (рис.3).

Высокомолекулярный компонент рецептора мигрирует в полиакриламид-Ном геле в виде диффузной полосы, характерной для гликопротеинов, как это имеет место, например, в случае а-субъединицы натриевого канала, и может объясняться микрогетерогенностью гликозилирования. Гликопротеиновая природа этого белка, а также компонента 160 ООО была подтверждена в экспериментах по электроблоттингу, когда полученные реплики окрашивали биотинилированным лектином из зародышей пшеницы.

В ряде препаратов имеются минорные компоненты: один либо два близких белка с мол. массами около 120 ООО. Происхождение этого белка пока не ясно, однако он присутствует во многих конечных фракциях элюата с аффинной колонки, где рецепторная активность практически не обнаруживалась. Кроме того, этот компонент элшруется с ЛТ-сефарозы при хроматографировании солюбилизированных мембран в отсутствии ионов кальция. Белок не является токсином, вымывающимся с аффинного сорбента, так как имеет меньшую электрофоретическую подвижность, чем токсин, и не взаимодействует с антителами к токсину. С увеличением времени использования аффинного сорбента, а также с сокращением времени его отмывки появляются некоторые другие примесные белки, в основном с мол. массами 66 ООО, 56 000-55 ООО и 30 ООО. Этот набор является неспецифичным фоном сорбента и соответствует по своей электрофоре тиче ской подвижности белкам, сорбирующимся на преколонке с се-фарозой без токсина и на иммобилизованном токсине, инактивированном обработкой кислотой, а также основным компонентам солюбилизированных мембран.

Идентификация компонентов рецегипорного комплекса, непосредственно связывающих мжротоксин

Комплекс солюбилизированного рецептора с латротоксином, как было показано в более ранних наших исследованиях, весьма устойчив к диссоциирующему воздействию ионной силы в присутствии ионов кальция. Это позволило ввести в одностадийный метод выделения рецептора дополнительную ступень предъэлюции кальций-содержащими буферами с возрастающей ионной силой в целях улучшения отмывки аффинного сорбента от фоновых белков, количество которых, как уже было сказано, возрастало с увеличением времени использования сорбента, без опасения вызвать десорбцию рецепторных компонентов.

Промывание аффинного сорбента буферами с линейным градиентом концентрации хлористого калия не привело к заметному уменьшению фоновых белков в рецепторных препаратах, однако позволило выявить тенденцию к раздельной элюции белков рецепторного комплекса: фракции элюата с более низкой концентрацией соли (0,4-0,8М KCl) содержали преимущественно низкомолекулярные компоненты, тогда как основное количество высокомолекулярных обнаруживалось во фракциях, начиная с 0,8М KCl.

Использование в дальнейшем элюции аффинного сорбента ступенчатым градиентом концентрации соли привело к разделению рецепторного комплекса на две группы компонентов: низкомолекулярных 79 ООО и 43 ООО, элюируемых раствором с 0,55-0,65М хлорида калия в присутствии Са2+, и высокомолекулярных 200 ООО и 160 ООО, элюируемых раствором KCl в присутствии кальциевого комплексона ЭДТА (рис.4).

Интересно отметить, что отсутствие в препарате рецептора латро-токсина, выделенном Meldolesi в 1985 г, низкомолекулярных компонентов 79 ООО и 43 ООО может быть следствием жестких условий промывки аффинного сорбента буфером с 0,5 М NaCl, которые, согласно полученным нами результатам, вызывают десорбцию этих белков.

Многократное определение связывающей активности полученных препаратов показало, что ею обладают только фракции высокомолекулярных

1 I > 4 i • 1 «

IHK

»4K

I7K

4IK __M

Рис.4. Электрофэретический анализ компонентов рецептора. I: обозначение электрофоретической подвижности стандартных белков; 2,3: элгааты с ЛТ-сефарозы растворами с 0,6М KCl, 2мМ СаС12 ( 3 ) и IM KCl, 10мМ EDTA ( 2 ); 4-8: латротоксин, индивидуальные компоненты рецептора 200 ООО, 160 ООО, 79 ООО и 43 ООО.

Таблица 2

Разделение рецепторного комплекса на фракции высоко-и низкомолекулярных компонентов

Этап элюции Рецепторная Удельная связываю-

белков Количество белка активность щая активность

с ЛТ-сефарозы МГ пмоль* пмоль*/мг белка

0,6МКС1\2мМСаС1г 0,15 _ _

элюат

IMKC1/10 mM EDTA элюат 0,25 400 I 600

* Приведено количество [1?SI3JIT, связываемого фракциями.

Рис.5. Зависимость уровня специфического связывания [1г51]-ЛТ фракции высокомолекулярных компонентов от концентрации [1г51]-ЛТ. Обозначения как на рис.2.

компонентов (табл.2). Согласно полученным результатам для одного из препаратов (рис.5), параметры связывания составляют 2^0,95x10-10 М, Вта1=1,6 вмоль/мг белка. Выход рецептора в этих препаратах достигал 19% при очистке более чем в 5000 раз.

Для идентификации компонента рецептора, непосредственно связывающего' ЛТ, было проведено разделение фракции высокомолекулярных белков на индивидуальные компоненты анионообменной хроматографией на БЕАЕ-сорбентах (кислая природа рецептора уже была показана ранее). Сопоставление профиля связывания [1251]-ЛТ полученными фракциями с их электрофоретическим анализом (рис.6) показало, что оба индивидуальных гликопротеина специфично взаимодействуют с токсином. Было отмечено также, что после разделения рецептирующих компонентов происходит быстрое падение их связывающей активности, что может быть связано с частичной делипидизацией солюбилизированных белков при хроматографии.

Таким образом, в получаемых аффинной хроматографией препаратах рецептора присутствуют два связывающих латротоксин белка. Если предположить, что каждый белок взаимодействует с одной молекулой токсина, то теоретически возможное удельное связывание составит

А 8 12 16 обьем. мл

160 ООО

Б

7 12 16

_ род ООО

_ . 51911 ' •

Рис.6. Разделение белков 200 ООО и 160 ООО ионообменной хроматографией ( А ). Концентрация соли (---); поглощение

элюата ( ); специфически связанный [1251]ЛТ (-0-0-). Б - электрофоретический анализ фракций.

5,5нмоль/мг белка. Определяемое максимальное удельное связывание ЛТ препаратами высокомолекулярных компонентов рецептора составляет болев 30% от теоретически возможного. Эта цифра может быть объяснена как частичной инактивацией рецептора в процессе выделения, так и тем, что не все сорбированные на нитроцеллюлозе молекулы активного .рецептора способны связывать ЛТ в силу стерических препятствий.

Поскольку оба высокомолекулярных компонента содержат центр связывания ЛТ, была проведена их сравнительная биохимическая характеристика. Сравнение пептидных карт, полученных в результате электрофоре-тического разделения продуктов ограниченного протеолиза индивидуаль-

1 2 3 4 5 6 7 6 91011 12

3: . h

- as es

i__

«к

■i

Рис.7. Пептидное картирование высокомолекулярных компонентов, расщепленных протеиназой 8V из St. aureus. 1: пептиды, образовавшиеся в результате автопротеолиза фермента; 2-6: белок 200 ООО без и с 0,1, 0,3, I и 3 мкг протеиназы соответственно; 8-12: белок 160 ООО без и с 0,1, 0,3, I и 3 мкг протеиназы соответственно; стрелкой указаны стандартные белки.

ных рецептирующих компонентов химотрипсином и протеиназой 8V из St. aureus (рис.7), показало наличие высокой степени гомологии в их первичной структуре. Однако причина существования двух молекулярных форм рецептора, очень близких по своей первичной структуре, но различающихся по суммарному заряду молекулы, а также их происхождение и эндогенные функции, остаются на сегодняшний день непонятными.

Как было отмечено выше, специфичное связывание токсина характерно только для высокомолекулярной белковой фракции элюата с аффинного сорбента. Компоненты низкомолекулярной фракции обладают лишь фоновым связыванием [1г51]-ЛТ в диапазоне использованных концентраций 0,5 - 2 нМ (табл.2). Они также не сорбируются на латротоксин-се-фарозе при повторной аффинной хроматографии. Однако, их сорбция происходит в случае предварительной иммобилизации на ЛТ-сефарозе белков высокомолекулярной фракции.

Такое поведение низкомолекулярных компонентов, а также их присут-

Исследование колсплексообразования рецептора

сгвие в получаемых препаратах рецептора, может быть объяснено следующими предположениями. Возможно, низкомолекулярные компоненты имеют низкоаффинный центр связывания, и образование комплекса токсин-рецептор в этом случае не детектируется используемым методом анализа связывания. В этом случае аффинность, по-видимому, повышается в присутствии высокомолекулярных компонентов.

Вероятно и то, что низкомолекулярные белки либо изначально входят, либо, обладая сродством к высокомолекулярным белкам в их нативном состоянии или после их связывания с токсином, образуют в ходе выделения комплексы, малоустойчивые при повышенной ионной силе.

То, что белки 79 ООО и 43 ООО взаимодействуют непосредственно с гликопротеинами 200 ООО и 160 ООО, а также независимость образования цельного рацепторного комплекса от присутствия токсина, было подтверждено экспериментами по биоспецифической хроматографии на ЛЗП-се-фарозе. При нанесении смеси всех компонентов на лектинсефарозу либо малых на тот же сорбент, но с предварительно иммобилизованными большими, белки сорбировались практически полностью. Низкомолекулярные белки в отсутствие высокомолекулярных компонентов не сорбировались на ЛЗП-сефарозе.

Поскольку гликопротеины 200 ООО и 160 ООО могут быть разделены ионообменной хроматографией, причем каждый из них непосредственно взаимодействует с латротоксином, логично предположить, что в полученных препаратах очищенного рецептора ЛТ присутствуют в одинаковом количестве комплексы двух типов, состоящий каждый из трех (либо 3 п) компонентов - 79 ООО, 43 ООО и 200 ООО (либо 160 ООО). Возможно, эти комплексы предтавляют собой два субтипа рецептора с одинаковым сродством к латротоксину, как в случае мозгового высокоаффинного никотинового рецептора.

Для проявления сродства низкомолекулярных белков к высокомолекулярным существенно участив сульфгидрильных групп: в выделенном в присутствии дитиотреита либо иодацетамида рецепторе обнаруживались только высокомолекулярные компоненты. Белки 79 ООО и 43 ООО не могут быть продуктами направленного протеолиза 200 ООО и 160 ООО, так как пептидным картированием по Cleveland не выявлено гомологии ни с высокомолекулярными компонентами, ни между собой.

По-видимому, низкомолекулярные компоненты имеют цримембранную локализацию, так как отсутствуют в рецепторе, выделенном из предвари-

телъно экстрагированных раствором с высокой ионной силой мембран. Можно предположить, что не очень прочная ассоциация низкомолекулярных компонентов с ЛТ-связывашцими белками и их расположение вне мембраны имеет функциональное значение.

Таким образом, существует, по-видимому, два субтипа рецептора латротоксина, и молекулярная организация каждого представляется на сегодняшний день в виде комплекса одного из двух еысокогомологичных ЛТ-связывавдпх гликопротеинов и ассоциированных с ним за счет неко-валентных взаимодействий двух низкомолекулярных белков. Высокомолекулярные компоненты являются интегральными мембранными белками с экспонированной во внемембранное пространство значительной частью молекул, а низкомолекулярные компоненты, соединенные друг с другом в прочный комплекс, расположены вне мембраны. Функциональное значение как комплекса, так и его компонентов, еще предстоит исследовать.

Выделение компонентов -рецептора в индивидуальном виде и их химическая характеристика

Разделение компонентов рецепторного комплекса на высоко- и низкомолекулярные белковые фракции значительно облегчило их дальнейшее выделение в индивидуальном виде.

Препараты высокомолекулярных белков, разделенные аниокообменной хроматографией в нативных условиях, содержали в ряде случаев, согласно электрофоретическим данным, до 10-20% примесных белков, и поэтому не могли быть сразу использованы для дальнейшего анализа. Индивидуальные электрофоретически гомогенные гликопротеины 200 ООО и 160 ООО (рис.4) были получены с помощью высокоэффективной гельпроникаю-щей хроматографии в денатурирующих условиях на двух последовательно соединенных колонках TSK 4000 (рис.8). Было также проведено разделение высокомолекулярных компонентов гельфильтрацией в присутствии SBS и DTT без предварительной ионообменной хроматографии. Из-за довольно близких молекулярных масс разрешение белковых пиков было не достаточным (рис.8), и индивидуальные компоненты получали в этом случае рехроматографией обозначенных фракций.

Фракцию низкомолекулярных компонентов разделить в нативных условиях не удалось ни гель-фильтрацией, ни ионообменной хроматографией, что может объясняться как образованием ими прочного комплекса, так и

Рис.8. Разделение фракции высокомолекулярных белков ( А ) и очистка белков 200 ООО (Б) и 160 ООО (В) на двух последовательно соединенных колонках TSK 4000 в 0,1% SDS. Отмечены границы объединенных фракций.

В 22 26 30 34 38 79 ООО ----------

" ' --—---—43 ООО

Рис.9. Разделение белков 79 ООО и 43 ООО на последовательно соединенных колонках ТЭК 4000 и Т5К 3000 в 0,1% ЭБЭ (А). Отмечены границы объединенных фракций.

Б - электрофоретический анализ фракций после гель-фильтрации.

повышенной тенденцией к агрегации при концентрировании.

Электрофоретически гомогенные низкомолекулярные компоненты были получены только в денатурирующих условиях с помощью высокоэффективной гельфяльтрации в присутствии Б1В на последовательно соединенных колонках ТБК 4000 и ТБК 3000 (рис.4 и 9).

Анализ общего аминокислотного состава индивидуальных компонентов рецептора (табл.3) подтверждает их кислый характер. Все четыре белка сходны в относительном содержании различных аминокислот. Отношение количества полярных аминокислот к гидрофобным (1,6, 1,66, 1,38 и 1,42 соответственно для белков 200 ООО, 160 ООО, 79 ООО и 43 ООО) не позволяет отнести ни один из .компонентов к категории интегральных

Таблица 3

Аминокислотный и углеводный состав компонентов рецептора латротоксина (мол.Ж)*

амино- 200K I60K 79K 43K амино- 200К I60K 79К 43К

кислота кислота

сахар сахар

Asj: 12,02 13 9,02 9,83 Phe 4,27 4,54 3,88 3,73

Thr 7,06 7,53 5,59 5,95 His 2,1 2,03 1,73 2,3

Ser 9,41 8,27 7,11 7,5 Lys 5,16 6,44 5,91 6,61

Glz 10,69 10,31 12,26 9,69 Arg 4,42 4,68 4,62 4,53

Pro 4,87 5,15 6,48 6,12 Тгр 1,16 не опр. 2,14 1,83

Gly 10,69 9,56 9,3 9,59 Fue 13,65 9,84

Ala 6,59 6,37 7,83 9,15 Man 26 29,1

Val 4,9S 5,49 6,87 5,4 Gal 26 46,72

Met 1,37 0,54 1,83 2.5 GlcNAo 10,47 5,74

lie 4,0 4,68 4,32 3,6 GalNAo 23,77 8,61

Leu 8,32 9,03 8,98 9,85 Белок,% весовой 78,97 71,22

Туг 2,49 2,31 2,14 1,74 Углеводы, йве с 21,03 28,78

*200К, I60K, 79К, 43К - сокращенные обозначения компонентов рецептора ЛТ с мол. массой 200 ООО, ISO ООО, 79 ООО и 43 ООО соответственно.

мембранных белков. По этому критерию все компоненты могут быть отнесены либо к категории периферических мембранных белков, либо к гидрофобной группе растворимых белков, что подтверждает полученные ранее данные о примембранной локализации низкомолекулярных компонентов рецептора латротоксина. Однако, в случав высокомолекулярных белков высокий коэффициент полярности не может свидетельствовать об отсутствии у них трансмембранных сегментов.

Данные углеводного анализа (табл.3) подтверждают гликопротэиновую

природу высокомолекулярных компонентов. Высокая степень гликозилиро-вания ( > 20% ) также свидетельствует об экспонированности из мембраны значительной части молекул этих белков.

Необходимым этапом в исследовании молекулярной организации белков является определение их первичной структуры. В эпоху генной инженерии структуры даже небольших белков устанавливаются в основном по гену, однако непременным условием клонирования структурного гена и определения его строения является получение частичной информации об аминокислотной последовательности исследуемого белка классическими методами белковой химии. С этой целью были определены частичные последовательности всех компонентов рецептора ЛТ.

Таблица 4

Аминокислотные последовательности пептидов, полученных при гидролизе протеиназой 8V из St. aureus компонентов рецептора ЛТ

ВК-И-1* Ala-Ile-Tyr-beu-Ser-Asp-Val-Pro-Ser—Asn-Phe-

I1е-Ьуs-Тут-Leu ВК-И-3 Leu-Asn-Ala-Arg-Phe-Gly-Leu-Arg-Ala-Ile-Val-

A1a-Asp-Pro-Val-Pro-Ser 79К-И-1 Ile-Ala-Thr-Val-Ser-bys-Arg-Pro-Glu-Lys-Val-Ile-Gly-Met

43К-И-4 Phs-S er-Thr-S er-Glu-Thr-Me t-Gly-Asp-Sег-Ala-

Thr-Leu-Leu-Ala-Ala-Phe 43К-И-7 Val-Ala-Leu-?ro-Asn-?-Met-Leu-Ala-Gln-ly5-Ala-Gln-Thr

*ВК - высокомолекулярные компоненты рецептора ЛТ; остальные обозначения как в табл. 3.

Поскольку Я-концевые аминокислотные остатки идентифицировать не удалось, по-видимому, или по причине их эндогенного блокирования, или блокирования в ходе выделения, определение Н-концевых аминокислотных последовательностей оказалось не возможным. Поэтому были получены фрагменты индивидуальных компонентов рецептора путем ограни-

ченного гидролиза протеиназой 87 из St. aureus по методу Cleveland., причем высокомолекулярные компоненты расщепляли в смеси, без выделения индивидуальных белков, в следствие высокой степени их структурной гомологии. После злектрофэретического разделения в полиакрила-мидном геле в присутствии SDS и электропереноса на поливинилиденди-фторидную мембрану, фрагменты детектировали окрашиванием кумасси R-250. Анализ их аминокислотной последовательности проводили непосредственно с ПВДФ-мембраны при помощи автоматической деградации в газофазном секвенаторе 470А (Applied Biosystems, США) с иденти-фккацией ФТГ-производных. Структура ряда пептидов приведена в таблице 4.

В настоящее время полученная информация используется в работах по поиску определению структуры соответствующих генов компонентов ре-цеп гора JTT.

ВЫВОДЫ

1. Предложен простой восцроизводимый метод препаративного выделения рецептора нейротоксина каракурта, позволяющий получать этот специфичный белок пресинаптических. мембран в количествах, достаточных для проведения его структурно-функциональных исследований.

2. Впервые установлено, что в состав рецептора входят белки с молекулярной массой 200 ООО, IG0 ООО, 79 ООО и 43 ООО в соотношении 1:1:2:2.

3. Показано, что функцию связывания с латротоксином выполняют гликопротеины 200 ООО и 160 ООО , а два других компонента ассоциированы с ними за счет нековалентных взаимодействий. Установлена существенная гомология в первичной структуре собственно рецептирующих компонентов.

4. Все компоненты рецептора выделены в индивидуальном виде; определены их аминокислотные и углеводные составы. С целью получения структурной информации установлено строение ряда пептидов из всех компонентов рецептора.

Основные результаты работы изложены в следующих статьях и материалах симпозиумов:

1. Петренко А.Г., Шамотиенко О.Г., Суркова И.Н., Коваленко В.А., Гришин Е.В. Исследование рецептора нейротоксина паука каракурта.

1. Характеристика мембранно-связанного и солюбилизированного рецептора из мозга быка. - Биоорган, химия, 1990, т. IS, N 2, с.149-157.

2. Петренко А.Г., Суркова И.Н., Шамотиенко О.Г., Коваленко В.А., Красноперов В.Г., Третьяков Л.А., УшкаревЮ.А., Гришин Е.В. Исследование рецептора нейротоксина паука каракурта.

2.Выделение и характеристика рецептора из мембран мозга быка.-Биоорган. химия, 1990, т.16, К 2, с.158-165.

3. Petrenko A.G., Kovalenko Y.A., Shamotieriko O.G., Surkova I.N., Tarasyuk T.A., Ushkaryov Yu.A. and Grisîiin E.V. Isolation and properties oî the a-latrotoxln receptor.-EMBO. J. ,1990, v.9,N 6, p.2023-2027.

4. Petrenko A.G., Kovalenko V.A., Shamotlenko O.G., Surkova I.N., Tarasyuk T.A., Ushkaryov Yu.A. and Ovchinnikov Yu.A. Purification of the latrotoxin-binding proteins Xrom bovine brain membranes. - Neurochemistry Internat., 1988, V.13, N 1, suppl., p.159.

5. Петренко А.Г., Коваленко В.А., Шамотиенко О.Г., Суркова И.Н., Тарасязк Т.А., Ушкарев Ю.А., Овчинников Ю.А. Исследование рецептора латротоксина из мембран мозга быка.- Сборник тезисоз 5 Советско-швейцарского симпозиума " Биологические мембраны: структура и функции. Рига, 1988, с.103.

6. Petrenko A.G., Surkova I.N., Tarasyuk Т.A. Biochemical characterization ol the latrotoxln receptor proteins. -Тезисы XIX конгресса Международного союза биохимиков, Прага, 1988, с.235