Биомиметические модели нитрогеназы с участием природного и синтетических гетерополиядерных комплексов железа и молибдена тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

005019279

На правах рукописи

БАЖЕНОВА Тамара Александровна

БИОМИМЕТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ НИТРОГЕНАЗЫ С УЧАСТИЕМ ПРИРОДНОГО И СИНТЕТИЧЕСКИХ ГЕТЕРОПОЛИЯДЕРНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА И МОЛИБДЕНА

02.00.15 - кинетика и катализ, химические науки

2 6 ДПР /.012

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Черноголовка - 2012

005019279

Работа выполнена в Институте проблем химической физики Российской Академии наук

Научный консультант: доктор химических наук, академик

Шилов Александр Евгеньевич

Официальные оппоненты:

Шур Владимир Борисович

доктор химических наук, профессор; Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук, г. Москва; заведующий лабораторией металлокомплексной активации малых молекул

Нефедов Сергей Евгеньевич

доктор химических наук, профессор; Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова Российской академии наук, г. Москва; заведующий сектором химии синтетических аналогов природных

металлоферментов

Сырцова Лидия Александровна

доктор химических наук, старший научный сотрудник;

Институт проблем химической физики Российской академии наук, г. Черноголовка; ведущий научный сотрудник лаборатории химической физики ферментов

Ведущая организация:

Институт физиологически активных веществ Российской академии наук

Защита состоится мая 2012 г. в 10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.082.02 при Институте проблем химической физики РАН по адресу: 142432, Московская область, г. Черноголовка, просп. академика H.H. Семенова, д. 1, Корпус общего назначения ИПХФ РАН (КОН).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института проблем химической физики РАН

Автореферат разослан " " апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук

Т. С. Джабиев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фермент нитрогеназа, входящий в состав азотфиксирующих бактерий, катализирует в природе восстановление N2 до №13, который, в отличие от атмосферного азота, может использоваться живыми организмами для синтеза белков, нуклеиновых кислот и других важных биомолекул. Не будет преувеличением сказать, что жизнь на Земле зависит от биологической фиксации азота - процесса восстановления атмосферного азота до аммиака.

Несмотря на большие успехи в исследовании нитрогеназы, достигнутые в последние годы, механизм функционирования фермента на молекулярном уровне остается неясным.

Второй главный источник связанного азота на Земле, индустриальный процесс синтеза аммиака по методу Габера-Боша, является очень энергозатратным, поэтому химики не оставляют попыток создания альтернативы с использованием гомогенного катализа. Для этого необходимо понимание того, каким образом природа в мягких условиях активирует самую прочную межатомную связь, тройную связь молекулы азота.

Нитрогеназа очень сложный фермент, многосубъединичный и многосубстратный. Чтобы разобраться в различных аспектах механизма, необходимо использовать разного типа биомиметические модели, некие упрощения, которые позволяют адекватно исследовать какие-то стороны функционирования фермента.

В активный центр фермента входит железо-молибденовый кофактор (РеМосо). Это восьмиядерный кластер состава [(С)МоРе789 гомоцитрат], на котором, как сейчас доказано, осуществляется координация и восстановление различных субстратов -малых молекул с кратными связями, главной из которых является молекула N2. Молекулярный механизм процессов на РеМосо не известен. Изучение фермента в целом дает мало информации о реакциях превращения субстрата в активном центре, так как эти реакции не являются скорость определяющими и не проявляются в ферментативной кинетике.

Общая особенность и биологического и промышленного путей синтеза аммиака - использование соединений железа в качестве активных центров -катализаторов реакции. В связи с этим развитие координационной химии диазотных комплексов железа, особенно полиядерных, и исследование восстановления азота в гомогенных апротонных азотфиксирующих системах на основе соединений железа является актуальным направлением исследований, позволяющим описать химизм постадийного превращения N2 в природном полиядерном железо-содержащем центре.

Исследование другого типа моделей, протонных азотфиксирующих систем с полиядерными активными центрами, позволяет понять общие принципиальные закономерности кластерного катализа восстановления азота, каким, по сути, является и природный процесс.

Мы решили ввести в круг изучаемых катализаторов и сам железо-молибденовый кофактор нитрогеназы, экстрагированный из фермента. Задача введения выделенного из белка РеМосо в реакции с субстратами нитрогеназы „и

изучения его как катализатора этих реакций к началу наших исследований решена не была. Исследование поведения FeMoco вне белковой матрицы позволяет преодолеть кинетические ограничения, существующие в белковой нитрогеназной системе, которые препятствуют расшифровке детального механизма превращения субстратов в активном центре фермента. Такой подход позволяет также прояснить роль белкового окружения активного центра нитрогеназы в осуществлении ферментом его функции. А сравнение каталитических характеристик природного и моделирующих его действие синтетических комплексов, действующих в протонных азотфиксирующих системах в одинаковых небелковых условиях, позволяет понять, насколько они адекватны как модели.

Цель работы - получение новых знаний о механизме действия фермента нитрогеназы посредством разработки и изучения новых типов небелковых биомиметических систем, моделирующих различные стороны действия фермента, а также применения новых экспериментальных подходов к изучению нитрогеназной белковой системы in vitro.

Работа включала следующие задачи:

1. Изучение механизма восстановления молекулярного азота системами на основе соединений железа с литийорганическими восстановителями.

Для этого необходимо было

• изучить кинетические закономерности реакции восстановления хлорного железа литийорганическим соединением без азота и в присутствии азота

• выяснить состав и строение низковалентных производных железа, образующихся в этих системах и способных давать комплексы с азотом и другими субстратами нитрогеназы; выделить и исследовать состав, строение и свойства промежуточных диазотных комплексов, образующихся в этих системах; исследовать реакции низковалентных производных железа с рядом других малых молекул, определить их молекулярные структуры

• определить роль лития в активации малых молекул этими комплексами

2. Выделение из молибден-железного белка нитрогеназы входящего в его активный центр железо-молибденового кофактора - FeMoco и изучение его реакционной способности в чисто химических условиях.

Для этого необходимо было

• найти условия, в которых выделенный из белка FeMoco способен катализировать реакции восстановления субстратов нитрогеназы

• изучить кинетические закономерности этих реакций, а также реакций FeMoco с ингибиторами нитрогеназы, с целью сравнения каталитического поведения FeMoco вне белка и в составе фермента

• изучить возможности восстановления на отделенном от белка FeMoco основного субстрата нитрогеназы - молекулярного азота

• изучить механизм каталитического действия выделенного из фермента кластера в реакциях восстановления субстратов нитрогеназы в чисто химических условиях, в частности, определить природу скорость определяющей стадии и механизм

протонирования субстрата при катализе FeMoco; определить характерные свойства и особенности FeMoco как катализатора реакций восстановления субстратов нитрогеназы

3. Определение сходства и различий в механизмах катализа восстановления субстратов нитрогеназы кластерами природного и искусственного происхождения с целью выяснения, в какой мере синтетические полиядерные катализаторы моделируют активный центр фермента.

Для этого необходимо было

• изучить кинетические закономерности восстановления ацетилена, катализируемого полиядерным молибден-магниевым комплексом (Mg2Mo8), и ингибирования этой реакции молекулярным азотом и оксидом углерода (II) в тех же самых условиях и с участием тех же восстановителей, что были использованы при изучении каталитической реакционной способности выделенного из фермента FeMoco

4. Исследование особенностей протекания нитрогеназной реакции in vitro в сильных магнитных полях в разных условиях проведения эксперимента

Для этого необходимо было

• разработать экспериментальные условия проведения реакции в шахте магнита

• исследовать кинетику реакции при различных соотношениях белковых компонентов реакции, разных температурах, разных значениях напряженности магнитного поля, в присутствии различных реагентов, оказывающих влияние на протекание нитрогеназной реакции in vitro

Научная новизна. Найдены и подробно исследованы азотфиксирующие системы на основе железа и литийорганических восстановителей. Сочетание детального кинетического исследования и синтетического подхода, направленного на выделение и идентификацию промежуточных комплексов, позволило впервые убедительно обосновать механизм восстановления азота в этих системах. Показано, в частности, что определяющей скорость стадией восстановления азота в системе FeCb-LiPh является реакция образования комплекса нуль-валентного железа, активного к молекулярному азоту.

Впервые экспериментально показано, что содействие соединений лития восстановлению азота комплексами железа связано с тем, что он образует смешанные комплексы переходного и непереходного металла, в которых литий равным образом принимает участие в активации N2 за счет множественной координации молекулы азота.

Впервые получены рентгеноструктурные характеристики бинарных железоорганических производных двухвалентного железа, а также ряда неописанных ранее железо-литиевых комплексов с субстратами и ингибиторами нитрогеназы.

Показано, что моноядерные комплексы железа образуют диазотные комплексы, содержащие реакционно-способную молекулу азота, только если состояние окисления железа в комплексе равно 0.

Впервые экспериментально показано, что достаточная активация молекулы N2 к дальнейшим реакциям по азоту возможна и в комплексах двухвалентного железа, только если эти комплексы полиядерные.

Впервые предложено и реализовано оригинальное исследование каталитической реакционной способности отделенного от белковой матрицы кластера FeMoco в реакциях восстановления субстратов нитрогеназы в небелковой среде.

Впервые установлено, что FeMoco и вне белкового окружения способен эффективно координировать молекулярный азот.

Проведено изучение кинетических закономерностей реакций, катализируемых FeMoco вне белка; изучено взаимное влияние субстратов и ингибиторов, что позволило установить, что на восстановленном вне белка кофакторе активны к субстратам и ингибиторам несколько взаимозависимых активных центров с разными параметрами связывания.

Впервые проведенный сравнительный анализ каталитического поведения выделенного FeMoco в реакциях восстановления ацетилена и ингибирования этого процесса оксидом углерода (II) и молекулярным азотом с таковым для ферментативной системы, показал значительное сходство основных закономерностей этих реакций (вплоть до количественного совпадения констант) для фермента и химических систем с участием кофактора. Сделан вывод, что наблюдаемые особенности связаны в первую очередь с составом и структурой FeMoco, и проявляются им независимо от природы восстановителя и среды реакции.

Впервые найдены экспериментальные подтверждения механизма опосредованного протонирования субстрата при катализе FeMoco вне белка, предсказанного ранее теоретическими расчетными методами.

На основе данных о каталитическом восстановлении ацетона на отделенном от белка FeMoco найден новый субстрат нитрогеназы: показано, что нитрогеназа in vitro, как и FeMoco вне белка, способна восстанавливать ацетон с образованием метана.

В работе впервые проведено сравнительное экспериментальное исследование в одинаковых условиях каталитических свойств магний-молибденового комплекса, входящего в активный центр самой эффективной на сегодняшний день модельной азотфиксирующей системы, и системы с участием FeMoco вне белка. Показано значительное сходство в поведении и механизмах катализа реакций восстановления С2Н2 и ингибирования их оксидом углерода (II) системами с участием данных кластеров.

Впервые из исследования температурных зависимостей скоростей каталитических реакций в присутствии FeMoco и Mg-Mo-кластера найдено, что оба типа кластеров как катализаторы благоприятствуют осуществлению многоэлектронных окислительно-восстановительных каталитических процессов: энергии активации образования продуктов 4-х электронного восстановления субстрата заметно меньше, чем продуктов 2-х электронного восстановления.

Впервые изучено влияние магнитного поля на нитрогеназную реакцию in vitro, что позволило выявить следующие особенности нитрогеназного катализа: а)

различные кинетические события могут лимитировать общую скорость каталитического цикла в разных условиях проведения реакции; б) в лимитирующую стадию процесса восстановления субстрата при физиологических температурах включен дистанционный межкластерный электронный перенос; в) излом на температурной зависимости нитрогеназной реакции связан с изменением скорость определяющей стадии при температуре 20°С.

Практическая значимость работы заключается в формулировке механизма активации молекулярного азота металлоорганическими соединениями железа, что может быть использовано для последующего развития этого направления гомогенного катализа. Определенный практический интерес представляет разработка конкретных методик синтеза устойчивых железоорганических соединений.

Предложенный и реализованный в работе подход - исследование каталитической активности РеМосо вне белка - является полезным и информативным для изучения механизма превращения субстратов нитрогеназой. Практический интерес представляет нахождение и разработка новых систем для изучения каталитической активности выделенного из белка РеМосо, а также разработка модифицированного хроматографического метода получения препаративных количеств РеМосо с использованием техники Шлейка.

Понимание химического механизма функционирования одного из самых сложных ферментов - нитрогеназы - представляет интерес для фундаментальной науки, а в дальнейшем может стать научной основой создания новых экологически чистых катализаторов и каталитических процессов с использованием принципов, реализуемых в живой природе.

Личный вклад автора. В диссертации представлены результаты исследований, выполненных самим автором или под его непосредственным руководством. Личный вклад автора состоит в постановке задач, разработке и осуществлении экспериментальных исследований, в том числе, модифицированных методик выделения РеМосо, всего спектра кинетических исследований, методов обработки экспериментальных данных, а также анализе, интерпретации и обобщении полученных результатов.

В работе принимали участие сотрудники ИПХФ РАН: кхн Н.В. Ковалева, кхн Г.Н. Петрова, д.х.н. А.Ф. Шестаков, кхн А.К. Шилова. Особая благодарность - д.х.н. К.А. Лысенко и д.х.н. М.Ю. Антипину (ИНЭОС РАН), выполнивших большую часть РСА полученных автором монокристаллов комплексов.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на следующих симпозиумах и конференциях: II Международная летняя школа по металлоорганическому катализу, Нойбранденбург, ГДР, 1984 год; IV Европейская конференция по металлоорганической химии, Рига, 1985 год; 11 Международный конгресс по фиксации азота, Париж, Франция, 1997 год; 3 Европейская конференция по фиксации азота, Лунтерен, Голландия, 1998 год; Всероссийское совещание по высокоорганизованным каталитическим системам,

Черноголовка, 1998 год; 12 Международный конгресс по фиксации азота, Фос-до Игуасу, Парана. Бразилия, 1999 год; 4 Европейская конференция по фиксации азота, Севилья, Испания, 2000 год; II Всероссийское научное совещание «Высокоорганизованные каталитические системы» 2000 г., МГУ, Москва; 13 Международный конгресс по фиксации азота, Гамильтон, Онтарио, Канада 2001 год; 1 Международная конференция по высокоорганизованным каталитическим системам (Highly Organized Catalytic Systems, HOCS2002) Черноголовка 2002 год; Международная конференция «Modern trends in organometallic and catalytic chemistry» памяти M.E. Вольпина, г. Москва, 2003 год; XV Всероссийский симпозиум «Современная химическая физика», г. Туапсе, 2003 год; 6 Европейская конференция по фиксации азота, Тулуза, Франция, 2004 год; Третий международный симпозиум «Молекулярный дизайн и синтез супрамолекулярных архитектур», Казань, Россия, 2004 год; 9 Международный симпозиум по спиновым и магнитным эффектам в химии и других областях, Оксфорд, Великобритания, 2005 год; VII Всероссийская конференция «Механизмы каталитических реакций» (с международным участием) г. Санкт-Петербург, Россия, 2006 год; 38-й Международная конференция по координационной химии ICCC38, г. Иерусалим, Израиль, 2008 год; XXI Симпозиум «Современная химическая физика», Туапсе, 2009 год; 39 Международная конференция по координационной химии ICCC39, г. Аделаида, Австралия, 2010 год.

Публикации. Основное содержание работы опубликовано в 37 статьях в

отечественных и зарубежных журналах (список приводится в конце данного

реферата) и более чем 30 тезисах докладов на международных и российских конференциях и конгрессах.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 336 страницах машинописного текста и включает 10 таблиц и 90 рисунков. Диссертация состоит из введения, шести глав, списка литературы из 307 наименований.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 96-03-33627, 98-03-32291, 01-03-33278, 04-03-32635, 08-0300674) и Совета по грантам Президента Российской федерации (программа по государственной поддержке ведущих научных школ РФ, гранты № НШ-2065.2003.3, № НШ-4525.2006.3, № HI1I-4167.2008.3, № НШ-3198.2010.3).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика области исследований, обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи работы, описаны основные результаты, их научная новизна и практическая значимость.

В первой главе приведен обзор литературы по теме диссертации, а именно, по составу, свойствам, структуре и механизму действия фермента нитрогеназы; рассмотрены известные к настоящему времени литературные данные о составе и свойствах железо-молибденового кофактора нитрогеназы в белке и вне белка; по

восстановлению азота в апротонных средах; по диазотным комплексам железа и молибдена, особенно тем, которые содержат реакционно-способный азот.

Во второй главе описаны экспериментальные методики и аналитические методы, использованные в работе.

В тиетьей главе приведены результаты изучения апротонных азотфиксирующих систем состава БеСЬ + 1лАг.

В качестве восстановителей хлорного железа в эфире для получения гомогенных апротонных азотфиксирующих систем исследован ряд ароматических и алифатических литийорганических соединений, а именно, фениллитий, о-, т-, р-толиллитий, мезитиллитий, а-нафтиллитий и н-пропиллитий. На примере системы ИеСЬ + 1лРЬ проведено подробное кинетическое исследование процессов восстановления хлорного железа фениллитием а также кинетики реакции восстановления молекулярного азота в этой системе. Изучено влияние характера радикала И. литийорганического соединения на строение, свойства и реакционную способность образующихся железо-органических комплексов. Исследованы реакции этих комплексов с рядом малых молекул, в частности, с N2, Н2, СО, С?Н4, РЬС=СРЬ, РБ^ЫРЬ; для большинства соединений получены монокристаллы и определены их молекулярные структуры.

Кинетические закономерности и механизл< восстановления азота в системе хлорное железо - литийфенил.

В одной из наших ранних работ1 было показано, что при смешивании эфирных растворов хлорного железа и фениллития образуются гомогенные системы, способные восстанавливать молекулярный азот до гидразина и аммиака. Затем А.К. Шилова, А.Е. Шилов и Б. Чубар2 показали, что присутствие галоидных солей лития (ЫВг, ЬП) в реакционном растворе значительно увеличивает скорость накопления продуктов восстановления азота. Интересно было понять, какова природа ускоряющего действия солей, способствуют ли они облегчению восстановления азота в комплексах, как это ранее предполагали2, или же они влияют на скорость накопления активной к азоту формы железа. Для решения этой задачи мы, наряду с исследованием кинетики накопления азотсодержащих продуктов, изучили кинетическое поведение системы без азота и сделали вывод о механизме восстановления хлорного железа фениллитием и действия солей на эту реакцию.

Кинетика и механизм реакции восстановления хлорного железа фениллитием

Изменения спектров поглощения систем БеСЬ + 1лРЬ в атмосфере аргона в присутствии и в отсутствие бромистого лития качественно аналогичны: по мере накопления комплекса восстановленного железа в спектре поглощения появляется полоса с максимумом 500 нм. Оптическая плотность при 500 нм растет во времени и

' Бройтман М.О., Воронцова Т.А., Шилов А.Е.. Восстановление молекулярного азота в системе РеС13 + 1лРЬ + N2 //Кинетика и катализ. 1972. Т. 13. №1. С. 61-66.

2 Чубар Б., Шилов А.Е., Шилова А.К. Каталитический эффект литиевых солей при восстановлении азота в системе РеСЬ-ЫРЬ-Иг// Кинетика и катализ. 1975. Т. 16. №4. С. 1097-1080.

достигает постоянного значения. Кривые имеют автокаталитический характер, причем с увеличением концентрации бромистого лития уменьшается период индукции и

увеличивается скорость процесса, Рис. 1. Было обнаружено, что предельное значение оптической плотности при 500 нм

пропорционально исходной концентрации хлорного железа и не зависит от концентрации бромистого лития. При этом начальные

скорости накопления окрашенного комплекса и максимальные

скорости

пропорциональны исходным

концентрациям, как бромистого лития, так и хлорного железа. Если в начальный момент времени к реакционной смеси РеС1з + 1лРЬ добавить раствор конечного продукта, то индукционный период снимается и наблюдается максимальная скорость с самого начала процесса. Конечным продуктом, накапливающимся в системе при комнатной температуре и ответственным за автокатализ, является комплекс нульвалентного железа. В пользу этого свидетельствуют следующие экспериментальные данные: во-первых, по данным магнитного взвешивания конечный продукт диамагнитен, во-вторых, при действии НС1 на продукты реакции выделяется водород, в-третьих, его образование из комплекса Ре(П), образующегося при сливании хлорного железа с фениллитием, сопровождается выделением дифенила. Автокаталитический характер реакции можно объяснить тем, что накапливающийся в системе комплекс Ре(0) вступает во взаимодействие с низкотемпературным комплексом Ре(Н), ускоряя его восстановление. Для объяснения совокупности экспериментальных данных был предложен следующий механизм. В первой стадии (Схема 1, уравнение 1) взаимодействие хлорного железа с фениллитием при низкой температуре приводит к образованию комплекса двухвалентного железа. Этот комплекс при комнатной температуре восстанавливается до соединения нуль-валентного железа посредством отщепления молекулы дифенила.

1.2 -

время мин

Рис.1. Кинетические кривые накопления восстановленного

комплекса железа в системе РеСЬ + ирь в аргоне для различных концентраций иВг: 1 - без 1лВг, 2-0.1 М 1лВг, 3 - 0.2 М 1лВг, 4 - 0.4 М 1лВг, |ТеС1з] = 0.7 10'2 М

Схема 1.

1ЛРИ с ПВг

РеС13 -- ЬпРе(П)РЬ2 1

-20оС

к]

ЬпРе(И)Р112 + 1ЛВг -»- Ьп Ре(0) + РЬ2 2

к-,

ЬпРе(П)РЬ2 + ЬпРе(0) ---»- 2ЬпРе(0) +РЬ2 3

где Ь - лиганды, например РЫл, Ь1Вг, эфир; п - число лигандов, которое, возможно, является переменным.

Процесс восстановления ускоряется бромистым литием (уравнение 2). Третье уравнение учитывает, что накопление комплекса нуль-валентного железа ускоряется самим конечным продуктом.

Из этой схемы следует, что накопление комплекса нуль-валентного железа происходит по закону

= (к, [ЫВг] + к2 [Ре(0)])([Ре(//}]0 - [МО)])

Интегрируя это дифференциальное уравнение, находим, что

1 1 + 1 к, [ЫВг] + к2СРеСЮ]0 П1" [Ре(0)]/[РеСИ)]0

Теоретические кривые, изображенные на Рис. 1 сплошными линиями, рассчитывали по этой формуле. Параметры к,, |Те(Н)]о, и к2 определяли из экспериментальных значений [Ре(0)], 1, соответствующих случаю [иВг]=1х10"'м (Рис. 1, кривая 2). Остальные теоретические кривые строили, исходя из тех же значений к] , к2 и [Ре(П)]0- Величину к,[иВг] меняли в соответствии с экспериментальными значениями концентрации бромистого лития. Было найдено: к2 = 0.7ч"1 О"1 , Отах = 1.11, к^ЬлВг] (кривая 2) = 0.07ч"1. Видно, что при значительных изменениях концентраций соли и железа экспериментальные данные достаточно хорошо укладывается на теоретические кривые, что говорит о правильности предлагаемого механизма.

По нашему мнению механизм ускоряющего действия бромистого лития в процессе восстановительного распада железоорганических комплексов связан с вхождением аниона в координационную сферу металла, что приводит к ослаблению связи железо-углерод и облегчению отщепления дифенила. В этом смысле действие Вг" аналогично действию других оснований, например, ТГФ, РРЬз, алкенов, которые,

как известно, ускоряют распад металлоорганических соединений. Таким же образом можно объяснить каталитическое действие комплекса нуль-валентного железа на восстановительный распад соединения двухвалентного железа, поскольку по отношению к соединению Ре(Н) комплекс Ре(0) является донором. Кинетика восстановления молекулярного азота в системе РеСЬ + ЫР/г Если реакцию взаимодействия хлорного железа с фениллитием проводить в присутствии молекулярного азота, то образующийся на стадии 2 (см. Схему 1 на стр. 10) комплекс нуль-валентного железа реагирует с N2 с образованием комплекса, имеющего линию поглощения в видимой области с максимумом 476 нм. Под действием протонсодержащих реагентов азот из комплекса выделяется в виде гидразина (до 25% на железо в комплексе), N2 (около 75%) и аммиака (1-4%). Сумма азотсодержащих продуктов, образующихся при разложении, равна 1 моль на моль железа. На Рис. 2 приведены кинетические кривые накопления диазотного комплекса для различных исходных концентраций хлорного железа при постоянной

концентрации 1лВг. Видно, что начальная скорость накопления комплекса с азотом пропорциональна исходной концентрации хлорного железа. Константа скорости не зависит от концентрации хлорного железа в интервале (0.3-1.4)х10"2М при постоянной концентрации бромистого лития. Кроме этого было показано, что начальная скорость накопления гидразина изменяется пропорционально концентрации 1лВг и не зависит от концентрации фениллития при соотношении РЫл/РеС13 >10 и давления азота при РМ2 >200мм.рт.ст. Если вначале провести реакцию РеС13+1лР11 в атмосфере аргона до достижения максимальной оптической плотности при 500 нм, а затем в систему ввести N2, то в спектре уменьшается поглощение при 500нм и увеличивается при 476нм, причем, постепенно спектр становится идентичным конечному спектру раствора, в котором реакция с самого начала проводилась под азотом. Полученные кинетические данные показывают, что активной частицей, реагирующей с молекулярным азотом, является комплекс нуль-валентного железа, так как система, выдержанная в аргоне в течение длительного времени и содержащая только Ре(0), продолжает оставаться активной к азоту. Кинетическое уравнение включает концентрацию железа в первой степени, что соответствует активной моноядерной форме железа, т.е. при рассмотрении реакции

200 300 400

время, мин

Рис. 2 Кинетические кривые накопления азотного комплекса в системе РеОз-ЦРЬ-Кг для различных концентраций БсСЬ: 1 - 0.4х10"2 М, 2 -0.5, 3 - 0.7, 4 - 1.1 хЮ"2 М; [1лВг]=0.3М; 5 - спрямление кривых 1 и 2 в координатах 1п О^ЯХ-О -1

хлорного железа с феннллитнем в азоте приведенную выше Схему 1 реакции в аргоне необходимо дополнить реакцией взаимодействия комплекса ЬпРе(0) с азотом.

Схема 2.

УРЬ с ЫВг

РеС13 -- ЬпРе(И)РЬ2 1

-20оС

ЬпРе(П)РЬ2 +ЫВг -» ЬпРе(0) + РЬ2 2

ЬпРе(П)РЬ2 + ЬпРе(0) --—>► 2ЬпРе(0)+РЬ2 3

ЬпРе(0)+К2 -[1п Ре(0)К2] 4

Предположим, что образующийся в реакции 2 комплекс ЬпРе(0) быстрее реагирует с азотом, чем расходуется по реакции 3, т.е. к3»к2[Ре(П)]о. Из этой схемы скорость накопления азотного комплекса равна

кЛШЩРеСЮ]

атак как ^е(И)] = [Fe(7//']oехр{-£,[1/5г]?} находим = к1[ыВг][Ре(П) ]0ехр{-Л1[1Шг]С}

at

а [Ре№] = [Лг(7/;]0(1-ехр{-*,[£Юг]*})

Теоретические кривые, построенные по этому уравнению, приведены на Рис. 2 сплошными линиями. Видно, что экспериментальные точки достаточно хорошо укладываются на теоретические кривые. В координатах 1п - I

экспериментальные точки с хорошей точностью описываются линейной зависимостью (прямая 5, рис. 2). Это позволило определить величину 1<1 - константы скорости восстановительного распада железоорганического соединения Ре(П) к'1=0.б В'ч"1, которая оказалась близкой по значению к величине к| (к]=0.7 0"'ч"'), найденной из автокаталитических кривых накопления активного к азоту комплекса нуль-валентного железа.

Таким образом, мы установили, что в изучаемой системе азот реагирует с комплексом нуль-валентного железа, который образуется по автокаталитическому закону из комплекса двухвалентного железа. Процесс восстановления ускоряется в присутствии бромистого лития. С ускоренной наработкой активного к азоту

комплекса железа (0) связано и наблюдавшееся ускорение восстановления N2 в присутствии солей лития.

Строение бинарных железоорганических соединений

Для расширения класса гомогенных азотфиксирующих систем на основе железа исследован, помимо фениллития, ряд ароматических и алифатических литийорганических соединений, а именно, о-, т-, />-толиллитий, мезитиллитий, а-нафтиллитий и н-пропиллитий. Мы нашли, что о-толилитий и мезитиллитий не взаимодействуют с хлорным железом, по-видимому, из-за стерических затруднений. Мета- и р-толиллитий реагируют с хлорным железом аналогично фениллитию с образованием анионных а-арильных комплексов железа (0), но с меньшими скоростями. Все эти комплексы нуль-валентного железа активны в восстановлении азота.

Взаимодействие хлорного железа с а-нафтиллитием заканчивается образованием парамагнитного дилитийтетранафтилферрата(П), стабильного как к дальнейшему восстановлению а-нафтиллитием, так и к реакции с азотом. Это подтверждается обнаружением динафтила в продуктах реакции, а также результатами изучения состава и строения образующегося комплекса двухвалентного железа.

Отметим, что комплекс содержит только о-связанные арильные лиганды и является первым примером такого типа соединений двухвалентного железа.

-ЗОоС

РеС13 + 5 ос-ИрЫ -[ЬЮЕ^ЫРеЫр^ + 3 ЫСН + 1/2Ыр2

эфир

Дополнительное восстановление этого соединения, например, н-пропиллитием, приводит к диамагнитному комплексу нуль-валентного железа, который, в отличие от исходного литийтетранафтилферрата, реагирует с молекулярным азотом с образованием диазотного комплекса, способного к протонированию по азоту.

Железо-литиевые комплексы с молекулярным водородом

Рис. 3 .Молекулярная структура [LiO(C2Hi)2]2[Fe(C,oH7)4]:

вверху - проекция структуры в направлении минимального перекрывания атомов; внизу - вдоль С(1) - Fe связи

515 пг

Железо-органические производные нуль-валентного железа (с И=РИ р-То1, т-То1),

активные к молекулярному азоту, реагируют в очень мягких условиях (20°С, давление Н2 менее 100 мм рт. ст.) с молекулярным водородом.

Фенильные комплексы железа реагируют с водородом очень быстро: уже через 2 минуты после напуска водорода из раствора выпадают блестящие черные кристаллы; реакция ткегаа-толильного производного с Н2 заканчивается лишь через сутки, пара-толильного - за несколько часов. За реакцией с водородом удобно следить по спектрам (Рис. 4). Молекулярные структуры определены для фенильного и пара-толильного дигидридов.

Было найдено, что комплексы двухвалентного железа [(Н)2РеР1|4]1л4 4Е120 (1) и [(Н)2Ре(р-То1)4]ЬЦ 4Е^0 (2) имеют сходное строение с фактически одинаковой геометрией центрального октаэдрического узла [РЬ4РеН2] и транс расположением двух гидридных атомов Н при атоме металла. Расстояния Ре-Н равны 1,64(3) и 1,69(2) А и характерны для известных гидридных комплексов железа. В ИК-спектре 1 колебанию связи железо-гидрид отвечает очень интенсивная широкая полоса при 1200 см"1, понижающая частоту до 898 см"1 при замене в 1 Н2 на (соответственно для 2 у(РеН) составляет 1223 см"1 и у(РеО) - 910 см"1).

После выпадения из эфирного раствора кристаллы 1 и 2 в эфире уже не растворяются. Но они прекрасно растворяются в 2,5-

диметилтетрагидрофуране и стабильны в этом растворителе в течение длительного времени. Растворяются они и в тетрагидрофуране: уже при температуре плавления ТГФ (-66°С) раствор интенсивно окрашен в ярко-малиновый цвет с линией поглощения той же, что в эфире. При

Рис. 4. Вверху: Изменение спектра поглощения системы ИеСЬ + ЫРИ при комн. Т° в аргоне и в присутствии Н2: 1-спектр фенильного производного двухвалентного железа; 2 - спектр комплекса нуль-валентного железа; 3-спектр дигидрида Щ[Ре(Н)2Р1и]4Е120 (продукта реакции комплекса нуль-валентного железа с молекулярным водородом;

Внизу: молекулярная структура дигидрида Ц4[Ре(Н)2РИ4]4Е120

повышении температуры до комнатной цвет ТГФ раствора дигидрида медленно меняет окраску с ярко-малиновой на красно-коричневую (Хтах = 465 нм), т. е., ТГФ не является нейтральным растворителем для этих комплексов. Проведенный РСА показал, что 1 при растворении в абсолютном ТГФ превращается в железо-литиевый гидридный комплекс [ГеРЬз(ц2-Н)зРеРЬз]Ь15-5ТНР (3). Его молекулярная структура приведена на Рис. 5.

Рис. 5 Молекулярная структура железо-литиевого гидридного кластера [РЬзРе(цг-

H)3FePh3]LÍ5-5THF (3).

Яара-толильный транс-дигидрид претерпевает аналогичное, но гораздо более медленное превращение уже в среде абсолютного диэтилового эфира, в котором он, в отличие от 1, хорошо растворим. Молекулярная структура образующегося комплекса 4 также определена методом РСА. Механизм превращения специально не изучался, показано лишь, что все уходящие фенильные группы находятся в реакционной смеси в виде дифенила.

Оба изученных комплекса 3 и 4 имеют сходное строение центрального фрагмента с двумя концевыми и тремя мостиковыми атомами лития между двумя атомами железа, связанными в комплексах связью металл-металл длиной 2,389(1) и 2,379(1) А в 3 и 2,378(2) А в 4. Такие длины связей отвечают прочному взаимодействию металл-металл. Концевые атомы лития расположены фактически на продолжении линии связи Fe-Fe с образованием почти строго линейных цепочек Li-Fe-Fe-Li. Симметрия расположения мостиковых атомов лития близка к тройной (см. рис 5).

Транс-дигидридные комплексы двухвалентного железа не реагируют с молекулярным азотом. Образующиеся из них под действием ТГФ железо-литиевые полиядерные комплексы реагируют с ненасыщенными соединениями, образуя аддукты с частичным восстановлением субстратов при обработке HCl. Так, например, этилен образует с 3 комплекс, дающий при разложении HCl этан (выход 70%) и этилен (30%). Монооксид углерода (II) дает карбонильный комплекс (1 СО на 1 Fe),

высвобождающий СО под действием HCl. Адцукт с молекулярным азотом дает гидразин (25-30% на железо) и N2 (70-75%).

ИК спектры продукта взаимодействия комплекса 3 с N2, содержащие изотопы <14)N2, (15)N2, а также 7Li и 6Li, показывают, что ионы лития участвуют во взаимодействии 3 с N2, образуя Li-N связи.

Анализ имеющейся к настоящему времени литературы по диазотным комплексам железа показал, что только моноядерные комплексы Fe(0), с очень высокой электронной плотностью на железе, причем, анионные, с дополнительной координацией на азоте калия или магния, показывают образование небольшого количества гидразина при протолизе3. В литературе нет ни одного примера диазотного комплекса Fe(ll), содержащего реакционно-способный азот, кроме комплекса, образующегося при взаимодействии 3 с азотом, описанного в данной работе. Обращает на себя внимание тот факт, что фактически комплекс является полиядерным, где возможна множественная координация молекулы азота, за счет которой достигается необходимая для дальнейших реакций активация N=N связи даже таким не слишком восстановленным состоянием железа, как Fe(II), которое, по-видимому, только и возможно в активном центре природных азотфиксирующих систем.

Реакция азобензола с железо-литиевыми соединениями; молекулярная структура и свойства образующихся комплексов

Рис. 6. Молекулярная структура Ре(1Ч2РЬ2)з(1Л((да2))з (6). А и В показывают различные проекции структуры; контакты Ре..,1л показаны пунктиром

Чтобы получить информацию о возможных способах

координации NN кратных связей с железо-литиевыми комплексами, мы исследовали их взаимодействие с азобензолом (дифенилдиазеном) и реакции образующихся комплексов с протонирующими агентами, а именно, с водой или сухим HCl. Отметим здесь, что диметилдиазен, как было показано, является субстратом нитрогеназы.

3 J.L. Crossland, D.R. Tyler. Iron-dinitrogen chemistry: Dinitrogen activation and reactivity // Coord. Chem. Rev. 2010. V. 254. P. 1883-1894.

В реакцию с азобензолом вводили железо-литиевые комплексы, показавшие активность к молекулярному азоту, комплекс нуль-валентного железа предположительного состава РЬцРеП^СЖг)^ образующийся по реакции РеС13 + 1лРЬ (5) и гидридный комплекс Ре(П) [РеРЬ3(ц2-Н)3РеР113]1л5-5ТНР (3).

Согласно данным рентгеноструктурного анализа при взаимодействии комплекса 5 с азобензолом получается соединение Ре(М2РЬ2)31л3(С)Е1:)3 6, а комплекса 3 - соединения Ре^гР^^зГлгСГНР^ 7 и РерЧгРЬг^Ь^ОЕ^г 8. Найденные молекулярные структуры соединений 6, 7 и 8 приведены на Рис. 6, 7, соответственно.

Рис. 7. Молекулярная структура комплексов: Слева Ре(ТЧ2РЬ2)з(Ь1(ТНР))2 7 Справа -Ре^МгРЬгМЩСЖг)^ 8. А и В показывают различные проекции структуры; контакты Ре...1л показаны пунктиром

Соединение 6 имеет кристаллографическую ось третьего порядка, С3, проходящую через атом железа, который координирован тремя азобензольными лигандами и имеет слегка искаженную плоскую геометрию. Атомы азота азобензольных И2РЬ2 лигандов, помимо связей Ре-Ы, образуют дополнительные связи с 1лОЕ12 группировками. Таким образом, в соединении 6 атом железа оказывается в центре девятичленного «складчатого» цикла Ы3(Ы2)з (Рис.. 6, В), с фенильными кольцами азобензольных лигандов, расположенными выше и ниже плоскости цикла (Рис.. 7, А). Расположение ионов лития в соединении 7 вызывает укорочение расстояния Ре.до 2.689(3)А. Примечательно, что расстояния 1л-Ре в комплексе (РеРЬ3(ц2-Н)3РеРЬ3)Ь15 5ТНР значительно короче (2.45-2.53(1) А).

Соединения 7 и 8 изоструктурны, длины связей и углы в этих комплексах очень похожи. Кристаллические структуры соединений имеют кристаллографические оси второго порядка С2 , проходящие через атомы железа и середины N(l)-N(2) связей. Кроме этого, также как и в соединении 6, металлические центры в обеих структурах имеют координационное число 6 и слегка искаженную плоскую геометрию. Интересно, что в структурах 7 и 8 только по два иона лития в виде групп (1л(ТНР) в 7 и 1л(ОЕ12) в 8 образуют связи с азобензольными лигандами, с той же самой ориентацией РЬ колец по отношению к Ре(ТМ2РЬ2)3 фрагменту (Рис. 7) как и в соединении 6.

При протолизе комплексов образуются азобензол, гидразобензол и анилин, то есть продукты двух и четырехэлектронного восстановления азобензола. Взаимное соотношение их зависит от условий протолиза.

Реакция железо-литиевых соединений с тройной С=С связью

Чтобы исследовать строение аддуктов 3 с непредельными соединениями, мы провели его реакцию с толаном. Реакцию проводили в тех же условиях, что и реакцию с азотом.

Из раствора были выделены черные, хорошо ограненные кристаллы, как показал РСА монокристалла, 1,4-дилитийтетрафенилбутадиена (9). Интересно, что ранее было описано образование такого соединения в реакции толана с

металлическим литием4, но структура этого соединения не была известна.

Общий вид комплекса 9 показан на Рис. 8 Он соответствует димеру димеров лития [1л4(ТНР)4(С4РЬ4)2] с осью симметрии второго порядка. Атомы лития образуют сильно искаженный тетраэдр, и каждый атом лития координирован одной молекулой ТГФ (длины связей 1л-0 равны 1.944(2) и 1.967(5)А), а также углеродными атомами бутадиеновой цепи С(1)-С(4) дианионов [РИС1 = С2(РЬ)-С3(РЬ) = С4(РЬ)]2_.

Механизм образования соединения 9 можно представить как рекомбинацию двух 1л-С(РЬ)-С(РЬ) фрагментов, образованных в координационной сфере одного или двух атомов железа после переноса атомов лития к С атомам толанового лиганда, хотя в отсутствие кинетических данных нельзя исключать и образование таких частиц вне координационной сферы железа.

Таким образом, мы показали, что взаимодействие ароматических литийорганических соединений с безводным хлорным железом в апротонных растворителях приводит к образованию железо-литиевых комплексов разной ядерности и состава в зависимости от характера радикала и полярности и координирующей способности растворителя. Поскольку в этих соединениях все расстояния между атомами металлов находятся в области валентных взаимодействий, их следует рассматривать как гетерометаллические кластеры. Согласно расчетам состояние атомов лития в этих смешанных комплексах является промежуточным между 1л(0) и 1л(+1) и литию принадлежит равноправная роль в активации молекулы

4 Е.Н. Вгауе, \У. ШЪе1 ап<1 I. СарНег//Л Атег. СИет. Бос. 1961. 83. Р. 4406

Рис 8. Общий вид молекулярной структуры 1,4-дилитийбутадиен-ТН!7 комплекса.

азота. Экспериментальное исследование ИК-спектров ряда изотопозамещенных (с изотопами лития, азота и водорода) образующихся из этих соединений азотных комплексов показало, во-первых, многосвязанность молекулы N2 в этих комплексах, а во-вторых, существенную роль лития при координации азота за счет образования связей азот-литий. Существенная роль лития в координирующей способности этих кластеров подтверждается также результатами, полученными при исследовании их взаимодействия с дифенилацетиленом и азобензолом как модельными молекулами.

В четвертой главе приведены и обсуждены результаты изучения

каталитической активности железо-молибденового кофактора нитрогеназы вне белка

в сравнении с поведением «М»-

центра - кофактора внутри

белковой матрицы.

Наличие всего лишь двух

связей кофактора с белком (Рис. 9)

позволяет при соблюдении

определенных условий5 отделить

этот кластер от белковой глобулы

без его разрушения и работать с

ним как с обычным химическим

соединением. Из

рентгеноструктурного анализа

монокристалла МоРе белка

известно, что РеМосо погружен

примерно на 1ОА внутрь белковой

глобулы, что объясняет его

устойчивость к действию воды в аминокислотами, определяющими «выдачу»

протонов (а-195т) и предельный размер протеин-связанном состоянии.

субстратов (а-70Уа1) Разрушение защитного окружения

при отделении РеМосо от белка приводит к тому, что он легко гидролизуется водой или спиртами. Поэтому мы предложили создавать каталитические системы с участием РеМосо в апротонных средах разной полярности, а в качестве источников протонов, необходимых для получения продуктов восстановления из координированных на катализаторе молекул субстрата, использовать специально добавляемые вещества, с рК, достаточными для протонирования, но не разрушающими кластерную структуру активного центра.

РеМосо выделяли из МоРе белка нитрогеназы АгоШЬа^ег уте1апс!и с использованием хроматографического метода, внеся некоторые модификации в методику: вместо проведения процедуры выделения в аргоновом «боксе» пользовались техникой Шленка для работы в инертной атмосфере, сконструировав для этой цели специальную хроматографическую установку.

5 ЭЬаЬ V. К. апё ВгШ \У. I // Ргос. №11. Асас1. Бш, иБА, 1977. V. 74. Р. 3249

Рис. 9. Молекулярная структура железо-молибденового кофактора нитрогеназы (РеМосо) с аминокислотами, посредством которых он связан с белковой матрицей (а-442н,!1 и а-275Су5), а также важными

Базовая система, для которой были получены основные результаты работы, выглядела следующим образом: FeMoco нитрогеназы Azotobacter vinelandii (катализатор), амальгама цинка или европия (восстановитель), диметилформамид (ДМФА) (растворитель), тиофенол (донор протонов) и ацетилен (субстрат).

С целью подбора амальгам, имеющих восстановительный потенциал, достаточный для перевода FeMoco в восстановленное (субстратсвязывающее, FeMoco(red)) состояние, было проведено исследование электрохимического поведения FeMoco в ДМФА методом циклической вольтамперометрии. Найдено, что формальный редокс потенциал перехода FeMoco из так называемого полувосстановленного (дитионит-восстановленного, FeMoco(s-r)) состояния , в восстановленное состояние, равен - 0.73 В (отн. н.в.э.). Таким образом, потенциалы амальгам цинка (£ = - 0.84 В отн. н.в.э.) и европия (Е = - 1.4 В отн. н.в.э) (потенциалы получены прямыми измерениями в среде ДМФА/тиофенол) достаточны для восстановления FeMoco.

Целостность кластерного скелета FeMoco и наличие гомоцитрата в его составе после выделения кофактора из белка и после участия его в каталитической реакции вне белка проверяли с помощью теста на «биологическую активность», который заключается во встраивании экстрагированного FeMoco в дефектный по кофактору MoFe белок с последующей проверкой активности холофермента по отношению к восстановлению ацетилена в полной нитрогеназной системе. Этот тест является единственным критерием для идентификации и оценки состава и строения выделенного из белка FeMoco. В наших опытах специфическая активность экстрагированного FeMoco после встраивания его в дефектный MoFe белок нитрогеназы Klebsiella pneumoniae Кр 5058 составляла 180±20 нмоль С2Н4 в мин на нмоль Мо. Активность нитрогеназной системы к восстановлению ацетилена после реконструкции MoFe белка образцами FeMoco «до» и «после» участия его в каталитических реакциях (с использованием амальгам цинка и европия в качестве восстановителей, а также тиофенола с концентрацией до 0.2 М) оказалась практически одинаковой. Этот факт доказывает, что FeMoco является истинным катализатором изучаемых реакций, так как после участия в реакциях кофактор сохраняет свою целостность и активность.

Кинетические закономерности восстановления ацетилена, катализируемого FeMoco вне белка

При изучении каталитической активности FeMoco вне белка было найдено, что при использовании амальгам цинка и европия как доноров электронов (в апротонных растворителях с тиофенолом в качестве источника протонов) FeMoco является эффективным катализатором восстановления субстрата нитрогеназы ацетилена, причем выход продуктов и скорость реакции растут при переходе от Zn(Hg) к Eu(Hg), увеличиваясь с ростом катодного (отрицательного) потенциала восстановителя.

Редокс состояние FeMoco в присутствии восстановителя дитионита

В системе с амальгамой европия проведено сравнительное изучение каталитического поведения кофакторов, выделенных из MoFe белков нитрогеназ различных микроорганизмов - Azotobacter vinelandii и Klebsiella pneumoniae. Мы нашли, что в одинаковых реакционных условиях эти катализаторы ведут себя практически идентично (Рис. 10). Специфическая активность в «биотесте» для данных образцов также оказалась одинакова.

Были установлены следующие факты: катализатор необратимо разрушается под действием кислорода; как в отсутствие FeMoco, так и в присутствии FeMoco, разрушенного кислородом воздуха, не наблюдается образования продуктов восстановления ацетилена амальгамами Zn или Ей в ДМФА в присутствии тиофенола; при повышении температуры реакции выше 40°С скорости восстановления ацетилена обеими амальгамами значительно падают, видимо, за счет термического разрушения FeMoco. Этилен является плохим субстратом в этих системах: наблюдается только лишь стехиометрическое восстановление этилена в этан. Кроме потенциала восстановителя, на скорость накопления продуктов каталитических реакций оказывают влияние интенсивность перемешивания амальгамы, фактически, размер площади поверхности «электрода», что указывает на поверхностный характер реакций.

Рис. 10. Кинетика восстановления ацетилена амальгамами цинка или европия, катализатор FeMoco (слева)', справа - Сравнение каталитического поведения кофакторов нитрогеназ из разных бактериальных источников: —•—FeMoco из нитрогеназы Klebsiella pneumoniae [Mo] = О.бх 10 s М, —°—FeMoco из нитрогеназы Azotobacter vinelandii [Mo] = 0.53x10"5 М Условия реакции: [Мо] = 0.53х10"5М; растворитель - ДМФА (4 мл); Eu(Hg) 0.5 мл.; Zn(Hg) 0.7 мл.; [PhSH] = 0.012 М, давление С2Н2 -180 мм Hg, температура

21°С

Система с Еи/Н& в качестве восстановителя

Протекающая в системе реакция в общем виде может быть представлена следующим уравнением:

РеМосо

С2Н2 + Еи/Нц + РЬЭН

ДМФА 21°С

С2Н4 + С2Н6 + Ей + РИЭ- + Н2

Фактически происходит восстановление С2Н2 до этилена и этана с использованием электронов амальгамы европия и протонов тиофенола. Накопление продуктов восстановления С2Н2, этилена и этана, в данной системе происходит параллельно (см. Рис. 10).

*у, моль этилена/мнн х Мо 60-,

0.00 0,02 0.04 С,Н„ »тм

1ое W -2.8+ 1.6 • |оЕ Р

1.3 -1.2 -1.1 -1.0 -0.9 -0.8 .0.7 -0.6

'В р С,н,

0.00 0.05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 С,Н,, атм

Рис. 11. Зависимость скорости образования этилена в реакции восстановления С2Н2 амальгамой Ей, катализируемой РеМосо, от давления субстрата; вставка А - участок зависимости для Р (С2Н2) = 0+0.06 атм; вставка Б - преобразование Б-образной части кривой (Р (С2Н2) = 0.06-0.3 атм) в координатах Хилла; Условия: [РеМосо] = 0.55х10"5 М; Еи(Щ) (1.1 М) 0.5 мл; [РЬЭН] = 0.012 М; растворитель - ДМФА (4.3 мл); С2Н2; 21°С

В системе изучены зависимости скоростей образования этилена и этана от концентраций катализатора, субстрата, протонирующего агента, концентрации амальгамы, а также методом ИК-Фурье спектроскопии исследована стереоспецифичность реакции. Зависимость начальной скорости образования

Под начальной скоростью (\у) подразумевается количество продукта реакции, образовавшегося в единицу времени в расчете на один моль Мо, на начальном линейном участке кинетической кривой образования продукта реакции

этилена от давления субстрата при катализируемом РеМосо восстановлении ацетилена амальгамой европия приведена на Рис. 11.

Видно, что зависимость скорости накопления этилена (и этана, не приведено на Рис.) от концентрации субстрата имеет сложный характер, что объяснено наличием на восстановленном кластере РеМосо как минимум двух взаимозависимых центров координации и восстановления ацетилена: один центр действует при давлениях 0 0.06 атм С2Н2 и описывается с помощью гиперболической функции (Кт = 0.006 атм С2Н2 как для С2Н4, так и для С2Н6). Насыщение этого центра субстратом индуцирует активность еще как минимум одного центра, и при давлениях 0.06 4- 0.3 атм С2Н2 активны несколько центров (коэффициент Хилла составляет 1.6) с эффективной Кт = 0.08 атм.

Поскольку образование

РеМосо(гес1) происходит на поверхности амальгамы, а превращение субстрата в продукты, по-видимому, осуществляются без выхода катализатор-субстратного комплекса [РеМосога1(Н)(РЬ5)(С2112)] в объем раствора, скорость реакции с участием восстановленного кофактора должна быть пропорциональна площади поверхности амальгамы и поверхностной концентрации РеМосо: VI ~ кЗ[ТеМосо]5, где 8 - площадь соприкосновения данного количества амальгамы с раствором, а [РсМосо]5 -поверхностная концентрация кофактора . В таком случае зависимость скоростей образования этилена и этана от концентрации РеМосо должна описываться уравнением,

[ РеМосо] 8 = ^ЛРеМ0С°]У

1 + каа$ [реМос°]у > сходным с изотермой адсорбции, отражающей изменение поверхностной концентрации катализатора при увеличении его объемной концентрации, что и было найдено экспериментально. На Рис. 12

" као, - коэффициент адсорбции РеМосо на Еи(Ь^), аналогичный коэффициенту X в уравнении изотермы адсорбции Лэнгмюра. Формула используется с теми же допущениями, что и при выводе изотермы адсорбции, в частности, с приближением об однородном характере поверхности (центры адсорбции имеют одинаковые адсорбционные свойства)

[РеМосо!, Мх 10 !

Рис. 12. Зависимость скоростей образования этилена и этана от объемной концентрации РеМосо; Условия: РеМосо; Еи(Щ) (1.1 М) 0.5 мл; [РЬБН] = 0.012 М; Р С2Н2 0.2 атм; ДМФА (4 мл); 21°С

приведены полученные зависимости скоростей накопления С2Н4 и С2Н6 от концентрации РеМосо.

Скорость накопления этилена описывается уравнением,

8.2 [РеМосо]у 2 [РеМосо],

WC2H4

0.25 + [ FeMoco]

а этана -

W,

С2Н6

0.25 + [ FeMoco]

(сплошные линии на Рис. 12).

Величины каЛ, входящие в выражения зависимости скоростей образования и этилена, и этана от концентрации катализатора, равны, что говорит о том, что оба продукта образуются с уч&стием одной и той же частицы [РеМосогса(Н)(РЬ8)(С2Н2)],

адсорбированной на поверхности

w, моль продукта/мин х Мо 60 50 40 Н 30 20 100

0 12 3 4 -1Ё ([РЬвНЬМ)

Рис. 13. Зависимость скоростей образования этилена и этана от концентрации тиофенола; полулогарифмические координаты Условия: [РеМосо] = 0.55x10"' М; Еи(ВД (0.35 М) 0.5 мл; растворитель - ДМФА (4 мл); р С2Н2А2 атм; РЬБН; 21°С

амальгамы

Из зависимости скоростей образования этилена и этана от кониентраиии тиофенола (Рис. 13), имеющих резко экстремальный характер (максимум при

концентрации PhSH в ДМФА 10'2 М), сделано заключение о сложном характере протонирования

координированного ацетилена:

первичная атака протона

осуществляется по одному из атомов кластера, и лишь затем в результате внутримолекулярного переноса протон попадает на субстрат.

Подобную ситуацию

предполагают и в нитрогеназе in vitro, где протоны, доставленные к кофактору по сети водородных связей, вероятно, первоначально связываются либо с мостиковыми атомами серы, либо с атомами железа.

С целью изучения характера связывания С2Н2 с кластером и механизма протонирования координированного ацетилена была исследована стереоспецифичность реакции образования этилена из С2Б2 при протонировании его «легким» РИЭИ методом ИК-Фурье спектроскопии.

Рис.14. ИК-спектр продуктов

восстановления C2D2 в диапазоне 1000+800 см"', катализатор FeMoco (1); газовая фаза аналогичной реакции без FeMoco (2) Условия: ИК-спектрометр FTIR-1600 Perkin Elmer, разрешение 2см"', вакуумируемая кювета со стеклами из KB г

Волновое число

Найдено, что основным продуктом восстановления C2D2 является цис-1,2-дидейтероэтилен (транс- 1,2-C2H2D2 образуется 11%, a C2H3D - 13%). Видно (Рис. 15), что амальгама европия без катализатора не дает никаких продуктов восстановления ацетилена; аналогичный результат показывает хроматографический анализ газовой фазы реакции без FeMoco.

Данные о стереоселективности реакции (Рис. 14), также как и результаты исследования скорости реакции от концентрации тиофенола, подтверждают опосредованный характер протонирования координированного на FeMoco ацетилена.

Система с Zn/Hg в качестве восстановителя

Зависимость начальной скорости образования этилена от концентрации субстрата описывается гиперболической функцией, Кт = 0.045 атм С2Н2. Количество этана в продуктах реакции восстановления С2Н2 зависит от давления субстрата: в области низких давлений С2Н2 0.009+0.06 атм (от 7 до 45 мм рт. ст.) образуется значительное количество этана (до 17 % от общего количества продуктов), причем с ростом давления субстрата наблюдается линейное падение доли этана в продуктах реакции.

При изучении стереоспецифичности реакции восстановления C2D2 методом ИК-Фурье-спектроскопии было найдено, что единственным продуктом восстановления C2D2 в этой системе является tyuc-1,2-дидейтероэтилен. Транспродукта, в отличие от системы с амальгамой европия, не наблюдается совсем. Таким образом, стереоспецифичность реакции превращения ацетилена в системе с Zn/Hg практически совпадает с ситуацией в классической нитрогеназе: единственным продуктом является цис- 1,2-C2D2H2, H-D обмена координированного C2D2 с Н+ из среды реакции не происходит.

Наиболее интересной реакцией, наблюдаемой в системе с Zn/Hg, была обнаруженная нами реакция каталитического восстановления ацетона (Рис. 15) с образованием метана и этанола. СО и ацетилен ингибируют эту реакцию, причем ацетон и ацетилен являются конкурирующими субстратами и, соответственно, взаимно ингибируют восстановление друг друга. В системе с Eu/Hg восстановления ацетона не происходит, что объяснено слишком высоким уровнем восстановления

Г1 C,H3D "^ллЛМЛГ^ 1

943 см'

__

2

- —

1000 950 900 850 800

кластера РеМосо, который обеспечивает амальгама европия, не способствующим координации электрон-донорного субстрата ацетона на кофакторе.

До наших исследований не было никаких данных о том, является ли ацетон субстратом фермента нитрогеназы. Мы провели качественную

нитрогеназную реакцию с участием ацетона в качестве субстрата (в атмосфере аргона) и показали, что нитрогеназа, как и выделенный РеМосо, способна восстанавливать ацетон с образованием метана. Этот результат важен не только потому, что он обнаруживает новый субстрат нитрогеназы, но и потому, что подтверждает плодотворность используемого нами подхода — изучения закономерностей нитрогеназного катализа на отделенном от белка кофакторе - для понимания механизма восстановления субстратов в активном центре фермента.

Ингибирование каталитического восстановления ацетилена оксидом углерода (II)

Изучение "взаимоотношений" различных субстратов и ингибиторов на отделенном от белка РеМосо дает важную дополнительную информацию о химии активного центра нитрогеназы, о его редокс состояниях, о свойствах координирующих центров кластера. С этой точки зрения очень интересно изучение ингибирующего действия СО, который, будучи изоэлектронным основному субстрату нитрогеназы азоту, не восстанавливается ферментом, но является ингибитором восстановления практически всех субстратов нитрогеназы. Мы нашли, что СО взаимодействует с выделенным из фермента РеМосо, восстановленным амальгамами цинка или европия. Найдено, что в системе с СО обратимо ингибирует

реакцию восстановления ацетилена до этилена с К( = 0.05 атм СО.

В системе 'с ЕиД^ ингибирование СО образования двух продуктов восстановления С2Н2 различно: ингибирование образования этилена смешанного или конкурентного типа, К( = 0.003 атм СО, тогда как в случае образования этана можно

Время, с

Рис. 15. Образование метана при восстановлении ацетона амальгамой цинка, катализатор РеМосо. Условия реакции: [РеМосо] = 0.5х10"5 М; 2п(^) (4.27М) 0.7 мл; [РЬБН] = 0.012 М; растворитель -ДМФА (4 мл); [(СН3)2СО] = 0.2 М; 21°

говорить о неполном конкурентном ингибировании, А",- = 0.006 атм СО. Это означает,

Рис. 16, Зависимость начальных скоростей образования этилена и этана от давления СО.

(слева); Справа - ингибирование образования этилена (координаты Диксона): Квадратики - р С2Н2 0.07 атм; • - р С2Н2 0.2 атм. Условия реакции: [FeMoco] = О.бхЮ"5 М; Eu(Hg) (0.35М) 0.5 мл; [PhSH] = 0.012 М; ДМФА (4 мл); давление С2Н2 0.07 атм; СО;21°С

что присоединение к FeMoco молекулы (или молекул) СО оказывает негативное влияние как на связывание ацетилена с кластером, так и на распад катализатор-субстратного комплекса. Константы и тип ингибирования были определены путем обработки экспериментальных данных в координатах Диксона и координатах «обратное парциальное ингибирование / обратное давление СО». Более сильное ингибирующее влияние СО на образование С2Н4 приводит к тому, что при давлении СО 0.05 атм доля С2Н6 в продуктах реакции составляет более 50% (Рис. 16).

Изменение продуктспецифичности центров восстановления ацетилена под действием СО объяснено некоторой стабилизацией промежуточного комплекса (FeMoco*C2H2) при одновременной координации СО на каталитическом кластере, в результате чего доля продукта многоэлектронного восстановления - этана - растет. Полученные результаты дополнительно указывают на то, что на восстановленном амальгамой европия кластере FeMoco одновременно могут быть заняты субстратами и (или) ингибиторами несколько активных центров.

Продуктов восстановления СО, метана и метанола, найдено не было; по-видимому, FeMoco вне белка не катализирует восстановление СО. Также, как и в Мо-содержащей нитрогеназе, СО является лишь ингибитором, но не субстратом.

Ингибирование каталитического восстановления ацетилена молекулярным азотом

Сравнение описанных выше кинетических зависимостей реакции восстановления С2Н2, катализируемой FeMoco вне белка, с аналогичными данными для нитрогеназной системы in vitro показывает, что наблюдаемые скорости реакции, состав продуктов, общие закономерности очень похожи для столь различных систем с

0.00 0.01 0.02 0,03 0,04 СО, атм

-0,01 0.00 0,01 0,02 0,03 0,04 СО, ятм

участием РеМосо в качестве катализатора. То есть, способность РеМосо катализировать восстановление С2Н2 практически сохраняется при отделении его от белковой матрицы.

Была проведена работа по поиску продуктов восстановления азота, аммиака или гидразина, в системе с Еи/Ь^ с использованием изотопа |5Ы. В результате тщательных экспериментов было показано, что восстановления азота, катализируемого РеМосо вне белка, даже стехиометрического, не происходит в тех условиях, где активно восстанавливается С2Н2.

Хотя образование аммиака

1,0-

0,9-

f 0,8-§ 0,7-

0,60,5

й

Ж сх

ж 8.

из молекулярного азота - процесс сложный и многостадийный, но начинаться он обязательно должен с восстановления РеМосо и координации молекулы N2 на восстановленном кофакторе. Чтобы определить, способен ли отделенный от белка РеМосо хотя бы обратимо координировать N2, мы исследовали влияние азота на кинетику катализируемого

РеМосо восстановления

ацетилена. Было найдено, что молекулярный азот является ингибитором каталитического восстановления ацетилена в системе с Еи/Н§.

Полученные результаты приведены на Рис. 17 вместе с данными по ингибированию азотом восстановления ацетилена различными нитрогеназами.

Видно, что количественный эффект замедления реакции восстановления СгН2 в присутствии N2 практически одинаков для всех приведенных систем, как белковой, так и небелковой природы.

С помощью обработки экспериментальных данных в координатах Диксона (Рис. 18) было показано, что ингибирование молекулярным азотом образования как этана, так и этилена носит конкурентный характер, К, = 0.5 атм N2 для обоих продуктов. То есть, N2 и С2Н2 как лиганды конкурируют за связывание на одном и том же координационном месте на восстановленном кластере РеМосо. Как и в

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Рис. 17. Ингибирование молекулярным азотом восстановления С2Н2 до этилена в различных системах с участием FeMoco ■ - FeMoco вне белка с Eu/Hg;

• - нитрогеназа A. vinelandii, Rivera-Ortiz J. 1975; о - нитрогеназа A. vinelandii, Kim С.-Н. 1995;

* - мутант a-Gln-195 A. vinelandii, Kim С.-Н. 1995; w(N2) - скорость реакции восстановления С2Н2 в системе {N2 + С2Н2 + Аг}

w(Ar) - то же в отсутствие азота (в системе {С2Н2 + Аг})

Условия реакции: [FeMoco] = 0.7х 10"! М; ДМФА (4 мл); Eu(Hg) (0.35 М) 0.5 мл; [PhSH] = 0.012 М; давление С2Н2 0.0145 атм (во всех сравниваемых системах)

нитрогеназных системах in vitro, наблюдается снятие ингибирования азотом при больших давлениях субстрата.

Факт наблюдения ингибирующего действия азота очень важен, так как он впервые определенно показывает возможность взаимодействия молекулярного азота с кофактором, выделенным из белковой матрицы и восстановленным обычным химическим восстановителем.

Рис. 18 Ингибирование молекулярным азотом катализируемого РеМосо восстановления ацетилена амальгамой европия (координаты Диксона): слева-ингибирование образования этилена, справа - этана

Влияние рКа и химической природы реагента на скорость восстановления ацетилена, катализируемого РеМосо вне белка

Нами было установлено, что РеМосо и вне белкового окружения способен эффективно координировать молекулярный азот. При этом продуктов восстановления азота в условиях реакции найдено не было. Причиной этого могла быть либо недостаточная основность координированной молекулы N2, либо неподходящий по кислотности и(или) химической природе протонирующий агент. Таким образом, пытаясь найти ответ на один из важных вопросов, а именно, может ли отделенный от белка кластер РеМосо катализировать восстановление азота в чисто химической системе, а также для получения информации о механизме протонирования субстрата по ходу восстановления, мы провели изучение влияния характера протонирующего агента на реакцию восстановления ацетилена с участием РеМосо вне белка.

Поскольку из экспериментов по зависимости величины восстановительного потенциала электрода на каталитическую реакцию восстановления С2Н2 в присутствии РеМосо (см. ниже) мы нашли, что чем меньше по абсолютной величине восстановительный потенциал электрода, тем относительно важнее кислотность протонирующего агента, систематические опыты по влиянию рКа на реакцию проводили с амальгамой цинка в качестве восстановителя, ожидая, что эффект влияния кислотности реагента будет в этом случае более значительным.

В качестве потенциальных доноров протонов для образования С2Н4 или С2Н6 из С2Н2, были изучены 12 соединений. Их строение и величины рКа в Н20 и ДМФА, приведены в Таблице 1. Необходимыми требованиями при выборе являлись растворимость в ДМФА и значения рЛ"а в ДМФА > 5 (в более кислой среде кофактор необратимо разрушается).

Таблица 1. Значения рпротонирующих агентов в растворителях

№ соединение ptf, вН206 РА', в ДМФА7

молекулярная формула название

1 тиофенол 6.6 10.7 •

2 F пентафтортиофенол 2.7 6.8

3 фенол 9.95 15.4

4 /^N HNU имидазол 14.5 18.6

5 ©LV H 2-меркаптобензимидазол ~8 -13

6 cooh ¿h2 ho—c—cooh ¿hi cooh лимонная кислота 3.13 4.76 6.40 10.6 13.3 15.7

7 COOH COOH щавелевая кислота 1.2 4.2 8.6 16.6

8 a: пирокатехин 9.2 -15

9 C18H38COOH стеариновая кислота 4.9 -13

10 Or- бензойная кислота 4.2 12.3

11 H3P04 ортофосфорная кислота 2.1 -10

6 March J. Advanced Organic Chemistry, 3rd ed., New York.: John Wiley & Sons, 1985, P. 1087-1136.

7 Izutsu K. Acid-base dissociation constants in dipolar aprotic solvents. Oxford.: Blackweli Scientific, 1990.

7.2 12.3 -15 -20

12 Н20 вода 15.7 -32

Выбор химической природы соединений определялся строением лигандного окружения кофактора в белке при протекании реакции in vivo и in vitro (тиофенол, имидазол и их аналоги, вода) и необходимостью «охватить» в исследовании различные классы соединений.

Для каждого из приведенных соединений [Н А"] изучены скорости накопления С2Н4 и С2Н6 в системе {FeMoco + Zn/Hg + С2Н2 + [Н+А"]} в ДМФА. В данных условиях вода, ортофосфорная и монокарбоновые кислоты (бензойная и стеариновая), а также фенол оказались неактивными. Остальные 7 соединений в системе активны, причем, значительное изменение кислотности (от 8 до 19) и различная химическая природа (при условии соблюдения возможности образования координационной связи) применяемых соединений слабо влияют на скорости накопления продуктов реакции.

Для объяснения этого факта мы привлекли результаты всех работ, проведенных на выделенном из белка кофакторе, литературные данные по изучению влияния рН среды на нитрогеназную реакцию in vitro, а также, теоретические расчеты механизма протонирования в белке. Совокупность экспериментальных данных, полученных для FeMoco вне белка, указывает на сложный характер протонирования субстрата. По-видимому, для осуществления реакции восстановления субстратов на FeMoco необходимо, чтобы источник протонов имел некоторое пороговое значение кислотности, при котором происходит протонирование мостикового атома серы с дальнейшим переносом водорода на субстрат. Интересно, что в области значений рКа соединений от 8 до 19 независимость от кислотности протонирующего агента можно объяснить и тем, что для кофактора, как выделенного из белка, так и в составе фермента, стадия переноса протона не является лимитирующей. При переходе же к более «кислому» соединению - пентафтортиофенолу - наблюдается смена лимитирующей стадии (см. ниже).

Влияние потенциала внешнего донора электронов на закономерности катализа восстановления C2Ü2 в присутствии активного центра нитрогеназы (FeMoco), выделенного из фермента

Для определения лимитирующей стадии процесса было исследовано влияние изменения потенциала внешнего донора электронов на параметры каталитического восстановления С2Н2 до этилена и этана в присутствии в качестве доноров протонов тиофенол а,/?/<"„ (Н20) 6.6, и пентафтортиофенола, рКа (Н20) 2.7.

Протонирующие агенты - тиофенол или вода

На рис.19 представлена экспериментально полученная зависимость скорости восстановления ацетилена до этилена от потенциала катода из амальгамы цинка. Видно, что с увеличением отрицательного потенциала рабочего электрода наблюдается резкое возрастание скорости образования этилена; при этом в широком диапазоне значений потенциалов скорость реакции экспоненциально зависит от потенциала катода. Зависимость спрямляется в полулогарифмических координатах (рис. 19, вставка), то есть, подчиняется уравнению Тафеля, связывающему скорость электрохимической- реакции с потенциалом электрода. Такая зависимость скорости реакции от потенциала катода говорит о том, что замедленной стадией последовательности реакций является электрохимическая стадия, т.е. перенос электронов через границу раздела фаз от катода на кластер РеМосо. Аналогичные экспоненциальные зависимости скорости реакции образования С2Н4 от потенциала рабочего электрода получены и при катодной поляризации электрода из чистой ртути, в присутствии и тиофенола, и Н20.

Помимо величины катодного потенциала,

материал электрода также оказывает заметное влияние на скорость и механизм реакции. На катодах из разных материалов (чистая ртуть,

0,14-

0,12-

0,10-

или одинаковом задаваемого равного, потенциалу

Еи/1^) при значении потенциала, например, амальгамы

о

европия (-1.4 В отн. н.в.э.), и одном и том же протонирующем агенте -тиофеноле, абсолютные

значения скорости накопления этилена на амальгаме европия примерно в 20 раз выше (а накопления этана даже в 30 раз выше), чем на катоде из чистой ртути с- тем же потенциалом, и в 10 раз - чем на катоде из амальгамы цинка при том же значении заданного потенциала.

Зависимость скорости реакции восстановления С2Н2

0,08-

0,06-

0,04"

0,02"

0,00

1,05 1,20 1,35

1,50 1,65 1,80 1,95 -£! В отн. Ад/АдС!, КС!ии ■£! Мчъ. Ад/АдС1, КС|

Рис. 19. Зависимость скорости накопления С2Н4 от заданного потенциала рабочего электрода; на врезке -преобразование зависимости в координатах Тафеля; Условия реакции: электрохимическая ячейка: [РеМосо]=1.210~5 М; [РЬ8Н]=1.2 10~2 М; электрод гп/Щ (2 мас.%), 2 мл; площадь поверхности катода 3.1 см ; электрод сравнения А§/А§С1/КС1(нас.); объем католита 6.5 мл; 20 °С;РС2Н2 100 мм Нё

от температуры снимали в потенциостатическом режиме при заданном потенциале рабочего электрода (Zn/Hg) Е = -1.7 В. Мы нашли, что скорость накопления и этилена, и этана возрастает экспоненциально с увеличением температуры в интервале от 13 до 30°С. Выше температуру не поднимали, так как ранее мы установили, что FeMoco обладает ограниченной термической устойчивостью, и при температуре 40°С в значительной степени разрушается. Рассчитанная по уравнению Аррениуса эффективная энергия активации восстановления ацетилена с образованием этилена составляет 18.3 (±1.5) ккал/моль, а до этана - примерно в полтора раза меньше, 12.8 (±2) ккал/моль. В связи с этим относительный выход этана заметно падает с повышением температуры.

Использование пентафтортиофенола вместо тиофенола приводит не только к увеличению примерно в пять раз скорости реакции по этану и в три раза по этилену, но и к изменению кинетических зависимостей. Вначале при увеличении потенциала катода от Е = - 1.07 В до Е = - 1.2 В скорость увеличивается с ростом потенциала. Затем, начиная с этого значения, и вплоть до Е = -1.75 В, скорость реакции перестает зависеть от потенциала. После выключения тока стационарный потенциал реакционного раствора составляет Е = - 1.15 В. По-видимому, это потенциал редокс пары FeMoco(s.r/FeMocO(red)- При этом значении потенциала происходит восстановление катализатора до субстратсвязывающего состояния. При напуске воздуха в систему, т.е. при необратимом окислении FeMoco, потенциал раствора падает до Е = -1.07 В. Интересно, что в этом случае скорости накопления, как этана, так и этилена, практически не зависят от материала катода: поляризация чистой ртути и амальгамы цинка дает практически одинаковые скорости при одинаковых значениях потенциала. Независимость скорости восстановления от величины катодного потенциала и материала электрода говорит о том, что перенос электрона от катода не является лимитирующей стадией в этом случае. Скорость реакции растет с повышением температуры от 15 до 30°С. Температурная зависимость подчиняется уравнению Аррениуса. Эффективная энергия активации для этой системы, измеренная при заданном потенциале катода Е = - 1.3 В составляет 32 (±4) ккал/моль для обоих продуктов.

Таким образом, мы показали, что в зависимости от кислотности применяемого донора протонов, катализируемое FeMoco восстановление тройной связи может лимитироваться как переносом электрона от внешнего . донора, так и внутримолекулярными перегруппировками в координационной сфере металлокомплекса с субстратом и донором водорода.

Проведенное исследование показало, что существует целый ряд сходных черт между процессами превращения ацетилена разнообразными нитрогеназами и химическими системами с участием отделенного от белка FeMoco. Сходны особенности координации субстратов, подачи на субстрат электронов от внешнего восстановителя и протонов от донора Н+, механизм распада комплекса катализатор-субстрат с образованием продуктов, стереоспецифичность реакции восстановления

С202, наличие в обоих случаях нескольких одновременно работающих взаимозависимых активных центров на восстановленном РеМосо, и некоторые другие особенности.

Проведено сравнение количественных параметров (Кт, активностей, доли этана в продуктах) реакции восстановления ацетилена с участием РеМосо в качестве катализатора вне белка и в составе разнообразных белковых систем. Также проведено количественное сравнение каталитического поведения РеМосо вне белка и в составе фермента по отношению к восстановлению С2Н2 в присутствии N2 и СО. Сделан вывод, что по ряду показателей (закономерности восстановления ацетилена, характер ингибирования СО, выделение водорода и т.д.) каталитическое действие кофактора в небелковых условиях аналогично его действию в составе фермента. То есть, каталитический кластер РеМосо проявляет высокую степень самодостаточности и способен успешно вести реакции восстановления некоторых субстратов нитрогеназы (С2Н2, Н+), находясь вне белка.

На основании полученных в работе результатов сделаны следующие заключения: извлечение РеМосо из белковой матрицы приводит к потере им способности катализировать восстановление азота, оставляя почти неизменной возможность и особенности восстановления ацетилена и протонов и способность обратимо координировать молекулу азота. На восстановленном амальгамой европия кластере РеМосо в ДМФА активны к субстратам и ингибиторам (С2Н2, Ы2, СО) три центра. На одном из них, самом активном, может координироваться и восстанавливается С2Н2 с К„, = 0.006 атм, а также координироваться без восстановления N2 и (или) СО. Центры 2 и 3 гораздо менее активны (Кт по ацетилену более чем на порядок превышает Кт для центра 1), и могут связывать С2Н2 и (или) СО. Данные по ингибированию молекулярным азотом восстановления ацетилена, катализируемого выделенным из фермента РеМосо в ДМФА, причем практически с теми же количественными параметрами, что и в ферментных системах (и в нативной нитрогеназе, и в мутантах), позволяют заключить, что кластер РеМосо с обязательностью является сорбционным участком активного центра фермента (отвечает за комплексообразование субстрата с ферментом; определяет специфичность действия катализатора). Каталитическим же участком, где происходит перераспределение электронных плотностей и перенос групп в химическом акте катализа, или, иначе говоря, активным центром фермента следует считать кластер РеМосо с окружающими его аминокислотными остатками, стабилизирующими интермедиаты каталитического цикла и участвующими в передаче протонов нужной (оптимальной) кислотности на координированный азот.

В пятой главе приведены результаты кинетического исследования восстановления С2Н2 при катализе К/^Мо комплексом и влияния СО и N2 на этот процесс в сравнении с аналогичными данными, полученными для системы с участием РеМосо вне белка.

В работе А.Е. Шилова с соавторами8 была открыта азотвосстанавливающая система на основе полиядерных комплексов молибдена. На данный момент эта система является единственной неферментативной системой, способной каталитически, со скоростями, сравнимыми с нитрогеназой, восстанавливать N2 при атмосферном давлении и комнатной температуре. Реакция осуществляется в среде метилового спирта с небольшими добавками воды, которая, по-видимому служит донором водорода при образовании аммиака и(или) гидразина. Восстановителем может служить амальгама натрия, амальгама европия или катод с заданным потенциалом, равным потенциалу ЫаЛ^.

Мы показали9, что данные системы на основе полиядерных комплексов молибдена могут катализировать восстановление и С2Н2, причем, гораздо более слабыми, чем амальгама натрия восстановителями, например, амальгамой цинка, правда, в присутствии более кислого донора водорода, тиофенола. В данной главе приведены результаты изучения закономерностей этой реакции с целью проведения сравнения механизма одной и той же реакции в одинаковых условиях с участием синтетических азотфиксирующих кластеров и природного кластера РеМосо.

Были изучены, в частности, зависимости скоростей накопления этилена и этана от концентраций катализатора и субстрата, параметры ингибирования данной реакции монооксидом углерода и молекулярным азотом, а также исследовано влияние потенциала внешнего донора электронов на закономерности данной реакции в присутствии доноров протонов различной кислотности. Изучены температурные зависимости скорости этих реакций.

Показано, что на полиядерном М§-Мо комплексе, как и на восстановленном амальгамой европия РеМосо, активны к субстратам и ингибиторам несколько взаимозависимых координирующих центров. СО заметно менее эффективно, чем при катализе РеМосо ингибирует реакцию восстановления ацетилена, хотя, как мы нашли, тип ингибирования в обеих системах - смешанный: СО координируется на нескольких центрах кластера и влияет как на стадию комплексообразования С2Н2 с восстановленным кластером, так и на стадию разложения катализатор-субстратного комплекса с образованием продуктов.

Исследование температурных зависимостей скоростей каталитических реакций в присутствии Мц-Мо-кластера показало, что, как и РеМосо, этот кластер как катализатор благоприятствует осуществлению многоэлектронных окислительно-восстановительных каталитических процессов: энергии активации образования продуктов 4-х электронного восстановления субстрата заметно меньше, чем продуктов 2-х электронного восстановления, что крайне важно для восстановления азота в мягких условиях.

Mg-Mo кластер, в отличие от РеМосо, эффективно катализирует восстановление молекулярного азота. Ацетилен является очень мощным ингибитором

' Shilov А. Е., Pure & Appl. Chem., 1992, v. 64, p. 140

9 Т. А. Баженова, M. А. Баженова, Г. Н. Петрова, А. К. Шилова, А. Е. Шилов, Изв. АН. Сер. хим., 1998, 890

этой реакции: К, ~ 0.009 атм С2Н2 при использовании амальгамы натрия в качестве восстановителя. При этом мы не наблюдали ингибирования восстановления ацетилена азотом, что было найдено для системы с участием природного кластера в качестве катализатора. Причиной этого, по-видимому, является то, что система с участием Mg-Mo кластера намного более активна по отношению к ацетилену, чем к азоту (для Na/Hg в качестве восстановителя различие в константах Михаэлиса Кт составляет четыре порядка).

Ингибирование ацетиленом восстановления азота в системе с участием MgMo комплекса

Высокие скорости образования N2H4 и NH3 наблюдаются в так называемой «полной» системе, когда в качестве восстановителя используется амальгама натрия, и присутствуют сокатализаторы - фосфатидилхолин и трибутилфосфин. В этих условиях ацетилен является очень хорошим субстратом с константой Михаэлиса Кт около 3-10"4 атм С2Н2. Запределивание же скорости реакции по концентрации азота наблюдается при давлениях N2 в несколько десятков атмосфер, а рассчитанное значение К„ для азота из данных по ингибированию восстановления азота ацетиленом составило порядка 25 атм. Не удивительно, что ацетилен эффективно ингибирует восстановление азота в этих условиях.

На рис. 20 приведены

зависимости

скорости

восстановления азота (при двух разных значениях давления Ы2) от концентрации ацетилена в газовой фазе. Прямые пересекаются на оси абсцисс «давление ингибитора» в области отрицательных значений, что свидетельствует о протекании ингибирования реакции по

неконкурентному

типу.

Рис. 20. Ингибирование восстановления N2 ацетиленом в «полной» системе при pN2 = 400 (]), 760 мм рт. ст. (2); данные в координатах Диксона

Условия реакции:[ MgMo] = 8.3-10~бМ; [фосфатидилхолин] = 3-10"4 М; [ВиэР] = 5-Ю"3 М; [NaOMe] = 6-10'3 М; [Bu4NBr] = 0.1 М; МеОН; Na/Hg (1.07 М); С2Н2; 21 "С

Найденное значение константы ингибирования (К,) составило 0.009 атм С2Н2.

v-з

Сравнение с аналогичными данными для нитрогеназной системы in vitro показывает, что в природной системе и лучшей ее функциональной модели сродство каталитического кластера к ацетилену больше, чем к азоту на

несколько порядков, при этом С2Н2 неконкурентно ингибирует восстановление N2 с близкими значениями констант ингибирования (K¡ = 0.008 атм С2Н2 в случае

• , 10ч

нитрогеназнои системы in vitro ).

В шестой главе описаны результаты исследования влияния сильного магнитного поля на нитрогеназную реакцию in vitro, позволившие определить лимитирующие оборот стадии реакции и предложить объяснение излома на аррениусовской зависимости нитрогеназной реакции. (Работа выполнена совместно с Факультетом физики и астрономии Университета г. Ноттингема, Великобритания).

Изучая кинетические особенности моделирующих действие фермента нитрогеназы систем, как на основе выделенного из белка кластера FeMoco, так и синтетических кластеров молибдена, мы нашли, что лимитирующей стадией процесса восстановления субстрата является перенос электрона от внешнего донора на каталитический кластер. Что же касается самой нитрогеназной системы, как in vitro, так и in vivo, то к настоящему времени нет единого мнения о природе скорость определяющей стадии этого природного процесса. Доминирующая в литературе точка зрения, что лимитирует процесс реакция диссоциации белкового комплекса на компоненты после каждого акта межбелкового переноса электрона, не кажется нам верной, так как в последнее время появилось много новых данных по стационарной кинетике нитрогеназной реакции, противоречащих такому утверждению.

О 2 4 6 8 10 12 14 16- 18

Магнитное поле, Т

Рис. 21. Влияние магнитного поля на стационарную скорость восстановления С2Н2 нитрогеназой in vitro; вставка показывает скорость накопления продукта в магнитном поле (В) (W(B)) относительно скорости без наложенного магнитного поля (В=0) (W(0)) при различных температурах

'"Rivera-Ortiz J. М., R. Н. Burris. Interactions among substrates and inhibitors of nitrogenase H J. Bacterio!. 1975. V.123. № 2. P. 537-545.

Мы высказали предположение, что исследование влияния сильных магнитных полей на нитрогеназную реакцию могло бы дать новую информацию относительно механизма функционирования фермента. Поскольку движущей силой процесса является серия дистанционных, сопряженных с гидролизом АТФ, электронных переносов между кластерами металлов, мы полагаем, что скоростьопределяющая стадия оборота нитрогеназы связана, скорее всего, с одной из стадий гидролиза АТФ или со стадией сопряженного с гидролизом межкластерного переноса электрона. Если электронный перенос определяет общую скорость процесса, сильное магнитное поле может повлиять на реакцию". Если же, либо стадия диссоциации нитрогеназных белков, либо какая-то из стадий гидролиза АТФ лимитирует скорость оборота нитрогеназы, мы не увидим влияния магнитного поля на этот процесс.

Измерения проводили на сверхпроводящем магните OXFORD Instrument на Факультете физики и астрономии Университета г. Ноттингема в Великобритании. В данном магните генерируются поля от 0 до 17.5 Тесла и возможно поддержание температур от очень низких до комнатной и выше.

Рис. 21 показывает эффект влияния магнитного поля на нитрогеназную активность по

восстановлению ацетилена in vitro: скорость реакции монотонно уменьшается с увеличением поля. Мы нашли, что эффект является температурно-зависимым. Магнитное поле

ингибирует накопление продукта восстановления при температурах 20°С и выше. Когда реакция осуществляется при 15°С или более низких температурах при прочих равных условиях приложенное магнитное поле не оказывает влияния на нитрогеназную активность (Рис. 21, вставка). Эффективные энергии активации (Еакт) для этих реакций были рассчитаны из зависимостей скорости от температуры (см. Рис. 22) согласно уравнению Аррениуса. Зависимость показывает резкое изменение в энергии активации реакции: было найдено, что ^„составляет около 15 ккал моль'1 и

11 Ferraudi, G., Magnetokinetic effcct in outer-sphere electron-transfer reactions: on the role of spin-orbit and hypcrfine coupling // Molecular Physics. 1997. 91. №2. C. 273-279.

7,50 7,25 7,00 6,75 6,50 6,25 6,00 5,75 5,50

E = 15 kcal/mol

Л.

E ,= 30 kcalfrnol

act s^

3,36 3,39 3,42 3,45 3,48 3,51 3,54 1/T X 1000

Рис. 22. Зависимость специфической активности нитрогеназной реакции от температуры (координаты Аррениуса) в магнитном поле 10 Т и без поля, 0 Т

30 ккал моль"1 для температур выше 20°С и ниже 15°С соответственно. Величина Еакт не зависит от приложенного магнитного поля в обоих температурных интервалах (Рис. 22).

Из всех многочисленных реакций, осуществляющихся в системе до образования продукта, только перенос электрона включает изменение спинового состояния подсистем донора и акцептора и, таким образом, приводит к изменению магнитных характеристик компонентов системы. Это значит, что магниточувствительной стадией, которую мы наблюдаем при температурах выше 20°С, является стадия дистанционного электронного переноса, чувствительного к сильному магнитному полю; это или межбелковый перенос от Fe белка на MoFe белок (в условиях low electron flux) или внутрибелковый перенос от Р кластера на кофактор (в условиях high electron flux). При температурах ниже 15°С белковая динамика, а именно, конформационные изменения, вызванные связыванием и гидролизом АТФ, контролируют скорость оборота нитрогеназы. Эффект объяснен влиянием магнитного поля на скорость интерконверсии различных спиновых состояний восстановленного железо-серного кластера Fe-белка, которые имеют различную активность в переносе электрона с Fe белка на MoFe белок нитрогеназы.

Проведенное изучение влияния магнитного поля на нитрогеназную реакцию in vitro позволило выявить следующие особенности нитрогеназного катализа: а) различные кинетические события могут лимитировать общую скорость каталитического цикла в разных условиях проведения реакции; б) один из двух дистанционных межкластерных электронных переносов включен в лимитирующую стадию процесса восстановления субстрата при физиологических температурах (выше 20°С); в) излом в температурной зависимости нитрогеназной реакции связан с изменением скорость определяющей стадии при этой температуре.

ВЫВОДЫ

1 На основании кинетических исследований предложен механизм восстановления азота системами на основе соединений железа с литийорганическими восстановителями. Показано, что лимитирующей стадией реакции является накопление соединения нуль-валентного железа, реагирующего с азотом с образованием диазотного комплекса, содержащего реакционно способную молекулу азота.

2 Впервые получены и охарактеризованы рентгеноструктурным анализом стабильные бинарные железоорганические комплексы двухвалентного железа и ряд неописанных ранее железо-литиевых комплексов с субстратами и ингибиторами нитрогеназы.

3 Экспериментально показано, что содействие соединений лития восстановлению азота комплексами железа связано с тем, что он образует смешанные комплексы переходного и непереходного металла, в которых литий равным образом принимает участие в активации N2 за счет множественной координации молекулы азота.

4 Впервые найдены условия и показана принципиальная возможность вовлечения железо-молибденового кофактора нитрогеназы (FeMoco), отделенного от белковой матрицы, в реакции с субстратами нитрогеназы в чисто химических условиях.

5 Показано значительное сходство основных закономерностей реакций каталитического восстановления С2Н2 и ингибирования этого процесса оксидом углерода (II) и молекулярным азотом для нитрогеназы /я vitro и химических систем с участием выделенного из белка FeMoco. Найдено, что наблюдаемые особенности поведения FeMoco в изучаемых реакциях определяются его составом и структурой, и проявляются им независимо от природы (белковой или небелковой) - восстановителя и среды реакции; установлено, что восстановленный FeMoco и вне белкового окружения способен обратимо координировать молекулярный азот.

6 На основе данных о каталитическом восстановлении ацетона на отделенном от белка FeMoco найден новый субстрат нитрогеназы: показано, что нитрогеназа in vitro, как и FeMoco вне белка, способна восстанавливать ацетон с образованием метана.

7 Показано, что в зависимости от кислотности протежирующего агента, лимитирующей стадией каталитического восстановления С2Н2 на выделенном из белка FeMoco может быть как перенос электрона от катода на каталитический кластер, так и стадия переноса протона в катализатор-субстратном комплексе.

8 Изучена кинетика восстановления С2Н2 и ингибирование этого процесса N2 и СО при катализе синтетическим MgMo комплексом в условиях, аналогичных для системы на основе экстрагированного из фермента активного центра нитрогеназы (FeMoco). Сравнение основных параметров реакций показало значительное сходство механизмов каталитического восстановления субстратов в присутствии природного и синтетического кластеров.

9 Исследованы температурные зависимости скоростей реакций, катализируемых FeMoco вне белка и MgMo комплексом. Показано, что оба типа кластеров как катализаторы благоприятствуют осуществлению многоэлектронных окислительно-восстановительных каталитических процессов: энергии активации образования продуктов 4-х электронного восстановления субстрата заметно меньше, чем продуктов 2-х электронного восстановления, что крайне важно для восстановления азота в мягких условиях.

10 Впервые предложенное и реализованное изучение влияния магнитного поля на нитрогеназную реакцию in vitro позволило выявить следующие особенности нитрогеназного катализа: а) различные кинетические события могут лимитировать общую скорость каталитического цикла в разных условиях проведения реакции; б) в лимитирующую стадию процесса восстановления субстрата при физиологических температурах (выше 20°С) включен дистанционный межкластерный электронный перенос; в) излом на

температурной зависимости нитрогеназной реакции связан с изменением скорость определяющей стадии при этой температуре.

Основное содержание диссертации опубликовано в статьях, приведенных ниже.

1 Shilov А.Е., Shilova А.К., Kvashina E.F., Vorontsova T.A. Isolation of a Binuclear complex intermediate in the reaction of molecular nitrogen with titanium compounds // J. Chem. Soc. Chem. Communs. 1971. P. 1590

2 Бройтман M.О., Воронцова Т.А.. Шилов А.Е. Восстановление молекулярного азота в системе FeCl3+LiPh+N2 // Кинетика и катализ. 1972. Т. 13. №1. с. 61-66.

3 Воронцова Т.А.. Шилов А.Е. О механизме действия аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) в биологической фиксации азота и в модельных системах // Кинетика и катализ. 1973. Т. 14. №5. С. 1226-1228.

4 Khrushch А.Р., Vorontsova Т.А.. Shilov А.Е. Role of acids in reduction of acetylene catalyzed by molybdenum-thiol complexes // J. Amer. Chem. Soc. 1974. V. 96. №15. P. 4987-4989.

5 Shilov A.E., Shilova A.K., Vorontsova T.A. Molybdenum complexes as catalysts for the reduction of molecular nitrogen in protic media // React. Kinet. Catal. Lett. 1975. V.3, №2. P. 143-148.

6 Хрущ А.П., Воронцова T.A.. Шилов А.Е. О механизме образования этана при восстановлении ацетилена в присутствии молибден-тиольных катализаторов // Кинетика и катализ. 1975. Т. 16. №6. С. 1618-1619.

7 Баженова Т.А.. Иоффе М.С., Качапина JI.M., Лобковская P.M., Шибаева Р.П., Шилов А.Е., Шилова А.К. Строение молибден-карбонильных комплексов, образующихся в системе Ti(OH)3 + M0OCI3 + СО // Журнал структурной химии. 1978. Т. 19. №6. С. 1047-1062.

8 Качапина J1.M., Кичигина Г.А., Баженова Т.А. Резонансное комбинационное рассеяние комплексов молекулярного азота с дициклопентадиенильными соединениями трехвалентного титана // Оптика и спектроскопия. 1980. Т. 48. №2. С. 250-255.

9 Баженова Т.А.. Грюзель М., Лени Ж., Шилов А.Е., Шилова А.К. Кинетика и механизм восстановления азота в системе FeCl3 + LiPh в присутствии галогенидов лития И Кинетика и катализ. 1981. Т. 23. №6. С. 1457-1464.

10 Bazhenova Т.А.. Shilova А.К., Deschamps Е., Gruselle M., Leny G., Tchoubar В. Obtention d'un complexe de fer(II) ne comportant que des ligands a, le bis-lithium tetranaphtylferrate, et sa transformation par action de C3H7Li en un complexe reducteur de Nг11 J. Organomet. Chem. 1981. V. 222. P. C1-C4.

11 Баженова T.A.. Лобковская P.H., Шибаева Р.П., Шилов А.Е., Шилова А.К., Грюзель М., Лени Ж., Чубар Б. Строение промежуточного активного комплекса в азотфиксирующей системе FeCl3 + LiPh // Кинетика и катализ. 1982. Т. 24. №1. С. 246-247.

12 Bazhenova T.A.. Lobkovskaya R.M., Shibaeva R.P., Shilova A.K., Shilov A.E. Structure of the naphthyl iron(II) complex formed in the reaction of FeCl3 and Ci0H7Li II J. Organomet. Chem. 1983. V. 244. P. 375-382.

13 Bazhenova T.A.. Lobkovskaya R.M., Shibaeva R.P., Shilova A.K., Shilov A.E. Structure of the intermediate iron(O) complex isolated from the nitrogen fixing system LiPh + FeCl3 II J. Organomet. Chem. 1983. V. 244. P. 265-272.

14 Bazhenova T.A.. Ivleva I.N., Kachapina L.M., Shilova A.K., Shilov A.E. Isolation and investigation of the complex Li3[FeNp3N2]nEt20 - the product of the interaction of molecular nitrogen with a naphthyl derivative of zero-valent iron // J. Organomet. Chem. 1985. V. 296. P. 95-101.

15 Bazhenova T.A.. Lobkovskaya R.M., Shibaeva R.P., Shilova A.K., Shilov A.E. Crystal and molecular structures of hexameric lithium dimethylnaphthylsilanolate, [LiOSiNPMe2]i // J. Organomet. Chem. 1987. V. 330. P. 9-15.

16 Bazhenova T.A.. Kachapina L.M., Shilov A.E.,. Antipin M.Yu, Struchkov, Yu.T. Mono- and binuclear a-aryl iron-lithium hydrides; synthesis and molecular structure // J. Organomet. Chem. 1992. V. 428. P. 107-123.

17 Bazhenova T. A.. Shilov A. E. Nitrogen Fixation in Solution // Coord. Chem. Rev. 1995. V. 114. P. 69-144.

18 Bazhenova T. A.. Shestakov A.F., Shilov A.E., Antipin M.Yu., Struchkov Yu.T., Lyssenko K.A. Reaction of an Iron-lithium complex with tolane and the structure of dilithiumtetraphenylbutadiene formed// J. Organomet. Chem. 1995. V. 490. P. 71-73.

19 Bazhenova T. A.. Kulikov A. V., Shestakov A. F., Shilov A. E.,. Antipin M. Yu., Lyssenko K. A. Structure of [Li2Cl 6THF][Cp2ZrPPh2] and Its Implications for the Nature of Dilithium Dinitrogen Complex // J. Amer. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 12176-12180.

20 Баженова Т. А.. Шилов A. E. Фиксация молекулярного азота в растворах // ЖВХО им. Менделеева. 1995. Т.39, С. 50-112.

21 Баженова Т.А.. Ивлева И.Н., Куликов А.В., Шестаков А.Ф., Шилов А.Е. Антипин М.Ю., Лысенко К.А., Стручков Ю.Т. Молекулярное строение литий-циркониевой комплексной соли [Li2Cl 6THF][Cp2ZrPPh2]. Вывод о природе дилитиевого комплекса с молекулярным азотом // Коорд. Химия. 1995. Т. 21. Р. 704-710.

22 Баженова Т.А.. Баженова М.А., Петрова Г.Н., Шилов А.Е. Железо-молибденовый кофактор нитрогеназы как катализатор восстановления ацетилена амальгамой цинка// Кинетика и катализ. 1997. Т. 38. С. 319-320.

23 Баженова Т.А., Баженова М.А., Петрова Г.Н., Шилова А.К., Шувалова Н.И., Шилов А. Е. Роль тиофенола в каталитическом восстановлении ацетилена амальгамой цинка. Развитие химических моделей нитрогеназы И Доклады академии наук. 1997. Т. 354. №1. С. 51-54

24 Bazhenova Т. A.. Bazhenova М. A., Mironova S. A., Petrova G. N., Shilova А. К., Shuvalova N. I., Shilov А. Е. Catalytic reduction of acetylene in presence of

molybdenum and iron clusters, including FeMo-cofactor of nitrogenase // Inorg. Chim. Acta. 1998. V. 270. P. 221-226.

25 Баженова T.A.. Баженова M.A., Петрова Г. H., Шилова А.К., Шилов А.Е. Каталитическое восстановление ацетилена и азота с участием железо-молибденового кофактора нитрогеназы и синтетических полиядерных комплексов молибдена (III) // Известия академии наук, серия химическая. 1998. №5. С. 890-896.

26 Bazhenova Т.А.. Emelyanova N.S., Shestakov A.F., Shilov A.E., Antipin M.Yu., K.A. Lyssenko. Molecular Structure and Reactions of Azobenzene Complexes with Iron-Lithium Compounds II Inorg. Chim. Acta. 1998. V. 280. P. 288-294.

27 Bazhenova T.A.. Bazhenova M.A., Petrova G.N., Shilov A.E. Catalitic reduction of acetylene with participation of isolated FeMo-co from Azotobacter vinelandii in non-enzymatic conditions, in Biological Nitrogen fixation for the 21" century. A. Kondorosi, W. Newton (eds.) 1998. Kluwer Academic Publishers. P. 69.

28 Баженова T.A., Баженова M.A., Петрова Г.Н., Шилов А.Е. Ингибирование молекулярным азотом восстановления ацетилена, катализируемого выделенным из белка FeMo-кофактором нитрогеназы II Кинетика и катализ. 1999. Т. 40., С. 942-943.

29 Баженова Т. А.. Баженова М. А., Петрова Г. Н., Миронова С. А., Стрелец В. В., Каталитическое поведение в неэнзиматических условиях выделенного из фермента железо-молибденового кофактора нитрогеназы в реакции восстановления С2Н2, И Кинетика и катализ. 2000. Т. 41. №4. С. 550-563.

30 Bazhenova Т.А., Bazhenova М.А., Petrova G.N., Shilov A.E. Catalytic behavior of isolated FeMo-cofactor of nitrogenase in non-protein surroundings, in Nitrogen fixation: from molecules to crop productivity, F.O. Pedrosa, M. Hungria, G. Yates, W. Newton (eds.) 2000, Kluwer Academic Publishers, P. 49-50

31 Баженова Т.А., Баженова M.A., Петрова Г.Н., Миронова С.А. Кинетика и механизм реакции восстановления ацетилена амальгамой европия, катализируемой активным центром нитрогеназы, выделенным из фермента // Кинетика и катализ. 2002. Т. 43. № 3. С. 382-393.

32 Баженова М.А., Баженова Т.А.. Петрова Г.Н., Миронова С.А. Взаимное влияние субстратов и ингибиторов в реакциях, катализируемых железо-молибденовым кофактором нитрогеназы вне белка // Кинетика и катализ. 2002. Т. 43. № 2. С. 219-230.

33 Bazhenova Т.A., Bazhenova М.А., Petrova G.N. Isolated FeMo-co catalytic reactivity in non-protein surroundings: substrate and inhibitor interactions (C2H2, N2, CO), in Nitrogen fixation:global perspectives, T. Finan, M. О 'Brian, D. Layzell, K. Vessey, W. Newton (eds.) 2002. CAB International. P. 363

34 Баженова T.A.. Бардина H.B., Петрова Г.Н., Боровинская М.А. Влияние потенциала внешнего донора электронов на закономерности катализа восстановления ацетилена в присутствии активного центра нитрогеназы

(FeMoco), выделенного из фермента // Известия АН, Серия химическая. 2004. №8. С. 1583-1591.

35 Бардина Н.В., Баженова Т.А.. Петрова Г.Н., Шилова А.К., Шилов А.Е. Сравнительное изучение каталитического поведения полиядерного Mg-Mo комплекса и активного центра нитрогеназы, выделенного из фермента, в реакциях с С2Н2, N2 и СО // Известия АН, Серия химическая. 2006. №5. С. 766774.

36 Bardina N.V., Bazhenova Т.А.. Lissenko К.А., Antipin M.Yu., Shulga Yu.M., Filina T.A., Shestakov A.F. Unusual binuclear alkoxomolybdenum(V) complex free of oxo groups: synthesis, structure and IR spectra II Mendeleev Commun., 2006. V. 16. P. 307-308.

37 Savinykh T. A., Shestakov A. F., Bardina N. V., Bazhenova T. A.. Shulga Yu. M. Density functional theoretical study of electron structure and IR spectra of polynuclear Mo8Mg2 complex, which is precursor of clusters with high nitrogen fixing ability // Mendeleev Commun. 2008. V. 18. P. 128-130.

Заказ № 15-П/04/2012 Подписано в печать 03.04.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.2,4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП:info@cfr.ru

Введение.

Сокращения.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Биологическая фиксация азота.

1.1.1. Строение белковых компонентов нитрогеназы.

1.1.1.1. Строение и свойства Fe белка.

1.1.1.2. Строение и свойства MoFe белка.

1.1.1.3. Структура и свойства нитрогеназного комплекса.

1.1.2. Железо-молибденовый кофактор нитрогеназы.

1.1.2.1. Состав, структура, свойства.

1.1.2.2. Анализ методов выделения FeMoco из белка.

1.1.3. Субстраты и ингибиторы нитрогеназы.

1.1.3.1. Азот, НГ, ацетилен.

1.1.3.2. Оксид углерода (II); особенности ингибирования.

1.2. Фиксация азота в химических системах.

1.2.1. Системы Вольпина-Шура.

1.2.2. Комплексы молекулярного азота.

1.2.3. Комплексы, содержащие реакционно-способный азот.

1.2.4. Диазотные комплексы железа.

1.2.5. Протонируемые диазотные комплексы железа.

1.2.6. Восстановление азота в протонных средах.

Глава 2. Экспериментальные методики, аналитические методы.

Глава 3. Апротонные азотфиксирующие системы на основе железа с литийорганическими соединениями в качестве восстановителей; механизм реакции и строение комплексов с субстратами нитрогеназы.

3.1. Кинетические исследования.

3.1.1. Кинетика и механизм реакции восстановления хлорного железа фениллитием.

3.1.2. Кинетика восстановления азота в системе FeCl3 + LiPh.

3.2. Влияние характера радикала литийорганического соединения на состав, строение и реакционную способность по отношению к малым молекулам железо-литиевых комплексов, образующихся по реакции FeCl3 + LiR.

3.2.1. Кристаллическая и молекулярная структура литийтетранафтилферрата(П).

3.2.2. Восстановление азота системой литийтетранафтилферрат (II) - н-пропил литий.

3.2.3. Реакции систем FeCb + LiR с молекулярным водородом: моно и биядерные железо-литиевые гидриды; синтез, свойства, молекулярные структуры.

3.2.4. Взаимодействие азобензола с железо-литиевыми комплексами; молекулярная структура и свойства образующихся комплексов.

3.2.5. Реакция железо-литиевого комплекса с толаном и структура дилийтетрафенилбутадиена.

3.3. Молекулярное строение литий-циркониевой комплексной соли {[(C^H$)2Zr(и-Р(С(уН$))72/{[(THF)^Li]2(и-Cl)}. Вывод о природе дилитиевого комплекса с молекулярным азотом.

Глава 4. Модельные системы на основе кофактора, выделенного из молибден-железного белка нитрогеназы; сравнение с поведением нитрогеназы in vitro.

4.1. Выбор условий, позволяющих изучать каталитическую активность FeMoco вне белка; биохимическое исследование FeMoco.

4.2. Кинетические закономерности восстановления ацетилена, катализируемого FeMoco вне белка.

4.2.1. Восстановитель - амальгама цинка.

4.2.2. Восстановитель - амальгама европия.

4.3. Ингибирование.

4.3.1. Ингибирование СО: тип, кинетика, механизм.

4.3.2. Ингибирование молекулярным азотом катализируемого кофактором восстановления ацетилена.

4.4. Влияние кислотности и химической природы реагента на скорость восстановления ацетилена.

4.5. Влияние потенциала внешнего донора электронов на реакцию восстановления ацетилена; температурная зависимость.

Глава 5. Кинетические закономерности восстановления ацетилена при катализе магний-молибденовым кластером; сравнение с системой на основе FeMoco вне белка.

5.1. Зависимость от концентрации катализатора.

5.2. Зависимость от концентрации субстрата.

5.3. Ингибирование оксидом углерода (II) восстановления ацетилена.

5.4. Ингибирование ацетиленом восстановления азота в системе с участием синтетического Mg-Mo кластера.

5.5. Электрохимические исследования и температурная зависимость.

Глава 6. Нитрогеназа in vitro; определение лимитирующей стадии оборота посредством изучения кинетики реакции в сильном магнитном поле.

Выводы.

Фермент нитрогеназа, входящий в состав азотфиксирующих бактерий, катализирует в природе восстановление N2 до ЫН3, который, в отличие от атмосферного азота, может использоваться живыми организмами для синтеза белков, нуклеиновых кислот и других важных биомолекул. Не будет преувеличением сказать, что жизнь на Земле зависит от биологической фиксации азота - процесса восстановления атмосферного азота до аммиака.

Несмотря на большие успехи в исследовании нитрогеназы, достигнутые в последние годы, механизм функционирования фермента на молекулярном уровне остается неясным.

Второй главный источник связанного азота на Земле, индустриальный процесс синтеза аммиака по методу Габера-Боша, является очень энергозатратным, поэтому химики не оставляют попыток создания альтернативы с использованием гомогенного катализа. Для этого необходимо понимание того, каким образом природа в мягких условиях активирует самую прочную межатомную связь, тройную связь молекулы азота.

Нитрогеназа очень сложный фермент, многосубъединичный и многосубстратный. Чтобы разобраться в различных аспектах механизма, необходимо использовать разного типа биомиметические модели, некие упрощения, которые позволяют адекватно исследовать какие-то стороны функционирования фермента.

В активный центр фермента входит железо-молибденовый кофактор (РеМосо). Это восьмиядерный кластер состава [(С)МоРе789 гомоцитрат], на котором, как сейчас доказано, осуществляется координация и восстановление различных субстратов - малых молекул с кратными связями, главной из которых является молекула Молекулярный механизм процессов на РеМосо не известен. Изучение фермента в целом дает мало информации о реакциях превращения субстрата в активном центре, так как эти реакции не являются скорость определяющими и не проявляются в ферментативной кинетике.

Общая особенность и биологического и промышленного путей синтеза аммиака - использование соединений железа в качестве активных центров -катализаторов реакции. В связи с этим развитие координационной химии диазотных комплексов железа, особенно полиядерных, и исследование восстановления азота в гомогенных апротонных азотфиксирующих системах на основе соединений железа является актуальным направлением исследований, позволяющим описать химизм постадийного превращения N2 в природном полиядерном железо-содержащем центре.

Исследование другого типа моделей, протонных азотфиксирующих систем с полиядерными активными центрами, позволяет понять общие принципиальные закономерности кластерного катализа восстановления азота, каким, по сути, является и природный процесс.

Мы решили ввести в круг изучаемых катализаторов и сам железо-молибденовый кофактор нитрогеназы, экстрагированный из фермента. Задача введения выделенного из белка РеМосо в реакции с субстратами нитрогеназы и изучения его как катализатора этих реакций к началу наших исследований решена не была. Исследование поведения металлокластера РеМосо вне белковой матрицы позволяет преодолеть кинетические ограничения, существующие в белковой нитрогеназной системе, которые препятствуют расшифровке детального механизма превращения субстратов в активном центре фермента. Такой подход позволяет также прояснить роль белкового окружения активного центра нитрогеназы в осуществлении ферментом его функции. А сравнение каталитических характеристик природного и моделирующих его действие синтетических комплексов, действующих в протонных азотфиксирующих системах, в одинаковых небелковых условиях позволяет понять, насколько они адекватны как модели.

Цель работы - получение новых знаний о механизме действия фермента нитрогеназы посредством разработки и изучения новых типов небелковых биомиметических систем, моделирующих различные стороны действия фермента, а также применения новых экспериментальных подходов к изучению нитрогеназной белковой системы in vitro.

Работа включала следующие задачи:

1. Изучение механизма восстановления молекулярного азота системами на основе соединений железа с литийорганическими восстановителями. Для решения задачи необходимо было изучить кинетические закономерности реакции восстановления хлорного железа литийорганическим соединением без азота и в присутствии азота выяснить состав и строение низковалентных производных железа, образующихся в этих системах и способных давать комплексы с азотом и другими субстратами нитрогеназы изучить влияние природы радикала R литийорганического соединения на восстановление азота системами на основе железа выделить и исследовать состав, строение и свойства промежуточных азотных комплексов, образующихся в этих системах исследовать реакции низковалентных производных железа с рядом других малых молекул, в частности, с молекулярным водородом, СО, С2Н4, соединениями с тройной С=С связью и двойной N=N связью; определить их молекулярные структуры определить роль лития в активации малых молекул этими комплексами

2. Выделение из молибден-железного белка нитрогеназы входящего в его активный центр железо-молибденового кофактора - кластера FeMoco и изучение его реакционной способности в чисто химических условиях Для решения задачи необходимо было

Найти условия, в которых выделенный из белка FeMoco способен катализировать реакции восстановления субстратов нитрогеназы.

Изучить кинетические закономерности этих реакций, а также реакций БеМосо с ингибиторами нитрогеназы, с целью сравнения каталитического поведения БеМосо вне белка и в составе фермента

Изучить возможности восстановления на отделенном от белка БеМосо основного субстрата нитрогеназы - молекулярного азота изучить механизм каталитического действия выделенного из фермента кластера в реакциях восстановления субстратов нитрогеназы в чисто химических условиях, в частности, определить природу скорость определяющей стадии и механизм протонирования субстрата при катализе БеМосо; определить характерные свойства и особенности БеМосо как катализатора реакций восстановления субстратов нитрогеназы.

3. Определение сходства и различий в механизмах катализа восстановления субстратов нитрогеназы кластерами природного и искусственного происхождения с целью выяснения, в какой мере синтетические полиядерные катализаторы моделируют активный центр фермента Для решения задачи необходимо было

Изучить кинетические закономерности восстановления ацетилена, катализируемого полиядерным молибден-магниевым комплексом (М§2Мо8), и ингибирования этой реакции молекулярным азотом и оксидом углерода (II) в тех же самых условиях и с участием тех же восстановителей, что были использованы при изучении каталитической реакционной способности выделенного из фермента БеМосо

Исследование особенностей протекания нитрогеназной реакции in vitro в сильных магнитных полях в разных условиях проведения эксперимента Для решения задачи необходимо было разработать экспериментальные условия проведения реакции в шахте магнита исследовать кинетику реакции при различных соотношениях белковых компонентов реакции, разных температурах, разных значениях напряженности магнитного поля, в присутствии различных реагентов, оказывающих влияние на протекание нитрогеназной реакции in vitro

Научная новизна.

Найдены и подробно исследованы азотфиксирующие системы на основе железа и литийорганических восстановителей. Сочетание детального кинетического исследования и синтетического подхода, направленного на выделение и идентификацию промежуточных комплексов, позволило впервые убедительно обосновать механизм восстановления азота в этих системах. Показано, в частности, что определяющей скорость стадией восстановления азота в системе FeCb-LiPh является реакция образования комплекса нуль-валентного железа, активного к молекулярному азоту.

Впервые экспериментально показано, что содействие соединений лития восстановлению азота комплексами железа связано с тем, что он образует смешанные комплексы переходного и непереходного металла, в которых литий равным образом принимает участие в активации N2 за счет множественной координации молекулы азота.

Впервые получены рентгеноструктурные характеристики бинарных железоорганических производных двухвалентного железа, а также ряда неописанных ранее железо-литиевых комплексов с субстратами и ингибиторами нитрогеназы.

Показано, что моноядерные комплексы железа образуют диазотные комплексы, содержащие реакционно-способную молекулу азота; только если состояние окисления железа в комплексе равно 0.

Впервые экспериментально показано, что достаточная активация молекулы N2 к дальнейшим реакциям по азоту возможна и в комплексах двухвалентного железа, только если эти комплексы полиядерные.

Впервые предложено и реализовано оригинальное исследование каталитической реакционной способности отделенного от белковой матрицы кластера РеМосо в реакциях восстановления субстратов нитрогеназы в небелковой среде.

В работе впервые найдены условия и показана принципиальная возможность введения РеМосо, отделенного от белковой матрицы, в реакции с субстратами нитрогеназы в чисто химических условиях. Показано, что железо-молибденовый кофактор является активным катализатором восстановления ацетилена и некоторых других субстратов нитрогеназы, если обеспечены условия сохранения кластерной структуры катализатора в ходе реакции, а также перенос электронов и протонов к активированной молекуле субстрата.

Впервые установлено, что РеМосо и вне белкового окружения способен эффективно координировать молекулярный азот.

Проведено изучение кинетических закономерностей реакций, катализируемых РеМосо вне белка; изучено взаимное влияние субстратов и ингибиторов, что позволило установить, что на восстановленном вне белка кофакторе активны к субстратам и ингибиторам несколько взаимозависимых активных центров с разными параметрами связывания.

Впервые проведенный сравнительный анализ каталитического поведения выделенного РеМосо в реакциях восстановления ацетилена и ингибирования этого процесса оксидом углерода (II) и молекулярным азотом с таковым для ферментативной системы, показал значительное сходство основных закономерностей этих реакций (вплоть до количественного совпадения констант) для фермента и химических систем с участием кофактора. Сделан вывод, что наблюдаемые особенности связаны в первую очередь с составом и структурой FeMoco, и проявляются им независимо от природы (белковой или небелковой) восстановителя и среды реакции.

Впервые найдены экспериментальные подтверждения механизма опосредованного протонирования субстрата при катализе FeMoco вне белка, предсказанного ранее теоретическими расчетными методами

На основе данных о каталитическом восстановлении ацетона на отделенном от белка FeMoco найден новый субстрат нитрогеназы: показано, что нитрогеназа in vitro, как и FeMoco вне белка, способна восстанавливать ацетон с образованием метана.

В работе впервые проведено сравнительное экспериментальное исследование в одинаковых условиях каталитических свойств магний-молибденового комплекса, входящего в активный центр самой эффективной на сегодняшний день модельной азотфиксирующей системы, и модельной системы с участием FeMoco вне белка. Показано значительное сходство в поведении и механизмах катализа реакций восстановления С2Н2 и ингибирования их оксидом углерода (II) системами с участием данных кластеров.

Впервые из исследования температурных зависимостей скоростей каталитических реакций в присутствии FeMoco и Mg-Mo-кластера найдено, что оба типа кластеров как катализаторы благоприятствуют осуществлению многоэлектронных окислительно-восстановительных каталитических процессов: энергии активации образования продуктов 4-х электронного восстановления субстрата заметно меньше, чем продуктов 2-х электронного восстановления, что крайне важно для восстановления азота в мягких условиях.

Впервые предложенное и реализованное изучение влияния магнитного поля на нитрогеназную реакцию in vitro позволило выявить следующие особенности нитрогеназного катализа: а) различные кинетические события могут лимитировать общую скорость каталитического цикла в разных условиях проведения реакции; б) в лимитирующую стадию процесса восстановления субстрата при физиологических температурах (выше 20°С) включен дистанционный межкластерный электронный перенос; в) излом на температурной зависимости нитрогеназной реакции связан с изменением скорость определяющей стадии при этой температуре.

Практическая значимость.

Практическая ценность работы заключается в формулировке механизма активации молекулярного азота металлоорганическими соединениями железа, что может быть использовано для последующего развития этого направления гомогенного катализа. Определенный практический интерес представляет разработка конкретных методик синтеза устойчивых железоорганических соединений.

Предложенный и реализованный в работе подход - исследование каталитической активности РеМосо вне белка - является полезным и информативным для изучения механизма превращения субстратов нитрогеназой. Практический интерес представляет нахождение и разработка новых систем для изучения каталитической активности выделенного из белка РеМосо, а также разработка модифицированного хроматографического метода получения препаративных количеств РеМосо с использованием техники Шленка. Полученные результаты являются абсолютно оригинальными и вносят существенный вклад в понимание механизма каталитического действия активного центра фермента нитрогеназы.

Понимание химического механизма функционирования одного из самых сложных ферментов - нитрогеназы - представляет интерес для фундаментальной науки, а в дальнейшем может стать научной основой создания новых экологически чистых катализаторов и каталитических процессов с использованием принципов, реализуемых в живой природе.

Сокращения

FeMoco - железо-молибденовый кофактор нитрогеназы

РСА - рентгеноструктурный анализ

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

XAS - рентгеновская абсорбционная спектроскопия

EXAFS - дальняя тонкая структура рентгеновских спектров поглощения

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

ЦВА - циклическая вольтамперометрия н.в.э. - нормальный водородный электрод нас.к.э. - насыщенный каломельный электрод

ДМФА - N, N'- диметилформамид

N-МФА - N-метилформамид

ТГФ - тетрагидрофуран

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

М^АТФ - аденозинтрифосфат магния

АДФ - аденозиндифосфорная кислота

NADH - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

ДЕАЕ-целлюлоза (ДЕАЕ-сефароза) - (диэтил)аминоэтилцеллюлоза (сефароза)

TRIS - трис-(гидроксиметил)аминометан

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1 -этилсульфит натрия

ТХУ - трихлоруксусная кислота

К. Ч. - координационное число

XANES - около краевая тонкая структура рентгеновских спектров поглощения ENDOR - электронно-ядерный двойной резонанс

ВЫВОДЫ

На основании кинетических исследований предложен механизм восстановления азота системами на основе соединений железа с литийорганическими восстановителями. Показано, что лимитирующей стадией реакции является накопление соединения нульвалентного железа, реагирующего с азотом с образованием диазотного комплекса, содержащего реакционно способную молекулу азота.

Впервые получены и охарактеризованы рентгеноструктурным анализом стабильные бинарные железоорганические комплексы двухвалентного железа и ряд неописанных ранее железо-литиевых комплексов с субстратами и ингибиторами нитрогеназы.

Экспериментально показано, что содействие соединений лития восстановлению азота комплексами железа связано с тем, что он образует смешанные комплексы переходного и непереходного металла, в которых литий равным образом принимает участие в активации N2 за счет множественной координации молекулы азота.

Впервые найдены условия и показана принципиальная возможность вовлечения железо-молибденового кофактора нитрогеназы (FeMoco), отделенного от белковой матрицы, в реакции с субстратами нитрогеназы в чисто химических условиях.

Показано значительное сходство основных закономерностей реакций каталитического восстановления С2Н2 и ингибирования этого процесса оксидом углерода (II) и молекулярным азотом для нитрогеназы in vitro и химических систем с участием выделенного из белка FeMoco. Найдено, что наблюдаемые особенности поведения FeMoco в изучаемых реакциях определяются его составом и структурой, и проявляются им независимо от природы (белковой или небелковой) восстановителя и среды реакции; установлено, что восстановленный FeMoco и вне белкового окружения способен обратимо координировать молекулярный азот.

На основе данных о каталитическом восстановлении ацетона на отделенном от белка FeMoco найден новый субстрат нитрогеназы: показано, что нитрогеназа in vitro, как и FeMoco вне белка, способна восстанавливать ацетон с образованием метана.

Показано, что в зависимости от кислотности протонирующего агента, лимитирующей стадией каталитического восстановления С2Н 2 на выделенном из белка FeMoco может быть как перенос электрона от катода на каталитический кластер, так и стадия переноса протона в катализатор-субстратном комплексе.

Изучена кинетика восстановления С2Н2 и ингибирование этого процесса N2 и СО при катализе синтетическим MgMo комплексом в условиях, аналогичных для системы на основе экстрагированного из фермента активного центра нитрогеназы (FeMoco). Сравнение основных параметров реакций показало значительное сходство механизмов каталитического восстановления субстратов в присутствии природного и синтетического кластеров.

Исследованы температурные зависимости скоростей реакций, катализируемых FeMoco вне белка и MgMo комплексом. Показано, что оба типа кластеров как катализаторы благоприятствуют осуществлению многоэлектронных окислительно-восстановительных каталитических процессов: энергии активации образования продуктов 4-х электронного восстановления субстрата заметно меньше, чем продуктов 2-х электронного восстановления, что крайне важно для восстановления азота в мягких условиях.

Впервые предложенное и реализованное изучение влияния магнитного поля на нитрогеназную реакцию in vitro позволило выявить следующие особенности нитрогеназного катализа: а) различные кинетические события могут лимитировать общую скорость каталитического цикла в разных условиях проведения реакции; б) в лимитирующую стадию процесса восстановления субстрата при физиологических температурах (выше 20°С) включен дистанционный межкластерный электронный перенос; в) излом на температурной зависимости нитрогеназной реакции связан с изменением скорость определяющей стадии при этой температуре.

1. Hellriegel H, Wilfarth H. Untersuchungen über die Stickstoffnährung der Gramineen und Leguminosen II Beil Z Ver dt Zuchlnd. 1888. P. 1-234.

2. Beijerinck MW, Die Bakterien der Papilionaceen-Knölchen II Bot Ztg. 1888. 46:725-735; 741-750; 757-771; 781-790; 797-804.

3. Winogradsky S. Sur l'assimilation de l'azote gaseux de l'atmosphère par les microbes// Crhedb. Séanc. Acad. Sei. Paris. 1893. V. 116. P. 1385-1388.

4. Beijerinck MW. Über oligonitrophile Mikroben // ZentBl Bakt ParasitKde. 1901. P. 561-582.

5. Meyerhof O, Burk D. On the fixation of air nitrogen through Azotobacter II Z. Phys. Chem. 1928. V. 139. P. 117-142.

6. Bortels H. Molybdän als Katalysator bei der biologischen Stickstoffbindung II Arch Mikrobiol. 1930. P. 333-342.

7. Burris H. Distribution of isotopic nitrogen in Azotobacter vinelandii // J. Biol. Chem. 1942. P. 509-517.

8. Carnahan J.E., Mortenson L.E., Mower H.F. Nitrogen fixation in cell-free extracts of Clostridium pasteurianum II Biochim Biophys Acta. 1960. V. 38. P. 188-189.

9. Bulen WA, Burns RC, LeComte JR. Nitrogen fixation: cell-free system with extracts of Azotobacter II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1964. V. 17. P. 265-271.

10. Bulen W.A., Burns R.C., Lecomte J.R. Nitrogen fixation: hydrogensulfite as electron donor with cell-free preparations of Azotobacter vinelandii and Rhodospirillum rubrum II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1965. V. 53. P. 532539.

11. Bulen W.A., LeComte J.R. The nitrogenase system from Azotobacter: two enzyme requirement for N2 reduction, ATPdependent H2 evolution, and ATP hydrolysis И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1966. V. 56. P. 979-986.

12. Howard J.B., Rees D.C. Structural basis of biological nitrogen fixation // Chem. Rev. 1996. V. 96. P. 2965-2982.

13. Burgess В. K., Lowe D. J. Mechanism of molybdenum nitrogenase // Chem. Rev. 1996. V. 96. P. 2983-3011.

14. Burris R.H. Nitrogenases II J. Biol. Chem. 1991. V. 266. № 15. P. 9339-9342.

15. Eady R. R. Structure function relationships of alternative nitrogenases // Chem. Rev. 1996. V. 96. P. 3013-3030 и ссылки в этом обзоре.

16. Peters J.W., Fisher К., Dean D.R. Nitrogenase structure and function: a biochemical-genetic perspective II Ann. Rev. Microbiol. 1995. V. 49. P. 335366.

17. Thorneley R.N.F., Lowe D.J. Kinetics and mechanism of the nitrogenase enzyme system // In: Spiro, TG (ed). Molybdenum Enzymes. 1985. P. 221284. Wiley, New York, NY

18. Georgiadis M. M., Komiya H., Chakrabarti P., Woo D., Kornuc J. J., Rees D. C. Crystallographic structure of the nitrogenase iron protein from Azotobacter vinelandii 11 Science. 1992. V. 257. P. 1653-1659.

19. Watt G. D., Reddy K. R. N. Formation of an all Ferrous Fe4S4 Cluster in the Iron Protein Component of Azotobacter vinelandii Nitrogenase // J. Inorg. Biochem. 1994. V. 53. P. 281-294.

20. Angove H. C. Yoo S.J., Munck E., Burgess B.K., Mössbauer and EPR Evidence for an All-Ferrous Fe4S4 Cluster with S = 4 in the Fe Protein of Nitrogenase // J. Amer. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 8730-8731.

21. Mortenson L.E., Ferredoxin requirement for nitrogen fixation by extracts of Clostridium pasteurianum II Biochim Biophys. Acta. 1964. V. 81. P. 473-478.

22. Angove H.C., Yoo S.J., Munck E., Burgess B.K., An All-ferrous State of the Fe Protein of Nitrogenase: Interaction with Nucleotides and Electron Transfer to the MoFe protein// J. Biol. Chem. 1998. V. 273. №41. P. 26330-26337.

23. Musgrave K.B., Angove H.C., Burgess B.K., Hedman B., and Hodgson K. O. All-ferrous titanium(III) citrate reduced Fe protein of nitrogenase: An XAS study of electronic and metrical structure // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. №21. P. 5325-5326.

24. Yoo S.J, Angove H.C, Burgess B.K. Magnetic circular dichroism study of the allferrous 4Fe-4S. cluster of the Fe-protein of Azotobacter vinelandii nitrogenase // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 9704-9705.

25. Burgess B. K. The mechanism of molybdenum nitrogenase: an overview. // In: Nitrogen fixation: from molecules to crop productivity, F. O. Pedrosa et al, Eds., Kluwer Academic Publishers, 2000, P. 13-18.

26. Cordewener J, Haaker H, Van Ewijk P. Properties of the MgATP and MgADP binding sites on the Fe protein of nitrogenase from Azotobacter vinelandii II Eur. JBiochem. 1985. V. 148. P. 499-508.

27. Ryle M.J., Seefeldt L.C., Hydrolysis of nucleoside triphosphates other than ATP by nitrogenase II J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 6214-6219.

28. Sen S., Igarashi R., Smith A., Johnson M.K., Seefeldt L.C., Peters J.W. A conformational mimic of the MgATP-bound "on state" of the nitrogenase iron protein // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 1787-1797.

29. Strop P., Takahara P.M., Chiu H.J. Crystal structure of the all-ferrous 4Fe-4S.° form of the nitrogenase iron protein from Azotobacter vinelandii II Biochemistry. 2001. V. 40. P. 651-656.

30. Burgess B. K. The iron-molybdenum cofactor of nitrogenase // Chem. Rev., 1990. V. 90. P. 1377-1406.

31. Kim J., Rees D.C. Structural models for the metal centers in the nitrogenase molybdenum-iron protein // Science. 1992. V. 257. P. 1677-1682.

32. Chan M.K., Kim J., Rees D.C. The nitrogenase FeMo-cofactor and P-cluster pair-2.2- re solution structures II Science. 1993. V. 260. P. 792-794.

33. Kim J., Rees D.C. Crystallographic structure and functional implications of the nitrogenase molybdenum-iron protein from Azotobacter vinelandii II Nature. 1992. V. 360. P. 553-560.

34. Peters J.W., Stowell M.H.B., Soltis S.M., Finnegan M.G., Johnson M.K., Rees D. C. Redox-dependent structural changes in the nitrogenase P-cluster // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 1181-1187.

35. Schindelin H., Kisker C., Schlessman J.L., Howard J.B., Rees D.C. Structure of ADP-AlF4-stabilized nitrogenase complex and its implications for signal transduction // Nature. 1997. V. 387. №6631. P. 370-376.

36. Comparison to the ADP-A1F4 stabilized structure // Biochemistry. 2002. V. 41. №52. P. 15557-15565.

37. Tezcan F.A., Kaiser J.T., Mustafi D., Walton M.Y., Howard J.B., Rees D.C. Nitrogenase complexes: multiple docking sites for a nucleotide switch protein //Science. 2005. V. 309. P. 1377-1380.

38. Shah V.K., Brill W.J. Isolation of an iron-molybdenum cofactor from nitrogenase // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977. V. 74. P. 3249-3253.

39. Hoover T.R., Robertson A.D., Cerny R.L., Hayes R.N., Imperial J., Shah V. K., Ludden P.W. Identification of the V-factor needed for synthesis of the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase as homocitrate // Nature. 1987. V. 329. P. 855-857.

40. Gronberg K.L.C., Gormal C.A., Durrant M.C., Smith B.E., Henderson R.A. Why R-homocitrate is essential to the reactivity of the FeMo-cofactor of nitrogenase: studies on NifV" extracted FeMo-cofactor // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 10613-10621.

41. Einsle O., Tezcan F.A., Andrade S.L.A., Schmid B., Toshida N., Howard J.B., Rees D.C. The nitrogenase MoFe-protein at 1.16 A resolution: a central ligand in the FeMo-cofactor // Science. 2002. V. 297. P. 1696-1700.

42. Peters J. W, Szilagyi R.K. Exploring new frontiers of nitrogenase structure and mechanism // Curr. Opin. Chem. Biol. 2006. V. 10. P. 101-108.

43. Yang TC, Maeser NK, Laryukhin M. Lee H.I., Dean D.R., Seefeldt L.C., and Hoffman B.M. The interstitial atom of the nitrogenase FeMo-cofactor: ENDOR and ESEEM evidence that it is not a nitrogen // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. №37. P. 12804-12805.

44. Lovell T., Li J., Liu T., Case D.A., and Noodleman L. FeMo cofactor of nitrogenase: A density functional study of states MN, Mox, MR, and M1 // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. №49. P. 12392-12410.

45. Pelmenshikov V., Case D.A., Noodleman L. Ligand-bound S = 1/2 FeMo cofactor of nitrogenase: Hyperfine interaction analysis and implication for the central ligand X identity II Inorg. Chem. 2008. V. 47. №14. P. 6162-6172.

46. Dance I. The consequences of an interstitial N atom in the FeMo cofactor of nitrogenase // Chem. Commun. 2003. №3. P. 324-325.

47. Dance I. The mechanistically significant coordination chemistry of dinitrogen at FeMo-co, the catalytic site of nitrogenase // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 1076-1088.

48. Shah V.K., Davis L.C., Gordon J.K., Orme-Johnson W.H., Brill W.J. Nitrogenase. 3. Nitrogenaseless mutant of Azotobacter vinelandii: activities, cross-reactions and EPR spectra // Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 292. P. 246-255.

49. Rawlings J., Shah V.K., Chisnell J.R., Brill W.J., Zimmerman R., Miinck E., Orme-Johnson W. H. Novel metal cluster in the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase II J. Biol. Chem. 1978. V. 253. № 4. P. 1001-1004.

50. Newton W.E. Isolated iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. // In: Biological Nitrogen Fixation, Stacey G., Burris R. H., Evans H. J. (Eds.) Chapman & Hall, New York. 1992. P. 877-928.

51. Walters M.A., Chapman S.K., Orme-Johnson W.H. The nature of amide ligation to the metal sites of FeMoco // Polyhedron. 1986. V. 5. № 1-2. P. 561-565.

52. Lee H.-I., Hales B.J., Hoffman B.M. CO binding to and metal-ion valencies of the FeMo-cofactor in CO-inhibited nitrogenase // In: Biological nitrogen fixation for the 21st century, C. Elmerich et al. Eds. Kluwer Academic Publishers. 1998. P. 55-56.

53. Yoo S.J., Angove H.C., Papaefthymiou V., Burgess B.K., and Miinck E. Mossbauer study of the MoFe protein of nitrogenase from Azotobacter vinelandii using selective 57Fe enrichment of the M-centers // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. №20. P. 4926-4936.

54. Lovell T, Liu T, Case D.A. and Noodleman L. Structural, spectroscopic, and redox consequences of a central ligand in the FeMoco of nitrogenase: A density functional theoretical study // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. №27. P. 8377-8383.

55. Schultz F.A., Gheller S.F., Burgess B.K., Lough S., Newton W.E. Electrochemical characterization of the iron-molybdenum cofactor from Azotobacter vinelandii nitrogenase // J. Am. Chem. Soc. 1985. V. 107. P. 5364-5368.

56. Watt G.D., Burn S.A., Lough S., Tennent D.L. Redox and spectroscopic properties of oxidized MoFe protein from Azotobacter vinelandii. II Biochemistry. 1980. V. 19. №21. P. 4926-4932.

57. Сырцова JI.A., Тимофеева E.A. Перенос электрона, сопряженный с гидролизом АТР, в нитрогеназе // Изв. Акад. РАН, Серия химическая. 2001. С. 1706-1711.

58. Ibrahim S.K., Vincent К., Gormal С.A., Smith В.Е., Best S.P., Pickett C.J. The isolated iron-molybdenum cofactor of nitrogenase binds carbon monoxide upon electrochemically accessing reduced states // Chem. Commun. 1999. P. 1019-1020.

59. Hawkes T.R., McLean P.A., Smith B.E. Nitrogenase from nifV mutants of Klebsiella pneumoniae contains an altered form of the iron-molybdenum cofactor // Biochem. J. 1984. V. 217. P. 317-321.

60. Christiansen J., Goodwin P. J., Lanzilotta W.N., Seefeldt L.C., Dean D.R. Catalytic and biophysical properties of a nitrogenase apo-MoFe protein produced by a m^B-deletion mutant of Azotobacter vinelandii II Biochemistry. 1998. V. 37. P. 12611-12623.

61. Hawkes T.R., Smith B.E. Purification and characterization of the inactive MoFe protein (NifB-Kpl) of the nitrogenase from nifB mutants of Klebsiella pneumoniae II Biochem. J. 1983. V. 209. P. 43-50.

62. Shah V.K., Ugalde R.A., Imperial J., Brill W.J. Inhibition of iron-molybdenum cofactor binding to component I of nitrogenase // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 3891-3894.

63. McKenna C.E., McKenna M.-C., Higa M.T. Chemical probes of nitrogenase. 1. Cyclopropene. Nitrogenase-catalyzed reduction to propene and cyclopropane II J. Am. Chem. Soc. 1976. V. 98. P. 4657-4659.

64. Le Gall T., Ibrahim S.K., Gormal C.A., Smith B.E., Pickett C.J. The isolated iron-molybdenum cofactor of nitrogenase catalyses hydrogen evolution at high potential // Chem. Commun. 1999. P. 773-774.

65. Shah V.K., Chisnell J.R., Brill W.J. Acetylene reduction by the iron-molybdenum cofactor from nitrogenase // Biochem. Biophys. Res. Commun, 1978. V. 81. № l.P. 232-236.

66. McKenna C.E., McKenna M.-C., Huang C.W. Low stereoselectivity in methylacethylene and cyclopropene reductions by nitrogenase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. № 10. P. 4773-4777.

67. Weathers B.J., Grate J.H., Strampach N.A., Schrauzer G.N. Chemical evolution of a nitrogenase model. 18. Reduction of molecular nitrogen with molybdoinsulin catalysts II J. Am. Chem. Soc. 1979. V. 101. P. 925-928.

68. Corbin J.L., Pariyadath N., Stiefel E.I. Ligand effects and product distributions in molybdothiol catalyst systems // J. Am. Chem. Soc. 1976. V. 98. № 24. P. 7862-7864.

69. Newton W.E., Corbin J.L., Schneider P.W., Bulen W.A. On potential model systems for the nitrogenase enzyme // J. Am. Chem. Soc. 1971. V. 93. P. 268269.

70. Eady R.R., Robson R.L., Richardson Т.Н., Miller R.W., Hawkins M. The vanadium nitrogenase of Azotobacter chroococcum. Purification and properties of the VFe protein // Biochem. J. 1987. V. 244. P. 197-207.

71. Chisnell J.R., Premakumar R., Bishop P.E. Purification of a 2nd alternative nitrogenase from a NIFHDK deletion strain of Azotobacter vinelandii II J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 27-33.

72. Rehder D. Vanadium nitrogenase // J. Inorg. Biochem. 2000. V. 80. P. 133136.

73. Харди P. Восстанавливаемые субстраты нитрогеназы. // В кн.: Проблемы фиксации азота. М.: Мир. 1982. С. 455-503.

74. Seefeldt L.C., Rasche М.Е., Ensign S.A. A carbonyl sulfide and carbondioxide as new substrates, and carbon-disulfide as a new inhibitor, of nitrogenase II Biochemistry. 1995. V. 34. P. 5382-5389.

75. Ryle M.J., Lee H.-I., Seefeldt L.C., Hoffman B.M. Nitrogenase reduction of carbon disulfide: freeze-quench EPR and ENDOR evidence for three sequential intermediates with cluster-bound carbon moieties // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 1114-1119.

76. Rivera-Ortiz J. M., Burris R. H. Interactions among substrates and inhibitors of nitrogenase II J. Bacteriol. 1975. V. 123. № 2. P. 537-546.

77. Hwang J.C., Chen C.H., Burris R.H. Inhibition of nitrogenase-catalyzed reductions // Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 292. P. 256-270.

78. Kim C.-H., Newton W.E., Dean D.R. Role of the MoFe protein a-subunit histidine-195 residue in FeMo-cofactor binding and nitrogenase catalysis // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 2798-2808.

79. Newton W.E., Corbin J.L., McDonald J.W. Nitrogenase: mechanism and models // In: Proceedings of the First International Symposium on Nitrogen Fixation, Newton W. E., Nyman C. J., Eds. Washington State University Press: Pullman. WA. 1976. P. 53-74.

80. Dilworth M.J., Thorneley R.N.F. Nitrogenase of Klebsiella pneumoniae. Hydrazine is a product of azide reduction // Biochem. J. 1981. V. 193. P. 971985.

81. Christiansen J., Cash V.L., Seefeldt L.C., Dean D.R. Isolation and characterization of an acetylene-resistant nitrogenase // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 15. P. 11459-11464.

82. Dilworth M.J. Acetylene reduction by nitrogen-fixing preparations from Clostridium pasteurianum II Biochim. Biophys. Acta. 1966. V. 127. P. 285294.

83. Ashby G.A., Dilworth M.J., Thorneley R.N.F. Klebsiella pneumoniae nitrogenase. Inhibition of hydrogen evolution by ethylene and the reduction of ethylene to ethane II Biochem. J. 1987. V. 247. P. 547-554.

84. Schneider K., Müller A., Krahn E., Hagen W.R., Wassink H., Knüttel K.-H. The molybdenum nitrogenase from wild-type Xanthobacter autotrophics exhibits properties reminiscent of alternative nitrogenase // Eur. J. Biochem. 1995. V. 230. P. 666-675.

85. Cameron L.M., Hales B.J. CO inhibition of nitrogen fixation // In: Nitrogen fixation: fundamentals and applications. I. A. Tikhonovich et al. Eds. Kluwer Academic Publishers. 1995. P. 109-113.

86. Cameron L.M., Hales B.J. Unusual effect of CO on C2H2 reduction by V nitrogenase from Azotobacter vinelandii 11 J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 279-280.

87. Miiller A., Schneider K., Gollan U., Krahn E., Drottboom M. Characterization of the "iron only" nitrogenase from Rhodobacter capsulatus II In: Iron-sulfur proteins. New York: Wiley. 1982. P. 551.

88. Moore V.G., Tittsworth R.C., Hales B.J. Construction and characterization of hibrid component 1 from V-nitrogenase containing FeMo cofactor // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 12101-12102.

89. Lind C.J., Wilson P.W. Mechanism of biological nitrogen fixation. VIII. Carbon monoxide as an inhibitor for nitrogen fixation by red clover // J. Am. Chem. Soc. 1941. V. 63. № 11-12. P. 3511-3514.

90. Беррис P. Ингибирование // В кн.: Проблемы фиксации азота. М.: Мир. 1982. С. 504-536.

91. Davis L.C., Henzl М.Т., Burris R.H., Orme-Johnson W.H. Iron-sulfur clusters in the molybdenum-iron protein-component of nitrogenase electron-paramagnetic resonance of the carbon-monoxide inhibited state // Biochemistry. 1979. V. 18. P. 4860-4869.

92. Pollock R.C., Lee H.-I., Cameron L.M., DeRose V.J., Hales B.J., Orme-Johnson W. H., Hoffman В. M. Investigation of CO bound to inhibited forms of nitrogenase MoFe protein by 13C ENDOR I/ J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 8686-8687.

93. Christie P.D., Lee H.-I., Cameron L.M., Hales B.J., Orme-Johnson W. H., Hoffman В. M. Identification of the СО-binding cluster in nitrogenase MoFeprotein by ENDOR of 57Fe isotopomers // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 8707-8709.

94. Gronberg K.L.C., Gormal C.A., Smith B.E., Henderson R.A. A new approach to identifying substrate binding sites on isolated FeMo-cofactor of nitrogenase // Chem. Commun. 1997. № 7. P. 713-714.

95. George S.J., Ashby G.A., Wharton C.W., Thorneley R.N.F. Time-resolved binding of carbon monoxide to nitrogenase monitored by stopped-flow infrared spectroscopy II J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 6450-6451.

96. Lee H.-I., Hales B.J., Hoffman B.M. Metal-ion valencies of the FeMo cofactor in СО-inhibited and resting state nitrogenaseby Fe Q-band

97. ENDOR// J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 11395-11400.

98. Вольпин М.Е., Шур В.Б., Илатовская М.А., Фиксация азота системами на основе дициклопентадиенилтитандихлорида // Изв. АН СССР, сер. хим. 1964. с.1728-1729.

99. Shilov A.E., Dinitrogen fixation in solution in the presence of transition-metal complexes // In A Treatise on Dinitrogen Fixation, R. W. F. Hardy, F. Bottomley and R. C. Burns, (eds) Wiley. New York 1979. P. 31-108.

100. Vol'pin М.Е., Shur V.B., Nitrogen fixation by transition metal compounds: Results and prospects II J. Organomet. Chem. 1980. V. 200, P.319-334.

101. Бочкарев M.H., Трифонов А.А., Разуваев Г.А., Илатовская M.A., Шур В.Б. Фиксация молекулярного азота соединениями редкоземельных металлов II Изв. АН СССР, сер. хим. 1986. С. 1898-1900

102. Бочкарев М.Н., Трифонов А.А., Разуваев Г.А., Илатовская М.А., Шур

103. B.Б., Вольпин М.Е., Активация молекулярного азота соединениями лантаноидов И ДАН СССР. 1987. V. 295. Р. 1381-1384.

104. Шилов А.Е., Шилова А.К., Квашина Е.Ф. Промежуточные комплексы в реакциях восстановления азота // Кинетика и катализ. 1969. Т. 10. № 6.1. C. 1402.

105. Шилов А.Е., Шилова А.К., Образование гидразина при восстановлении молекулярного азота в растворах титановых комплексов // Ж. физ. хим, 1970. Т. 44. №1. С. 288.

106. Van Tamelen Е.Е., Fechter R.B., Schneller S.W., Boche G., Greeley R.H., Akermark B. Titanium(II) in the fixation-reduction of molecular nitrogen under mild conditions///. Am. Chem. Soc. 1969. V.91. №6. P.1551-1552.

107. Allen A.D., Senoff C.V. Nitrogenpentaaminoruthenium(II) complexes // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1965. № 24. P.621-622.

108. Шилов A.E., Шилова A.K., Бородько Ю.Г. Прямое получение комплексов молекулярного азота с соединениями рутения // Кинетика и катализ. 1966. Т.7. №4. С.768-769.

109. Боттомли Ф. Диазотные комплексы переходных металлов // В кн.: Проблемы фиксации азота. М.: Мир. 1982. С. 104-154.

110. Studt F., Tuczek F. Theoretical, Spectroscopic, and Mechanistic Studies on Transition-Metal Dinitrogen Complexes: Implications to Reactivity and Relevance to the Nitrogenase Problem // Journal of Computational Chemistry. V. 27. №12. P. 1278 1291.

111. Jonas K. 7t-Bonded nitrogen in a crystalline nickel-lithium complex // Angew. Chem. Int.Ed. 1973. V. 12. P. 997-999.

112. Kruger C., Tsay J.-H. Moleculstructur eines 7r-distictoff nickel-lithiumkomplexes //Angew. Chem. 1973. V. 23. P. 1051-1056.

113. Jonas K. Kruger C. Side-on dinitrogen-transition metal complexes. The molecular structure of {Ph(Na OEt2)2(Ph2Ni)2N2 NaLi6(OEt2)4 OEt2.} // J. Amer. Chem. Soc. 1976. V. 98. № 1. P. 74-81.

114. Хенрици-Оливэ Г. Оливэ С. Молекула азота // В книге Проблемы фиксации азота. М. Мир. 1982. С. 13-36.

115. Girolami G.S., Salt J.E., Wilkinson G.W. Alkyl, hydride and dinitrogen 1,2-bis(dimethylphosphino)ethane complexes of chromium // J.Amer. Chem. Soc. 1983. V. 105. P. 5954-5956.

116. Sanner R.D., Duggan D.N., McKenzie T.S. Structure and magnetism of ju-dinitrogen-bis(bispentamethylcyclopentadienil)titanium(II), (rj 5-C5(CH3)5)2Ti2N2 // J.Amer. Chem. Soc. 1976. V. 98. № 26. P. 8358-8365.

117. Помбейро А. Получение, структура, природа связывания и реакционная способность комплексов молекулярного азота // В кн. Новое в химической фиксации азота. М. : Мир. 1983. С. 164-213;

118. Shilov А.Е., Shilova А.К., Kvashina E.F., Vorontsova Т.A. Isolation of a Binuclear complex intermediate in the reaction of molecular nitrogen with titanium compounds //J. Chem. Soc., Chem. Communs. 1971. P. 1590-1591.

119. Teuben J.H. Binuclear dinitrogen complexes of aryl- and benzyldicyclopentadienyltitanium(III) compounds // J. Organomet. Chem. 1973. V. 57. P. 159-168.

120. Borod'ko Yu.G., Broitman M.O., Kachapina L.M. Shilov A.E. Reduction of nitrogen to hydrazine in a binuclear complex of iron // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1971. № 19. P. 1185-1186.

121. Бройтман M.O., Воронцова Т. А., Шилов A.E., Восстановление молекулярного азота в системе FeCb + LiPh + N2 // Кинетика и катализ. 1972. Т. 13. №1. с. 61-66.

122. Chatt J., Pearman A.J., Richards R.L. The Reduction of Mono-Coordinated Molecular Nitrogen to Ammonia in a Protic Environment // Nature. 1975. V. 253. P. 39-40.

123. Chatt J. The reactions of dinitrogen in its mononuclear complexes // J. Organomet. Chem. 1975. V. 100. P. 17-28.

124. Chatt J., Pearman A.J., Richards R.L. Conversion of dinitrogen in its molybdenum and tungsten complexes into ammonia and possible relevance to the nitrogenase reaction///. Chem. Soc. Dalton Trans. 1977. P. 1852-1860.

125. Chatt J., Heath G A. and Leigh G. J. The formation of a nitrogen to carbon bond in a reaction of a dinitrogen complex // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1972. P. 444-445.

126. Henderson R.A., Leigh G.J., Pickett C.J. The chemistry of nitrogen fixation and models for the reactions of nitrogenase // Adv. Inorg. Chem. Radiochem., 1983. V. 27. P. 197-292.

127. Pickett C.J. The Chatt cycle and the mechanism of enzymic reduction of molecular nitrogen // J. Biol. Inorg. Chem. 1996. V. l.P. 601-606.

128. Yandulov D.V., Schrock R.R., Rheingold A.L., Ceccarelli C., Davis W.M. Synthesis and reactions of molybdenum triamidoamine complexes containing hexaisopropylterphenyl substituents IIInorg. Chem. 2003.V. 42. P. 796-813.

129. Yandulov D.V., Shrock R.R. Catalytic reduction of dinitrogen to ammonia at a single molybdenum center // Science. 2003. V. 301. P. 76-78.

130. Sacco A., Aresta M. Nitrogen fixation: Hydrido- and Hydrido-nitrogen-complexes oflron(II)// Chemical Communications. 1968. P. 1223-1224.

131. Crossland J.L., Tyler D.R. Iron-dinitrogen chemistry: Dinitrogen activation and reactivity // Coord. Chem. Rev. V. 254. 2010. P. 1883-1894.

132. Tuczek F., Lehnert N. New Developments in Nitrogen Fixation // Angew. Chem. Int. Ed. 1998. V. 37. P. 2636-2637.

133. Fryzuk M.D., Johnson S.A. The continuing story of dinitrogen activation // Coord. Chem. Rev. 2000. V. 200-202. P. 379-409.

134. Russell S.K., Darmon J.M., Lobkovsky E., and Chirik P.J. Synthesis of Aryl-Substituted Bis(imino)pyridine Iron Dinitrogen Complexes // Inorg. Chem. 2010. V. 49. P. 2782-2792.

135. Smith J.M.; Lachicotte R.J.; Pittard K.A., Cundari T.R.; Lukat-Rodgers, G. Rodgers K.R.; Holland P.L. Stepwise Reduction of Dinitrogen Bond Order by a Low-Coordinate Iron Complex //J. Amer. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 9222-9228.

136. Sellmann D., Kleinschmidt E. Simple Synthesis of C5H5Fe(CO)dppe.+ and its Photochemical Conversion into the Dinitrogen Complex [{C5H5Fe(dppe)}2N2]2+ // Angew. Chem. Int. Ed. 1975. V. 14. P. 571-575.

137. Shilov A.E. Dinitrogen fixation in solution in the presence of iron complexes. Intermediates and mechanism // New J. Chem. 1992. V. 16. P. 213-218.

138. Leigh G.J., Jimenez-Tenorio M. Exchange of dinitrogen between iron and molybdenum centers and the reduction of dinitrogen bound to iron: implications for the chemistry of nitrogenases // J. Am. Chem. Soc. 1991. V. 113. P. 5862-5863.

139. Komiya S., Akita M., Yoza A., Kasuga N., Fukuoka A., Kai Y. Isolation of a zerovalent iron dinitrogen complex with 1,2-bis(diethylphosphino)ethane ligands///. Chem. Soc., Chem. Commun. 1993. P. 787-788.

140. Gilbertson J.D., Szymczak N.K., Tyler D.R. Reduction of N2 to Ammonia and Hydrazine Utilizing H2 as the Reductant // J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 10184-10185.

141. Mankad N.P., Whited M.T., Peters J.C., Terminal Fe1 N2 and FenH~ С Interactions Supported by Tris(phosphino)silyl Ligands // Angew. Chem. Int. Ed. 2007. V. 46. P. 5768-5771.

142. Shilov A. E., Dinitrogen reduction in protic media // In New Trends in the Chemistry of Nitrogen Fixation, J.Chatt, L. M. da Camara Pina and R. L. Richards, (Editors), Acad. Press. London. 1980. P. 13-24

143. Shilov A. E. Catalytic nitrogen fixation in solution // In: Energy Resources through Photochemistry and Catalysis, M. Gratzel (editor). Academic Press. 1983. P.535-557.

144. Shilov A. E. Catalytic reduction of dinitrogen in protic media chemical-models of nitrogenase //J. Molec. Catal. 1987. V. 41. №1-2. P. 221-234.

145. Shilov A. E. Intermediate complexes in chemical and biological nitrogen fixation // Pure & Appl. Chem, 1992. V. 64. №10. P. 1409-1420.

146. Shuvalov V.F., Shuvalova N.I., Shilova A.K. New Nitrogenase Model for Reduction of Molecular Nitrogen in Protonic Media // Nature. 1971. V. 231. P. 460-462.

147. Antipin M.Yu., Didenko L.P., Kachapina L.M., Shilov A.E., Shilova A.K., Struchkov Yu.T. Polynuclear molybdenum(VI)- molybdenum(V) complex: a precursor of the catalyst for dinitrogen reduction // J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1989. P.1467-1468.

148. Lee C.C., Hu Y. and Ribbe M.W. Vanadium Nitrogenase Reduces CO // Science. 2010. V. 329. P. 642-644.

149. Shilov A.E. Catalysis with Organized Molecular Systems // In: Perspectives in Catalysis. J. A. Thomas and К. I. Zamaraev (eds). Blackwell 1992. P. 169.

150. Николаева Г.В., Ефимов O.H., Денисов H.T., Брикенштейн Х-М. А. Восстановление N2 на системе Ti(OH)3- Мо(ОН)з -амальгама натрия // Ж. физ. Химии. 1976. Т. 50. №11. С. 3009-3012.

151. Диденко Л.П., Шилова А.К., Шилов А.Е. Сокаталитическая роль фосфолипида в восстановлении азота в присутствии молибдена // Докл. АН СССР. 1980. Т. 254. №3. С. 643-645.

152. Шилова А.К., Махаев В.Д., Шилов А.Е. Каталитическое восстановление азота при комнатной температуре и атмосферном давлении // Докл. АН СССР. 1984. Т. 277. С. 1414-1417.

153. Didenko L.P., Gavrilina O.K., Yablonskaya E.E., Shilova A.K., Phospholipid-dependent catalytic dinitrogen reduction in the presence of molybdenum complexes // Nouv. J. Chim. 1983. V. 7. P. 605-611.

154. Didenko L.P., Gavrilov A.B., Shilova A.K., Shilov A.E., Dinitrogen fixation. Fast amalgam and electrochemical catalytic N2 reduction at ambient temperature and pressure II Nouv. J. Chim. 1986. V. 10. P. 584-590.

155. Шилова A.K., Стрелец B.B., Диденко Л.П., Шилов А.Е., Каталитическое восстановление азота амальгамой натрия в фосфолипидной пленке при пониженных температурах // Кинетика и катализ. 1987. Т. 28. С. 12391242.

156. Шилова А.К., Ефимов О.Н., Махаев В.Б., Шилов А.Е., Роль сокатализаторов в каталитическом восстановлении азота амальгамой натрия И Кинетика и катализ. 1995. Т 36. №2. С. 249-252.

157. Antipin M.Yu., Struchkov Yu.T., Shilov A.E., Shilova A.K. Geterometallic bi- and polymolybdenum complexes: precursors of the catalysts for dinitrogen reduction // Gazz. Chim. Ital. 1993. V. 123. P. 265-270.

158. Вайсберг А. Проскауэр Э. Риддик Дж. Туне Э. Органические растворители. М.: ИЛ. 1958. с. 341.

159. Брауэр Г. Руководство по препаративной неорганической химии. М.: ИЛ. 1956. с. 683.

160. Талалаева Т.В., Кочешков К.А. Методы элементоорганической химии. Литий. М.: Наука. 1971. с. 152.

161. Талалаева Т.В., Кочешков К.А. Методы элементоорганической химии. Литий. М.: Наука. 1971. с. 475.

162. Талалаева Т.В., Кочешков К.А. Методы элементоорганической химии. Литий. М.: Наука. 1971. с. 97.

163. Талалаева Т.В., Надь М.М., Кочешков К.А. Эфираты и диоксанаты литийорганических соединений // Докл. АН СССР. 1956. Т. 109. С. 101105.

164. Алексеев В.Н. Количественный анализ. М.: Изд. Хим. Лит. 1963. с. 490.

165. Bazhenova Т.A., Kachapina L.M., Shilov А.Е., Antipin M.Yu., Struchkov Yu.T. Mono- and binuclear a-aryl iron-lithium hydrides; synthesis and molecular structure // J. of Organomet. Chem. 1992. V. 428. P. 107-123.

166. Bazhenova T. A., Emelyanova N. S., Shestakov A. F., Shilov A. E., Antipin M. Yu., Lyssenko K. A. Molecular Structure and Reactions of Azobenzene Complexes with Iron-Lithium Compounds // Inorg. Chim. Acta. 1998. V. 280. P. 288-297.

167. Bazhenova Т.A., Shestakov A.F., Shilov A.E., Antipin M.Yu., Struchkov Yu.T., Lyssenko K.A. Reaction of an Iron-lithium complex with tolane and the structure of dilithiumtetraphenylbutadiene formed // J. of Organomet. Chem. 1995. V. 490. P. 71-73.

168. Ho, J.; Drake, R.J.; Stephan, D.W. Cp2Zr(mu-PPh).2[((THF)3Li)2(mu-N2)]: a remarkable salt of a zirconocene phosphinidene dianion and lithium dication containing side-bound dinitrogen //J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 37923793.

169. Bazhenova T.A., Kulikov A.V., Shestakov A.F., Shilov A.E.,. Antipin M.Yu., Lyssenko K.A. Structure of Li2Cl 6THF.[Cp2ZrPPh2] and Its Implications for the Nature of Dilithium Dinitrogen Complex // J. Amer. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 12176-12180.

170. Руководство по препаративной неорганической химии. Под ред. Брауера Г. М.: ИЛ. 1956. С. 165.

171. Сырцова Л.А., Попко Е.В., Лихтенштейн Г.И., Дружинин С.Ю. Изучение химического состава Fe-Мо-кофактора нитрогеназы новым флуориметрическим методом анализа тиосоединений // Биохимия. 1983. Т. 48. Вып. 7. С. 1195-1202.

172. Hawkes T.R., Smith В.Е. Purification and characterization of the inactive MoFe protein (NifB-Kpl) of the nitrogenase from ni/B mutants of Klebsiella pneumoniae II Biochem. J. 1983. V. 209. P. 43-50.

173. Бусев А.И. Аналитическая химия молибдена. Изд-во АН СССР. Москва. 1962. С. 205.

174. Алексеевский Е. В., Гольц Р. К., Мусакич А. П. Количественный анализ, Госхимиздат. Ленинград. 1957. С. 391.

175. Волынец В. Ф., Волынец А. П. Аналитическая химия азота. М.: Наука. 1977. С. 90.

176. Pickett C.J., Ryder K.S., Talarmin J. Electron-transfer reactions in nitrogen fixation. Part 2. The electrosynthesis of ammonia: identification and estimation of products //J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1986. № 7. P. 14531457.

177. Fawcett J.K., Scott J.E. A rapid and precise method for the determination of urea II J. Clin. Pathol. 1960. V. 13. P. 156-159.

178. Чубар Б., Шилов A.E., Шилова А.К., Каталитический эффект литиевых солей при восстановлении азота в системе FeCl3-LiPh-N2 // Кинетика и катализ. 1975. Т. 16. №4. С. 1079-1080.

179. Von Spiegl H.J., Groh G., Berthold H.J. Uber die Darstellung von Lithiumtetramethyloferrat(II), Li2Fe(CH3)4 / Z Anorg.allg.Chem. 1973. Bd.398. №3. P. 225-230.

180. Разуваев Г. Jl., Вышинская Л.И. Успехи химии о-производных переходных металлов IV-VI групп // Успехи химии. 1983. Т. 52. №10. С. 1648-1674.

181. Jacot-Guillarmod, Tabacchi R., Porret J. Etude sur les composes organometalliques, VIII. Synthese du tetrabenzyltitane / Helv.Chim.acta. 1970. V. 53. P. 1491-1493.

182. Дьячковский Ф.С., Хрущ H.E., Шилов А.Е. Кинетика гомолитического распада CH3TiCl3 под действием органических оснований // Кинетика и катализ. 1968. Т. 9. №5. С. 1006-1010.

183. Дьячковский Ф.С., Хрущ Н.Е., О механизме распада тетраметилтитана // Ж. общей химии. 1971. Т.41. №8. С. 1779-1783.

184. Bazhenova Т.A., Lobkovskaya R.M., Shibaeva R.P., Shilova A.K., Shilov A.E. Structure of the intermediate iron(O) complex isolated from the nitrogen fixing system LiPh + FeCl3 // J. of Organomet. Chem. 1983. V. 244. P. 265272.

185. Виноградова C.M., Шестаков А.Ф. Влияние симметрии лигандного окружения металла на линейную координацию молекулярного азота // Коорд. Химия. 1981. Т. 7. С. 974-982.

186. Taube R., Stransky N., Hoboldt W. a-organokomplex mit einer neideren Oxydationsstufe des Zentralatoms: Lithium-trisphenylnicolate(0)-3 Tetrahydrofuran//Z. Chem. 1979. № 11. S. 412-413.

187. Kachapina L.M., Borshch V.N., Kichigina G.A. Resonance Raman spectra and nature of the 2.3-2.5 eVelectronic transitions in some dinuclear dinitrogen-bridged complexes//Nouv. J. Chim. 1982. V. 6. P. 253-259.

188. Качапина Л.М., Кичигина Г. А., Махаев В. Д., Борисов А.П., Низкочастотный колебательный спектр комплекса молекулярного азота, хлоро(диазото)тетракис(диметилфенилфосфин)рения I // Изв. РАН, сер. хим. 1981. №10. С. 2185-2187.

189. Качапина Л.М., Спектроскопическое исследование комплексов молекулярного азота с соединениями переходных металлов // Дисс. канд. физ-мат. наук, Черноголовка, 1975.

190. Chatt J., Dilworth J.R., Leigh G.J., Richards R.L. Polynuclear dinitrogen complexes II J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1970. №15. P. 955-956.

191. Ричарде P.Л. Восстановление диазотного лиганда // В кн. Новое в химической фиксации азота. М.: Мир. 1983. С. 214-229.

192. Miura Yo., Yamamoto A. Novel dinitrogen-cobalt complexes Co(N2)(PR3)3Mg(THF)2. which liberate hydrazine on hydrolysis // Chem. Lett. 1978. P. 937-940.

193. Chatt J., Elson C.H., Hooper N.E., Leigh G.J. On the charge distribution in complexes II J. Chem. Soc., Dalton Trans. 1975. №22. P. 2392-2401.

194. Brintzinger H., Marvich R.H. Metastable form of titanocene. Formation from a hydride complex and reactions with hydrogen, nitrogen, and carbon monoxide II J. Am. Chem. Soc. 1971. V. 93. №8. P. 2046-2048.

195. Sarry B., Dettke M., Grossmann H. Wasserstoffverbindungen von Schwermetallen. VII. Eine Wasserstoffverbindung des Wolframs // Z. für anorg. und allgem. Chemie. 1964. V 329. № 1. P. 218-224.

196. Ackermann M.N., Naylor J.W., Smith E.J., Mines G.A., Amin N.S. and Kerns M.L. Iron carbonyl complexes of 2-(phenylazo)pyridines. First example of a six-electron, bridging 2-(phenylazo)pyridine ligand // Organometallics. 1992. V. 11. P. 1919-1926.

197. Allen F.H., Kennard O., Watson D.G., Brammer L., Orpen A.G., Taylor R. Tables of bond lengths determined by x-ray and neutron-diffraction . 1. Bond lengths in organic-compounds // J. Chem. Soc. Perkin Trans. II 1987. №12. S1-S19.

198. Mostad A., Romming C. A Refinement of the Crystal Structure of cis-Azobenzene //Acta Chem. Scand. 1971., V. 25. P. 3561-3568.

199. Cambridge Structural Database, edition 1996

200. Walsh P. J., Hollander F. J. and Bergmann R. G. Insertion of alkynes into zirconium-nitrogen bonds leading to 2,3-diazametallacyclopentenes. Generation and reactivity of Cp2Zr(N2Ph2) // J Organomet Chem. 1992. V. 428. №1-2. P. 13-47.

201. Dickson R. S. and Ibers J. A. pi.-Bonded azo-transition metal complex. Structure of bis(tert-butyl isocyanide) (azobenzene)nickel(O) // J. Am. Chem. Soc. 1972. V. 94. P. 2988-2993.

202. Ittel S. D. and Ibers J. A. The preparation and structure of bis(tri-p-tolylphosphine)(azobenzene)nickel(0), NitPCC^CHs^MCCeHs^NCöHs. // J. Organomet. Chem. 1973. V. 57. P. 389-402.

203. Bart J. C., Bassi I. W., Cerruti F. and Calcaterra M., Crystal and molecular-structure of cis-azobenzene bis(cyclopentadienyl) titanium // Gazz. Chim. Ital. 1980, V. 110. P. 423-442.

204. Zerger R. P. and Stucky G. D. Synthesis and crystal structure of bicyclol,l,0.butan-l-yl-lithium- tetramethylethylenediamine//J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1973. P. 44-45.

205. Re N., Sgamellotti A., Persson B.J., Roos B.O. and Floriani C. A Theoretical Study of the (Cyclobutane)diazadivanadium Complex // Organometallics. 1995. V. 14. P. 63-73.

206. Smith L.I. and Hoehn H.H. The Reaction between Lithium and Diphenylacetylene // J. Amer. Chem. Soc. 1941. V. 63. P. 1184-1187.

207. Braye E.H., Hübel W. and Caplier I. New Unsaturated Heterocyclic Systems II J. Amer. Chem. Soc. 1961. V. 83. P. 4406-4410.

208. Setzer W.N. von Raque Schleyer P. X-Ray Structural Analyses of Organolithium Compounds // Adv. Organomet. Chem. 1985. V. 24. P. 353451.

209. Kahn O., Chariot M.F., Overlap density in binuclear complexes a topological approach of the exchange interaction // Nouv. J. de Chimie. 1980. №4, P. 567-576.

210. Figgis, B.N., and Lewis, J. // Progress in Inorganic Chemistry. 1964. V. 6. P. 37.

211. Нейдинг А.Б. // Магнетохимия комплексов переходных металлов, M., 1970.

212. Дьячковский Ф. С., Шилов А. Е. Механизм реакции этиллития с иодистым этилом // Ж. общей химии. 1963. Т. 33. №2. С.406-411.

213. Хидридж Д. Электрохимия металлов в неводных растворах, под ред. Я. М. Колотыркина. М.: Мир. 1974. С. 166

214. Trimmel G., Slugovc C., Wiede P., Mereiter K., Sapunov V. N., Schmid R., Kirchner K. Labile complexes of the RuTp(pn).+ (Tp = tripyrazolylborate, pn

215. Ph2PCH2CH2NMe2) fragment including the dinitrogen ligand // Inorg. Chem. 1997. V. 36. P. 1076-1083.

216. Burgess В. K., Stiefel E. I., Newton W. E. Oxidation-reduction properties and complexation reactions of the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. // J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 353-356.

217. Almeida V.R., Gormal C.A., Gronberg K.L.C., Henderson R.A., Oglieve K. E., Smith B.E. Protonation and substitution reactions of Fe-S 'basket' clusters including extracted FeMo-cofactor of nitrogenase // Inorg. Chim. Acta. 1999. V. 291. P. 212-225.

218. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г. Биокинетика. М.: ФАИР-ПРЕСС. 1999.

219. Свердлов JI.M., Ковнер M.A., Крайнов Е.П. Колебательные спектры многоатомных молекул. М.: Наука. 1970. С. 218-290.

220. Benton Р.М.С., Christiansen J., Dean D.R., Seefeldt L.C. Stereospecificity of acetylene reduction catalyzed by nitrogenase // J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P.1822-1827.

221. Shen J, Dean D.R, Newton W.E., Evidence for multiple substrate-reduction sites and distinct inhibitor-binding sites from an altered Azotobacter vinelandii nitrogenase MoFe protein // Biochemistry. 1997. V. 36. №16. P. 4884-4894.

222. Henderson R.A. Protonation of Hydrocarbon Ligands // Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1996. V. 35. P. 946-967.

223. Gronberg, K.L.C., Henderson, R. A., Oglieve, K.E. A unified mechanism for the stoichiometric reduction of РГ and C2H2 by Fe4S4(SPh)4.3~ in MeCN // J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1998. P. 3093-3104.

224. Смирнов В. А. Восстановление амальгамами. JI.: Химия. 1970. С. 22.

225. Стрелец, В.В., Царев, В.Н., Особенности катализируемого ванадоценом амальгамного восстановления окиси углерода до метана // Кинетика и катализ. 1984. Т. 25. № 4. С. 821-829.

226. Pham D.N., Burgess В.К. Nitrogenase reactivity: effects of pH on substrate reduction and CO inhibition // Biochemistry. 1993. V. 32. P. 13725-13731.

227. Patricia D. Christie, Hong-In Lee, Linda M. Cameron, Brian J. Hales, W. H. Orme-Johnson, and Brian M. Hoffman. Identification of the CO-Bindingen

228. Cluster in Nitrogenase MoFe Protein by ENDOR of Fe Isotopomers // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 8707-8709.

229. Уэбб, Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма. М.: Мир. 1966.

230. Christiansen, J., Seefeldt, L. C., Dean, D. R. Competitive Substrate and Inhibitor Interactions at the Physiologically Relevant Active Site of Nitrogenase //J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 46. P. 36104-36110.

231. Muller, A., Schneider, K., Gollan, U. in Iron-sulfur proteins, New York: Wiley. 1982. p. 551.

232. Thorneley R.N.F., Eady R.R., Lowe D.J. Biological nitrogen fixation by way of an enzyme-bound dinitrogen-hydride intermediate // Nature. 1978. V. 272. P. 557-558.

233. March J. Advanced Organic Chemistry, 3rd ed. New York.: John Wiley & Sons. 1985. P. 1087-1136.

234. Izutsu K. Acid-base dissociation constants in dipolar aprotic solvents. Oxford.: Blackwell Scientific. 1990.

235. Бейтс P. Определение pH: теория и практика. Л.: Химия. 1972. С. 160.

236. Bordwell F.G. Equilibrium Acidities in Dimethyl Sulfoxide Solution // Acc. Chem. Res. 1988. V. 21. P. 456-463.

237. Dance I. The Hydrogen Chemistry of the FeMo-co Active Site of Nitrogenase //J. Am. Chem. Soc. 2005. V.127. P. 10925-10942.

238. Henderson R.A. Mechanistic Studies on Synthetic Fe-S-Based Clusters and Their Relevance to the Action of Nitrogenases // Chem. Rev. 2005. V. 105. P. 2365-2438.

239. Igarashi R.Y., Seefeldt L. C., Nitrogen Fixation: The Mechanism of the Mo-Dependent Nitrogenase // Crit. Rev. in Biochem. and Mol. Biol. 2003. V. 38. P. 351-384.

240. Rod Т.Н., Norskov, J.K. Modeling the nitrogenase FeMocofactor // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. P. 12751-12763.

241. Schultz F.A., Gheller S.F., Burgess B.K., Lough S., and Newton W.E. Electrochemical characterization of the iron-molybdenum cofactor from Azotobacter vinelandii nitrogenase // J. Am. Chem. Soc. 1985. V. 107. P. 5364-5368.

242. Schultz F.A., Feldman В.J., Gheller S.F. and Newton W.E. Effects of oxidation state, solvent acidity and thiophenol on the electrochemical properties of iron-molybdenum cofactor from nitrogenase // Inorg. Chim. Acta. 1990. V. 170. №1. P. 115-122.

243. Дамаскин Б.Б., Петрий O.A., Цирлина Г.А. Электрохимия. Химия. Москва. 2001. 624 с.

244. Диксон M., Уэбб Э. Ферменты. Мир. Москва. 1982. Т. 2. с. 627. М. Dixon and Е. С. Webb, Enzymes, Longman Group Ltd., London, 1979.

245. Lowe D., Fisher K., Thorneley R. Klebsiella pneumonia nitrogenase. Mechanism of acetylene reduction and its inhibition by carbon monoxide // Biochem. J. 1990. V. 272. P. 621-625.

246. Syrtsova L., Nadtochenko V., Denisov N., Timofeeva E., Shkondina N., Gak V. Kinetics of Elementary steps of Electron Transfer in Nitrogenase in the Presence of a Photodonor // Biochemistry (Moscow) 2000. V. 65., №10. P. 1145-1152.

247. Johnson J., Nyborg A., Wilson P., Tolley A., Nordmeyer F., Watt G. Analysis of steady state Fe and MoFe protein interactions during nitrogenase catalysis //Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1543. P. 36-46.

248. Duyvis M., Wassink H., Haaker H. Nitrogenase of Azotobacter vinelandii: Kinetic Analysis of the Fe Protein Redox Cycle // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 17345-17354.

249. Bergersen F.J. and Turner G.L. Kinetic Studies of Nitrogenase from Soya-Bean Root-Nodule Bacteroids II Biochem. J. 1973. V. 131. P. 61-75.

250. Ferraudi G. Magnetokinetic effect in outer-sphere electron-transfer reactions: on the role of spin-orbit and hyperfine coupling // Molecular Physics. 1997. V. 91. №2. P. 273-279.

251. Ferraudi G. On the Adiabaticity Contribution to the Rate of Outer-Sphere Electron Transfer. Reactions of Cytochrome с and Related Transition Metal Compounds // Inorg. Chem. 2000. V. 39. №13. P. 2866-2873.

252. Burns R. C. The nitrogenase system from Azotobacter Activation energy and divalent cation requirement // Biochim. Biophys. Acta. 1969. V. 171. P. 253259.

253. Watt G.D., Bulen W.A., Burns A., and Hadfield, K. L. Stoichiometry, ATP/2e Values, and Energy Requirements for Reactions Catalyzed by Nitrogenase from Azotobacter vinelandii // Biochemistry. 1975. V. 14. P. 4266-4272.

254. Watt G.D., Burns A., Kinetics of dithionite ion utilization and ATP hydrolysis for reactions catalyzed by the nitrogenase complex from Azotobacter vinelandii II Biochemistry. 1977. V. 16. P. 264-270.

255. Сырцова JI.A., Котельников А.И., Шкондина Н.И., Лапшина М.А. Влияние глицерина на реакции нитрогеназы // Кинетика и катализ. 2004. Т. 45. № 1.С. 35-44.

256. Thorneley R., Lowe D. Nitrogenase of Klebsiella pneumoniae. Kinetics of the dissociation of oxidized iron protein from molybdenum-iron protein: identification of the rate-limiting step for substrate reduction // Biochem. J. 1983. V. 215. P. 393-403.

257. Peters J., Fisher K., Newton W., Dean D. Involvement of the P Cluster in Intramolecular Electron Transfer within the Nitrogenase MoFe Protein // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 27007-27013.

258. Tittsworth R. and Hales B. Detection of EPR Signals Assigned to the 1-equiv-Oxidized P-Clusters of the Nitrogenase MoFe-Protein from Azotobacter vinelandii //J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 9763-9767.

259. Lanzilotta W., Christiansen J., Dean D., Seefeldt L. Evidence for Coupled Electron and Proton Transfer in the 8Fe-7S. Cluster of Nitrogenase // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 11376-11383.

260. Noodleman L., Peng C.Y., Case D.A., Mouesca J.-M. Orbital interactions, electron derealization and spin coupling in iron-sulfur clusters // Coord. Chem. Rev. 1995. V. 144. P. 199-244.

261. Gray H., Winkler J. Long-range electron transfer // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2005. V. 102. P. 3534-3539.

262. Davidson V. Protein control of true, gated, and coupled electron transfer reactions // Accounts of chemical research. 2008. V. 41. P. 730-738.

263. Boll M., Fuchs G., and Lowe D.J. Single turnover EPR studies of Benzoyl-CoA reductase II Biochemistry. 2001. V. 40. P. 7612-7620.

264. Boll M., Fuchs G., Meier C., Trautwein A. and Lowe D. J. EPR and Mossbauer studies of Benzoyl-CoA reductase II J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 31857-31868.