Бактериофаги и биосорбенты на их основе для специфической детекции клеток Escherichia coli биолюминесцентным методом тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

404 юз-»

МИНИХ Ольга Александровна

БАКТЕРИОФАГИ И БИОСОРБЕНТЫ НА ИХ ОСНОВЕ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

Специальности: 02.00.15 - кинетика и катализ 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва-2010

4841594

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова и в Канадском Исследовательском Институте по Безопасности Пищи Университета г. Гвельфа.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Угарова Наталья Николаевна доктор химических наук, профессор Бровко Любовь Юлиевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович доктор биологических наук, в.н.с. Исмаилов Анвар Джураевич

Ведущая организация:

Институт Биохимии имени А.Н. Баха РАН

Совета Д 501.001.59 по защи- , .... ских диссертаций по

химическим наукам при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится

часов на заседании

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 501.001.59, кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Стандартные микробиологические методы обычно занимают от 2-х до 5-и дней, чтобы определить и подтвердить наличие патогенов в исследуемых образцах. Такая длительная процедура анализа часто является неприемлемой, что ведет к необходимости разработки методов быстрой детекции. Имеющиеся экспресс-методы диагностики патогенов на основе детекции антигенов и нуклеиновых кислот позволяют проводить анализ в течение нескольких часов. Тем не менее, для иммуноанализа необходимо наличие 104- 106 КОЕ/мл образца, а для успешного проведения полимеразно-цепной реакции (ПЦР) наличие как минимум 200 клеток в образце. Чувствительность обоих анализов сильно ограничивается сложностью матрицы и неравномерным распределением клеток-мишэней в образце. Одной из возможностей увеличить чувствительность метода определения бактериальной обсеменённости является выделение и концентрация бактерий из образца перед анализом. Иммуномагнитное осаждение (ИМО) широко используется для подготовки образцов с целью последующей детекции бактерий. Тем не менее, эффективность выделения так же зависит и от сложности матрицы. Ранее было показано, что методы на основе бактериофагов могут успешно применяться для быстрой детекции патогенных микроорганизмов, поскольку фаг быстро и специфично атакует клетку и, как следствие, лизирует ее. Было показано, что анализ на основе лизиса клеток-мишеней фагом с последующей биолюминесцентной детекцией АТФ, выделившейся в результате лизиса, позволяет достоверно определять 104 КОЕ/мл в течение 1-2 часов в присутствии неспецифической микрофлоры. Более того, биосорбенты на основе бактериофагов могут применяться как с целью детекции, так и с целью выделения клеток из суспензий, так как легко связывают и удаляют клетки-мишзни даже из образцов со сложной матрицей. Актуальной задачей является разработка биосорбентов на основе иммобилизованных бактериофагов. Для сохранения наивысшей биологической активности, ориентированная иммобилизация является предпочтительной. Для этого можно использовать фаги, полученные генноинженерным путем и содержащие аффинную метку на головке фага, чтобы не препятствовать связыванию щупальцев с бактерией. Помимо этого, интерес представляет использование новых высокоэффективных фильтров на основе наноалюминиевых волокон, которые обеспечивают высокую неспецифическую адсорбцию фагов и/или бактерий. Положительный зета потенциал этих фильтров может обеспечить направленную иммобилизацию бактериофагов через отрицательно заряженный капсид. Оба

подхода были использованы в данной работе: 1) недавно предложенная иммобилизация бактериофага позволила расположить фаг в наиболее выгодном положении на носителе путём внедрения аффинных меток на поверхность фагового капсида посредством генетической модификации и 2) использование новых высокоэффективных фильтров на основе алюминиевых нановолокон для концентрирования фага и/или бактерии. Ориентированная аффинная иммобилизация бактериофагов на поверхности биосорбента (подход 1) обеспечивает максимальную эффективность связывания и лизиса бактерий за счет того, что специфически-чувстительные фибры на хвосте фага направлены в раствор. С другой стороны, увеличение плотности посадки фага на поверхность сорбента при содействии влияния электростатической составляющей (подход 2), скорее всего так же приведет к увеличению числа фагов с правильной ориентацией среди всех иммобилизованных фагов на поверхности сорбента. Свойства рекомбинантных Т4-бактериофагов и построенных биосорбентов на их основе сравнили с аналогичными сорбентами на основе дикого варианта Т4-фага. Биолюминесцентные методы (биолюминесцентная АТФ-метрия и измерение кинетики роста клеток E.coli, содержащих полный lux оперон бактериальной люциферазы) были использованы при изучении способности биосорбентов к выделению и детекции клеток E.coli.

Другим аспектом данной работы было исследование взаимодействия E.coli (lux) штаммов различной степени патогенности с эпителиальными HeLa клетками. Ранее было показано, что некоторые члены семейства Enterobacteriaceae, такие как Salmonella, Shigella и Escherichia coli после взаимодействия с клеточной тканью запускают в клетке-хозяине схожий каскад реакций, приводящий к развитию инфекции. При этом эпителиальные клетки играют существенную роль в процессе адгезии бактериальных клеток к поверхности, затем следует активация патогеном целого ряда путей передачи сигнала. Однако неизвестно, насколько сродство к эпителиальным HeLa клеткам коррелирует с патогенностью бактериальных клеток. Многие патогены используют одни и те же сигнальные молекулы (а именно Са2\ протеинкиназы, инозитол-3-фосфат и др.), которые обеспечивают передачу сигнала в животной клетке. Таким образом, мониторинг появления сигнальных молекул в клетке-хозяине может служить индикатором присутствия патогенов в образце.

Цели и задачи исследования. Целями данной работы было:

1. Разработка и тестирование различных систем на основе бактериофагов на предмет эффективности выделения и детекции клеток E.coli В. В работе использовались следующие системы:

• система на основе рекомбинантного бактериофага: фьюжен Т4 с биотин связывающим белком (Т4-ВССР), иммобилизованного на магнитные стрептавидиновые частицы;

• система на основе рекомбинантного бактериофага: фьюжен Т4 с доменом целлюлозосвязывающзго белка (T4-CBD) иммобилизованного на целлюлозные частицы;

• система на основе бактериофага дикого типа Т4 в комбинации с новыми алюминиевыми нановолокнистыми фильтрами «Disruptor».

2. Исследование зависимости между вирулентными свойствами E.coli штаммов и их адгезивной способностью к эпителиальным HeLa клеткам при использовании светящихся клеток E.coli (lux) с перспективой создания биосенсора для детекции патогенных бактерий в целом.

В соответствии с целями в диссертационной работе были поставлены следующие задачи:

1. Получение биосорбентов на основе бактериофагов. Изучение их стабильности.

2. Проверка способности выделения/концентрирования клеток E.coli В из раствора с помощ>ю разработанных биосорбентов.

3. Применение E.coli В (lux) для изучения влияния фаговых сорбентов на рост бактерий.

4. Исследование возможности использования комбинации разработанных биосорбентов и биолюминесцентного АТФ-анализа для одновременного концентрирования и детекции E.coli В. Сравнение с эффективностью метода прямой детекции в системе бактериофаг Т4-E.coli В.

5. Исследование кинетики роста светящихся штаммов E.coli (lux) различной вирулентности в различных средах.

6. Исследование зависимости адгезивой способности различных штаммов E.coli к эпителиальным HeLa клеткам от их вирулентных свойств.

Научная новизна. Разработан биолюминесцентный метод определения клеток E.coli с использованием бактериофага Т4, предел количественного обнаружения которого составляет 6,2*103 КОЕ/мл при длительности анализа 2 часа. Впервые детально исследованы биосорбенты на основе рекомбинантных Т4-ВССР и

T4-CBD фагов, а также система на основе новых нанофильтров "Disruptor" + бактериофага Т4 дикого типа. Показано, что биосорбенты на основе рекомбинантных фагов менее подвержены к десорбции фагов с поверхности (более стабильны) по сравнению с аналогичными биосорбентами на основе бактериофага Т4, однако менее эффективны для детекции бактерий. Наилучшие результаты показала система на основе нанофильтов "Disruptor" в комбинации с бактериофагом Т4 иммобилизованным на фильтрах или в растворе. Чувствительность детекции клеток E.coli составляет -500 КОЕ/мл. Показана высокая специфичность детекции E.coli в смеси с S. Typhimurium.

Разработан новый подход на основе биолюминесцентного метода детекции для исследования зависимости между патогенностью различных штаммов E.coli и их адгезивной способности к эпителиальным HeLa клеткам, основанный на определении времени до начала момента появления детектируемого сигнала. Биолюминесцентные E.coli (lux) штаммы различной степени патогенности были протестированы предложенным методом. Показано, что взаимодействие с HeLa клэтками специфично для каждого штамма. Данные по адгезивной способности клеток сильно разнятся между штаммами внутри групп, что делает различие между группами патогенных и непатогенных штаммов статистически незначительными (значения р > 0,05). Впервые показано, что контакт бактерий с HeLa клетками активирует рост различных штаммов E.coli, что может указывать на важную регуляторную роль HeLa клеток в процессе колонизации эпителия бактериями.

Практическая значимость работы.

Разработанный метод определения клеток E.coli основанный на применении новых нанофильтров «Disruptor» и бактериофага дикого типа Т4 показал высокую чувствительность (предел обнаружения равен ~500 КОЕ/мл) и возможность определять бактерии-мишени при высоком (до 60 раз) избытке посторонней микрофлоры. Преимуществами метода на основе нанофильтров «Disruptor» с иммобилизованным бактериофагом Т4 является то, что фаг иммобилизуется на фильтре за счет физической сорбции, тем самым отсутствует необходимость его химической или генноинженерной модификации, что может приводить к ухудшению литической активности фага. Все это указывает на возможность удобного практического применения системы на основе использования бактериофага и нанофильтров для специфического экспресс-определения патогенных бактерий. Показана ослабленная (по сравнению с фагом дикого типа) литическая активность рекомбинантных фагов и биосорбентов на их основе, что приводит к

неэффективности применения этих сорбентов для выделения и детекции клеток E.coli В.

Изучение взаимодействия эпителиальных HeLa клеток со светящимися клетками Eco//' различной вирулектности выявило отсутствие влияния вирулентных свойств E.coli штаммов на их адгезивную способность по отношению к эпителиальным HeLa клеткам; одновременно было установлено, что непосредственный контакт бактерий с HeLa клетками приводит к интенсификации их роста, особенно при низких начальных концентрациях.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: the 16th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence (Lyon, France, 2010), International Conference Biocatalysis-2009: Fundamentals and Applications (Arkhangelsk, Russia, 2009), the 15th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence (Shanghai, China, 2008), the 11th NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show Nanotech (Boston, USA, 2008).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 3 статьи и6 тезисов к конференциям.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (три главы), описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (четыре главы), выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 118 страниц печатного текста, 20 рисунков, 18 таблиц и 197 ссылок.

Принятые в тексте обозначения. T4-BCCP - рекомбинантный биотинилированный бактериофаг T4, содержащий биотинсвязывающий белок на поверхности капсида; T4-CBD - целлюлозосвязывающий рекомбинантный бактериофаг T4, содержащий домены целлюлозосвязывающэго белка на поверхности капсида; MOI-отношгние концентрации фага к концентрации бактерий в образце; SD - стандартное отклонение; п - количество повторов эксперимента; MEM - минимальная среда Игла; FBS - сыворотка крови телят.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БАКТЕРИЙ Е. COLI В С БАКТЕРИОФАГОМ Т4 И ЕГО

РЕКОМБИНАНТНЫМИ АНАЛОГАМИ Т4-ВССР И T4-CBD В РАСТВОРЕ

Детекция клеток E.coli В при помосци прямого Т4 - E.coli В метода. Образцы клеток E.coli (12 -1*107 КОЕ/мл) бы ли смешаны с бактериофагом Т4 дикого

типа так, чтобы концентрация фага в суспензии с бактериями составила Ю10 БОЕ/мл. Лизис клеток определялся при помощи биолюминесцентной АТФ-метрии. Зависимость интенсивности биолюминесценции от концентрации клеток Е.соН В (КОЕ/мл) в исходных тестируемых образцах представлена на Рис. 1. Математическая обработка данных показала, что предел обнаружения равен 980 КОЕ/мл, предел количественного обнаружения - 6,2х103 КОЕ/мл, что близко к чувствительности метода биолюминесцентной АТФ-метрии. Как видно из Рис. 1 калибровочная зависимость интенсивности биолюминесценции (И-11) от количества клеток (КОЕ/мл) описывается двумя прямыми: в диапазоне 600 - 1*105 КОЕ/мл уравнением веда: )д(НШ)=0,35х)д[Есо//]+1,1, где наклон калибровочной кривой меньше единицы (0,35), в то время как для 1х105 - 1 *106 КОЕ/мл описывается уравнением вида: 1д(ВШ)=1,22х|д[Н.со//]+3,3, где наклон калибровочной кривой больше единицы (1,22). Низкая чувствительность прямого Т4-£.со// В метода в диапазоне концентраций 600 - 1хю5 КОЕ/мл (наклон калибровочной кривой 0,35) затрудняет достоверное определение малых концентраций клеток.

1.0 .....-----------------1.......<....................I

2.0 1.0 4.0 5.0 6.0 7.0 lg([F.CO//], КОЕ/мл)

Рис. 1. Зависимость интенсивности биолюминесценции от концентрации клеток Е.соН В в диапазоне 600 - 1*106 КОЕ/мл при использовании прямого T4-£.coIi В метода.

Эксперименты со смешанной культурой клеток показали, что при 5-кратном избытке S. Typhimurium можно специфически определять клетки Е.соН с погрешностью не более 10%.

Взаимодействие с биотинилированным Т4-ВССР и целлюлозосвязывающим T4-CBD фагами. Ранее в литературе было замечено, что генетически модифицированные фаги обладают ослабленной литической способностью. Чтобы сравнить инфекционные свойства рекомбинантных фагов с фагом дикого типа были получены кривые роста Е.соН В (lux) в присутствии Т4, Т4-ВССР и T4-CBD при помощи биолюминесценции. Интенсивность биолюминесценции была пропорциональна содержанию клеток в образце, а степень ингибирования

роста характеризовала активность данного бактериофага. В качестве контроля был использован идентичный бактериальный образец, не содержащий фага. Для образца, содержащего бактериофаг Т4 дикого типа, наблюдали полное подавление роста, как минимум в течение 5 ч (Рис. 2). Бактериальные образцы с рекомбинантными фагами Т4-ВССР и T4-CBD ингибируют рост клеток Е.соН В (lax), однако после 5 ч инкубации наблюдается значительный биолюминесцентный сигнал, что свидетельствует о наличии живых бактерий в исходном образце способных инициировать дальнейший рост. Полученные результаты подтверждают данные литературы о том, что генетически модифицированные фаги обладают ослабленной литической способностью за счет меньшего числа фагов производимых одной клеткой, и более продолжительного латентного периода.

время, ч

Рис. 2. Кривые роста светящихся клеток E.coli В (lux) (2* 104 КОЕ/мл), полученные путем измерения биолюминесценции, в присутствии Т4-бактериофага (*), T4-CBD (♦), Т4-ВССР (А) при MOI 300-500 и контрольного образца, не содержащего фага ( ).

Детекция клеток E.coli В методом биолюминесцентной АТФ-метрии. Логическая активность фагов была сравнена путем биолюминесцентного измерения концентрации внеклеточной АТФ при инкубировании клеток Е.соН В в присутствии фага дикого типа и модифицированных фагов (Рис. 3). Данные также свидетельствуют об ослабленной литической активности рекомбинантныхфагов.

время, ч

Рис. 3. Зависимости концентраций внеклеточной АТФ в суспензии клеток Е.соН В (7*ю' КОЕ/мл) от времени в отсутствие фага (о) и в присутствии фага Т4 дикого типа (*), рекомбинантаых фагов Т4-ВССР (А) и Т4-СВ0 (♦) при МО! 140.

2. БИОСОРБЕНТЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФАГОВ. ИХ СВОЙСТВА И ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ КЛЕТОК

E.COLI

2.1. Иммобилизация бактериофагов на магнитных и целлюлозных частицах

Иммобилизация фага дикого типа Т4 и биотинилированного фага Т4-ВССР на магнитных частицах, покрытых стрептавидином. Способность фага связываться с поверхностью магнитных частиц, покрытых стрептавидином, изучена при инкубации раствора фага различных концентраций с магнитными частицами. Инкубация частиц и фага проводилась при 37°С в течение ночи. Процент связывания фага определялся как разница концентраций фаговых частиц в супернатанте после инкубации и в исходном растворе.

Процент Т4-ВССР фагов, связанных магнитными частицами, покрытыми стрептавидином, варьируется от 37 до 84%. В то время только 3-16% фага дикого типа Т4 было адсорбировано при тех же условиях. Промывание биосорбектов фосфатным буфером показало, что как для Т4-ВССР, так и для Т4 только 1 % от связанных фагов был смыт с поверхности магнитных частиц. Полученные данные подтверждают высокое специфическое связывание рекомбинантного Т4-ВССР фага через биотин-стрептавидиновое взаимодействие.

Иммобилизация фага дикого типа Т4 и целлюлозосвязывающего фага T4-CBD на целлюлозные частицы. Оценка связывания фага с поверхностью целлюлозных частиц была осуществлена путем инкубации раствора фага различных концентраций с целлюлозными частицами. Условия инкубации и расчет связанных фагов был аналогичен эксперименту с магнитными частицами и Т4-ВССР фагом. Процент связанных T4-CBD с целлюлозными частицами составил 98%, а для Т4 -92%. Тем не менее, до 100% связанного Т4 фага смывалось при интенсивном промывании биосорбента фосфатным буфером. Но только 12% связанного T4-CBD удалялось во время промывания. Этот результат подтверждает специфичность и прочность связывания фага с поверхностью целлюлозы через CBD домены на поверхности фагового капсида.

2.2. Исследование свойств полученных биосорбентов

Предварительная оценка литической активности биосорбентов по зонам лизиса показала наличие зон просветления вокруг тестируемых биосорбентов. Лизиса не наблюдалось вокруг частиц без фага (данные не представлены).

Оценка эффективности связывания клеток E.coli с биосорбентом на основе магнитных частиц. Биосорбент на основе 2*107 БОЕ/мл фага Т4-ВССР

был протестирован с клетками Е.соН (30 мин инкубация, 37°С, аккуратное перемешивание) в широком интервале концентрации клеток. Оказалось, что биосорбент на основе рекомбинантного фага показал чрезвычайно слабое преимущество или же не показал такового вообщэ по сравнению с биосорбентом на основе физически адсорбированного Т4 и контроля (частицы без фага) (Табл. 1). Связывание бактерий одним и тем мое биосорбентом сильно варьируется (от 17 до 53 %, данные для 105 КОЕ/мл) (Табл. 2).

Оценка эффективности связывания клеток Е.соН с биосорбентом на основе целлюлозных частиц. Целлюлозные частицы инкубировались в течение ночи с рекомбинантным фагом Т4-СВО при его различных концентрациях при условиях, указанных вы не. Целлюлозные частицы с бактериофагом Т4 использовались как контроль. Оценка эффективности биосорбента проходила по следующим параметрам: стабильность биосорбента (степень десорбции фагов с поверхности бисорбента) и эффективность связывания бактерий.

Биосорбент на основе фага Т4-СВО (1,7x104 БОЕ/мг целлюлозы, полученный при инкубации целлюлозных частиц с фагом при концентрации 206 БОЕ/мл) тестировали с клетками Е.соН В (103 - 107 КОЕ/мл). Процент связанных клеток варьировался от 24 до 58 % вне зависимости от концентрации Е.соН (Табл. 1). Сильная вариация связывания бактерий наблюдалась и для Т4 бисорбента и целлюлозных частиц без фага. В среднем процент связывания для Т4-СВО биосорбента был несколько вышз (максимальное связывание 58%), чем для Т4 биосорбента (максимальное связывание 48%). Однако разброс данных для взаимодействия 105 КОЕ/мл с Т4-СВО-целлюлозными частицами в повторных экспериментах (от 0 до 48 %) был весьма велик (Табл. 2).

Таблица 1. Данные по связыванию клеток Е.соН различных концентраций с биосорбентами. Условия: 30 мин инкубация, 37°С, аккуратное перемешивание.

[Б-соИ], КОЕ/мл 2*107 БОЕ/мл В ССР-магнитные частацы магнитные частицы без фага 2*10® БОЕ/мл СВО-целлюлозные частицы целлюлозные частицы без фага

связывание, % ЭО, л=2 связывание, % во, п=2 связывание, % ЭО, п=3 связывание, % БО, п=2

107 12 3 35 1 40 3 25 1

10е 19 8 40 7 58 6 38 3

105 17 2 35 13 48 9 48 3

10* 21 3 29 21 35 3 24 14

103 12 13 25 20 41 5 46 2

Связывание определялось по разнице количества бактерий в образце до и после контакта с биосорбентом.

Таблица 2. Данные по связыванию клеток E.coli одинаковых концентраций с биосорбентами. Условия: 30 мин инкубация. 37°С, аккуратное перемешивание.

[£.со«1, КОЕ/ш 2*107 БОЕ/мл ВССР-магнитные частицы магнитные частицы без фага 1*10э БОЕ/мп T4- магнитные частицы

связывание,% SD, п=2, 3 связывание, % SD, п=2 связывание, % SD, п=2-4

106 53 19 4 8 45 40 3 7 - -

105 53 17 9 2 9 35 16 13 17 10 3 6

2*106 БОЕ/мл CBD-целлюлозные частицы целлюлозные частицы без фага 2«10® БОЕ/мл T4-целлюлозные частицы

106 38 58 8 6 34 38 3 3 - -

105 0 48 11 9 29 48 43 3 24 42 18 11

Из всех полученных данных можно сделать вывод о высокой степени неспецифичности адсорбции бактерий на биосорбент, что можно объяснить низкой инфекционной способностью иммобилизованных рекомбинантных фагов.

Сравнение инфекционных свойств биосорбентов на основе магнитных и целлюлозных частиц с использованием светящихся клеток E.coli В (lux). Биосорбенты, полученные при инкубации магнитных частиц с бактериофагами Т4-ВССР (2х107 и 2хЮ9 БОЕ/мл), Т4 (2хЮ9 БОЕ/мл) и целлюлозные частицы при инкубации с бактериофагами T4-CBD (2*106 БОЕ/мл), Т4 (1x1 о9 БОЕ/мл), а также носители без фага (контроль), были протестированы с 2х106 КОЕ/мл суспензией клеток E.coli В (lux). Бактериальные суспензии инкубировали с биосорбентом в течение 30 мин, удаляли неспецифически связанные клетки (промывание раствором PBS с 0,05% Tween) и ресуспевдировали в свежей среде. Затем частицы ставили на дальнейшую инкубацию, принимая это время за нулевую точку. Измерение биолюминесценции проводили как до инкубации (нулевое значение), так и в конце каядого часа инкубации в течение 4-х часов.

Были получены кривые биолюминесценции для сорбентов на основе магнитных (Рис. 4) и целлюлозных частиц (Рис. 5). Во всех образцах, содержащих фаг, наблюдалось ингибирование бактериального роста по сравнению с контролем. Минимальное ингибирование было отмечено для Т4-биосорбента. Эффективность ингибирования для биосорбентов на основе рекомбинантных Т4-ВССР и T4-CBD фагов была сильнее. Слабое ингибирование Т4-биосорбентом может быть объяснено меньшим количеством фага Т4, адсорбированного на магнитные частицы, по сравнению с Т4-ВССР-биосорбентами, а также меньшей его

стабильностью (Т4-фаги могут легко десорбироваться с поверхности, а следовательно, вымываться из системы при промывании биосорбентов).

Ингибирование клеточного роста биосорбентом на основе Т4-ВССР 2x109 БОЕ/мл (кривая 1, Рис. 4) было немного сильнее, чем ингибирование биосорбентом на основе Т4-ВССР 2*107 БОЕ/мл (кривая 2, Рис. 5), что свидетельствует о пропорциональности литических свойств биосорбента количеству иммобилизированного на нем фага.

2500 2000 1500 " »000 500

: 4

/ .. » 3 :-2............... : 1

J

0 12 3 4 5

время, ч

Рис. 4. Влияние биосорбентов на основе магнитных частиц на ростклеток Е.coli В (lux) (2*106 КОЕ/мл). Кривые роста клеток, связанных с Т4-ВССР (2*10s БОЕ/мл) магнитными частицами (1), с T4-ВССР (2«107 БОЕ/мл) магнитными частицами (2), с Т4 (1*109 БОЕ/мл) магнитными частицами (3), с магнитными частицами без фага (4). Концентрация магнитных частиц при инкубации с клетками равна 2*10* частиц/мл.

Детекция клеток Е.coli В при помощи биосорбентов на основе магнитных и целлюлозных частиц и биолюминесцентной АТФ-метрии. К клеточной суспензии добавляли биосорбент на основе фага, инкубировали и за лизисом клеток следили методом биолюминесцентной АТФ-метрии. Количество выделенной АТФ пропорционально литической активности фага, тем самым на основе интенсивностей полученных биолюминесцентных сигналов можно сравнивать активности различных биосорбентов.

Для сравнения эффективности методов на основе биосорбентов с эффективностью метода прямой детекции TA-E.coii В, суспензию клеток обрабатывали бактериофагом Т4 в растворе с последующей биолюминесцентной детекцией внеклеточной АТФ. Минимальная концентрация, которая была определена при помощи Т4-ВССР-магнитных частиц, составила 107 КОЕ/мл, а при помощи Т4-СВй-целлю лозных частиц - 105 КОЕ/мл, тогда как для метода прямой детекции количественное определение клеток возможно уже при 6,2*103 КОЕ/мл.

6000

5000

3

4000

2000

3000

1000

-1

:2

о

о

1

2

3

4

время, ч

Рис. 5. Влияние биосорбентов на основе целлюлозных частиц на рост клеток E.coli В (lux) (2*10® КОЕ/мл). Кривые роста клеток, связанных с T4-CBD (2*106 БОЕ/мл)-целлюлозными частицами (1), с Т4 (1*109 БОЕ/мл) - целлюлозными частицами (2), с целлюлозными частицами без фага (3). Концентрация целлюлозных частиц при инкубации с клетками равна 10 мг частац/мл.

Следует отметить, что для магнитных и целлюлозных частиц без фага также были получены значительные сигналы интенсивности биолюминесценции. Это говорит о том, что при данном методе обработки (2-х часовая инкубация, 200 об/мин) происходит повреждение клеточной стенки бактерий и неспецифическое увеличение внеклеточнойАТФ.

Низкая чувствительность метода с использованием Т4-ВССР-магнитных частиц может быть объяснена малым количеством бактерий на частицах после промывки частиц с PBS-Tween, также как и слабой инфекционной способностью рекомбинантных фагов. Лучшая чувствительность в случае биосорбентов на основе целлюлозных частиц может быть обусловлена как более высокой инфекционной способностью Т4-СВО-целлю лозного биосорбента, так и более высоким неспецифическим связыванием клеток на целлюлозной поверхности. Одной из причин низкой эффективности модифицированных бактериофагов, может быть переизбыток аффинных групп на поверхности фагового капсида.

Помимо чистой культуры E.coli Т4-ВССР-магнитные частицы и T4-CBD-целлюлозные частицы применяли для детекции 1,4x10s КОЕ/мл клеток E.coli в смеси с Salmonella Typhimurium. Культура Salmonella была выбрана как посторонний микроорганизм, так как она принадлежит к тому же семейству (Enterobacteriaceae), что и род Escherichia, и также является палочкообразной, грамм-отрицательной, не спорообразующей факультативно-анаэробной энтеробактерией как и Escherichia coli. Однако уже при однократном избытке культуры Salmonella над культурой E.coli, значение сигнала вышло за погрешность в 10%, что свидетельствует о

непригодности данных биосорбентов для специфического определения клеток E.coli в смеси.

3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАНОФИЛЬТРОВ «DISRUPTOR» И БАКТЕРИОФАГА Т4 ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ КЛЕТОК E.COLI

3.1. Получение биосорбента на основе нанофильтров и фага Т4 и исследование его стабильности

Иммобилизация бактериофага Т4 на нанофильтры путем физической адсорбции. Нанофильтры «Dlsruptor4601» - фильтры на основе наноалюминиевых волокон, которые были любезно предоставлены корпорацией «Ahlstrom», США. Эти фильтры обладают положительным электрокинетическим зета потенциалом и способны эффективно задерживать как бактерии, так и вирусы. Более того, положительный электрокинетический зета потенциал этих фильтров может обеспечить направленную иммобилизацию бактериофагов через отрицательно заряженный капсид, как это происходит в случае кремниевых микрочастиц. Чтобы иммобилизовать Т4 бактериофаг на нанофильтрах (поры 2 мкм, толщина 0,8 мм), 50 мкл раствора фага (3,4x1010 БОЕ/мл) наносили на поверхность фильтра (диаметр 1 см) и оставляли на 15-40 мин при комнатной температуре для адсорбции фага на поверхность фильтра. Стабильность полученного биосорбента оценивали путем пропускания через фильтр 10 мл фосфатного буфера. Было обнаружено, что до 60% нанесенного фага остается на фильтре после промывания.

Удержание клеток E.coli биосорбентами на основе нанофильтров «Disruptor». Нанофильтры как с иммобилизованным фагом, так и без фага были использованы для фильтрации 10 мл суспензий клеток E.coli с различными концентрациями (от 10 до 1«107 КОЕ/мл). Эффективность удержания бактерий была определена путем высева на чайку фильтратов и составила 99,9 % для суспензий до 1*107 КОЕ/мл как для фильтров с фагом, так и без.

3.2. Сравнение инфекционных свойств системы бактериофаг Т4 + нанофильтры с использованием светящихся клеток E.coli В (lux)

Для сравнения инфекционных свойств системы бактериофаг Т4 + нанофильтры использовали суспензии светящихся клеток E.coli В (lux), для которых получали кривые роста, измеряя интенсивность биолюминесценции. По методу А 10 мл суспензии клеток фильтровали через нанофильтр, не содержащий фага, а затем на фильтр наносили 100 мкл Ю10 БОЕ/мл раствора Т4 (109 БОЕ/фильтр). По методу Б 10 мл суспензии клеток E.coli В (lux) фильтровали через нанофильтр с иммобилизованным Т4 бактериофагом (1,7*109 БОЕ/фильтр). Фильтры с

бактериями ставили на инкубацию. Интенсивность биолюминесценции измеряли как до инкубации (нулевое значение), так и после каждого часа инкубации в течение пяти часов. Нанофильтры с бактериями без фага использовали в качестве контроля.

Зависимости интенсивности биолюминесценции от времени (Рис. 6) показывают, что в случае контроля - нанофильтры без фага, наблюдается рост клеток (кривая 1). Когда на нанофильтрах присутствует бактериофаг (кривые 2 и 3), роста клеток E.coli В не наблюдается. Напротив, интенсивность биолюминесценции уменьшается, что говорит об уменьшении числа живых клеток за счет инфицирования их бактериофагом и гибели клеток. Более эффективное ингибирование наблюдается при использовании метода А, когда раствор бактериофага добавляется к клеткам на фильтре (кривая 3). Меньцвя степень ингибирования при использовании метода Б свидетельствует об уменьшзнии питическойактивности иммобилизированного бактериофага.

1.Е+07 1.Е+06

31.Е+05

к

1.Е+04 1.Е+03

0 1 2 3 4 5 6 время, ч

Рис. 6. Влияние биосорбентов на основе нанофильтров «Disruptor» на рост E.coli В 0их) (1 мл, 2*106 КОЕ/мл). Кривые роста клеток на нанофильтрах без фага (1), на нанофильтрах с иммобилизованным фагом T4 (1,7x10® БОЕ/фильтр) (2), на нанофильтрах в присутствии 10° БОЕ/фильтр свободного фага T4 (3).

3.3. Исследование возможности специфической детекции клеток E.coli при помощи биосорбента на основе нанофильтров с бактериофагом Т4

С целью исследования возможности детекции клеток E.coli при помощи биосорбента за лизисом клеток следили путем измерения концентрации внеклеточной АТФ биолюминесцентным методом. Результаты представлены на Рис. 7 и в Табл. 3. Как мы отмечали выше (стр. 7), предел количественного обнаружения (LQD) прямого метода Т4 - E.coli В метода равен 6,2х103 КОЕ/мл. При использовании биосорбентов на основе нанофильтров, для метода А наклон градуировочной прямой значительно круче по сравнению с прямым методом, что приводит к LOD, равному ~500 КОЕ/мл, а значит - к увеличению чувствительности

--J 3

метода в 20 раз. Для метода Б величина LOD равна 730 КОЕ/мл. Однако используемый объем суспензии клеток при прямом методе для анализа составляет 50 мкл, а при методах А и Б с использованием нанофильтров - 10 мл, то есть количество клеток в анализируемом образце различается в 200 раз при одинаковой исходной концентрации. Более низкая, чем могла ожидаться, чувствительность методов с использованием данных биосорбентов может быть объяснена неполным лизисом клеток за счет толщины нанофильтров (0,8 мм).

Методы на основе нанофильтров показали хорошую специфичность детекции клеток Е.соН в смеси с клетками S. Typhimurium. Метод А позволяет определять E.coli В (7х104 КОЕ/мл) при 8-кратном избытке S. Typhimurium с погрешностью не более 7%. Метод Б дает 4-х % погрешность при 60-кратном избытке клеток 5. Typhimurium (при 3*104 КОЕ/мл E.coli В). В тоже время для прямого метода 5-кратный избыток клеток Salmonella дает погрешность в 8%. Более высокая специфичность методов на основе нанофильтров может быть обусловлена более высокой концентрацией бактерий в смеси с фагом по сравнению с прямым методом. Добавочными факторами могут служить эффективный контакт «клетка - фаг» за счет избыточного давления во время фильтрации бактериальной суспензии через фильтр с фагом, а также направленная ориентация бактериофагов за счет положительного зета потенциала нанофильтров (метод Б).

7,0

6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0

« -1 • -2 » -3

"¡г*"'

Tñ#"

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0

1д([£.со/;'], КОЕ/мл)

Рис. 7. Зависимость интенсивности биолюминесценции от концентрации Е.соН В (КОЕ/мл). Используемые методы определения: на основе Т4 с нанофильтрами: метод А {кривая 1), метод Б (кривая 2) и метод прямого анализа Т4-£.со// В (кривая 3). Условия: концентрация Т4 - Ю10 БОЕ/мл, 1 ч инкубация при 37 "С (200 об/мин). Данные представлены в виде среднего значения (13Ш) как среднее±50, п=3.

Таблица 3. Рассчитанные параметры методов детекции на основе нанофильтров с бактериофагом T4 и прямого метода T4-E.coli В.

Диапазон концентраций клеток 600- 1*106 KOWm E.coli В

Метод Метод А Метод Б Прямой Т4-E.coli В метод

Предел обнаружения 500 КОЕ/мл 730 КОЕ/мл 980 КОЕ/мл

Предел количественного определения 990 КОЕ/мл 4,7x103 КОЕ/мл 6,2x103 КОЕ/мл

Пороговый сигнал 430 RLU 680 RLU 140 RLU

Пороговый сигнал количественного определения 820 RLU a.lxlO^RLU 270 RLU

БОфона 37RLU 80 RLU 13 RLU

Уравнение калибровочной кривой для 1ё(ЯШ) 0,94x)g[£.co/;] + 0,10 0,61 x]g[£.co/i]+l,08 0,35x|g[£-.co/i]+l,l l,22*lg[£.co/i]+3,3

Я2 0,990 0,994 0,963/0,994

Объем пробы, мл 10 10 0,050

3.4. Исследование инфекционных свойств биосорбентов разных типов при использовании светящихся клеток Е.соИ В (1их)

Способность различных биосорбентов ингибировать рост бактериальных клеток была изучена с использованием светящихся клеток E.coli В (lux). Были получены биосорбенты на основе бактериофагов Т4, Т4-ВССР или T4-CBD, которые были иммобилизованы на нанофильтрах, магнитных частицах, покрытых стрептавидином, или на целлюлозных частицах, соответственно. Носители без фагов были использованы в качестве контроля. Биосорбенты добавляли к суспензиям клеток E.coli В (lux) (1-2*106 КОЕ/мл) и инкубировали в течение 30 мин. Несвязавшиеся клетки удаляли путем промывания, а биосорбенты с удержанными бактериями помешали в свежую среду и инкубировали при 37°С.

В начальный момент эксперимента максимальный уровень биолюминесценции был получен для биосорбента на основе нанофильтров ((6-7)*104 RLU). Более низкий сигнал имел биосорбент на основе целлюлозных частиц (250-450 RLU) и еще более низкий сигнал имел биосорбент на основе магнитных частиц (~140 RLU). Максимальная биолюминесценция за счет нанофильтров обуславливается удержанием фильтром более 99% бактерий. Величины интенсивности биолюминесценции биосорбента и соответствующего контроля были близки для каждого вида сорбентов. В случае нанофильтров,

происходит почти полное удержание бактерий фильтром независимо от присутствия на нем фага. Однако в случае биосорбентов на основе магнитных и целлюлозных частиц это еще раз сведетельствует о преобладании неспецифической сорбции, которая играет решающую роль в процессе связывания бактерий.

В присутствии иммобилизованного фага наблюдалось ингибирование роста клеток (Рис. 8). Чем больше клеток было удержано биосорбентом, тем сильнее было ингибирование их роста. Уменьшение сигнала свидетельствует об уменьшении числа живых клеток, скорее всего за счет их лизиса фагом. Рост клеток полностью подавлялся биосорбентом на основе фага Т4, связанного с нанофильтрами.

Таким образом, из данных по ингибированию бактериального роста, биосорбент на основе фага Т4, связанного с нанофильтрами, является наиболее эффективным ингибитором роста бактериальных клеток, что может быть использовано в будущем для создания бактерицидных материалов.

время, время, ч

В

время, ч

Рис. 8. Влияние биосорбентов на рост клеток E.coli В (lux) (2*106 КОЕ/мл). Кривые роста клеток E.coli В (lux), связанных нанофильтрами без фага (рис. 8А, кривая 1), нанофильтрами с иммобилизованным фагом (рис. 8А, кривая 2); целлюлозными частицами (10 мг/мл) (рис. 8Б, кривая 1) и целлюлозными частицами, покрытыми T4-CBD бактериофагом (рис. 8Б, кривая 2); стрептавидиновыми магнитными частицами (2х 10е частиц/мл) (рис. 8В, кривая 1) и магнитным частицами, покрытыми T4-BCCP (2*10° частиц/мл) (рис. 8В, кривая 2).

4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПАТОГЕННЫХ И НЕПАТОГЕННЫХ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ ШТАММОВ Е. COLIC ЭПИТЕЛИАЛЬНЫМИ HELA КЛЕТКАМИ

В работе использовались эпителиальные HeLa клетки, которые являются гибридными раковыми клетками человеческой эпителиальной ткани. Ранее в ряде работ было показано успешное применение данной линии раковых клеток как модельной системы для исследования механизма взаимодействия патогенных E.coli штаммов: ЕРЕС и Е. coli 0157:Н7 и непатогенных с человеческими эпителиальными клетками. Этот факт, а также однородность упомянутых эпителиальных клеток и удобство работы с ними и обусловили выбор данной модельной системы.

4.1. Биолюминесценция штаммов Е.соЩlux)

В работе с эпителиальными HeLa клетками использовали 15 штаммов светящихся клеток Е. coli, содержащих полный luxCDABE оперон бактериальной люциферазы, из которых 5 штаммов были непатогенные клетки Е. coli., 5 -энтерогеморрагические (ЕНЕС) Е. coli 0157:Н7 и 5 - эктерогеморрагические Е. coli различных 0:Н серотипов. Рост интенсивности биолюминесценции, выраженной в относительных световых единицах (RLU), характеризовал кинетику роста штаммов. При сравнении кривых роста штаммов E.coli в различных средах (МЕМ+10% FBS в присутствии и в отсутствие HeLa клеток; использованная среда МЕМ+10% FBS, в которой HeLa клетки росли в течение 3-х суток; среда LB), наиболее интенсивный рост для всех штаммов наблюдался в среде МЕМ+10% FBS в присутствии HeLa клеток, которая была выбрана для проведения всех экспериментов. Скорость роста бактерий в среде сильно варьировалась, но для каждого штамма была индивидуальна.

4.2. Адгезия бактериальных клеток Е. coli к эпителиальной HeLa ткани

Бактериальные штаммы, исследованные в настоящей работе, покрывают широкий спектр инфекционных свойств и частоты, с которой эти заболевания случаются (в частности, по частоте приводящей к гемо лит ико-уремическому синдрому), что может быть ассоциировано с их степенью вирулентности. Как известно, наиболее опасными бактериями, из изучаемых нами штаммов, являются Е. coli 0157.Н7.

Из литературы известно, что клетки E.coli, принадлежащие к типичным ЕРЕС (группа энтеропатогенных штаммов E.coii) и ко второй группе ЕНЕС (энтерогеморрагические штаммы £.со//, Шига токсин не 0157:Н7), инфицируют

эпителиальную ткань путем прикрепления к ней по механизму «прикрепления-сглаживания» (А/Б поражения). Тот факт, что колонизация патогенных бактерий E.coli ЕНЕС в кишечнике человека может занимать от 3 до 8 суток, свидетельствует в пользу адгезии бактерий к стенке кишечника и их размножения в нём. Нами было решэно оценить степень адгезии штаммов E.coli к эпителиальной ткани с целью определения существует ли зависимость мезду степенью адгезии бактериальных штаммов и их вирулентностью.

Определение адгезии бактерий проводилось путем сравнения времён до начала детекции (TTD - время, когда значение биолюминесценции достигает уровня двойного фона), полученных при инкубировании известных концентраций, с временами TTD, полученных для образцов инокулята клеток Е. coli с HeUa клетками после их совместной инкубации и последующего промывания (удаления несвязавимхся клеток Е. coli). Время инкубации варьировалось (10 и 60 мин), и использовались две концентрации инокулята (5*104 и5*105 КОЕ/лунку).

Данные по адгезивной способности бактерий к эпителиальным HeLa клеткам представлены в Табл. 4, Количество адгезированных бактериальных клеток сильно варьируется в зависимости от штамма: от 0 до Зх104 КОЕ/лунку для концентрации инокулята (5±4)х104 КОЕ/лунку и от 0 до 9Х105 КОЕ/лунку для концентрации инокулята (5±4)*105 КОЕ/лунку. Существенная вариация по адгезии присутствует и внутри каждой группы штаммов. Однако можно заметить, что штаммы группы ЕНЕС прикрепляются к эпителиальной ткани лучше других. Так, для четырех из пяти штаммов количество прикрепленных бактерий на лунку составило от 330 до 5250 КОЕ/лунку (для концентрации инокулята (5±4)х104 КОЕ/лунку при 1 ч инкубации). Полученные данные согласуются с данными литературы, согласно которым клетки E.coli, принадлежащие к ЕНЕС группе 2 (0157:Н7 штаммы, не выделяющие Шига токсин), поражают клетку-хозяина по механизму «присоединения-сглаживания» (attaching/effacing lesion, А/Е поражение).

Штаммы, принадлежащие к группе 0157:Н7, обладают наиболее слабой адгезией (адгезия для 4-х из 5-и штаммов составила -13 КОЕ/лунку и менее для концентрации инокулята (5±4)*104 КОЕ/лунку, 1 ч инкубации). В литературе отмечено, что штаммы E.coli 0157:Н7 (ЕНЕС группа 1) поражают эпителиальную клетку путем частичного разрушения целостности мембраны. Таким образом, E.coli 0157:Н7 не присоединяются к эпителиальной клетке, а нарушают изолирующие функции её мембраны. Наблюдение пораженных HeLa клеток под микроскопом подтверждает полученные данные.

Таким образом, поведение каждого штамма специфично при взаимодействии с эпителиальной HeLa тканью. Данные по адгезии клеток сильно разнятся между штаммами внутри групп, что делает различие между группами статистически незначительными (значения р > 0,05). Тем самым невозможно достоверно отличить патогенные штаммы от непатогенных. Тем не менее, впервые было показано, что HeLa клетки активно способствуют росту различных штаммов Eco//, что указывает на важную регуляторную роль HeLa клеток в процессе колонизации бактерий.

Таблица 4. Адгезия клеток Е. coli на эпителиальную ткань HeLa, измеренная при помощи светящихся клеток Е. coli.

Штамм Е. coli Время контакта 10 мин Время контакта 60 мин

Концентрация инокулята. (КОЕ/лунку) Концентрация инокулята, (КОЕ/лунку)

(5±4)*104 (5±4)*10s (5±4)*104 (5±4)*105

Уровень адгезии клеток Е. coli !од(КОЕ/лунку)

Е. coli патогенные ЕНЕС 0157 :Н7

С695 <2,62 <2,62 <2,62 <2,62

С696 <3,41 <3,41 <3,41 < 3,41

С697 <0,45 <0,45 <0,45 1,98+0,13

С698 <3,38 <3,38 <3,38 ' <3,38

С699 2,02±0,61 3,08±0,36 2,58±0,24 3,63±0,37

Е. coli патогенные ЕНЕС не 0157

С727 3,08±1,28 3,80±1,02 3,72±0,74 5,25±1,02

С730 3,73±0,17 3,91 2,52±1,31 3,79±0,36

С735 2,32±1,32 3,44±0,27 3,07±0,40 3,88±0,11

С 758 2,36±0,96 3,38±0,72 3,30±0,61 4,01±0,67

С 760 <2,60 <2,60 <2,60 1,17±1,75

Непатогенные Е. coli

С602 2,41±1,16 3,50±0,78 2,82±0,21 3,95±0,36

С823 1,64±2,49 3,13 (л=1) 2,89±0,74 4,19±0,50

С1038 2,45±1,09 3,48±0,73 3,27 ±0,78 3,99±0,33

С1147 <2,41 <2,41 <2,41 <2,41

С1152 <1,81 3,04±2,14 <1,81 1,59±1,13

выводы

1. Изучено взаимодействие бактерий E.coli В в растворе с бактериофагом Т4 и его рекомбинантными аналогами: фагом Т4, слитым с биотин связывакицш белком (Т4-ВССР) и фагом Т4, слитым с доменом целлюлозосвязывающэго белка (T4-CBD). Показано, что питическая активность генетически модифицированных Т4-фагов ниже, чем исходного бактериофага Т4.

2. Получены биосорбенты путем иммобилизации фага Т4-ВССР на магнитных стрептавидиновых частицах, и фага T4-CBD на целлюлозных частицах. Показана высокая специфичность связывания рекомбинантных Т4-ВССР и Т4-CBD фагов с носителями, подтверждена прочность связывания.

3. Показано наличие более высокой логической активности биосорбентов на основе рекомбинантных бактериофагов по сравнению с аналогичными биосорбентами на основе исходного бактериофага Т4. Инфекционная активность иммобилизованных фагов снижена по сравнению с фагами в растворе.

4. Впервые нанофильтры «Disruptor» использованы для получения биосорбентов на основе бактериофага Т4 с целью задержания (на 99,9%) и детекции бактерий E.coli В. Предел обнаружения при использовании метода с неиммобилизованным бактериофагом составил 500 КОЕ/мл, при использовании метода с Т4-фагом, иммобилизованным на нанофильтре, - 730 КОЕ/мл. Показана высокая специфичность детекции E.coli в смеси с Salmonella Typhimurium.

5. Изучено взаимодействие эпителиальных HeLa клеток со светящимися клетками Е. coli, содержащими полный luxCDABE оперон бактериальной люциферазы (15 штаммов, из которых 5 - непатогенные штаммы £. со Ii, 10 -энтерогеморрагические штаммы (ЕНЕС), из них 5 - штаммы Е. coli 0157:Н7 и 5 - штаммы Е. coli других 0:Н серотипов). Впервые показано, что HeLa клетки активно способствуют росту различных штаммов E.coli, что может указывать на важную регуляторную роль HeLa клеток в процессе колонизации эпителия бактериями.

6. Исследование адгезивной способности клеток E.coli к эпителиальным HeLa клеткам показало отсутствие зависимости адгезивной способности клеток E.coli от их вирулентных свойств. Характер поведения клеток E.coli в присутствии HeLa клеток был специфичен для кахдого штамма.

Список публикаций по теме диссертации

1. О. Minikh, ГЛ. Tolba, L. Y. Erovko, ГЛ. W. Griffiths. Bacteriophage-based biosorbents coupled with bioluminescent ATP assay for rapid concentration and detection of Escherichia coliff Journalof MicrobiologicalMethods. 2010. V. 82. P. 177-183.

2. О. Мини*, П. Ю. Бровко, М. У. Гриффите, Н. Н. Угарова. Специфическое определение Е.соН В при помощи бактериофага Т4, нано-фильтров и АТФ-биолюминесценции // Вестник МГУ. Серия 2 «Химия». 2010. Т. S1 (3). С. 241-245.

3. М. Tolba, О. Minikh, L. Brovko, М. W. Griffiths. Oriented immobilization of T4 bacteriophage for simultaneous specific capture and detection of E co/i II Journal of Applied and EnvironmentaiMlcrobioiogy. 2010. V. 76 (2). P. 528-S3S.

4. L. Y. Brovko, H. Wang, J. Elliott, R. Dadarwal, O. Minikh, M. W. Griffiths. Bioluminescence imaging of bacteria-host interplay: interaction of E.coli with epithelial cells // In Bioluminescence and Chemiluminescence (Stanley, P. E. and Kricka L. J. eds.) Proceedings of the IS"1 International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence. World Scientific, Singapore. 2008. P. 343-345.

5. L. Y. Brovko, M. Tolba, O. Minikh and M. W. Griffiths. Engineering of bacteriophages displaying affinity tags on its head for biosensor applications // In NSTI-Nanotech 2008. Proceedings of the 2008 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. 2008. V. 2. P. 449-452. www.nsti.org

6. M. Tolba, O. Minikh, L. Y. Brovko, M. W. Griffiths. Simultaneous isolation/concentration and bioluminescent detection of Escherichia coli using bacteriophage-based biosorbents II Abstracts of the 15th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence. The Journal of Biological and Chemical Luminescence. 2008. V. 23.1. 2. P. 96.

7. L. Y. Brovko, H. Wang, J. Elliott, R. Dadarwal, O. Minikh, M. W. Griffiths. Bioluminescence imaging of bacteria-host interplay: interaction of E.coli with epithelial cells // Abstracts of the 155"1 International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence. The Journal of Biological and Chemical Luminescence. 2008. V. 23.1. 2. P. 60.

8. O. Minikh, M. Tolba, L.Y. Brovko, N.N. Ugarova, M.W. Griffiths. Specific detection of Escherichia co/i 6 using bacteriophage-mediated lysis and bioluminescent ATP assay // Abstracts of International Conference Biocatalysis-2009: Fundamentals and Applications. 2009. P. 58-59.

9. O. Minikh, M. Tolba, L. Y. Brovko, N. N. Ugarova, M. W. Griffiths. Biosorbents based on gene modified and wild type T4 bacteriophages for bioluminescent detection of host bacteria // Abstracts of the 16th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence. The Journal of Biological and Chemical Luminescence. 2010. V. 25.1. 2. P 177.

Тираж: 100 экз. Заказ № 765 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Патогенные бактерии и методы их детекции.

1.1. Патогены. Ущерб от патогенов.

1.2. Стандартные методы детекции.

1.3. Быстрые методы.

1.4. Вид Escherichia coli. Детекция патогенных клеток E.coli.

2. Бактериофаги.

2.1. Общие сведения о бактериофагах.

2.2. Литические и лизогенные бактериофаги.

2.3. Применение бактериофагов для детекции бактерий.

2.4. Применение бактериофагов как биосорбентов.

3. Биосенсоры.

3.1. Общие сведения.

3.2. Биосенсоры на основе клеточных тканей.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Бактериофаги и бактериальные штаммы.

2. Методики проведения экспериментов.

2.1. Взаимодействие клеток Е. coli В с бактериофагами в растворе.

2.2. Получение биосорбентов на основе фагов.

2.3. Оценка способности связывания клеток полученными биосорбентами.

2.4. Исследование литической активности биосорбентов на основе фагов.

2.5. Детекция клеток E.coli В на основе нанофильтров «Disruptor» и фага Т4 в растворе.

2.6. Анализ данных.

2.7. Взаимодействие патогенных и непатогенных штаммов E.coli с эпителиальными IleLa клетками.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.57 '

1. Взаимодействие бактерий E.coli В с бактериофагом Т4 и его рекомбинантными аналогами Т4-ВССР и T4-CBD в растворе.

1.1. Определение оптимальных условий для прямой детекции клеток E.coli В с помощью бактериофага Т4 и метода биолюминесцентной АТФ-метрии.

1.2. Ингибирование роста светящихся клеток E.coli В при взаимодействии с диким Т4 фагом, биотинилированным Т4-ВССР и целлюлозосвязывающим T4-CBD фагами

1.3. Изучение лизиса клеток E.coli В посредством фага дикого типа Т4 и рекомбинантных фагов Т4-ВССР и T4-CBD по данным метода биолюминесцентной АТФ-метрии.

2. Биосорбенты на основе иммобилизованных фагов. Их свойства и возможность применения для детекции клеток E.coli.

2.1. Иммобилизация бактериофагов на магнитных и целлюлозных частицах.

2.2. Исследование свойств полученных биосорбентов.

3. Использование нанофильтров «Disruptor» и бактериофага Т4 для специфической детекции клеток E.coli.

3.1. Построение биосорбента на основе нанофильтров и фага Т4 и исследование его стабильности.

3.2. Сравнение инфекционных свойств системы «бактериофаг Т4 + нанофильтры» с использованием светящихся клеток E.coli В (lux).

3.3. Исследование возможности специфической детекции клеток E.coli при помощи биосорбента на основе нанофильтров с бактериофагом Т4.

3.4. Исследование инфекционных свойств биосорбентов разных типов при использовании светящихся клеток E.coli В (lux).

4. Взаимодействие патогенных и непатогенных биолюминесцентных штаммов E.coli с эпителиальными HeLa клетками.

4.1. Биолюминесценция штаммов Е coli (lux).

4.2. Рост бактериальных клеток E.coli в различных средах.

4.3. Адгезия бактериальных клеток Е. coli к эпителиальной HeLa ткани.

ВЫВОДЫ.

выводы l

1. Изучено взаимодействие бактерий E.coli В в растворе с бактериофагом Т4 и его рекомбинантными аналогами: фагом Т4, слитым с биотин связывающим белком (Т4-ВССР) и фагом Т4, слитым с доменом целлюлозосвязывающего белка (Т4-CBD). Показано, что литическая активность генетически модифицированных Т4-фагов ниже, чем исходного бактериофага Т4.

2. Получены биосорбенты путём иммобилизации фага. Т4-ВССР на магнитных стрептавидиновых частицах, и фага T4-CBD на!целлюлозных частицах. Показана высокая специфичность связывания рекомбинантных Т4-ВССР и T4-CBD фагов fс носителями, подтверждена прочность связывания.

3. Показано наличие более высокой литической активности биосорбентов на основе рекомбинантных бактериофагов по сравнению с аналогичными биосорбентами па основе исходного бактериофага Т4. Инфекционная активность иммобилизованных фагов снижена по сравнению с фагами в растворе.

4. Впервые нанофильтры «Disruptor» использованы для получения биосорбентов на основе бактериофага Т4 с целью задержания (на 99,9%) и»детекции бактерий E.coli В. Предел обнаружения при использовании метода с неиммобилизованным бактериофагом составил 500 КОЕ/мл, при> использовании метода с Т4-фагом, иммобилизованным на нанофильтре, - 730 КОЕ/мл. Показана высокая специфичность детекции клеток E.coli в смеси с культурой Salmonella Typhimurium.

5. Изучено взаимодействие эпителиальных HeLa клеток со светящимися клетками Е. coli, содержащими полный IwcCDABE оперон бактериальной люциферазы (15 штаммов, из которых 5 - непатогенные штаммы Е. coli, 10 — энтерогеморрагические штаммы (ЕНЕС), из них 5 — штаммы Е. coli 0157:Н7 и 5 — штаммы Е. coli других 0:Н серотипов). Впервые показано, что HeLa клетки активно способствуют росту различных штаммов Е coli, что может указывать! на важную регуляторную роль HeLa клеток в процессе колонизации эпителия бактериями.

6. Исследование адгезивной способности клеток E.coli к эпителиальным IleLa клеткам показало отсутствие зависимости адгезивной способности клеток E.coli от их вирулентных свойств. Характер поведения клеток Е coli в присутствии HeLa клеток был специфичен для каждого штамма.

1. Squirrell D.J., Price R.L., Murphy M.J. Rapid and specific detection of bacterial using bioluminescence. // Analytica Chimica Acta. 2002. V. 457. P. 109-114.

2. Gracias K.S., Mckillip J.L. A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food. II Can J Microbiol. 2004. V. 50. P. 883-890.

3. Fung D.Y.C. Rapid methods and automation and Microbiology II Comprehensive reviews in food scince and food safety. 2002. V. 1. P. 3-22.

4. Favrin S.J;, Jassim S.A., Griffiths M.W. Application of a novel immunomagnetic separation-bacteriophage assay for the detection of Salmonella enter itidis and Escherichia coli 0157.-H7 in food. И Int J Food Microbiol. 2003. V. 85. P. 63-71.

5. Wu Y., Brovko L., Griffiths M.W. Influence of phage population on the phage-mediated bioluminescent' adenylate kinase (AK) assay for detection of bacteria. // Lett Appl Microbiol. 200Г. V. 33. P. 311-315.

6. Blasco R., Murphy M.J., Sanders M.F., Squirrell D.J. Specific assays for bacteria using phage mediated release of adenylate kinase. IIJ Appl Microbiol. 1998. V. 84. P: 661-666.

7. Goodridge L., Chen J., Griffiths M. The use of a fluorescent bacteriophage assay for detection of Escherichia coli 0157:H7 in inoculated ground beef and raw milk. II Int J Food Microbiol. 1999. V. 47. P. 43-50.

8. Leiman P.G., Kanamaru S., Mesyanzhinov V.V., Arisaka F., Rossmann M.G. Structure and morphogenesis of bacteriophage T4. И Cell Mol Life Sci. 2003. V. 60. P. 2356-2370.

9. Bennett A.R., Davids F.G.C., Vlahodimou S., Banks J.G., Betts R.P. The use of bacteriophage-based systems for the separation and concentration of Salmonella. II Journal of Applied Microbiology. 1997. V. 83. P. 259-265.

10. Sun W., Brovko L., Griffiths M. Use of bioluminescent Salmonella for assessing the efficiency of constructed phage-based biosorbent. II J Ind Microbiol Biotechnol. 2001. V. 27. P. 126-128.

11. Karim M.R., Rhodes E.R., Brinkman N., Wymer L., Fout G.S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. II Appl Environ Microbiol. 2009. V. 75. P. 2393-2399.

12. Tolba M., Brovko L.Y., Minikh O., Griffiths M.W. Engineering of bacteriophages displaying affinity tags on its head for biosensor applications. II in NSTI Nana tech 2008 conference. 2008. Boston, USA.

13. Finlay B.B., Cossart P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. II Science. 1997. V. 276. P. 718-725.

14. Pace J., Hayman M.J., Galan J.E. Signal transduction and invasion of epithelial cells by S. Typhimurium. II Cell. 1993. V. 72. P. 505-514.

15. Dehio C., Prevost M.C., Sansonetti P.J. Invasion of epithelial cells by Shigella flexneri induces tyrosine phosphorylation of cortactin by a pp60c-src-mediated signalling pathway. IIEMBO J. 1995. V. 14. P. 2471-2482.

16. Nisan I., Wolff C., Hanski E., Rosenshine I. Interaction of enteropathogenic Escherichia coli with host epithelial cells. II Folia Microbiol (Praha). 1998. V. 43. P. 247-252.

17. Wadsworth S.J., Goldfine H. Listeria monocytogenes phospholipase C-dependent calcium signaling modulates bacterial entry into J774 macrophage-like cells. If Infect Immun. 1999. V. 67. P. 1770-1778.

18. Shin S., Hur G.H., Kim Y.B., Park K.J., Park Y.M., Lee W.S. Intracellular calcium antagonist protects cultured peritoneal macrophages against anthrax lethal toxin-induced cytotoxicity. II Cell Biol Toxicol. 2000. V. 16. P. 137-144.

19. Cdc. Food-related disease information from the CDC 2009. http://www.cdc.gov/ncidod/diseases/food/index.htm.

20. Anon. The European standard 12824: 1997. Microbiology for food and animal feedings stuff Horizontal method for the detetion of Salmonella. II. 1998. British Standard Institution, London, UK.

21. Robert D., Hooper W., Greenwood M. Methods for examinasion of food for microorganisms pf public health significance. // Practical food microbiology. 1995. Public health laboratory service. London, UK.

22. The Compendium of Analytical Methods of Health Canada. // Health Canada and the Canadian Food Inspection Agency (CFIA) 2005.

23. Haddock S.H.D. Luminous Marine Organisms. II in Photoproteins in Bioanalysis. / Daunert S„ Deo S.K., Editors. 2006. Wiley-VCH. Weinheim. P. 25-47.

24. Wilson Т., Hastings J.W BIOLUMINESCENCE. II Annual Review of Cell and Developmental Biology. 1998. V. 14. P. 197-230.

25. Hastings J.W Biological diversity, chemical mechanisms, and the evolutionary origins of bioluminescent systems. //Journal of Molecular Evolution. 1983. V. 19. P 309-321.

26. Hastings J.W., Johnson C.H. Bioluminescence and chemiluminescence. И in Methods' in Enzymology. / 2003. Academic Press. P. 75-104.

27. Harvey E.N. Review of Bioluminescence. II Annual Review of Biochemistry. 1941. V. 10. P.531-552.

28. Seliger HH., Mcelroy W.D. Spectral emission and quantum yield of firefly bioluminescence. //Arch Biochem Biophys. 1960. V. 88 P. 136-141.

29. Ando Y., Niwa K., Yamada N., Enomoto Т., Irie Т., Kubota H., Ohmiya Y., Akiyama H. Firefly bioluminescence quantum yield and colour change by pH-sensitive green emission //Nat Photon. 2008. V. 2. P. 44-47

30. Угарова H.H., Фрунджян В.Г. Применение биолюминесцентной АТФ-метрии в биоаналитических целях. // Химический Факультет МГУ. 2003. 52 С.

31. Lundin A. Use of firefly luciferase in atp-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. II in Methods in Enzymology. / 2000. Academic Press. P. 346-370.

32. Roda A., Pasini P., Mirasoli M., Michelini E., Guardigli M. Biotechnological applications of bioluminescence and chemiluminescence II Trends Biotechnol. 2004. V. 22. P. 295-303.

33. Viviani V.R., Ohmiya Y. Beetle Luciferases Colorful Lights on Biological Processes and Diseases. // in Photoproteins in Bioanalysis. / Daunert S., Deo S.K., Editors. 2006 Wiley-VCH. Weinheim. P. 49-63.

34. Greer Iii L.F., Szalay A A. Imaging of light emission from the expression of luciferases in living cells and organisms: a review. II Luminescence. 2002. V. 17. P 43-74.

35. Griffiths M.W., Brovko L.Y. ATP bioluminescence in Detecting Pathogens in food. // ed Mcmeekin T.A. 2003. Cambridge, UK. CRC Woodhead Publishing.

36. Rees C.E.D., Loessner M.J. Chapter 9: Phage for the detection of pathogenic bacteria. // in Bacteriophages: biology and applications. / Kutter E., Sulakvelidze A., Editors. 2005. CRC Press. P. 267-284.

37. Sun W., Brovko L., Griffiths M. Use of bioluminescent Salmonella for assessing the efficiency of constructed phage-based biosorbent. // J Ind Microbiol Biotechnol. 2001. V. 27. P. 126-128.

38. Lee H.A., Wyatt G.M., Bramham S., Morgan M.R. Enzyme-linked immunosorbent assay Jor Salmonella Typhunurium in food: feasibility of 1-day Salmonella detection. // Appl Enviion Microbiol. 1990. V. 56. P. 1541-1546.

39. Wyatt G.M., Langley M.N., Lee H.A., Morgan M.R. Further studies on the feasibility of one-day Salmonella detection by enzyme-linked immunosorbent assay. II Appl Environ Microbiol. 1993. V. 59. P. 1383-1390.

40. Swaminathan B., Feng P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. II Annu Rev Microbiol. 1994. V. 48. P. 401-426.

41. Cloak O.M., Duffy G., Sheridan J.J., Mcdowell D.A., Blair I.S. Development of a surface adhesion immunofluorescent technique for the rapid detection of Salmonella spp. from meat and poultry. IIJ Appl Microbiol. 1999. V. 86. P. 583-590.

42. Yang L., Li Y. Detection of viable Salmonella using microelectrode-based capacitance measurement coupled with immunomagnetic separation. // J Microbiol Methods. 2006. V. 64. P. 9-16.

43. Fung D.Y.C. Rapid methods and automation and Microbiology. II Comprehensive reviews in food science and food safety. 2002. V. l.P. 3-22.

44. Kubitscheck H.E. Cell volume increase in Escherichia coli after shifts to richer media. // Journal of Bacteriology. 1990. V. 172. P. 94-101.

45. Conway P.L. ed. Human colonic bacteria: role in nutrition, physiology, and pathology. Microbial ecology of the human large intestine. // Ed. Gibson G.R., Macfarlane G.T. 1995. CRC Press. Boca Raton, FL. 1-24.

46. Ewing W.H. ed. Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae. 4th ed. 1986. Elsevier. New York.

47. Neill M.A., Tarr P.I., Taylor D.N., Trofa A.F. Eds. Escherichia coli. Foodborne Disease Handbook. // Ed. Hui Y.H., Gorham J.R., Murell K.D., Cliver D.O. 1994. Marcel Decker, Inc. New York. P. 169-213.

48. Donnenberg M.S., Whittam T.S. Pathogenesis and evolution of virulence in enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli. II J Clin Invest. 2001. V. 107. P. 539-548.

49. Ray B., Bhunia A. Eds. Fundamental Food Microbiology. 4th ed. 2007. CRC Press. Boca Raton, FL.

50. Wu S., Ueno D., Inoue K., Someya T. Direct viable count combined with Fluorecence in situ hybridization (DVC-FISH) for Specific Enmeration of viable Esherichia coli in Cow Manure. II Microbs Environment. 2009. V. 24. P. 33-38.

51. Ivanov V., Tay J.H., Tay S.T., Jiang H.L. Removal of micro-particles by microbial granules usedfor aerobic wastewater treatment. II Water Sei Technol. 2004. V. 50. P. 147154.

52. Upadhyayula V.K.K., Deng S.G., Smith G.B., Mitchell M.C. Adsorption of Bacillus subtilis on single-walled carbon nanotube aggregates, activated carbon and NanoCeram (TM). II WATER RESEARCH. 2009. V. 43. P. 148-156

53. Li H., Wu C., Tepper F., Lee J., Lee C.N. Removal and retention of viral aerosols by a novel alumina nanofiber filter. II Aerosol Science. 2009. V. 40. P. 65-71.

54. Kong H., Jang J. Antibacterial properties of novel poly(methyl methacrylate) nanofiber containing silver nanoparticles. II Langmuir. 2008. V. 24. P. 2051-2056.

55. Zadik P.M., Chapman P.A., Siddons C.A. Use of tellurite for the selection of verocytotoxigenic Escherichia coli 0157. II J Med Microbiol. 1993. V. 39. P. 155-158.

56. Voitoux E., Lafarge V., Collette C., Lombard B. Applicability of the draft standard method for the detection of Escherichia coli 0157 in dairy products. II Int J Food Microbiol. 2002. V. 77. P. 213-221.

57. Doyle M.P., Schoeni J.L. Isolation of Escherichia coli 0157:H7 from retail fresh meats and poultry. II Appl Environ Microbiol. 1987. V. 53. P. 2394-2396.

58. Padhye N.V., Doyle M.P. Production and characterization of a monoclonal antibody specific for enterohemorrhagic Escherichia coli of serotypes 0157:H7 and 026H11. II J Clin Microbiol. 1991. V. 29. P. 99-103.

59. Sernowski L.P., Ingham S.C. Frequency of false presumptive positive results obtained using a commercial ELISA kit to screen retail ground beef for E coli 0157-H7 II J. of Food Prot. 1992. V. 55. P. 846.

60. Chapman P.A., Malo A.T., Siddons C.A., Harkin M. Use of commercial enzyme immunoassays and immunomagnetic separation systems for detecting Escherichia coli 0157 in bovine fecal samples. // Appl Environ Microbiol. 1997. V. 63. P. 2549-2553.

61. Chapman P.A., Ashton R. An evaluation of rapid methods for detecting Escherichia coli 0157 on beef carcasses. II Int J Food Microbiol. 2003. V. 87. P. 279-285.

62. Dauglas J. Bacteriophages. // 1975. London. Chapman and Hall Ltd. 1-3, 105-107.

63. Ackermann H.W. Bacteriophage observations and evolution. II Res Microbiol. 2003. V. 154. P. 245-251.

64. Birge E.A. ed. Bacterial and bacteriophage genetics. 3rd ed. 1994. Spring Verlag. New York. 16-51.

65. Maloy S.R., Cronan J.E., Freifelder D. Eds. Microbial Genetics. 2nd ed. 1994. Jones and Bartlett publishers. London. 81-86.

66. Leiman P.G., Kostyuchenko V.A., Shneider M.M., Kurochkina L.P., Mesyanzhinov V.V., Rossmann M.G. Structure of bacteriophage T4 gene product 11, the interface between the baseplate and short tail fibers. II J Mol Biol. 2000. V. 301. P. 975-985.

67. Aksyuk A.A., Leiman P.G., Kurochkina L.P., Shneider M.M., Kostyuchenko« V.A., Mesyanzhinov V.V., Rossmann M.G. The tail sheath structure of bacteriophage T4~ a molecular machine for infecting bacteria II EMBO J. 2009. V. 28. P. 821-829.

68. Campbell A. ed. Molecular Genetics. // Ed. Taylor J.H. Vol. 2. 1967. Academic Press Inc. New York. 323.

69. Duckworth D.H. ed. History and basic properties of bacterial viruses. Phage Ecology. // Ed. Goyal S.M., Gerba C.P., Bitton G. 1987. Raven Press. New York. P. 1 43.

70. Gottesman M., Oppenheim.A. Eds. Lysogeny and prophage. Encyclopedia of virology. // Ed. Webster R.G., Graof A. 1994. Academic Press. New York. P. 814-824.

71. Suttle C.A. Viruses in the sea II Nature. 2005. V. 437. P. 356-361.

72. Ward L.R., De Sa J.D., Rowe B. A phage-typing scheme for Salmonella enteritidis. II Epidemiol Infect. 1987. V. 99. P. 291-294.

73. Platte R., Reynolds D.L., Phillips G.J. Development of novel method of lytic phage delivery by use of a bacteriophage P22 site-specific recombination system: II FEMS Microbiol. Letters. 2003. V. 223. P. 259-265.

74. Alisky J., Iczkowski K., Rapoport A., Troitsky N. Bacteriophages show promise as antimicrobial agents. IIJ Infect. 1998. V, 36. P. 5-15.

75. Wagner P.L., Waldor M.K. Bacteriophage control of bacterial virulence. II Infect immun. 2002. V. 70. P. 3985-3993.

76. Goodridge L., Abedon A.T. Bacteriophage biocontrol and bioprocessing: application phage therapy to industry. Feature article. II SIM News. 2003. V. 53. P. 254-262.

77. Hennes K.P., Suttle C.A., Chan A.M. Fluorescently Labeled Virus Probes Show that Natural Virus Populations Can Control the Structure of Marine Microbial Communities. I I Appl Environ Microbiol. 1995. V. 61. P. 3623-3627.

78. Goodridge L., Chen J., Griffiths M. Development and characterization of a fluorescent-bacteriophage assay for detection of Escherichia coli 0157:H7. // Appl Environ Microbiol. 1999. V. 65. P. 1397-1404.

79. Mosier-Boss P.A., Lieberman S.H., Andrews J.M., Rohwer F.L., Wegley L.E., Breitbart M. Use of fluorescently labeled phage in the detection and identification of bacterial species. II Appl Spectrosc. 2003. V. 57. P. 1138-1144.

80. Stewart G.S. In vivo bioluminescence: new potentials for microbiology. II Lett Appl Microbiol. 1990. V. 10. P. 1-8.

81. Duzhii D.E., Zavirgel'skii G.B. Bacteriophage lambda:lux: design and expression of bioluminescence in E. coli cells. II Mol Gen Mikrobiol Virusol. 1994. P. 36-38!

82. Kodikara C.P., Crew H.H., Stewart G.S. Near on-line detection of enteric bacteria usingilux recombinant bacteriophage. //FEMS Microbiol Lett. 1991. V. 67. P. 261-265.

83. Chen J., Griffiths M.W. Salmonella detection in egg using Lux+ bacteriophages. II J. Food Prot. 1996. V. 59. P. 908-914.

84. Loessner M.J., Rees G.E., Stewart G.S., Scherer S. Construction of luciferase reporter bacteriophage A511::luxAB for rapid and sensitive detection of viable Listeria cells. II Appl Environ Microbiol: 1996. V. 62. P. 1133-1140.

85. Loessner M.J., Rudolf M., Scherer S. Evaluation of luciferase reporter bacteriophage A511::luxAB for detection of Listeria monocytogenes in contaminated foods II Appl Environ Microbiol. 1997. V. 63. P. 2961-2965.

86. Sarkis G.J., Jacobs W.R., Jr., Hatfull G.F. L5 luciferase reporter mycobacteriophages: a sensitive tool for the detection and assay oj live mycobacteria. II Mol Microbiol. 1995. V. 15. P. 1055-1067.

87. Wolber P.K., Green R.L. Detection of bacteria by transduction of ice nucleation genes. II Trends Biotechnol. 1990. V. 8. P. 276-279.

88. Wolber P.K. Bacterial ice nucleation. II Adv Microb Physiol. 1993. V. 34. P. 203-237.

89. Irwin P., Gehring A., Tu S.I., Brewster J., Fanelli J., Ehrenfeld E. Minimum detectable level of Salmonellae using a binomial-based bacterial ice nucleation detection assay (BIND). IIJ AO AC Int. 2000. V. 83. P. 1087-1095.

90. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. II Science. 1994. V. 263. P. 802-805.

91. Funatsu T., Taniyama T., Tajima T., Tadakuma H., Namiki H. Rapid and sensitive detection method of a bacterium by using a GFP reporter phage. // Microbiol Immunol. 2002. V. 46. P. 365-369.

92. Roth A. Purification and protease susceptibility of the green fluorescent protein of Aequorea Victoria with a note on Halistra ura. // 1985. Rutgers University. New Brunswick, NJ.

93. Ward W.W., Cody C., Hart R.C., Cormier M.J. Spectrophotometric identity of the energy transfer chromophores in renilla and aequorea green-fluorescent proteins. II Photochemistry and photobiology. 1980. V. 31. P. 611-615.

94. Okabe M., Ikawa M., Kominami K., Nakanishi T., Nishimune Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. IIFEBS Lett. 1997. V. 407. P. 313-319.

95. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsien R.Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. II Trends Biochem Sci. 1995. V. 20. P. 448-455.

96. Prasher D.C. Using GFP to see the light. // Trends Genet. 1995. V. 11. P. 320-323.

97. Heim R., Prasher D.C., Tsien R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. II Proc Natl Acad Sci USA. 1994. V. 91. P. 12501-12504.

98. Stewart G.S., Smith T., Denyer S. Genetic engineering for biolumescent bacteria. // Food Science and Technology Today. 1989. V. 3. P. 19-22.

99. Burlage R.S., Yang Z.K., Mehlhorn T. A transposon for green fluorescent protein transcriptional fusions: application for bacterial transport experiments. 11 Gene. 1996. V. 173. P. 53-58.

100. Brovko L.Y., Griffiths M.W. Detection limits for bacteria with fluorescent and luminescent phenotypes using different instruments. II in the 10th International Symposium on Bioluinescent and Chemiluimencence. 1998. Bologna.

101. Oda M., Morita M., Unno H., Tanji Y. Rapid detection of Escherichia coli 0157:H7 by using green fluorescent protein-labeled PP01 bacteriophage. II Appl Environ Microbiol. 2004. V. 70. P. 527-534.

102. Tanji Y., Furukawa C., Na S.H., Hijikata T., Miyanaga K., Unno H. Escherichia coli detection by GFP-labeled lysozyme-inactivated T4 bacteriophage IIJ Biotechnol. 2004. V. 114. P. 11-20.

103. Srewart G.S.A.B., Jassim S.A.A., Denyer S.P; Newby P., Linley K, Dhir V.K. The specific and sensitive detection of pathogens within 4 h bactriophage amplification. II Journal of Applied Microbiology. 2002. V. 84.

104. Favrin S.J., Jassim S.A., Griffiths M.W. Development and optimization oj a novel immunomagnetic separation- bacteriophage assay for detection* of Salmonella enterica serovar enteritidis in broth. II Appl Enviion Microbiol. 2001. V. 67. P 217-224.

105. Stanley P.E. A review of bioluminescent ATP techniques in rapid microbiology. II J Biolumin Chemilumin. 1989. V. 4. P. 375-380.

106. Gregg C.T. ed. Bioluminescence in clinical microbiology. Physical Methods for Microorganisms Detection. // Ed. Nelson W.H. 1991. CRC Press Inc. London, pp. 3-4.

107. Schuch R., Nelson D., Fischetti V.A. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis. //Nature. 2002. V. 418. P. 884-889.

108. Chang T.C., Ding H.C., Chen S. A conductance method for the identification of Escherichia coli 0157:H7 using bacteriophage AR1. IIJ Food Prot. 2002. V. 65. P. 12-17.

109. Mcintyre L. Application and evaluation of bacterial viruses in rapid methodologies for the detection of food-borne pathogens. // 1998. University of Guelph. Guelph.

110. Mcintyre L., Griffiths M.W. A bacteriophage-based impedimetric method for the detection of pathogens in dairy products. II J. of Dairy Science. 1997. V. 80 (Suppl. 1). P. 107 (Abstract No. D142G).

111. Neufeld T., Schwartz-Mittelmann A., Biran D., Ron E.Z., Rishpon J. Combined phage typing and amperometric detection of released enzymatic activity for the specific identification and quantification of bacteria. II Anal Chem. 2003. V. 75. P. 580-585.

112. Balasubramanian S., Sorokulova I.B., Vodyanoy V.J., Simonian A.L. Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus—A surface plasmon resonance spectroscopic study. II Biosens Bioelectron. 2007. V. 22. P. 948-955.

113. Gervais L., Gel M., B. A., Tolba M., Brovko L.Y., Zourob M., Mandeville R., Griffiths M.W., Evoy S. Immobilization of biotinylated bacteriophage on biosensor surfaces. II Sensors and actuators B-Chemicals. 2007. V. 125. P. 615-621.

114. Nissim A., Hoogenboom H.R., Tomlinson I.M., Flynn G., Midgley C., Lane D., Winter G. Antibody fragments from a 'single pot' phage display library as immunochemical reagents. IIEMBO J. 1994. V. 13. P. 692-698.

115. Wilson D.S., Nock S. Functional protein microarrays. II Curr Opin Chem Biol. 2002. V. 6. P. 81-85.

116. Hoogenboom H.R., De Bruine A.P., Hufton S.E., Hoet R.M., Arends J.W., Roovers R.C. Antibody phage display technology and its applications. If Immunotechnology. 1998. V. 4. P. 1-20.

117. Heitzmann H., Richards F.M. Use of the avidin-biotin complex for specific staining of biological membranes in electron microscopy. II Proc Natl Acad Sci USA. 1974. V. 71. P. 3537-3541.

118. Bayer E.A., Wilchek M., Skutelsky E. Affinity cytochemistry: the localization of lectin and antibody receptors on erythrocytes via the avidin-biotin complex. II FEBS Lett. 1976. V. 68. P. 240-244.

119. Bayer E.A., Wilchek M. Biotin-binding proteins: overview and prospects. II Methods Enzymol. 1990. V. 184. P. 49-51.

120. Duffy S., Tsao K.L., Waugh D.S. Site-specific, enzymatic biotinylation of recombinant proteins in Spodoptera frugiperda cells using biotin acceptor peptides. II Anal Biochem. 1998. V. 262. P. 122-128.

121. Fall R.R. Analysis of microbial biotin proteins. II Methods Enzymol. 1979. V. 62. P. 390398.

122. Cronan J.E., Jr., Waldrop G.L. Midti-subunit acetyl-CoA carboxylases. II Prog Lipid Res. 2002. V.41.P. 407-435.

123. Choi-Rhee E., Cronan J.E. The Biotin Carboxylase-Biotin Carboxyl Carrier Protein Complex of Escherichia coli Acetyl-Co-A Carboxylase. II Journal of Biological Chemistry. 2003. V. 278. P. 30806-30812.

124. Cronan J.E. Biotination of proteins in vivo. A post-translational modification to label, purify, and study proteins. II Journal of Biological Chemistry. 1990. V. 265. P. 1032710333.

125. Li S., Cronan J.E. The gene encoding the biotin carboxlase subunit of Escherichia coli acetyl-CoA carboxylase. //Journal of Biological Chemistry. 1992. V. 267. P. 855-863

126. Tatsumi H., Fukda S., Kikuchi M., Koyama Y. Construction of biotinylated firefly luciferases using biotin acceptor peptides. I I Analytical Biochemistry. 1996. V. 243. P. 176-180.

127. Bayer E.A., Morag E., Lamed R. The cellulosome—a treasure-trove for biotechnology.^ I I Trends Biotechnol. 1994. V. 12. P. 379-386.

128. Ramirez C., Fung J., Miller R.C., Jr., Antony R., Warren J., Kilburn D.G. A bifunctional affinity linker to couple antibodies to cellulose. // Biotechnology (N Y). 1993. V. 11. P. 1570-1573.

129. Le K.D., Gilkes N.R., Kilburn D.G., Miller R.C., Jr., Saddler J.N., Warren R.A. A streptavidin-cellulose-binding domain fusion protein that binds biotinylated proteins to cellulose. II Enzyme Microb Technol. 1994. V. 16. P. 496-500.

130. Greenwood J.M., Gilkes N.R., Kilburn D.G., Miller R.C., Jr., Warren R.A. Fusion to an endoglucanase allows alkaline phosphatase to bind to cellulose. II FEBS Lett. 1989. V. 244. P. 127-131.

131. Gilkes N.R., Warren R.A., Miller R.C., Jr., Kilburn D.G. Precise excision of the cellulose binding domains from two Cellulomonas fimi cellulases by a homologous protease and the effect on catalysis. IIJ Biol Chem. 1988. V. 263. P. 10401-10407.

132. Gilkes N.R., Iienrissat B., Kilburn D.G., Miller R.C., Jr., Warren R.A. Domains in microbial beta-1, 4-glycanases: sequence conservation, function, and enzyme families. // Microbiol Rev. 1991. V. 55. P. 303-315.

133. Shoseyov O., Doi R.H. Essential 170-kDa subunit for degradation of crystalline cellulose by Clostridium cellulovorans cellulase. // Proc Natl Acad Sci USA. 1990. V. 87. P. 21922195.

134. Goldstein M.A., Takagi M., Hashida S., Shoseyov O., Doi R.H., Segel I.H. Characterization of the cellulose-binding domain of the Clostridium cellulovorans cellulose-binding protein A // J Bacteriol. 1993. V. 175. P. 5762-5768.

135. Doi R.H., Goldstein M, Hashida S., Park J.S., Takagi M. The Clostridium cellulovorans cellulosome. // Crit Rev Microbiol. 1994. V. 20. P. 87-93.

136. Shpigel E., Goldlust A., Efroni G., Avraham A., Eshel A., Dekel M., Shoseyov O. Immobilization of recombinant heparinase I fused to cellulose-binding domain. //< Biotechnol Bioeng. 1999. V. 65. P. 17-23.

137. Piervincenzi R.T., Reichert W.M., Hellinga H.W. Genetic engineering of a single-chain antibody fragment for surface immobilization in an optical biosensor. II Biosens Bioelectron. 1998. V. 13. P. 305-312.

138. Georgiou G., Baneyx F. Expression, purification, and immobilization of a protein A-beta-lactamase hybrid protein. II Ann N Y Acad Sci. 1990. V. 589. P. 139-147.

139. Ong E., Gilkes N.R., Miller R.C., Jr., Warren A.J., Kilburn D.G. Enzyme immobilization using a cellulose-binding domain: properties of a beta-glucosidase fusion protein. II Enzyme Microb Technol. 1991. V. 13. P. 59-65.

140. Richins R.D., Mulchandani A., Chen W. Expression, immobilization, and enzymatic characterization of cellulose-binding domain-organophosphorus hydrolase fusion enzymes. II Biotechnol Bioeng. 2000. V. 69. P. 591-596.

141. Katchalski-Katzir E. Immobilized enzymes—learning from past successes and failures. II Trends Biotechnol. 1993. V. 11. P. 471-478.

142. Wang A.A., Mulchandani A., Chen W. Whole-cell immobilization using cell surface-exposed cellulose-binding domain. II Biotechnol Prog. 2001. V. 17. P. 407-411.

143. Lehtio J., Wernerus H., Samuelson P., Teeri T.T., Stahl S. Directed immobilization of recombinant staphylococci on cotton fibers by functional display of a fungal cellulose-binding domain // FEMS Microbiol Lett. 2001. V. 195. P. 197-204.

144. Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. II Science. 1985. V. 228. P. 1315-1317.

145. Smith G.P., Petrenko V.A. Phage Display. // Chem Rev. 1997. V. 97. P. 391-410.

146. Sternberg N., Hoess R.H. Display ofpeptides and proteins on the surface of bacteriophage lambda. II ProcNatl Acad Sci USA. 1995. V. 92. P. 1609-1613.

147. Rodi D.J., Makowski L. Phage-display technology—finding a needle in a vast molecular haystack. II Curr Opin Biotechnol. 1999. V. 10. P. 87-93.

148. Danner S., Belasco J.G. T7 phage display: a novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries. // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V. 98. P. 12954-12959.

149. Zucconi A., Dente L., Santonico E., Castagnoli L., Cesareni G. Selection of ligands by panning of domain libraries displayed on phage lambda reveals new potential partners of synaptojanin 1. // J Mol Biol. 2001. V. 307. P. 1329-1339.

150. Ren Z.J., Lewis G.K., Wingfield ,P.T., Locke E.G., Steven A.C., Black L.W. Phage display of intact domains at high copy number: a system based on SOC, the small outer capsid protein of bacteriophage T4. II Protein Sci. 1996. V. 5. P. 1833-1843.

151. Ishii T., Yanagida M. Molecular organization of the shell of the Teven bacteriophage head. IIJ Mol Biol. 1975. V. 97. P. 655-660.

152. Rao V.B., Black L.W. DNA packaging of bacteriophage T4 proheads in vitro. Evidence that prohead expansion is not coupled to DNA packaging. II J Mol Biol. 1985. V. 185. P. 565-578.

153. Ren Z.J., Baumann R.G., Black L.W. Cloning of linear DNAs in vivo by over expressed T4 DNA ligase: construction of a T4 phage hoc gene display vector. II Gene. 1997. V. 195. P. 303-311.

154. Jiang J., Abu-Shilbayeh L., Rao V.B. Display of a PorA peptide from Neisseria meningitidis on the bacteriophage T4 capsid surface. I I Infect Immun. 1997. V. 65. P. 4770-4777.

155. Lazcka O., Del Campo F.J., Munoz F.X. Pathogen detection: a perspective of traditional methods and biosensors. // Biosens Bioelectron. 2007. V. 22. P. 1205-1217.

156. Pancrazio J.J., Whelan J.P., Borkholder D.A., Ma W., Stenger D.A. Development and application of cell-based biosensors. II Ann Biomed Eng. 1999. V. 27. P. 697-711.

157. PauF J.H., Rose J.B., Jiang S.C., London P., Xhou X., Kellogg C. Coliphage and indigenous phage in Mamala Bay, Oahu, Hawaii. II Appl Environ Microbiol. 1997. V. 63. P. 133-138.

158. Goodridge L., Griffiths M.W. Reporter bacteriophage assay as a mean to detectfoodborne pathogenic bacteria // Food Res. Int. 2002. V. 35. P. 863-870.

159. Dubow M.S. ed. Bacterial» identification and use of bacteriophages. Encyclopedia of virology. // Ed. Webster R.G., Granoff A. 1994. Academic Press. San Diego, Galif. P. 7881.

160. Takhistov P. ed. Cell-Based Biosensors. Handbook of foodscience, technology, and engineering. // Ed. Hui Y.H. Vol. 3. 2006. CRC Press. Boca Raton, Fl. 712 P.

161. Dad'o S. Tissue Morphology and Cell Impedance Based Biosensors for Toxicity Testing. II MEASUREMENT SCIENCE REVIEW. 2009. V. 9. P. 105-108.

162. Elwing H., Karlsson J.O., Grundstrom N., Gustafsson A.L., Von Schenck H., Sundgren H., Odman S., Andersson R.G., Lundstrom I. Fish scales as biosensors for catecholamines. II Biosens Bioelectron. 1990. V. 5. P. 449-459.

163. Rider T.H., Petrovick M.S., Nargi F.E., Harper J.D., Schwoebel E.D., Mathews R.H., Blanchard D.J., Bortolin L.T., Young A.M., Chen J., Hollis M.A. A B cell-based sensor for rapid identification of pathogens. II Science. 2003. V. 301. P. 213-215.

164. Meighen E.A., Szittner R.B. Multiple repetitive elements and organization of the lux operons of luminescent terrestrial bacteria. IIJ Bacteriol. 1992. V. 174. P. 5371 -53 81.

165. Tolba M., Minikh О., Brovko L.Y., Evoy S., Griffiths M.W. Oriented immobilization of bacteriophages for biosensor applications. H Appl Environ Microbiol. 2010. V. 76. P. 528535.

166. Sambrook J., Russell D.W. Eds. Molecular Cloning: a laboratory manual. Third ed. V. 1. 2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 5.4-5.13.

167. Harris D.C. ed. Quality Assurance and Calibration. Quantitative Chemical Analysis. // Ed. Harris D.C. 2007. W. H. Freeman and Company. New York. P. 78-92.

168. Pheiffer C., Carroll N.M., Beyers N., Donald P., Duncan K., Uys P., Van Helden P. Time to detection of Mycobacterium tuberculosis in BACTEC systems as a viable alternative to colony counting. H Int J Tuberc Lung Dis. 2008. V. 12. P. 792-798.

169. Botstein D., Maurer R. Genetic approaches to the analysis of microbial development. II AnnuRev Genet. 1982. V. 16. P/61-83.

170. Cademartiri R., Anany H., Gross I., Bhayani R., Griffiths M., Brook M.A. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. II Biomaterials. 2010. V. 31. P. 1904-1910.

171. Kaper J.B. EPEC delivers the goods. // Trends Microbiol. 1998. V. 6. P. 169-172; discussion 172-163 P.

172. Li Z., Elliott E., Payne J., Isaacs J., Gunning P., O'loughlin E V. Shiga toxin-producing Escherichia coli can impair T84 cell structure and function without inducing attaching/effacing lesions. //Infect Immun. 1999. V. 67. P. 5938-5945.

173. Всемирная организация здравоохранения. Информационный бюллетень № 125. Энтерогеморрагическая Escherichia coli (ЕНЕС). 2005. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs 125/ru

174. Frankel G., Phillips A.D., Rosenshine I., Dougan G., Kaper J.B., Knutton S. Enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli: more subversive elements. II Mol Microbiol. 1998. V. 30. P. 911-921.