Взаимодействие фосфолипазы А2 яда кобры с различными биоспецифическими лигандами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК УЗБЕКСКОЙ ССР ИНСТИТУТ БИООРГАТГИЧЕСКОИ ХИМИИ им. акад. А. С. САДЬТКОВЛ

На правах рукописи Для служебного пользования

Экз. №

СЛЛИХОВА ЗУГА ТУРАПОВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФОСФОЛИПАЗЫ А2 ЯДА КОБРЫ

С РАЗЛИЧНЫМИ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИМИ ЛИГАНДАМЙ

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 02.00.10 - БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, ХИМИЯ ПРИРОДНЫХ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТАШКЕНТ — 1990 ' гР

-нсорганичесой х • ад

У С; С Г __

• ' ///V/

'> К- '-Л*'1,

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академика Л. С. Садыкова АН УзССР л на биологическом факультете ТашГУ им. В. II. Лешша.

Научные руководители: доктор биологических наук

Т. Ф. Арипов

кандидат биологических наук Р. Ахмеджанов Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор Л. Я. Юкельсон доктор биологических наук К. Д. Давранов Ведущая организация: МГУ им. М. В. Ломоносова -

Защита диссертации состоится ., ^ '' ¿Мб/и:*?*^ 1991 х.

в № часов па заседашш Специализированного совета

Д 015.21.01 Института бноорганическои химии им. академика А. С. Садыкова АН УзССР но адресу: 700143, Ташкент, проспект М. Горького, 83.

Автореферат разослан - " 1991 г<

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

С. II. Мухамедханова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ .

Актуальность проблемы- Яды- змей: и насекомых и их отдельньв компоненты широко используются в практической медицине- при лечении различных заболеваний, ' в Фармацевтической промьшенности я' в научных исследованиях. Этим, объясняется повышенное внимание исследователей- к разработке высокоэффективных методов фракционирования компонентов ядов,-, выделению и полученио а очищенном состоянии отдельных компонентов, . изучении' их физико-химических и функциональных- особенностей »■ механизмов проявление токсических эффектов-•

И этом отношении яд среднеазиатской кобры является" наиболее изученным: разработаны методы фракционирования его компонентов, изучен биохимический состав, при, этом показано наличие- б яде целого ряда Ферментов (ФосФолипазы А^» фосфожзстараэы.. АТФ~пиро(5осФотазы и др.), мембрано-актив.чьсс полипептилов, а также нейротоксинов. Особый- интерес : •■пралстаапзат' цитотоксины -мембраноактявные полипептида с молекулярной массой -6900, которые обуславливают многие токсические эффекты цельного , яда: гемолитическую активность /фкельсон, 1378/, нарушение структурной организации биологических мембран /сопагеа, 1.эт4, Арипов и др., 1988/,. разобщенно дыхания и окислительного фосфорилирования./Кхсле и др., 1980/'и др.. Наибольшее внимание исследователей привлекает изучение механизма так назьааемого синергического эффекта способности штотоксина усиливать каталитическое действие фосфолипазы А^-

Предполагается, что этот эффект связан с. образованием каталитически более активных. комплексов фермента с ■цитотоксмном-При этом эффективность комплакссобразования зависит от присутствия фосфолипидод. Кроме того, - иммобилизованные фосфолипида

представляют собой высокоэффективные сорбенты для очистки фосфолипазы. А^- В этой связи можно предположить, что использование цитотоксина и фосфолипидов в.качестве лигандов позволит получить сорбенты для аффинной хроматографии с больной" биоспецифичностью. Настоящая работа представляет . собой • ' часть фундаментальных исследований, проводимых в'лаборатории физико-химических методов исследования Института биоорганической химии АН УзССР в соответствии с положениями ГКНТ СССР, Госплана СССР, АН СССР #24/25/13 от 13.02.31 пЬ проблеме 074-05-01.НБ и №23/13 от 03 .02.87 по проблема 13 .Н2. ' ■ ' '

Цель и задачи исследования. Основной целью, .настоящей работы было исследование молекулярных аспектов взаимодействия фосфолипазы А2 с биоспецифичаскими лигандами., обуславливающими синергический эффект - усиление каталитической активности фермента- В ходе исследования решались следующие задачи: •

- исследование влияния различных Факторов на. компледообразование фосфолипазы А2 и цитотоксина в модельных системах;

.- изучение каталитических свойств фосфолипазы. Ао в иммобилизованном на специфических, лигандах состоянии;

- синтез 'сорбентов с иммобилизованными биоспецифическими лигандами.

. Научная новизна и практическая значимость ■ результатов исследования- - В - работе впервые • изучены иммобилизованные • формы юте токсина из яда кобры, а хакаса быигандные производные цитотоксина и фосфолипида - фосфатидилэтаналамина на полиамидных носителях- Изучены условия ко мплз кс о об раз с вания фосфолипазы А^ из того хе яда с 'щгготоксином, фосфатимлзтаноламинсм и их смесями в ' модельных системах, в свободном и ' иммобилизованном состояниях. Показано,' что в молекуле фермента- "шиотргссинсвязывающий" и

"субстратсвязываюпшй" • участки пространственно разграничены-Связывание фермента с штотокскном, независимо от того, находится он в свободном или иммобилизованном состоянии повывает' сродство фермента к субстрату, что проявляется в повышении эффективности связывания. Вместе с этим, в бнлигандных сиситемах прочность комплекоообразованмя с цитотоксином ' (в присутствии фосфотадилэтаноламина) повышается. Определены.оптимальные условия комплексообразования.

На основе полученных ■ данных найдены, наилучшие услозия синтеза . биоспецифического' сорбента для билигашшой системы- Разработаны условия биоспецифической' хроматографии ...фосфолипазы А~ на синтезированных сорбентах. Достигнуто повышение эффективности биоспецифической хроматографии более чем в три раза* '

Наряду с вышеизложенным ■ подученные сведения • позволяют по-новому' интерпретировать механизм синергичного действия фосфолипазы А-, и цитотоксина.

В результате настоящих исследований был получен новый, тип биоспецифического сорбента ,для' очистки ■ фосфолипазы А^ и разработаны условия аффинной хроматографии-этого фермента. Данные, полученные в работе, используются'' при чтении .лекций ' по биотехнологии на биологическом факультете ТашГУ км. В .¡1-Ленина-

Апробация работы- Материалы диссертации докладывались на v и vi Всесоюзных симпозиумах по инженерной энзимбдагии (2985, 1388), и на Всесоюзной конференции "Выделание, очистка и анализ биологически активных соединений" (1987).

Публикации. . "По теме диссертации. опубликовано .7 печатных

работ-

Структура и обьем работы: Диссертация состоит из введения, 3-х глав, обсуждения результатов, ■ вывозов и списка цитируемой ■

е

литературы. Диссертация представляет собой рукопись ка 109 страницах, включая 14 рисунков и 3 таблиц. Список литературы содержит 110 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов-

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ-ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР- Обзор, посвящен обдам представлениям О яде среднеазиатской кобры Naja naja oxiana: составе, анализе свойств» механизме биологического действия, компонентном составе и свойствах биологически активных соединений, выделенных из яда. Подробно рассмотрены . сведения о цитотоксинах "vi и v 5, их взаимодействии с фосфолипазой А-? в модельных системах и биологических мембранах. Представлены данные о каталитических свойствах Фосфолипазы-Ао. Рассмотрены новые эффективные методы очистки фосфолипазы А^ с использованием аффинной хроматографии- Подчеркнуто, что этот тип .хроматографии -успешно используется при выделении фосфолипазы А^ иг различных ядов змей-ГЛАЗА 2. МАТЕРИМЫ И. .МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ-'.-ß работе использован цельный ЯД среднеазиатской кобры Maja naja oxiana, высушенный над cacaг. фосфожпазу А2 и цитотоксин выделяли из яда-хобры по известной -методике /Сахибов, -и др-» 1970,' Юкельсон и др., 1974/. s также методом •биоспедифической хроматографии, разработанным при выполнении настоядето исследования. Носитель для иммобилизации получен из отходов текстильного производства (мелкий срыв капрона). Полиамид (ДА) . с; определенным размером гранул (140-250 -ъэаО получали но известной методике /Ахмедканов, 1981/. Синтезировали сорбенты путем ковалентного присоединения к подученному т.олиащду фосфатидилэтанолашна (ФЭА), иитотоксина (ЦТ) и их смесей (ФЭА/ЦТ).' В качества спивающего реагента .использовали глутаровый . альдагид или госсипол. Госснгдел (Гос)

получали в лаборатории подифеколов Института биооргашческой

химии АН УзССР. Сербии» фосфолипазы А-, проводили в статических

о *• ■

условиях в течении двух часов при 4 С, что является оптимумом

данного процесса. Условия иммобилизации фермента были различны в

зависимости от вида лиганда. Контроль сорбции фермента

осуществляли по изменению концентрации белка и активности фосфолипазы Ао-

Аффинную сорбционную хроматографию фосфолипазы А^ проводили в колоночном режиме (0,8 х 15 см). Фракции анализировали на активность фосфолипазы ¿2 и содержание балка, фосфолипазную активность измеряли потенциометрическим титрованием при постоянном значении рН. Удельнухг активность фосфолипазы А^ вырахали в мкмоль згирных кислот, выделившихся за одну минуту в расчете на. один .миллиграмм белка. Гемолитическую активность цитотоксина определяли по выходу гемоглобина из лизированных эритроцитов. Смесь фосфолипидов получали из яичного гелтка. Содержание белка

определяли по методу Лоури и спектрофотоматрически по поглощении при 280 нм.

Ковалентную иммобилизацию фосфолипазы- А^- осусэстзляли путем

химической "сшивки" с гранулированный полиакидшо- носителем,.

модифицированным глутаровым альдегидом или госсиполоы.

ГЛАВА 3- РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ.

Раздел 3.1. СИНТЕЗ СОРБЕНТОВ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ

БИОСПЕПИФИЧЕСКИМИ ЛИГАНДАМИ. Раздел посвящен изложению

результатов по синтезу сорбентов с использованием различных биоспепифич'еских лигандов.

В качестве- лигандов использовали следуюпу.2 Бещаства: ФЗА. .

(природный субстрат фосфолипазы А2>, III (активатор), ФЭАУЦТ -

билигандные системы. Лигакды связывались- с носителем по-принцип/

образования ¡Зиффовых оснований с помопСЭ бифункциональных

соединений - глутарового альдегида или госсипола.

ФЭА связывается с поверхностью матрицы полярной головкой через аминогруппу остатка - . этаноламина, а гидрофобные жирнокислотные остатки должны быть организованны на границе модифицированного сорбента с водной фазой. Использование избытка фосфолипидоЕ при связывании, а также козалентное присоединение фосфолипидов к носителю через полярную головку' дает основание предположить, что на поверхности модифицированного полиамида образуются более или менее организованные фосфолипидн'ые структуры, в том числе и с бислойной организацией, как энергетически выгодные в системе лилид-зода. ЦТ, . в' свою очередь, связывается с модифицированным полиашдньм носителем через аминогруппу лизина/

В качестве биоспецифического лиганда использовали бинарную--систему ФЭА/ЦТ': первоначально ковалентно привязывали ФЭА, а затем полученный сорбент инкубировали в водном растворе ЦТ- Известно, что ЦТ- из-за высокого ссдергания .лизина обладает выраженным положительным ' зарядом,- а ФЭА, связанный с носителем, несет отрицательный заряд. Следовательно, можно предположить, что при инкубации сорбента с ЦТ благодаря электростатическим взаимодействиям будет наблюдаться сорбция ЦТ на поверхности ФЭА.

Структурный-фрагмент синтезированных сорбентов схематически можно представить следующим образом:

■ГТ^*^^»«'-. в

цт

а&-ГА<Гос>-ФЭА~="$1 ПА-ГА(Гос)-ЦТ" ПА-ГА(Гос)-ФЗА--ФЛ-ЦТ

Лги получении (Ишганлчых сорбентов не исключена возможность сбрасования структур, когда л ФЗА, и IIТ непосредственно связаны с носителем с помоиью ковалектной связи.

Характеристика синтезированных биоспецифических сорбентов

фосфолипазы Ап по различным.- лкгандам (табл.1) показала, что

госсилол, испольгутй ь качестве "свивающего" реагента, позволяет

увеличить количество связываемого' лиганла. как в случае с "ФЭА,

так и в случае с ЦТ-. Это увеличение по связанном:/ лиганду

составляет приглизительнэ 15?. Это связано, по-видимому, с тем,

Таблица 1.

Характеристика синтезированных .биоспецифических сорбентов фосфолипазы А-, по различный ¿¡игандам

£ ! Вил сорбента ,! .Количество связанного лиганда

! ! в'.»«нолях на 1 г носителя ______________- ~ФЭА . - ! цГ"

1 ПА-ГА-ФЭА - 2,00 -..'■.2 ПА-Гос-ФЭА - ..2,30 - -

3 ПА-ТА-ЦТ " - - ' ' 1,45

4 БА-Гос-ЦТ - 1,60

5 ПА-ГА-ФЭА/ДТ - 1,55- 0,06

6_ЛА-Гос-ФЭА/ЦТ - " " . 2,00 0,08

что госсипол- как было показано /Иванова - и др..,1982/, мокет. принимать участке в связывании -не. только .посредством , Шиффовых оснований, а такхе с помощью гидрофобных и электростатических взаимодействий. Эти взаимодействия являются причиной увеличения количества.связызаемото .лиганда, причем количественное соотношение связанных ФЭА и ЦТ на поверхности носителя составляет 32=1 и- 25:1 соответственно для глутароБого. альдегида и гбссипола.

Раздел 3.2. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ СОРБЦИИ НА СПЕЦИФИЧНОСТЬ СВЯЗЫВАНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ А2- Для изучения механизиюв образования

специфических комплексов фосфолилазы А^ с различными лигандами были проведены эксперименты при различных условиях рН. Показано, что адсорбция фосфодипазы А^ на иммобилизованном ФЭА происходит в слабо — кислой области среды. Комплексообразование значительно усиливается при увеличении рН, достигая максимального значения при рН=7,0 \ а более высокие ■ значения рН ке оказывают суаесгвенного влияния на адсорбцию фермента. Отметим, что специфичность сорбции максимальна при значении рН 5,7.

ЦТ в качестве лиганда, по сравнению с ФЭА, при тех :;се значениях р.Ч, связывает фосфолипагу А-, в большей степени. При этом специфичность сорбции фермента также более высокая. При увеличении значений 'рН степень комплексообразования уменьшается и с иммобилизованным ЦТ связываются в основном белки яда, не -обладгиссие фосфолипазкой активностью.

При • использовании в качестве лиганда бинарной системы в .исследованном"диапазоне значений рН наблюдается полное связывание фосфолипазы ' Ао из раствора. Эта система отличается большей избирательностью связывания фосфодипазы А^.

В данном разделе представлены также результаты изучения влияния рН на степень кош леке осбразования фосфолипазы А-> с лигандами, в зависимости от увеличения расстояния последних от поверхности сорбента, это достигалось путем использования прсьазугочнш реагентов разной структуры и, в частности, госсипола. Показано, что при использованию! ФЭА в качестве .лиганда, наблюдается снижение общего количества связанного фарьэкта праютчески во всем исследованном диапазоне рН. Бисспецкфичносхъ связывания фосфолипазы А2 увеличивается" в щелочной области.

Связывание ЦТ через госсипол приводит к незначительному; увеличению степени комплексообразования фосфолипазы о лигандом. Бинарная система лигандов ФЗА/ЦТ отличается не только более высокой емкостью, но и избирательностью связывания Фермента. При. этом щелочная область более предпочтительна для комплексообразования- Анализ представленных .данных позволяет заключить, что зависимость комплексообразования фосфолипазы А£. от . рН среды, ярко вырахена для иммобилизованного. ФЭА- По-видимому, здесь имеет место взаимодействие ОН-групп- среды, а триметиламмониевыш группами ФЭА, что благоприятствует стехиометрическому взаимодействию ФЭА с фосфолипазой А2- При использовании в качестве лигандов ЦТ и бинарной системы ФЭА/ЦТ зависимость комплексообразования от рН среды выражена в меньшей степени.

При изучении влияния ионов Са на комплексообразование ■ фосфолипазы йыл0 показано, что в отсутствии Сгг фосфолипаза А^, как показано выие, связывается с иммобилизованным ФЭА. Добавление- асе незначительных количеств ионов. С а . увеличивает эффективность связывания фермента и специфичность сорбции, но более высокие концентрации (40-80 мМ) ионов. несколько снижают • количество связываемого Фермента» не . оказывая при этом существенного влияния на специфичность сорбции.

При добавлении небольших концентраций ионов Са^+ в систему с ЦТ изменения в эффективности связывания фосфолипазы н&

наблюдается, а более высокие концентрации ионов вызывают значи- : тельное снижение эффективности связывания и специфичности сорбции-

В случае бинарной системы лигандов эффективное комплексообразование происходит а отсутствии экзогенного Са?*"г

?+ ■

добавление & среду 10 мМ Са снижает сорбцию, а более высокие концентрации не оказывают- существенного влияния ка количество связываемого фермента и специфичность сорбции.

Удаление лигандов от поверхности матрицы с помощью госсипола позволило более четко выявить характер- зависимости комплэксо-образования фермента от. наличия в среде экзогенного Са*"-1". В отсутствии Са сорбция фермента на иммобилизованном ФЭА малоепецифичка и неэффективна. Добавление небольших концентраций (10 мМ) увеличивает количество связьваемого фермента на 20«, ке оказывая существенного влияния на специфичность сорбции, а более высокие концентрации (40.-80 мМ) улучшают в основном полноту связывания фосфолипазы А2 •

Кошлексробразование фосфолипазы А2 с ЦТ, иммобилизованным . через госсипол, в присутствии ионов Са^* снижается, в три раза. В случае бинарного лиганда добавление 10 мМ Са2+ незначительно увеличивает специфичность ' сорбции фермента, а- увеличение концентраций. ухудшает комплексосбразование. Из этого можно заключить, что для образования специфических комплексов фосфо-липазы А2 потребность в ионах Са определяется видом лиганда.

Анализ полученных экспериментальных данных о' влиянии ионной силы на кошлексообразование фермента с исследуемыми лигандами показал, что увеличение ионной силы раствора с . помощью ко. не оказывало существенного влияние? . на адсорбцию фермента на иммобилизованном ФЭА, а такхе на ЦТ. Однако для бинарного лиганда ■ с увеличением ионной силы количество связьваемого фермента несколько снижается, а специфичность сорбции при этом увеличивается-

При "госситюльной" сшвке фссфолишдшго лиганда увеличение

ионной силы до 0,5 М кс1 приводит к увеличению количества связанного фермента почти в.два раза и в некоторой степени к улучиению сорбции. Более высокие концентрации соли снижают эффективность сорбции фермента- Для- .лиганда с .ЦТ и бинарной системы увеличение ионной силы раствора приводит к довольно значительному снижению эффективности • и количества связанной ФосФолипазы Ао- Полученные результаты свидетельствуют о сложном характере взаимодействия лриобразовании фермент-лигандных комплексов. Изучение комплексообразо&ания фосфолипазы А7 с различными лигандами показало ,■ что : выраженную специфичность комшгексообразования с ферментом проявляет, бинарный лиганд- Было установлено, что количество адсорбируемого Фермента бинарным лигандом по сравнению с фосфолипидным лигандом больше в 5-6 раз (рис-1, табл.2).

Таблица 2.

• Количественная характеристика комшгексообразования ФЛА£ с иммобилизованными специфическими -лигандами

Вид сорбента

•Адсорбировано;'.! Адсорбировано ! Специ-белксв . ' ! ФЛ/^>. .... ' ! фич-

Лв. ед-наЛв -%

__ __ I ность

в мг-на!в % Лв ед-наЛв - ! сорб-

1г сор-!от на- !1г. сор-!от на- ! ции

бента Лнесенн.!бента Тнесенн. !

1. ПА-ГА-ФЭА 15,2 22,8 292 ' 28,5 1,25

2- ПА-Гос-ФЭА 13,0 19,5 266 26.0 1,34

3 . ПА-ГА-ЦТ П.,8 17 ,7 123 12,0 0,68

4- , БА-Гос-ЦТ 12^8 19,2 ■ 128 : 12,5 0,65

5. ПА-ГА-ФЭА/ЦТ . . 9,0 13,5 61'4 60,0 4,44

6- П А-Г о с-ФЭ А/ЦТ 9,5 14,2 . 461 '■ 45 - 3,16

1-4

Б

■ Рис .1. Зависимость - комплексообразования фосфолипазы А2 с иммобилизованным лигандом от рН (а), Са2+ (б) и ко. (в)

через глугаровый альдегид (слева) и госсипол (справа) а) БА-ГА-ФЭА б)ПА-ГА-ЦТ в) ПА-ГА-ФЭА/ЦТ

ПА-Гос-ФЭА ПА-Гос-ЦТ ПА-Гос-ФЭА/ЦТ.

Раздел3.3. ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФОСФОЛИЛАЗЫ Ао, ИММОБИЛИЗОВАННОЙ НА СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЛИГ АНДАХ- Для сравнительного изучения зависимости каталитических свойств фермента от способа иммобилизаций и природы лиганда были получены препараты алсорбционно и ковалентно иммобилизованных форм фосфолилазы А9 на сорбентах полиамидной природы. Показано. ' что при ковалентной иммобилизации с 1 г" полиамидного носителя связывалось 6,4 мг белков яда, при адсорбции на биоспешфических лигандах количество иммобилизованного белка увеличивалось в 1,5-2 раза.

Сравнительный анализ показал, что каталитическая активность фосфолилазы А2 проявлялась различным образом в зависимости от способа иммобилизации и типа лиганда. Если- при ковалентной • иммобилизации фосфолипаза А~ сохраняла 3% связанной активности, то в случае ' адсорбционной иммобилизации активность фермента увеличилась в 2-5 раз- 3 данном разделе представлены также результаты изучения влияния рН, ионов Са~ , температуры и концентрации субстрата на проявление каталитических свойств иммобилизованной, ковалентной и. растворимой форм. фосфолилазы А2 (рис.2).

Каталитические свойства растворимой формы фосфолилазы А2 имеют ярко выраженный рН-оптимум. Ковалентное связывание фермента полиамидным , носителем приводило к расширению диапазона рН, ■ с сохранением рН-олтимума при рН 8.0. При адсорбции фермента на иммобилизованном цитотоксине также не наблюдалось изменение рН-оптимума. Для ФЗАи бинарного лиганда значение рН для фермента составляло 8.5-

Анализ полученных результатов показывает, что при адсорбфм фосфолипазы А? на различных- лигандах изменяются условия для.

актавность растворимой. -. 1 и иммобилизованных Форм • фосфолипазы-А^; ковалентная - 2. на ДТ -3, на ФЗл -4, на ФЭА/ЦТ-5. . .

.(•в) Зависимость активности растворимой и иммобилизованных форм фосфолипазы А2 от концентрации . субстрата* Обозначение выше-

(г) Термостабкльносгь растворимой - ковалентно — 2 и адсорбционно - 3 иммобилизованных фо^м фосфолипазы А-> ЗД>и 50°С-

3-7" '

проявления максимальной активности. Ферменту

Известно /БрокерхоФ, 1978/, что фосфолипаза А£ ялов змей

является С а'" ""-зависимым .ферментом- Каталитическая активность

растворимой формы фермента в определенной степени проявлась и в

отсутствии ионов Са*" , а внесение в реакционную среду С а в

значительной степени повышало активность фермента с максимумом при

содерхании Са - 5-10 мМ. более высокие его концентрации угнетали

работу фермента- В случае- ковалентного связывания фермента с

юлиашлным носителем, при отсутствии.экзогенного Са*"+ фермент не

троявлял каталитической активности, а для ¿остазеНия максимальной

1ктивпоста были необходимы сравнительно высокие концентрации Са^+.

величание концентрации. С а , вьше оптимальной» не- оказывала

ущественного' вЗшяния на активность фермента-

Зависимость каталитической активности фермента от наличия в

реле Са . сохранялась и после иммобилизации на специфических

иганлах. Так, на иммобилизованном ФЭА фосфолипаза А^

идролизовала фосфолипиды и в отсутствии Са2+, внесение аса:-его в

закционную среду активизировало ' ферменг с достижением

»ксишльной активности при 10 мЫ Са , более высокие концентрации

>давляли активность Фермента с полным ингибирсванием.

Фермент, иммобилизованный на . ЦТ, такхе гидролизовал

1сфолипиды в отсутствии Са2*"- При концентрациях Са2+" 5 мМ

тивность фермента была наибольшей. Высокие концентрации. 'Са^ '

гибировали каталитическую активность. ' Чувствительность -

2+

сфолипазы А2 к ионам С а усиливалась при- иммобилизации-: на парном лиганде. Активность фосфолшазы А-, повышалась с «имумом при 5-10 мМ Са , с увеличением концентраций : енияглас!»> галитическая активность февыентз-Полнсе . гса&алениз— здитическоЯ. активности наблюдалось' в присутствии 20?*|| ~ -

■ - 18 Из анализа полученных результатов следует, что • чувствительность фермента к ионам С а'" в среде определяется видом специфического лиганда для иммобилизации. •

Изучение влияния температуры на активность- фосфолипазы к7 показало, что как козаленткая, так и адсорбционная иммобилизация фермента хотя и уменьшает ее каталитическую активность, но не ингибирует. до нуля,тогда как активность - фермента в растворе практически уменьшается до нуля. В работе также показано, что ковалентно иммобилизованная фосфолипаза А^ выдергивает 10-12 циклов■ работы в течении 3-х-месяцев. Адсорбционно иммобилизованная Форш фермента полностью теряет каталитическую активность после 3-х кратного использования независимо от вида лиганда для иммобилизации-

Следовало ожидать, что иммобилизация фосфолипазы А2 на различньа лигандах' скажется на ее сродстве к .субстрату. Для выяснения этого вопроса была изучена зависимость активности растворимой и иммобилизованной форы фермента от концентрации субстрата. Ковалентно связанная фосфолипаза с носителем в значительной -степени снижала максимально достихимую скорость реакции- Адсорбция фермента на иммобилизованном ЦТ по сравнению . с ФЭ А создавала.;. более благоприятные условия для проявления каталитической активности ферыента- При сорбции на бинарном лиганде по сравнению с иммобилизацией на ЦТ максимально достихимая скорость реакции еще более возрастала.

Таким образом, данные, полученные в раздела 3.3, позволяют заключить, что иммобилизованная фосфолшаза А2 на специфическом лиганде по сравнению- с . ковалентным связыванием - на полиамидной матриц .обеспечивает, более-благоприятные - условия-.для' проявления каталитической активности фермента в иммобилизованном состоянии.

Раздел 3.4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СИНТЕЗИРОВАННЫХ БйОСПЕЦИФИЧЕСКИХ :0Р5ЕНТ0Б ДЛЯАМИННОЯ ХРОМАТОГРАФИИ МСФОЛИПАЗЙ А2 ЯДА ¡СОБРЫ. L' данной главе пред?тз5лены "результаты изучения ьсзмсзккоста использования синтезированных ссрбеитез для разработки метода »чистки фосфолмг.эзы А- пуге-м аффинчсП хрсчгтсграфии. £ присутствии IT Фесфолипазэ А о проявлзет максимальную гидролитическую • истивкость, т.е. образует зфгекткекьй Фер-ннт-су^стратный kcscuskc 'Рахимов, 1332/. В связи с зтлм представляет интерес вопрос о юзможностк использования шггс.тг~с:сна в качестве спЕЩфмческогз игашэ при синтрте гФФикног? сог'г^та ?-сс1гл::пгп: а^- С этой .ель ¡с в работе кзученз гзвксшость адсорбнки Ьосфолклазк Аг яда обры на сорбенте с юмобилиз^ьанетг ФЭА/UT от pH средь;, ониентряши и окон ¡: к.>ннсП с war p?rTBcps. Аналог пе:::~-:еккпх анных показал. что адсорсиия ?~-:фол;-:пэзн А2 на предлоггнном одкфпиигованнс'м сорбент? наиболее пф'ективно происходит при pH

о +

,3, в отсутствии понев Ca"i; при низкой пенней силе раствора. При тих условиях максимально связывалось 15—1? тыс. ел- активности оейолппазы А0, что соответствует 50-65 к<г цельного яда кобры, ■ е. _ по сравнению с ФЭА /Рахимов, 1S85/ емкость сорбента зеличилась в 3-3,5 раза у. наблюдалось снижение сорйют-; белков, не-слагавших фосфоштаздай активностью, что свидетельствует о звышении специфичности сообента к фосфолжазе А^-

Максимальная Мсорбцйя фосфолипазы достигалась при

давлении в элюмрукЕий раствор детергента, что свидетельствует о гаавдай' ролй" гидрд^абнж взажаЛКсТсй; в процэссе связывания ¡рмента с модифицированная' ci-iicTOKcviftöM ctfj5&v<£DM.-

Результаты проведенной- аффинной" хроматографии фосфолипазы предложенном дюдифищфойШкяг сорбенте с • ЦТ в определенных ■яовкз». сорбции-десорбции' показали,- «к» в щшзссе хроматографии

фосфолилаза А^ разделяется на две фракции, й наряду с основной полосой . белка,' принадлежащей фермент;/, имеется минорная компонента, содержание которой не превышает 1-5% белков.(рис.3) Это указывает на то, что предложенный метод хроматографии является

Рис.3. Аффинная хроматография фосфолипазы А-> на

¿о

полиамидном сорбенте с иммобилизованным ФЭА и ИТ. А — удельная активность Фермента (1), ^ге0 - оптическая -Плотность раствора при 280 нм (2), Т - концентрация .датоиаХ-100 .(3)- ■

•высохозйбактивыьм ■'■ /при получении очищенных препаратов

фосфогшпаз из а£а кобры- По-видимому, создание аффинных сорбентов с бинарным -литакаом £здяется-.перспективным путем повышения их .избирательности .к коадсретноыу виду Фермента-

В раЗдале '3-5' на основании полученных в работе экспериментальных и литературных данных обсуждаются следующие типы .взаимодействия доефолптаэы и ЦТ--

2 +

1. Взаимодействие фосфолипазы А2 и ЦТ, и роль ионов Сал -

2. Образование комплекса ЦТ с фосфолипидами мембран. 3 • Образование комплекса Са^ -фермент-ЦТ-фосфолипиды.

На основе перечисленных типов взаимодействия делается ряд заключений-

1. Внедрение цитотоксина в структуру фосфолипидов обеспечивает специфическую адсорбцию фермента-

2. фосфолипаза А~ имеет два участка связывания* разделенные друг от друга, в данном случае цитстоксиновый и субстратные -участей связывания.

3. Цитотоксиновьй и субстратный участки связывания фермента пространственно четко не различимы. Возможно, это объясняется тем, что фермент адсорбируется на поверхности модифицированной мембраны цитотоксиновым участком связывания за счет электростатического взаимодействия разноименно заряженных групп фосфолипазы А^ и цитотоксина. Необходимость использования детергента для полного разрушения данного комплекса показывает, - что взаимодействие не. носит межмолекулярного, гидрофобного характера,- а, обусловлено вероятнее всего поливалентностью и доступностью дел ионов.

Согласно известной теории ориентации /Брокаргоф, " 1978/, адсорбвдя фермента на границе раздала фаз долгна индуцировать обратимые изменения формы белковой глобулы . с оркзнтацией-субстратного участка активного центра. э направлении деформированных участков мембраны, а образование комплексов" фермента с ионами Са , по-видимому, долгно происходить в растворе. При этом формируются цитотокскновьчз и ' субстратные-участки "узнавания" фермента. В ' последующем цитотокс'ин адсорбируется на поверхности фосфолипидных мембран, что индуцирует изменение конфорыации глобулы. Цитатоксин внэдряэтея з. бислсйную структуру с образованием гидрофобного- "клина" и полярной' головки,.; обращенной в водную- фазу. Это приводит к- снигешда- величины фиксированного отрицательного заряда поверхности ьтйраиы .и:

ассиметриччой локализации зарядов в глобула ЦТ. Адсорбция ЦТ сопровождается деформацией бислоя с изменением градиента кривизны мембраны. Аннулярные фосфолипиды за счет прочного электростатического и гидрофобного контакта- с ЦТ теряют подвижность, а деформированные участки мембраны разрыхляются-

Далее происходит адсорбция комплекса Фермента с ионами кальция с помощью цитотоксинового участка узнавания. Белковая глобула фермента деформируется с формированием участков связывания субстрата с приближением его к фосфолипидам с необходимыми физико-химическими параметрами. Затем образуется комплекс Михаэлиса путем , переноса единичной молекулы из субстратной фазы в гидрофобное ядро фермента. Остальные стадии Собразование ацилферыента. гидролиз, -выделение продуктов реакции) должно происходить аналогично реакциям, катализируемым гидролитическими ферментами- Продукты реакции - свободные жирные кислоты и лизофосфолишды - вызывают дополнительную деструкцию бислойной структуры мембран, создавая необходимые предпосылки для активации фермента.

ВЫВОДЫ

1. Впервые синтезирован принципиально новый аффинный сорбент фосфолипазы ¿2 с ковадентно иммобилизованными биоспецифическими лигандами - фосфатадилэтаноламином и цитотоксином v i. Использование аффинного сорбента позволяет выделить из яда кобры две формы фосфолипазы А-? со степенью очистки соответственно з

а.

5,5-3,5 раза и выходом 31%. Введение в состаз сорбента с фосфолигшным лигандоы второго лиганда - ЦТ увеличивает его емкость 'л специфичность к фосфолипазе яда кобры.

2. Установлено, что влияние, различных Факторов, таких как рН,

? +

юиная сила, мочевина, зтилекгликоль, глицерин, Са^ не нарушает комплекс фссфолипазы а-? и цитотоксина в системе ковалентно мобилизованного фосфатидиЛэтаноламина. . Данный ' комплекс одушается только при воздействии трятона X—ЮС.

3. Изучены каталитические свойства фосфолипазы ^ мобилизованной в различных системах специфических лигандов. 1 оказано, что каталитическая активность ■ 'иммобилизованной ;ссфолипазы А^ растет е следующем ряду систем специфических игандов: ковалентно связанный цитотоксин, ковалентно связанный ¡осфатидилэтаноламин, смесь цитотоксина с фосфатидилэтаноламином.

4. Ка основании полученных данных уточнены отдельные этапы еханизма синергического эффекта фосфолилазы А^ и цитотоксина в сдельной системе, которые заключаются в опосредованном заимодействии данных белков в липидной фазе.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Ахмеджанов Р.,'Салихова 3.Т. , Арипов Т.Ф.., Рахимов М.М.. пособ получения сорбентов для биоспецифической хроматографии.: вторское свидетельство 3745153/05 от 24 мая 1984-

2.Ахмеджанов Р., Салихова З.Т.", Арипов Т.Ф- Иммобилизованный Т, как биоспецифический лиганд для аффинной хроматографии эсфолипазы А2 из яда среднеазиатской кобры. Сборник Тезисов' V сесоюзного-симпозиума по инженерной энзимологии. Кабу-Яетти. кгай 585 т.

3. Ахмеджанов Р., Вахобов А.X., ^тахова 3-Х., Софьина Е. юспецифические материалы на основе ■ полиамидов для ■ готехнологических целей.. Тезисы Конференции молодых,-. ученых >.Азии и Казахстана. Ашхабад 1986 г.

4- Ахмеджанов Р., Салихова З.Т., Арипсв Т.Ф., Рахимов М.М. Иммобилизация' фосфолипазы А^ яда среднеазиатской кобры на сорбентах полиамидной природы. Прикладная химия и микробиология. Д386. т.4, вып.5, с. 607-613.

5 • Рахимов М.М.. Ахмедаанов P.A., СалихоЕа 3.Т ■, Лкубов И.Т., Софьина' С-Я- Очистка фосфолипаз методом биоспецифической адсорбционной хроматографии. Тезисьг Всесоюзной конференции "Выделение, очистка-и анализ биологически активных соединений-. 21-25 сентября 1387 т. .Сухуми, с. 11-12 -

6- Рахимов K.M., Салихова З.Т., Ахмедханов Р.'А- Исследование механизма .взаимодействия фосфолипазы А- и цитотокскна яда кобры в модельных , системах с1 иммобилизованными лигандами. Тезисы vi всесоюзного симпозиума по инхенеркой энзимологии. Вильнюс, Каунас, 1988. 4.1, с.42-43.

7. Салихова ЗЛ., Ахмеджанов. ?-А., Арипов 7-Ф-, Рахимов М.М..Аффинная ' хроматография для очистки фосфолипазы Ао яда среднеазиатской кобры. Прикладная биохимия и микробиология- 1989. т. 25,с. 747-752.