Биолюминесцентные сенсоры на ионы ртути тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

. v о

1 1 ^

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НА9К

ОРДЕНА ТРИДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТЭТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. ММ. ШЕМЯКИНА

на правах рукописи

СЕЛИФОНОВА Ольга Вячеславовна БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ СЕНСОРЫ НА ИОНЫ РТНТИ

02 00. 10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в исследовательской лаборатории Агенства по Охране Окружающей Среды США (GBERL, Gulf Breeze, Florida}

Научный консультант: Официальные оппоненты:

Т. Баркай, рь. о., евши,

доктор химических наук, профессор Ю. Б. Алахов доктор биологических наук, профессор А. М. Егоров

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН

Защита диссертации состоится 19 апреля 1995г. в С_час. на заседании специализированного ученого совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. ММ. Шемякина РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. ММ. Шемякина РАН

Автореферат разослан "_____" марта

Зченый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

1995г.

В.А. Несмеянов

Актуальность проблемы Ртуть и ее соединения были известны с древности. В современных технологиях этот элемент имеет важное значение и используется в промышленности при производстве фармацевтических препаратов, красок, бумаги, в сельском хозяйстве, при зубном протезировании, а также в военных целях. В значительных количествах соединения ртути выливались в водные системы как в результате случайных аварий, так и намеренно, в качестве антибактериальных и антигрибных агентов, или как индустриальные стоки. Осознание опасности пришло когда отравление соединениями ртути было причиной смерти 41 индивидуума в японском городе Минамата в ранние 1950-е и в городе Ниигата в ранние 1960-е. Болезнь Минамата развивалась вследствие употребления рыбы из залива и реки, загрязненных стоками химического завода, использовавшего ртуть в некоторых своих процессах. Во многих странах мира повышенные концентрации ртути в водных источниках привлекают все большее внимание общественности. В водных системах постоянно происходит конверсия менее токсичной ионной ртути в значительно более токсичную метилртуть. Процесс метилирования может осуществляться микроорганизмами В дальнейшем метилртуть накапливается в биомассе различных водных организмов Рыбы, как представители верхних уровней биологических пищевых цепей, могут накапливать метилртуть до концентраций опасных для человеческого потребления. Поскольку, процесс метилирования зависит от доступности ионной ртути для метилирующих микроорганизмов, то актуальной является оценка концентраций биологически доступной Нд2* в окружающей среде.

Традиционно для анализа химических соединений, в том числе и тяжелых металлов, загрязняющих окружающую среду, применяются чувствительные и специфичные методы аналитической химии. Однако, такие методы очень трудоемки, требуют дорогостоящего оборудования и в то же время не позволяют определить находятся ли загрязнители в инертной или биологически доступной форме.

Биосенсоры на основе интактных бактериальных клеток могут успешно дополнить данные химических анализов, поставляя информацию о доступности загрязняющих веществ для живых организмов. Эффективные биосенсоры для определения биологически доступных металлов (как, впрочем, и других загрязнителей) должны содержать чувствительные рецепторный и репортерный компоненты. Продукты регуляторных генов, ответственные за индукцию специализированных

микробных систем, могут рассматриваться как чувствительные рецепторы, специфично отвечающие на индуктор при физиологически значимых концентрациях. В настоящей работе для конструирования биосенсоров на ионы ртути в качестве рецепторного компонента был использован тег оперон транспозона Тп21. определяющий устойчивость микроорганизмов к Hg2*, и состоящий из шести функциональных генов merRTPCAD. Существенной чертой этого оперона является наличие гена, кодирующего регуляторный белок (MerR), который служит как внутриклеточный рецептор для ионов ртути. Ранее было показано, что тег оперон может быть индуцирован при концентрациях 10"«-Ю-9 M Н^*. В процессе конструирования биосенсоров важно было придерживаться стратегии, позволяющей избежать снижения чувствительности ответа, опреде-ляемого природой репортерного компонента и физиологическими условиями. Одной из удобных и высокочувствительных репортерных систем являются биолюминесцентные гены (lux), которые были клонированы из ряда люминесцентных бактерий и изучены в деталях. Для практического удобства использования биосенсоров важно выбрать люминесцентную систему, не требующую разрушения клеток, и позволяющую анализировать желаемые образцы неоднократно в течение определенного времени, lux Оперон (luxCDABE) из Vibrio fischen, лишенный промотора, вполне удовлетворяет этим требованиям.

При конструировании биосенсоров на ионы ртути, помимо определения какие генетические элементы должны обязательно присутствовать, необходимо было понять влияние транспортных белков MerT, MerP, MeiC и редуктазы ионов ртути (МегА) на работу биосенсора. Цель работы Настоящая работа преследовала две основные цели:

1). Конструирование чувствительных биосенсоров на ионы ртути для последующего анализа ртутных загрязнений в окружающей среде..

2). Использование биосенсоров в качестве модели для изучения механизмов транспорта и индукции тег оперона для более полного понимания его функционирования.

Научная новизна и практическая ценность работы Сконструированы три mer-lux гибридные плазмиды, отличающиеся друг от друга частями ртутного оперона клонированными впереди люциферазных генов лишенных промотора. Получена высокоспецифичная индукция биолюминесценции под контролем промотора тег оперона в интактных бактериальных клетках содержащих гибридные плазмиды.

Поведение биосенсоров было изучено в различных лабораторных условиях, включая анализы в стандартных ростовых средах, а также в водных образцах из загрязненных и незагрязненных ртутью источников. Установлена количественная корреляция между биолюминесценцией и конценрацией ртути, а также факторы влияющие на ртуть-зависимую эмиссию света бактериальными клетками содержащими тег-lux плазмиды.

Показано, что рецепторная часть, представленная только регуля-торным геном MerR и промоторной областью, является достаточной для эффективной работы биосенсора. Присутствие специфичных для ионов ртути транспортных белков в составе биосенсора очень незначительно увеличивало его чувствительность.

Проведенное исследование показало, что ионы ртути могут проходить через клеточную мембрану благодаря сотранспорту с Na» и эффективно индуцировать тег оперон в отсутствие транспортных белков МегТ, МегР и Мв(С.

Публикации По теме работы опубликовано 2 статьи в международных журналах. Результаты работы докладывались на ежегодных встречах Американского Общества Микробиологии (Атланта, США, 1993; Лас Вегас, США, 1994), симпозиуме " Bioluminescence: from fundamentals to glowing applications" (Лас Вегас, США, 1994) и семинарах Агенства по Охране Окружающей Среды США

Объем работы Диссертация содержит 147 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (152 назв.) В обзоре литературы рассмотрены работы, посвященные биогеохимическому циклу ртути, структурным и функциональным исследованиям тег и lux оперонов, а также механизмам натриевого котранспорта. Демонстрируются возможности применения биосенсоров не только для анализа ртутных загрязнений, но и для исследования с их помощью фундаментальных механизмов индукции тег оперона и транспорта ионов ртути в клетки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Конструирование и тестирование биолюминесцентных сенсоров на ионы ртути

тег Оперон транспозона Тп21 специфично индуцируется ионами неорганической ртути и состоит из шести функциональных генов merRTPCAD. Активация транскрипции этого оперона возможна только в

присутствии ионов ртути внутри клетки. Продукты генов merR и merD имеют регуляторную функцию. MerR белок связывается с оператор-промоторной областью и регулирует экспрессию структурных генов и позитивно, и негативно. MerR также негативно регулирует собственную экспрессию. MerD играет минорную регуляторную роль, так что делеция этого гена не приводит к заметной потере устойчивости к ионам ртути в микроорганизмах, содержащих тег плазмиды. Продукты тегТР, и возможно merC, осуществляют активный транспорт ионов ртути внутрь клеток. твгА Ген кодирует редуктазу ртути, фермент, ответственный за восстановление Нд2* до значительно менее токсичной летучей элементной Нд°. Делеции или мутации в гене тегА при наличии интактных транспортных генов приводят к увеличению чувствительности к ионам ртути.

Теоретически для конструирования биосенсора необходимо было иметь только рецепторную часть тег оперона, представленную регуляторным геном merR с орератор-промоторной областью. Однако, было важно, исходя из знания строения тег оперона, ответить на вопрос как другие части оперона могут повлиять на работу биосенсора. В результате три репортерные плазмиды pRB28, pOS14 и pOS15 были сконструированы для анализа эффектов МегТРС-опосредованного транспорта ртути и процесса удаления ионов ртути из клеток с помощью редуктазы ртути на чувствительность биосенсоров.

1.1. Конструирование оепортерных плазмид pRB?a dOS14 и oOS15

Для получения биоренсоров на ионы ртути был использован плазмидный вектор широкого спектра pUCD6l5, содержащий пять генов люциферазного оперона luxCDABE, лишенных промотора, из морской бактерии Vi>riolischeri. Вектор обладает устойчивостью к ампициллину и канамицину и имеет укороченый полилинкер плазмиды р1)С19. Гены luxAB кодируют аир субъединицы люциферазы, a luxCDE являются генами для редуктазы, трансферазы и синтетазы соответственно, ферментов необходимых для восстановления жирных кислот до альдегида - субстрата для люциферазы.

На рис.1 схематически отражено конструирование биосенсоров pRB28, pOS14 и pOS15.

pOS15

BamHI

Рис.1 Схема конструирования биосенсоров на ионы ртути. EcoRI-SamHI фрагмент тег оперона кодирующий merRT был клонирован в вектор p(JCD6l5. В дальнейшем этот EcoRI-Sa/nHI фрагмент плазмиды pRB28 был заменен на EcoRI-BamHI фрагменты кодирующие merRTPC или merRTPCAD для получения плаэмид pOSH и pOSi5, соответственно.

Плаэмида pRB28 была получена клонированием короткого фрагмента mer оперона, содержащего регуляторный ген merR, оператор-промоторную область и небольшую последовательность ДНК, кодирующую только 29 аминокислот транспортного гена твгТ в вектор PUCD615. Таким образом, эта плазмида не содержала спосбных к функционированию генов транспорта ионов ртути, и индукция света в клетках содержащих pRB28 могла быть осуществлена только за счет ионов, проникших внутрь неспецифически. Плазмида pOSH, в дополнение к регуляторной части mer оперона, содержала три гена ответственных за транспортную функцию, в то время как плазмида pOSi5 была получена клонированием целого mer оперона в вектор pUCD615. Все три фрагмента mer оперона (merRo/pT, merRo/pTPC и merRa/pTPCAD) были клонированы в вектор по одним и тем же рестриктным сайтам EcoRl и BamHI. Клетки Е. coli HMS174 были трансформированы полученными репортерными плаэмидами и использованы в анализах ртуть-зависимой эмиссии света.

1.2. Тестирование биосенсоров в LB и минимальной среде.

Клетки, содержащие плазмиды pRB28, pOSi4 и posis, выращивали в LB или минимальной среде (МС) до оптической плотности A^-Oi, отмывали, ресуспендировали в том же объеме свежей среды и использовали немедленно. Клетки индуцировали различными концентрациями HgCI2 от 01 нМ до 50 мкМ. Анализ эмиссии света осуществляли с помощью сцинтилляционного счетчика. Суммарные результаты анализов в LB и МС представлены на рис. 2

Минимальная концентрация ионов ртути, вызывающая биолюминесцентный ответ в богатой LB среде, в клетках содержащих pRB28 составляла 5 нМ. При высоких концентрациях Нд2>, 500 нМ и 1 мкМ, эмиссия света достигала своего максимума в течение 30-40 минут с момента индукции, а затем падала до уровня неиндуцированного контроля вследствие токсичности. Известно, что ионы ртути способны связываться с тиольными группами белков и пептидов, что может объяснять улучшение чувствительности биосенсора в МС до 1 нМ, благодаря уменьшению связывания ионов ртути компонентами среды. Линейный ответ в МС наблюдался в диапазоне концентраций H g2* от 1 нМ до 50 нМ.

Клетки содержащие pOSi4 оказались наиболее чувствительными и продуцировали свет при 05 нМ H g2* и в LB, и в минимальной среде. Однако, линейный ответ в минимальной среде наблюдался в более узком диапазоне концентраций H g2* от 0.5 нМ до 10 нМ.

Присутствие гена редуктазы ионов ртути в плазмиде pOSl5 определяло проявление устойчивости к Нд^в клетках, содержащих эту mer-lux конструкцию. Редуктазная активность приводила к удалению восстановленной ртути из клеток, поэтому при низких концентрациях Нд2* биолюминесцентный ответ отсутствовал. В LB среде эмиссия света наблюдалась только при концентрациях Нд2* от 500 нМ до 20 мкМ. В то же время в минимальной среде чувствительность поднималась до 25 нМ и линейный ответ был между 10 и 50 нМ Hg2r

О .1

1 10 100 1000 10000 100000

109 108 107" 106" 105104" 103

10 100 1000 10000 100000

О .1 1 10 100 1000 10000 100000 КОНЦЕНТРАЦИЯ Hg2+ (нМ)

Рис 2 Зависимость эмиссии света от концентрации ионов ртути добавленных к Е. соН HMS174 содержащих тег-lux плазмиды pRB28 (А), POS14 (В) или pOSl5 (С) в LB (•,■) и минимальной среде (о, о) через 40 минут (•, о) и 100 минут (■, □) после индукции.

1.3. Тестирование биосенсоров в вопах из природных источников

Индукцию биосенсоров изучали с использованием водных образцов отобранных из пресноводного источника и морского залива, а также образцов дождевой воды, дополненных питательными компонентами минимальной среды и известными концентрациями ртути. Целью этих экспериментов было определение влияния состава воды из разных источников на работу биосенсоров.

В дождевой воде и воде, взятой из пресноводного источника, люминесцентный ответ был подобен ответу в минимальной среде (рис. ЗА). Однако, мы обнаружили неожиданное увеличение чувствительности биосенсоров к ионам ртути в морской воде, разбавленной дистиллированной водой в три раза, во избежание осмотического стресса. Величина эмиссии света была выше при низких концентрациях ртути, и эффект токсичности наблюдался уже при 100 нМ (рис. ЗВ). Для выяснения причин измененной чувствительности в разбавленной морской воде проводилось исследование влияния основных ионов морской воды, таких как натрий и калий на работу биосенсоров.

Рис.3 Эмиссия света клетками НМ3174(рВВ28) в (А) пресной (•, м) и дождевой воде (о, и), и в (В) 1:3 разбавленной морской воде (о, й) представленные данные соответствуют эмиссии света через 40 минут (•, о) и 100 минут (■, о) после индукции с

1.4. Определение ртутных загрязнений в сточных водах.

Два биосенсора, рЯВ28 и рОв14, были использованы для определения концентраций биологически доступных ионов ртути в сточных водах, собранных из искусственного пруда в штате Теннесси,

(Oak Ridge). США Этот пруд был построен поблизости завода, использовавшего ртуть в процессах обогащения "5U в 50-е и 60-е годы. До настоящего времени стены и дренажная система этого завода содержат высокие концентрации ртути, которые постоянно вымываются сточной водой. Сточная вода поступает в пруд для задержания прямого вытекания стоков в близлежащую реку. Пруд имеет систему входа и выхода для воды. Как определено с помощью атомной флуоресцентной спектроскопии, общая концентрация ртути в месте втекания стоков составляла 20.3i0.15 нМ, а в месте вытекания - 7.35±0.15 нМ. С помощью биосенсоров, созданных в результате настоящей работы, установлено, что концентрация биологически доступной ртути близка к 20 нМ в месте втекания стоков и к 1-2 нМ в месте вытекания. Таким образом, в процессе циркуляции воды в пруду происходит уменьшение концентрации биологически доступной ртути вследствие связывания с суспендированными и седиментными материалами, а также в результате восстановления и испарения. Эти данные подтвердили ранее проведенные исследования о динамике концентраций Нд2* в пруду.

Как показывает анализ, концентрация ртути в чистых водоемах находится в пикомолярном диапазоне, и в этом случае биосенсоры не могут быть применены. Однако, биосенсоры позволяют проводить простой полуколичественный биоанализ по определению ртути в загрязненных источниках и индустриальных стоках. Они позволяют детектировать биологически доступную ртуть, которая вследствие метилирования и накопления в живых организмах, включая промысловые виды рыб, может представлять опасность для здоровья людей.

2 Исследование механизмов транспорта ионов ртути с помощью

биосенсоров.

Сравнение поведения трех описанных выше биосенсоров выявило, что плазмида pRB28, несодержащая специфичных для ионов ртути транспортных генов, только незначительно уступала по чувствительности pOSi4, кодирующей полную транспортную функцию. При этом pRB28 давала наивысшую величину ответа в минимальной среде и, несмотря на отсутствие транспортных генов, не имела

задержки в инициации индукции. Целью дальнейших экспериментов было выяснение механизмов проникновения ионов ртути в бактериальную клетку в отсутствие транспортных белков. Анализы, проведенные с клетками содержащими рЯВ28, показали, что биолюминесцентный ответ на индукцию высокими концентрациями Нд2* был ингибирован в Ш среде и трехкратно разбавленной морской воде, но не в минимальной среде. Основным солевым компонентом 1.В и морской воды является ИаС1 Известно, что N8* играет важную роль в клеточных процессах. Концентрация ионов натрия меньше в цитоплазме, чем в окружающей клетку среде. Таким образом, постоянно выбрасывается из клеток с потреблением энергии и устремляется обратно внутрь клеток благодаря собственному концентрационному градиенту. При этом одной из основных функций ионов натрия является котранспорт различных неорганических и органических веществ, таких как фосфаты, органические кислоты, аминокислоты и сахара через клеточную мембрану внутрь клеток. Однако, данные в литературе о натрий-зависимом транспорте тяжелых металлов отсутствуют.

Поскольку индукция тег оперона является зависимой от поступления ионов ртути в клетку, мы использовали биосенсоры для изучения факторов, влияющих на транспорт этих ионов.

7.1. Влияние ионов натрия на инпукниш биолюминесценции в

клрткяу р г.п11

Исследование эффекта Ыа' проводили при концентрациях Ндг* 50 нМ и 1 мкМ. В клетках, содержащих рНВ28, величина ответа была максимальна и сходна при этих концентрациях ионов ртути. При 5 мкМ Нд2* эмиссия света ингибировалась вследствие токсичности. Присутствие 10, 100, 140 мМ №С1 ускоряло развитие эмиссии света в клеточной суспензии, индуцированной с 50 нМ Нд2* и величина ответа была выше в течении первых 40-50 минут с момента индукции, в сравнении с суспензией без Иа* (рис 4А) Сходные результаты были получены с использованием Ыа2304 вместо N801

- и -

Эмиссия света, индуцированная 1 мкМ Ндг* была ингибирована в присутствии Ыа* (рис. 4В). По-видимому, это ингибирование было вызвано благодаря увеличенному поступлению ионов ртути в клетки, достигающему токсичных внутриклеточных концентраций. Полученные данные предполагают, что ионы натрия могут способствовать ускоренному захвату ионов ртути клетками. Для подтверждения этой гипотезы были проведены эксперименты по захвату радиоактивной 203НдС1г.

Рис. 4 Развитие эмиссии света клетками НМ3174(рРВ28) индуцированными 50 пМ Н§2+ (А) и 1 цМ Н§2+(В) в присутствии и отсутствии ЫаС1. А: □ - без N8+, А - Ю шМ • - 100 шМ ■ - 140 шМ О- неиндуци-рованный контроль. В: То же самое как в А за исключением того, что • - 50 шМ

2.2. Исследование захвата радиоактивных ионов ртути.

В этих экспериментах были использованы клетки, несущие рйВ28, плаэмиду не имеющую генов для специфического транспорта ионов ртути. Клеточные суспензии содержали 500 нМ 20ЭНдС1г в присутствии или отсутствии 140 мМ МаС1. Результаты анализов показали, что концентрация ионов ртути захваченная клетками была в три раза выше при наличии в системе (рис. 5). Таким образом, эти данные подтверждают предыдущие наблюдения, что ионы натрия стимулируют транспорт ионов ртути внутрь бактериальных клеток.

ш

минэты

Рис. 5. Захват 2031^С12 клетками НМ5174(рРВ28): о-в минимальной среде содержащей 500 пМ в отсутствие ■ - в минимальной среде содержащей 500 пМ1^2+ и 140т\Ша+.

2.3. аффект ионов ртути и натрия на амигсию света отмытымы клетками содержашиими оЯВ?8

Эксперименты с отмытыми клетками проводили для анализа эффекта ионов натрия в системе, лишенной питательных веществ с лимитированными энергетическими ресурсами. Клетки, достигшие плотности А660-0.1, индуцировали 50 нМ Нд2» в присутствие или отсутствие 140 мМ в течение 30 минут при ростовых условиях в минимальной среде. После этого их отмывали в калий-фосфатном буфере и ресуспендировали в свежей порции буфера. Часть клеток после отмывки анализировали в буфере без добавок, а другую часть повторно индуцировали 50 нМ Нд2» в присутствии или отсутствии ионов натрия (рис. 6). В буфере без добавок начально измеренная эмиссия света была в восемь раз выше в клетках, индуцированных в присутствии ионов натрия, затем биолюминесценция падала с течением времени. Более замедленное падение светового ответа было в клетках, повторно индуцированных 50 нМ Нд2*. Однако, при повторной индукции Нд2* в присутствие падение эмиссии света за время анализа не наблюдалось. По-видимому, градиент ионов натрия в клетку является источником энергии для поддержания эмиссии света.

миныты

Рис. 6. Эффекты и на эмиссию света отмытыми клетками, содержащими рР1В28. Анализы биолюминесценции проделаны с клетками НМ5174(рНВ28) индуцированными с 50 пМ Ь^2* в течение 30 минут в отсутствии Ыаа в ростовой среде, отмытыми и затем повторно индуцированными в калий-фосфатном буфере с той же концентрацией Ь^2* с добавлением или без него : Л- 50 пМ ■- 50 пМ Н$2+ ап(1 140 тМ Ыа+, без добавления Hg2+ и о- клетки были индуцированы в течение 30 минут в ростовой среде с 50 пМ Ь^2* в присутствии 140 шМ N3*.

2.4. Влияние ионов калия на индукцию биолюминесценции.

Известно, что концентрация ионов калия выше внутри клеток, чем в среде. Этот ион играет важную роль в поддержании осмотического баланса и клеточного тургорного давления. Как ранее было показано (Сакпеу ее а1„ 1984), добавление К* к клеткам, нагруженным N8«, стимулирует захват веществ, ассоциированных с натрий-зависимыми транспортными системами, но не с протон-зависимыми. Исходя из этого, проверялся эффект ионов калия на индукцию биолюминесценции в клетках, содержащих рНВ28 и рОБ14. Клетки выращивали в минимальной среде, в которой калий-фосфатный буфер был заменен на натрий-фосфатный. Анализ биолюминесценции проводился после индукции с 50 нМ Нд2» в присутствии или отсутствии 10 мМ КС1 В присутствии ионов калия эмиссия света увеличивалась практически десятикратно в клетках, несущих обе плазмиды. Таким

образом, добавление ионов калия к клеткам, испытывающим недостаток в этом компоненте, приводило к восстановлению физиологического натрий-калиевого обмена и натриевого градиента, что выражалось в стимулировании индукции света. Стимуляция биолюминесценции в этих экспериментах говорит в пользу того, что транспорт ионов ртути может быть натрий-зависимым.

Существующая модель для транспорта Нд2» предполагает, что ион ртути передается тег транспортными белками в клетку как по цепи, связываясь с парами цистеиновых аминокислотных остатков этих белков. Первоначально Нд2* взаимодействует с периплазматическим белком МегР и переносится к находящемуся в мембране МегТ. От пары цистеинов, находящихся на цитоплазматической части МегТ, ион ртути может быть передан редуктазе ртути. Однако, в этой модели не представлен механизм захвата ионов ртути, существующий в клетках, лишенных этих транспортных белков. В настоящей работе показано, что индукция тег оперона может быть не менее эффективной в системе без транспортных белков и предложено, что котранспорт ионов натрия и ртути может быть одним из механизмов транспорта Нд2» в бактериальные клетки.

R Ы В О П Ы

1. Сконструированы три mer-lux репортерные плазмиды поволяющие получать высокоспецифичную ртуть-зависимую эмиссию света под контролем тег промотора в бактериальных клетках.

2. Установлена корреляция между биолюминесценцией и концентрацией ртути, а также факторы влияющие на ртуть-зависимую эмиссию света бактериальными клетками содержащими mer-lux плазмиды. Продемонстрировано, что полученные биосенсоры позволяют определять концентрации биологически доступной Нд2* в загрязненных водах в диапазоне от 0.5 нМ до 1 мкМ (0.1-200 мкг/л).

3 Показано, что люцифераза как репортер может быть использована не только для изучения генной экспрессии, детектирования загрязнителей окружающей среды и различных стрессовых факторов, но и для изучения механизмов транспорта веществ в индуцибельных системах.

4. Эстановлено, что эффективная индукция тег оперона не требует присутствия специфических транспортных белков МегР, МегТ и МегС. Захват Ндг* стимулируется присутствием Na», указывая что котранспорт ионов натрия и ртути является одним из механизмов транспорта Нд2* внутрь бактериальных клеток.

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Selifonova, О., R. Burlage, Т. Barkay. 1993. mer-lux based biosensors for detection of Hg(II) in contaminated water. Abstr. Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol. Q94, p. 363.

2. Selifonova, O., R. Burlage, T. Barkay. 1993. Bioluminescent sensors for detection of bioavailable Hg(II) in the environment. Appl. Environ. Microbiol, v.59, No. 9, p. 3083-3090.

3. Selifonova, O.V., and T. Barkay. 1994. The effect of sodium on mercury uptake by Escherichia coli. Abstr. Ann. Meet. Am. Soc. Micribiol. Q108, p. 406.

4. Selifonova, O.V., and T. Barkay. 1994. Role of Na+ in transport of Hg2+ and induction of the Tn21 mer-operon. Appl. Environ. Microbiol, v. 60, No. 10, p. 3503-3507.

27. 02 95 Г. Тир. 100 ЭКЗ. Нч-изд. Л. 1,0

Отпечатано :

Macintosh Hei/LaserWriter Ilf (Microsoft Word 5.0 Desktop publishing)