Сравнительное экспериментальное изучение механизма восстановления субстратов нитрогеназы при катализе модельным MgMo комплексом и природным кластером FeMoco, выделенным из фермента тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

БАРДИНА Надежда Владимировна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ВОССТАНОВЛЕНИЯ СУБСТРАТОВ НЙТРОГЕНАЗЫ

ПРИ КАТАЛИЗЕ МОДЕЛЬНЫМ М§Мо КОМПЛЕКСОМ И ПРИРОДНЫМ КЛАСТЕРОМ ЖеМосо, ВЫДЕЛЕННЫМ ИЗ ФЕРМЕНТА

02 00 15-катализ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Работа выполнена в Институте проблем химической физики РАН

Научный руководитель: кандидат химических наук

Баженова Тамара Александровна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Шур Владимир Борисович

Институт элементоорганических соединений им А Н Несмеянова РАН, г Москва

кандидат химических наук Чепайкин Евгений Григорьевич

Институт структурной макрокинетики и проблем материаловедения РАН, г Черноголовка

Ведущая организация: Московский государственный университет

им М В Ломоносова, Химический факультет, г Москва

Защита состоится 23 апреля 2008 г в Ю00 на заседании диссертационного совета Д 002 082 02 при Институте проблем химической физики РАН по адресу 142432, Московская обл, г Черноголовка, просп академика Н Н Семенова, 1, корпус общего назначения Института проблем химической физики РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института проблем химической физики РАН

Автореферат разослан 29 февраля 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор химических наук ТС Джабиев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Нитрогеназа является ферментом, катализирующим восстановление атмосферного азота до аммиака, который необходим живым организмам для биосинтеза аминокислот и других жизненно важных азотсодержащих молекул Несмотря на многолетние исследования, механизм нитрогеназного катализа еще далеко не ясен Среди подходов, используемых для получения информации о работе энзимов, особое место занимает биомиметический подход, который подразумевает изучение более простых - неферментативных модельных систем, созданных с использованием принципов и методов ферментативного катализа Применение его в настоящей работе дало возможность прояснить детали механизма восстановления субстратов в активном центре фермента, который на сегодняшний день содержит наибольшее количество нерешенных вопросов механизма биологической фиксации азота

Объекты исследования данной диссертационной работы - это уникальные каталитические системы, созданные и изучаемые в лаборатории акад А Е Шилова в ИПХФ РАН В состав одной из них входит природный, выделенный из МоРе-белка нигрогеназы кластер РеМосо состава [(|л-Х)МоРе789 гомоцитрат], являющийся центром координации и восстановления субстратов фермента Вторая является функциональной моделью нитрогеназы, роль активного центра в которой выполняет полиядерный кластер низковалентного молибдена, образующийся при восстановлении К^Мо комплекса известной структуры [М§2Мо8022(МеО)б(МеОН)4][^(МеОН)6] бМеОН В оптимальных условиях эта система восстанавливает азот с высокими скоростями и является на сегодняшний день самой эффективной среди модельных протонных азотфиксирующих систем

Сравнение реакционной способности и каталитических свойств Мо-содержащих кластеров, проводимое в одинаковых небиологических условиях, позволяет определить сходства и различия в механизме активации и восстановления инертной молекулы азота природными и искусственными системами Таким образом, изучение механизма восстановления «малых» молекул - субстратов нитрогеназы этими системами представляет огромный интерес, что наравне с изучением строения активных центров, принимающих непосредственное участие в каталитическом цикле, поможет понять причины уникальной эффективности ферментативного восстановления молекулярного азота

Цель работы

Данная работа была направлена на получение информации о механизме превращения субстратов нитрогеназы при катализе гетеробиметаллическими молибден-содержащими кластерами природного (РеМо кофактор) и искусственного (]\%Мо комплекс) происхождения

Работа включала следующие задачи

1 Изучение кинетических закономерностей восстановления ацетилена, катализируемого М^Мо комплексом, и ингибирования этой реакции молекулярным азотом и оксидом углерода (II) в тех же самых условиях и с участием тех же восстановителей, что были использованы при изучении каталитической реакционной способности выделенного из фермента РеМосо

2 Исследование влияния потенциала внешнего донора электронов, а также кислотности и химической природы протонирующего агента на реакцию восстановления С2Н2, катализируемую РеМосо вне белка

3 Сравнение каталитического поведения природного - РеМосо, и синтетического, моделирующего функцию нитрогеназы - М§Мо комплекса, на основе результатов, полученных в одинаковых небиологических условиях

4 Синтез и исследование состава и строения соединений молибдена, участвующих в активации азота в протонных азотфиксирующих системах

Научная новизна

В работе впервые проведено подробное исследование каталитических свойств магний-молибденового комплекса, входящего в активный центр самой эффективной на сегодняшний день модельной азотфиксирующей системы, посредством изучения кинетических закономерностей восстановления альтернативного субстрата нитрогеназы - ацетилена На основе полученных результатов проведено сравнение свойств как катализаторов и показано значительное сходство механизмов катализа с участием выделенного из белка активного центра нитрогеназы - РеМо кофактора и синтетического М§Мо комплекса в реакциях восстановления С2Н2 и ингибирования их оксидом углерода (II)

В работе впервые приведены экспериментальные подтверждения механизма опосредованного протонирования субстрата при катализе металлическими кластерами, предсказанного ранее теоретическими расчетными методами, а также показано, что кластерные катализаторы благоприятствуют протеканию многоэлектронных окислительно-восстановительных реакций субстратов

Впервые выделены и охарактеризованы методом РСА молибден-содержащие комплексы - продукты первичного взаимодействия МоС15 с ИаОСНз в метаноле, являющиеся предшественниками каталитически-активных азотвосстанавливающих комплексов

Практическая значимость

Все полученные результаты по изучению восстановления субстратов нитрогеназы с участием в качестве катализаторов магний-молибденового модельного кластера и отделенного от белковой матрицы активного центра фермента - БеМо кофактора являются совершенно уникальными, как в смысле объектов исследования, так и в смысле использованных подходов

Понимание химического механизма функционирования одного из самых сложных ферментов - нитрогеназы - представляет интерес для фундаментальной науки само по себе, а в дальнейшем может стать научной основой создания новых экологически чистых катализаторов и каталитических процессов с использованием принципов, реализуемых в живой природе

Личный вклад автора

Автором выполнены эксперименты по выделению железо-молибденового кофактора из MoFe-белка нитрогеназы и синтезу молибден-содержащих алкоксидных комплексов, по изучению кинетики восстановления С2Н2 в присутствии Мо - содержащих комплексов, кинетические эксперименты по взаимному влиянию субстратов и ингибиторов (С2Н2, N2, СО), электрохимические эксперименты и обработка полученных результатов РСА синтезированных кристаллов выполнен МЮ. Антипиным и К А. Лысенко (Центр рентгеноструктурных исследований ИНЕОС РАН), ИК - спектры записаны Ю М Шульгой (АЦКП ИПХФ РАН), квантово-химические расчеты выполнены совместно с А Ф Шестаковым (ИПХФ РАН)

Апробация работы

Основные результаты проведенных исследований были представлены в виде устных и стендовых докладов на международных и российских конференциях и симпозиумах «Modern trends m organometalhc and catalytic chemistry» (Москва, 2003), «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2003), «Современная химическая физика» (Туапсе, 2003, 2004,), «The 6th European Nitrogen Fixation Conference» (Тулуза, Франция, 2004), "Molecular design and synthesis of supramolecular architectures" (Казань, 2004), «Всероссийский симпозиум молодых ученых по химической кинетике» (Москва, 2004, 2006), «Механизмы каталитических реакций» (Санкт-Петербург, 2006) и на Конкурсе молодых ученых им С М Батурина (Черноголовка, ИПХФ РАН, 2004,2005)

Публикации

По результатам работы опубликовано 3 статьи в российских и зарубежных журналах, 9 тезисов докладов, список которых приводится в конце данного реферата

Объем и структура диссертации

Данная диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, главы, содержащей результаты работы и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из 185 названий Работа изложена на 134 страницах, включает 23 рисунка, 6 таблиц и 3 схемы

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность исследований, выполненных в работе, сформулированы цели и задачи работы, ее научная новизна и практическая значимость

В первой главе изложен анализ научной литературы в области функционирования природного фермента нитрогеназы, его строения и свойств, а также истории и развития химических молибденсодержащих азотфиксирующих систем

Во второй главе описаны экспериментальные методики очистки исходных реагентов и растворителей, синтеза Мо-содержащих комплексов и выделения БеМо кофактора, методики проведения реакции восстановления субстратов нитрогеназы, а также аналитические методы, использованные в работе

В третьей главе приведены результаты подробного изучения кинетического исследования восстановления С2Н2 при катализе ]У^Мо комплексом и влияния СО и N2 на этот процесс в сравнении с аналогичными данными1, полученными для системы с участием РеМосо вне белка В этой же главе представлены и обсуждаются результаты по влиянию химической природы протонирующего агента и потенциала восстановителя при различных температурах на каталитическое восстановление ацетилена в присутствии изучаемых кластеров Кроме того, приводятся данные по строению и квантово-химическому расчету некоторых свойств синтезированных Мо-содержащих комплексов -предшественников кластера-катализатора, изучаемого в данной работе

Кинетические закономерности восстановления ацетилена при катализе магний-молибденовым комплексом

К началу настоящей работы было показано, что выделенный из белка железо-молибденовый кофактор нитрогеназы является эффективным катализатором восстановления ацетилена, протонов, и некоторых других субстратов, а также способен обратимо координировать молекулу азота Продуктов восстановления азота обнаружено не было В то же время, его функциональный аналог - синтетический М§Мо комплекс активно восстанавливает эти субстраты, включая азот, со скоростями, сравнимыми с нитрогеназой

На рис 1 приведены молекулярные структуры MgMo кластера и РеМосо Нужно отметить, что оба они являются предшественниками активных кластеров, так как для проявления ими каталитической активности необходимо их предварительное восстановление

'Баженова М А Каталитическое поведение РеМосо вне белка Дисс Канд хим наук, Москва МГУ, 2001,124с

6

^ р

CH3S-

а)

б)

Рис. 1. Молекулярная структура К/^Мо комплекса (а); Структура РеМосо в составе МоРе-белка Аго/оЬааег у1пе1апс1И (б)

Для проведения адекватного сравнения свойств каталитических кластеров в качестве модельной была выбрана реакция восстановления ацетилена. Продуктами являются этилен и этан, накапливающиеся параллельно. В качестве восстановителей использовали амальгамы металлов или катод с заданным потенциалом, а в качестве доноров протонов тиофенол и ряд других соединений.

Для системы с 1У^Мо комплексом в качестве катализатора были изучены зависимости начальной скорости модельной реакции от концентрации катализатора, субстрата, от потенциала катода, от влияния ингибитора-СО и N2, а также методом ИК-Фурье спектроскопии исследовалась стереоспецифичность реакции (в автореферате не приводится).

Из зависимостей скоростей образования этилена и этана от объемной концентрации катализатора в реакционном растворе (рис. 2), имеющих вид кривых с насыщением, был сделан вывод о том, что, реакции, приводящие к образованию продуктов восстановления, осуществляются на поверхности амальгамы без выхода катализатор-субстратного комплекса в объем раствора.

• Условия реакции-. Eu/Hg (0.35М) 0.5 мл; MgMo комплекс; [PhSH] = 0.003 М; растворитель - МеОН (4.2 мл); /ХГ2Н2 110 Topp; 21 °С

Рис. 2. Зависимость скоростей образования этилена и этана от объемной концентрации катализатора в реакции восстановления ацетилена

0.0 0.5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 [MgMoJTO3, моль/л

На рис 3 приведена зависимость скоростей образования продуктов восстановления С2Н2 в газовой фазе над реакционным раствором Видно, что накопление этилена и этана происходит параллельно и в широком диапазоне давлений ацетилена плавно увеличивается (эффект активации реакции избытком субстрата)

4,0 3,5

g 3,0 | 2>5

Л

§ 2,0 S

Ъ 1.5 =£ 1,0 0,5 0,0

рС Н Topp

0 100 200 300 400 500 600 pC2H2, Topp

Рис. 3. Зависимость скоростей образования этилена и этана от давления субстрата в реакции восстановления С2Н2, на врезке увеличен рисунок в области давлений С2Н2 0-25 Topp

Условия реакции [MgMo] =5 10"6 М, [PhSH] =0 01 М, МеОН, Eu/Hg, С2Н2, 21°С

Объяснить такой характер зависимости можно, предположив образование в системе помимо обязательного катализатор-субстратного комплекса, также активного тройного комплекса «катализатор-субстрат-субстрат» (схема 1)

Схема 1

С2Н4 С2Н6

[Mg2Mo8]+C2H2, Кт~ {[Mg2Mo8]C2Hj\-X [Mg2Mo8]

с2н2

К\

C2H2[Mg2Mo8]C2Hj

[Mg2Mo8]C2Hj-

С2Н4 С2Н6

Найденные значения констант Михаэлиса (К„,) для этилена и этана в области низких концентраций ацетилена (3-22 Topp (рис 3, врезка) составили 0 0048 и 0 0023 атм С2Н2, соответственно То, что значения Кт для двух образующихся продуктов различны, может свидетельствовать либо о существовании различных центров связывания на каталитическом кластере, один из которых преимущественно дает этилен, а другой этан, либо о том, что в течение реакции не соблюдаются равновесные условия, то есть, на скорость стадии связывания молекулы ацетилена с кластером существенное влияние оказывают

последующие стадии Полученные экспериментальные данные показывают, что восстановленный MgMo кластер имеет несколько взаимозависимых субстрат координирующих центров По-видимому, один из них, самый активный (работает при низких давлениях ацетилена) дает этан и этилен в одинаковой пропорции - при давлении ацетилена до 7 Topp доля этана составляет около 50% в продуктах реакции

Ингибирование оксидом углерода (II) восстановления ацетилена

С целью получения информации о механизме восстановления субстратов на каталитическом кластере было проведено исследование влияния ингибирующего действия СО на каталитическое восстановление ацетилена в присутствии MgMo комплекса Молекула СО, являясь изоэлектронным аналогом N2 и С2Н2, связывается с восстановленным в ходе каталитического цикла кластером, что приводит к уменьшению скорости накопления продуктов реакции (рис 4) Обработка кинетических данных по ингибированию СО в координатах Диксона и Корниш - Боудена (в реферате не приводятся) позволила определить тип ингибирования и рассчитать все константы процесса Таким образом было показано, что ингибирование процесса восстановления ацетилена монооксидом углерода (К^ = 0 14 атм СО) протекает по смешанному типу, причем вклад неконкурентного ингибирования оказывается, больше конкурентного (К, > К',) (см схему 2)

1 4

1 2

х Ю

й 08 I

о" 0 6 0,4 0,2-

СД

Рис 4. Зависимость скоростей образования этилена и этана от давления ингибитора СО

Условия реакции [MgMo] = 5 10~s М, [PhSH] = 0 01 М, МеОН, Eu/Hg, рС2Пг 107 Topp, СО, 21 °С

О 10 20 30 40 50 рСО, Topp

Интересным наблюдением оказалось различие значений констант неконкурентного ингибирования для этилена и этана, что может указывать на то, что молекула СО связывается с комплексом, уже имеющим в координационной сфере молекулу субстрата, на разных стадиях реакции восстановления ацетилена

Данные по влиянию СО на восстановление ацетилена при катализе MgMo комплексом подтверждают ранее сделанный вывод о существовании нескольких взаимозависимых центров координации субстратов и ингибиторов на восстановленном MgMo каталитическом кластере

Схема 2 Каталитическое превращение ацетилена в этилен и этан в системе с участием М§Мо комплекса в присутствии оксида углерода (II)

с2н4 с2н6

[М^2Мо8]

«I

+ СО

[М82Мо„] СО

С2Н2

+ С2н2

а К',

К, - 0 14 атм СО Л:,' (С2Н4)=0 02 атм СО Л7(С2Н6)=0 04 атм СО

+ пН / пе

[Mg2Mo8] С2Н2 )- - - \ [МВ2Мо8] С2Н2+п

+ СО

[М8!Мо,] С2Н2 СО

I к2

к\

+ СО

пН / пе

С2Н4

[МВ2Мо8) С2Н2+пСО

Р к3 С2Н6

Ингибирование ацетиленом восстановления азота в системе с участием MgMo комплекса

Для определения характеристик образующегося комплекса N2 с восстановленным М^Мо комплексом и сравнения их с параметрами, полученными для природного катализатора БеМосо, были проведены опыты по ингибированию модельной реакции молекулярным азотом Однако в системе на основе К^Мо комплекса мы не обнаружили эффекта ингибирования даже при очень низких концентрациях ацетилена в газовой фазе Ингибирование ацетиленом восстановления N2 происходит, наоборот, очень эффективно В связи с этим, в настоящей работе приведены данные по ингибированию восстановления N2 ацетиленом в оптимальных для восстановления азота условиях Высокие скорости образования К2Н4 и ИНз наблюдаются в так называемой «полной» системе, когда в качестве восстановителя используется амальгама натрия, и присутствуют сокатализаторы - фосфатидилхолин и трибутилфосфин В этих условиях ацетилен является очень хорошим субстратом с константой Михаэлиса Кт около 3 10"4 атм С2Н2 (найдено из данных по ингибированию) Запределивание же скорости реакции по концентрации азота наблюдается при давлениях N2 в несколько десятков атмосфер, а рассчитанное значение Кт для азота из данных по ингибированию восстановления азота ацетиленом составило порядка 25 атм Не удивительно, что ацетилен эффективно ингибирует восстановление азота в этих условиях

На рис 5 приведены зависимости скорости восстановления азота (при двух разных значениях давления N2) от концентрации ацетилена в газовой фазе Прямые пересекаются на оси абсцисс «давление ингибитора» в области отрицательных значений, что свидетельствует о протекании ингибирования реакции по неконкурентному типу Найденное значение константы ингибирования (К,) составило 0 009 атм С2Н2

760 Topp (2), данные в координатах Диксона

Условия реакции [MgMo] = 83 10~бМ, [фосфатидилхолин] = 3 10"4 М, [Ви3Р] = 5 10~3 М, [NaOMe] = 6 10~3 М, [Bu4NBr] = 0 1 М, МеОН, Na/Hg (1 07 М), С2Н2,21 °С

Сравнение с аналогичными данными для нитрогеназной системы in vitro показывает, что в природной системе и лучшей ее функциональной модели сродство каталитического кластера к ацетилену больше, чем к азоту на несколько порядков, при этом С2Н2 неконкурентно ингибирует восстановление N2 с близкими значениями констант ингибирования (К, = 0 008 атм С2Н2 в случае нитрогеназной системы in vitro1)

Проведенное изучение кинетических закономерностей восстановления ацетилена в системе с MgMo комплексом в качестве катализатора и сравнение с аналогичными данными для природного кластера FeMoco, выделенного из белка, показывает на значительное сходство протекания изучаемых процессов Обе системы являются эффективными катализаторами восстановления С2Н2 и характеризуются близкими значениями констант Михаэлиса На полиядерном MgMo комплексе, как и на восстановленном амальгамой европия FeMoco, активны к субстратам и ингибиторам несколько взаимозависимых координирующих центров СО гораздо менее эффективно, чем при катализе FeMoco, ингибирует реакцию восстановления ацетилена, хотя, как было найдено, тип ингибирования в обеих системах смешанный СО координируется на нескольких центрах кластера и влияет как на стадию комплексообразования С2Н2 с восстановленным кластером, так и на стадию разложения катализатор-субстратного комплекса с образованием продуктов В обоих случаях восстановления СО не наблюдается MgMo кластер, в отличие от FeMoco, эффективно катализирует восстановление молекулярного азота Ацетилен является очень сильным ингибитором этой реакции При этом ингибирования восстановления ацетилена азотом в условиях эксперимента не наблюдается, что является следствием высокого сродства MgMo комплекса к ацетилену, в несколько тысяч раз превышающего сродство к молекулярному азоту

'Rivera-Ortiz J M,R Н Burns Interactions among substrates and inhibitors of nitrogenase J Bactenol, 1975, V 123, № 2, p 537-545

Влияние потенциала внешнего донора электронов на реакцию восстановления ацетилена, катализируемую РеМосо вне белка и М^Мо комплексом

Ранее при изучении каталитической системы с участием М^Мо комплекса было обнаружено, что скорость восстановления С2Н2 экспоненциально зависит от заданного потенциала катода из амальгамы цинка в присутствии тиофенола1 Это означает, что лимитирующей стадией процесса является перенос электрона от катода на каталитический кластер Для проведения сравнения изучаемых систем и по этому параметру в настоящей работе представлены результаты аналогичного исследования для БеМосо вне белка в присутствии доноров протонов с различной кислотностью

Протонирующие агенты - тиофенол или вода

На рис 6 представлена экспериментально полученная зависимость скорости восстановления ацетилена до этилена от потенциала катода (2п/Щ) в

Видно, что с увеличением отрицательного потенциала рабочего электрода наблюдается резкое возрастание скорости образования этилена, при этом в широком диапазоне значений потенциалов скорость реакции экспоненциально зависит от потенциала катода Аналогичные экспоненциальные зависимости скорости реакции образования С2Н4 от потенциала рабочего электрода получены и при катодной поляризации ртутного электрода, в присутствии и тиофенола, и Н20 Без тиофенола (при [Н20] в ДМФА = 5 10"2 М) заметное восстановление

ацетилена начинается только при потенциале Е ~ — 1 5 В, при этом этан не образуется ни при каких значениях катодного потенциала донной ртути

' Shilov А Е Catalytic dmitrogen reduction by amalgams In Electron transfer in Chemistry, V Balzani Ed, Wiley-VCH, Weinheim, 2001, P 899-903

2 Значения потенциалов приведены относительно насыщенного хлорсеребряного электрода (Ag/AgCl/KClHac)

присутствии выделенного из белка FeMoco

1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 В

Рис. 6 Зависимость скорости накопления С2Н4 от заданного потенциала рабочего электрода2, на врезке - преобразование зависимости в координатах Тафеля

Условия реакции лектрохимическая ячейка [FeMoco]=l 2 10"5 М, [PhSH]=l 2 1Г2 М, растворитель ДМФА, электрод Zn/Hg (2 мае %), 2 мл, площадь поверхности катода 3 1 см2, электрод сравнения Ag/AgCl/KCl(Hac), объем католита 6 5 мл, 20 °С, РС2Н2 100 Topp

При одинаковой величине задаваемого катодного потенциала, материал электрода также оказывает заметное влияние на скорость реакций На катодах из разных материалов (Н§, Тп!^ или Еи/Н§) при одинаковом потенциале, равном потенциалу амальгамы европия, и в присутствии одного и того же

протонирующего агента тиофенола, абсолютные значения скорости накопления продуктов различаются (табл 1) Скорость реакции зависит от материала электрода, если электрохимическому превращению предшествует стадия адсорбции, поскольку теплоты адсорбции различны для реагента и активированного комплекса

Энергию связи адсорбированной частицы с поверхностью катода определяет значение потенциала нулевого заряда, которое различно для поверхности ртути и амальгам

Скорость образования этана, накапливающегося параллельно этилену, также экспоненциально зависит от потенциала катода При этом, для этана зависимость имеет более сложный вид на ней явно выделяются два тафелевских участка с различными параметрами а и Ь (рис 7) и изломом зависимости при потенциале - 1 77 В Для реакций с последовательным переносом нескольких электронов излом на зависимости соответствует переходу от одной лимитирующей стадии к другой, причем обе эти стадии являются стадиями переноса одного из электронов Аналогичная ситуация наблюдается и в случае ¡У^Мо комплекса

Протонирующий агент - пентафтортиофенол

Использование вместо тиофенола его аналога с высокой кислотностью 8Н-группы - пентафтортиофенола, приводит не только к увеличению примерно в пять раз скорости реакции по этану и в три раза по этилену, которые так же, как и в присутствии тиофенола накапливаются параллельно, но и к изменению характера зависимости скорости реакции от потенциала катода опыты показывают, что после восстановления комплекса [РеМосо(Н+)(РЬ8")] до субстратсвязывающего состояния (Е = - 1 15 В), реакция не зависит от

Таблица 1. Влияние материала катода на скорость восстановления ацетилена при заданном потенциале Е = -1 67 В

Катод \У(С2Н4) 107, моль/мин \¥(С2Н6) 107, моль/мин

Еи/Щ 0 890 0 072

гп/щ 0 047 0 005

Нй 0 030 0 004

-£, В

Рис. 7.3ависимость скорости восстановления СгН2 до С2Нб от потенциала катода (2п/Н§), катализатор - РеМосо (условия реакции см подпись к рис 6 )

потенциала катода Кроме того, скорости накопления как этана, так и этилена, практически не зависят от материала катода поляризация чистой ртути и амальгамы цинка дает практически одинаковые скорости при одинаковых значениях потенциала Данные наблюдения говорят о том, что перенос электрона не является лимитирующей стадией в этом случае Вероятнее всего, пентафтортиофенол, как более сильная кислота, может осуществлять более чем однократное протонирование аниона РеМосо, что, в отличие от опытов с тиофенолом, уменьшает отрицательный заряд каталитического кластера и облегчает его адсорбцию на катоде Все это приводит к такому увеличению скорости электрохимической стадии, что лимитирует процесс в целом одна из последующих химических стадий, происходящих в координационной сфере металлокластера, скорее всего, внутримолекулярный перенос протона на субстрат в комплексе [(СбР581РеМ0С0(геа)(Н+)(С2Н2)], ведущий к образованию продуктов из координированного ацетилена

Изучение зависимости скорости каталитической реакции восстановления С2Н2 в присутствии 1У^Мо комплекса показало, что скорость накопления как этилена, так и этана экспоненциально растет с увеличением потенциала катода в интервале от -1 07 В до -1 9 В не только в присутствии тиофенола, но и более кислого донора протонов - пентафтортиофенола Из этого следует, что система с М^Мо комплексом менее чувствительна к кислотности протонирующего агента, видимо вследствие большей протонной емкости

Зависимость скорости реакции восстановления С2Н2 от температуры

В результате измерений скорости восстановления ацетилена при катализе РеМосо вне белка в присутствии тиофенола или пентафтортиофенола в потенциостатическом режиме (катод Ъа./Щ) было найдено, что скорость накопления и этилена, и этана возрастает экспоненциально с увеличением температуры в интервале от 13 до 30°С Выше температуру не поднимали, так как РеМосо обладает ограниченной термической устойчивостью и при температуре 40°С в значительной степени разрушается Рассчитанные по уравнению Аррениуса эффективные энергии активации образования продуктов реакции восстановления ацетилена приведены в таблице 2 В присутствии РЬвН величины различаются, причем меньшее значение получено для этана -продукта двухэлектронного восстановления С2Н2 В присутствии С6Р58Н величины для образования С2Н4 и С2Н6 заметно большие по значению и одинаковые, следовательно, в параллельных реакциях, по которым образуются эти продукты, существует общая лимитирующая стадия, сопровождающаяся значительными структурными изменениями Таким образом, изменение кислотности протонирующего агента влияет на механизм реакций восстановления субстратов нитрогеназы, катализируемых кластерами

Изучение зависимости скорости каталитической реакции восстановления С2Н2 в присутствии MgMo комплекса показало, что скорость накопления продуктов экспоненциально растет с увеличением температуры в интервале от 15 до 35°С Из рассчитанных по уравнению Аррениуса эффективных энергий

активации следует, что и для системы на основе катализатора MgMo комплекса Еакт образования С2Н6 меньше, чем Еаю„ образования С2Н4 (табл 2) независимо от кислотности реагента

Таблица 2. Энергии активации образования этилена и этана в присутствии тиофенола и пентафтортиофенола при катализе природным и синтетическим кластерами [MgMo] = 1 32 1(Г5 М, [PhSH] = [CsF5SH] = 1 2 10~2 М,рС2Н2 = 100 Topp

Катализатор условия реакции Еякт, ккал/моль

реагент -E, В С2Н4 С2Нб

FeMoco PhSH 1 7 18 3±15 12 8±2

c6f5sh 1 3 32±2 32±2

MgMo комплекс PhSH 1 3 9 4±0 6 5 4±0 6

c6f5sh 1 3 7 1±0 5 3 7±0 9

Можно сделать вывод, что общей особенностью изучаемых кластеров является то, что они представляют собой катализаторы для осуществления многоэлектронных процессов При этом абсолютные значения Еакт заметно больше в присутствии FeMoco, хотя были получены из опытов, проведенных при потенциале -17 В, а для системы с MgMo - при потенциале -13 В Учитывая, что с понижением потенциала при прочих равных условиях энергия активации уменьшается для систем, лимитирующей стадией которых является перенос электрона, это различие говорит о том, что в системе с MgMo комплексом наблюдается лучшая пространственная организация системы, более прочный контакт с амальгамой (восстановителем), что облегчает перенос электрона и уменьшает энергию активации

Влияние рКа и химической природы реагента на скорость восстановления ацетилена, катализируемого FeMoco вне белка

Было показано, что на восстановленном амальгамой европия FeMoco вне белка в растворе ДМФА реализуется стадия обратимой координации молекулы N2, хотя дальнейшего восстановления азота в комплексе не наблюдалось Для проверки предположения, что причиной этого может быть неподходящий по кислотности или химической природе источник протонов, было проведено изучение влияния характера протонирующего агента на реакции восстановления ацетилена с участием FeMoco вне белка Кроме того, такое исследование помогает прояснить механизм протонирования субстрата в системах с участием FeMoco, который неизвестен ни для нитрогеназы in vitro, ни для биомиметических систем с участием кофактора

В качестве потенциальных доноров протонов для образования С2Н4 и С2Н6 го С2Н2, были изучены 12 соединений Их строение и величины рКя в Н20 и ДМФА, приведены в таблице 3 Необходимыми требованиями при выборе являлись растворимость в ДМФА и значения pi*fa в ДМФА > 5 (в более кислой среде кофактор необратимо разрушается)

№ соединение Ркя вНгО1 рк„ вДМФА2

молекулярная формула название

1 CT тиофенол 66 107

2 Б пентафтортиофенол 27 68

3 0-" фенол 9 95 154

4 /^N HN^J имидазол 14 5 18 6

5 h 2-меркалтобензимидазол ~8 -13

6 cooh u ho—¿—cooh г cooh лимонная кислота 3 13 4 76 6 40 10 6 13 3 15 7

7 |X)OH COOH щавелевая кислота 1 2 42 86 16 6

8 0CI пирокатехин 92 -15

9 Ci8H38COOH стеариновая кислота 49 -13

10 ^C^COOH бензойная кислота 42 12 3

11 h3p04 ортофосфорная кислота 2 1 72 12 3 -10 -15 -20

12 H20 вода 15 7 -32

Выбор же химической природы соединений определялся строением лигандного окружения кофактора в белке при протекании реакции in vivo и in vitro (тиофенол, имидазол и их аналоги, вода, ортофосфорная кислота) и необходимостью «охватить» в исследовании различные классы соединений (карбоновые кислоты)

' March J Advanced Oiganic Chemistry, 3rd ed, New York John Wiley & Sons, 1985, P 1087-1136

2 Izutsu K Acid-base dissociation constants m dipolar aptotic solvents Oxford Blackwell Scientific, 1990

Для каждого из приведенных соединений [Н+А"] изучены скорости накопления С2Н4 и С2Н6 в системе {БеМосо + + С2Н2 + [Н+А~]} в ДМФА В данных условиях вода, ортофосфорная и монокарбоновые кислоты (бензойная и стеариновая), а также фенол оказались неактивными Остальные 7 соединений, обладая различным химическим строением, в системе активны, по-видимому, благодаря своей способности образовывать с кофактором координационную связь по типу лиганд - комплексообразователь Из зависимостей, приведенных на рис 8, видно, что значительное изменение кислотности (от 8 до 19) и различная химическая природа (при условии соблюдения возможности образования координационной связи) применяемых соединений слабо влияют на скорости накопления продуктов реакции

а)

9 9

10 12 14 р/свдмя>а

16

Д 0 06-

яГ

с_Г

% ода-

ооо-

б)

» 9

м 6 8 10 12 14 16 18 20

р/С вДШ>А

Рис.8. Зависимости скоростей образования этилена (а) и этана (б) от pifa протонирующего агента Условия реакции [FeMoco] = 1 10"s М, Zn(Hg) (4 27М) 0 7 мл [НА] = 1 10 2 М, растворитель - ДМФА (4 мл), давление С2Н2 100 Topp, 21°С

Для объяснения этого факта мы привлекли результаты всех работ, проведенных на выделенном из белка кофакторе, литературные данные по изучению влияния pH среды на нитрогеназную реакцию in vitro, а также, теоретические расчеты механизма протонирования в белке Совокупность экспериментальных данных, полученных для FeMoco вне белка, указывает на сложный, а не прямой (из среды), характер протонирования субстрата По-видимому, для осуществления реакции восстановления субстратов на FeMoco необходимо, чтобы источник протонов имел некоторое пороговое значение кислотности, при котором происходит протонирование мостикового атома серы с дальнейшим переносом водорода на субстрат Интересно, что в области значений pi*fa соединений от 8 до 19 независимость от кислостности протонирующего агента можно объяснить и тем, что для кофактора, как выделенного из белка, так и в составе фермента, стадия переноса протона не является лимитирующей При переходе же к более «кислому» соединению -пентафтортиофенолу - наблюдается смена лимитирующей стадии

Для системы с участием MgMo комплекса, также как для нитрогеназы in vitro и для систем с FeMoco вне белка, мы предполагаем наличие первоначальной стадии протонирования комплекса с последующим переносом

протона на координированный субстрат, поскольку наблюдаем сложную зависимость скорости реакции от концентрации тиофенола1 (что указывает на сложный характер протонирования), а также наличие зависимости скорости протекания реакции от химической природы донора протонов (активны не все соединения, даже обладающие достаточной кислотностью)

Таким образом, сравнивая экспериментальные данные, полученные при изучении восстановления ацетилена, катализируемого М^Мо комплексом и ТеМосо вне белка, можно сделать вывод, что механизмы протонирования сходны в обеих системах перенос протона на субстрат осуществляется не из среды, а с первоначально протонированных атомов каталитического комплекса

Алкоксидные комплексы молибдена, образующиеся при первичном взаимодействии МоС15 с МаОСН3: синтез, молекулярные структуры, ИБС спектры

Из двух Мо-содержащих систем, рассматриваемых в настоящей работе, синтетическим путем можно получить предшественник катализатора М§Мо комплекса по реакции взаимодействия МоСЬ со щелочами ("ОСНз или "ОН) При этом помимо 1У^Мо кластера образуется ряд соединений молибдена разной ядерности, которые в разной степени активны в реакции активации и восстановления азота Механизм образования полиядерного MgMo кластера

неизвестен В связи с этим, мы начали систематическое

изучение механизма образования и строения продуктов взаимодействия пентахлорида молибдена со щелочами в метаноле - основной реакции получения модельных

протонных каталитических азотвосстанавливающих систем К настоящему времени выделены и охарактеризованы два кристаллических продукта (рис 9, 10), полученные при разных мольных отношениях исходных реагентов Комплекс да/)анс-[С1(ОСНз)зМо(ц-ОСНз)2Мо(ОСНз)зС1] (1) был получен при мольном соотношении КаОСН3/МоС15 ~ 3 в виде темно-зеленых с металлическим блеском кристаллов плохо растворимых в спирте, воде, эфире В отличие от большинства кислород-содержащих комплексов Мо(У), комплекс 1 не содержит оксо - групп

1 Bazhenova T A Bazhenova M A , Mironova S A, Petrova G N, Shilova A K, Shuvalova NI, Shilov A E Catalytic leduction of acetylene m the presence of molybdenum and iron clusters, including FeMo cofactor of nitrogenase Inorg Chim Acta ,1997, V 270, P 221-226

Рис. 9 Кристаллическая структура комплекса 1

При соотношении

]МаОСН3/МоС15 > 5 в тех же условиях образуется комплекс 2 (рис. 10), винно-красные кристаллы игольчатой формы которого хорошо растворимы в метаноле. Соединение

представляет собой полимерную цепочку, содержащую

катионную [№(МеОН)]+ и анионную [Мо202(ОМе)7]" части, в которой при Мо(У) находятся как метокси-, так и оксо-группы.

Литий - содержащий аналог комплекса 2 был известен ранее, тогда как комплекс 1 синтезирован в настоящей работе впервые. Причем оказалось, что соотношение Мо:С1 в комплексе оказалось равным 1:1, хотя по реакции МоС15 с 3 эквивалентами основания это соотношение в продукте реакции должно равняться 1:2. Для объяснения причин образования комплекса с дефицитом С1-лигандов, был проведен анализ его структуры, способа образования и свойств с привлечением методов теоретического изучения. Методами функционала плотности ВЗЬУР и РВЕ были выполнены квантово-химические расчеты его строения, электронной структуры и ИК-спектра, и показано, что экспериментально найденная структура является основной по энергии. На основании рассчитанного ИК-спектра комплекса 1, который достаточно точно воспроизводит структуру экспериментального, было сделано отнесение линий в последнем. Кроме этого, был проведен анализ возможного пути образования комплекса, для чего были рассчитаны тепловые эффекты некоторых из вероятно протекающих в растворе реакций. И показано, что полученный комплекс, является устойчивым к диссоциации, и его состав обусловлен реакциями сольволиза.

Таким образом, применение теоретических методов расчета к Мо-содержащим комплексам может дать дополнительную информацию как об их структуре, так и о механизме их образования. Экспериментальное и теоретическое исследование молекулярного строения и механизма формирования молибденовых и молибден - магниевых оксо-алкоксидных кластеров высоковалентного молибдена, а также исследование процессов восстановления данных комплексов с образованием активных в катализе кластеров низковалентного молибдена будет продолжено. Это даст возможность понять особенности строения активных комплексов и определить факторы, обеспечивающие уникальную эффективность восстановления молекулярного азота протонными молибденсодержащими системами.

В четвертой главе проведен заключительный анализ полученных результатов, основанный на сравнении каталитического поведения природного ЕеМосо и синтетического MgMo кластеров в реакциях с субстратами и ингибиторами нитрогеназы.

Рис. 10. Молекулярная структура фрагмента полимерной цепи в кристалле комплекса 2

Можно выделить ряд сходных черт обе системы являются эффективными катализаторами восстановления ацетилена до этилена и этана со сходными параметрами образования комплекса «катализатор-субстрат» Продукты образуются по параллельным маршрутам, по-видимому, из одной и той же частицы [Cat(H)PhS(C2h2)] Cat = FeMoco или MgMo комплекс При этом эффективная энергия активации образования этана в полтора раза меньше, чем этилена, что является необычным и наблюдалось в настоящей работе впервые для металлокомплексных каталитических систем Было показано, что лимитирующая стадия процесса в обеих системах в присутствии тиофенола -электрохимическая, а именно, перенос электрона от катода на кластер И FeMoco, и MgMo комплекс в изучаемых системах имеют несколько взаимосвязанных субстрат (ингибитор) координирующих центров Оксид углерода (II) ингибирует восстановление ацетилена, при этом сам в системах не восстанавливается Использование различных соединений в качестве доноров протонов показало, что только те, которые каким-либо образом могут взаимодействовать с катализатором, способны эффективно протонировать его и координированный субстрат, причем, кислотность агента может находиться в достаточно широком диапазоне Механизм протонирования в обеих системах сложный, включает промежуточное протонирование атомов катализатора с последующим переносом протона на координированную молекулу ацетилена

Главные различия системы проявляют в отношении реакции с молекулярным азотом При катализе выделенным из белка FeMoco наблюдается только обратимое комплексообразование азота с восстановленным кластером, тогда как в присутствии MgMo комплекса происходит восстановление N2 до гидразина и аммиака Нам не удалось получить каких-либо характеристик первичного комплексообразования N2, поскольку в данной системе не наблюдается ингибирования восстановления ацетилена азотом По-видимому, уже в условиях далеких от насыщения по азоту, характер образующегося диазотного комплекса таков, что он быстро и необратимо протонируется с образованием N2H4 и NH3

Выводы

1. Изучена кинетика восстановления С2Н2 и ингибирование этого процесса N2 и СО при катализе синтетическим MgMo комплексом в условиях, аналогичных для системы на основе экстрагированного из фермента активного центра нитрогеназы (FeMoco) Сравнение основных параметров реакций показало значительное сходство механизмов каталитического восстановления субстратов в присутствии природного и синтетического кластеров

2. Изучено влияние потенциала внешнего донора электронов на каталитическое восстановление С2Н2 в присутствии FeMoco вне белка Показано, что в зависимости от кислотности протонирующего агента, лимитирующей стадией может быть как перенос электрона от катода на каталитический кластер, так и стадия переноса протона в катализатор-субстратном комплексе

3. Изучено влияние кислотности и химического строения источника протонов на реакции, катализируемые FeMoco вне белка Установлено, что протонирование субстрата, координированного на каталитическом кластере, происходит через стадию первичного протонирования атомов катализатора, то есть опосредованно

4. Исследованы температурные зависимости скоростей реакций, катализируемых FeMoco вне белка и MgMo комплексом Показано, что строение и состав обоих кластеров благоприятствуют протеканию многоэлектронных реакций

5. Впервые получены и охарактеризованы методом РСА монокристаллы двух алкоксо-комплексов молибдена, образующихся при разном соотношении МоС15 и NaOCH3 в реакционном растворе Показано, что при соотношении МоС15 NaOCH3 1 3 образуется редкий представитель димерных алкоксидов молибдена (V), Мо2(ОСН3)8С12, не содержащий оксо-групп, а при соотношении МоС15 NaOCH3 = 15- анионный биядерный комплекс, [Мо202(ОСНз)7]*, связанный в кристаллической решетке в цепи посредством взаимодействия с катионной группировкой [Na (СН3ОН)]+

6. На основании расчета методом функционала плотности найдено, что структура наинизшего по энергии изомера синтезированного биядерного комплекса молибдена (V) совпадает с экспериментальной Также-показано, что комплекс, является устойчивым к диссоциации в среде метилового спирта и его состав обусловлен реакциями сольволиза

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1 Баженова Т А, Бардина Н В , Петрова Г Н, Боровинская М А Влияние потенциала внешнего донора электронов на закономерности катализа восстановления С2Н2 в присутствии активного центра нитрогеназы, выделенного из фермента Изв АН, Сер хим , 2004, №8, с 1583-1591

2 Бардина Н В , Баженова Т А , Петрова Г Н, Шилова А К, Шилов А Е Сравнительное изучение каталитического поведения синтетического полиядерного Mg-Mo комплекса и активного центра нитрогеназы (FeMoco), выделенного из фермента, в реакциях с С2Н2, N2 и СО Изв АН, Сер хим, 2006, №5, с 766-774

3 N V Bardma, Т A Bazhenova, К A Lyssenko, М Y Antipm, Y М Shulga, Т A Filma and A F Shestakov The unusual bmuclear alkoxomolybdenum (V) complex oxo-groups free synthesis, structure and IR-spectra Mendeleev Communications, 2006, No 6, p 307-308

4 Bazhenova T A , Borovmskaya M A, Pavkaeva (Bardina) N V, Petrova G N Study of the catalytic reactivity of FeMoco extracted from the protein marix, substrate and inhibitor interactions // Materials of Memorial symposium dedicated to Professor Mark VoFpm (1923-1996) «Modern trends m organometallic and catalytic chemistry» - Moscow, 2003, p 197

5 Баженова Т А, Бардина Н В , Петрова Г Н Изучение влияния характера донора протонов на каталитическое поведение выделенного из белка активного центра нитрогеназы // Тез докл IV Всерос конф молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" - Саратов, 2003, с 54

6 Баженова Т А, Бардина Н В, Петрова Г Н Влияние потенциала внешнего донора электронов и кислотности протонирующего агента на параметры катализа нитрогеназных реакций в присутствии выделенного из белка активного центра фермента // Тез докл XV симпозиума «Современная химическая физика» - Туапсе, 2003, с 132

7 Nadezhda V Bardma, Tamara A Bazhenova, Galina N Petrova The effect of the proton donor acidity and the external electron donor potential value on C2H2 reduction reaction catalyzed by mtrogenase active center (FeMoco) isolated from the enzyme // Materials of the 6th European Nitrogen Fixation Conference -Toulouse, France, 2004, p 25

8 Bazhenova T A , Borovmskaya M A , Bardma N V , Petrova G N Catalytic reactivity of FeMoco, active site of mtrogenase, outside the protem matrix // Materials of the 3d International Symposium "Molecular design and synthesis of supramolecular architectures" - Kazan, Russia, 2004, p 61

9 Бардина H В , Баженова T A , Петрова Г Н Сравнительное изучение каталитического поведения активного центра нитрогеназы (FeMoco) и его функционального аналога - полиядерного MoMg-комплекса // Тез докл XVI симпозиума «Современная химическая физика» - Туапсе, 2004,с 164

10 Бардина НВ, Баженова ТА, Петрова ГН Влияние потенциала внешнего донора электронов и кислотности протонирующего агента на каталитическое поведение выделенного из белка активного центра нитрогеназы // Тез докл XXII Всероссийского симпозиума молодых ученых по химической кинетике - Москва, п/т «Клязьма», 2004, с 49

11 Бардина Н В , Баженова Т А, Петрова Г Н Влияние потенциала катода на реакцию восстановления ацетилена при катализе FeMo кофактором и MgMo комплексом, сравнительный анализ // Тез докл XXIV Всероссийской школы - симпозиума молодых ученых по химической кинетике - Москва, п/т «Березки», 2006, с 17

12 Бардина Н В , Баженова Т А , Петрова Г Н Шилова А К, Шилов А Б Химическое моделирование каталитического действия фермента нитрогеназы с целью изучения механизма его функционирования // Тез докл VII Российской Конференции «Механизмы каталитических реакций» -СПб, Россия, 2006, т 2 с 195

Заказ № 181/02/08 Подписано в печать 15 02 2008 Тираж 110 экз Уел п л 1,25

000 "^P°BH40K".тел (495> 797-75-76, (495) 778-22-20 \'\ /' www cfr ru , e-mail info@cfr ru

ВВЕДЕНИЕ.

Сокращения.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биологическая фиксация азота. Фермент нитрогеназа. f 1 '

1.1.1. Строение белковых компонентов фермента и входящих в их состав металлокластеров.

1.1.2. Железо-молибденовый кофактор нитрогеназы (FeMoco).

1.2. FeMoco вне белка. Методы изучения.

1.2.1. Физико-химические свойства.

1.2.2. Окислительно-восстановительные свойства.

1.2.3. Стехиометрические реакции.

1.2.4. Каталитическая активность.

1.3. Химические модели нитрогеназной реакции.

1.3.1. Системы Волъпина-Шура.

1.3.2. Комплексы переходных металлов с молекулярным азотом.

1.3.3. Модельные системы на основе молибдена.

1.4. Комплексы молибдена в протонных средах: методы получения, строение, свойства.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Реактивы. Методы получения и очистки реагентов.

2.2. Выделение FeMoco из белка и оценка качества препарата.

2.3. Синтез молибден-содержащих комплексов.

2.4. Проведение экспериментов по изучению каталитической активности растворов кластеров.

2.4.1 Восстановление ацетилена.

2.4.2 Восстановление азота комплексами молибдена.

2.5. Аналитические процедуры.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Кинетические закономерности восстановления ацетилена при катализе магний-молибденовым кластером.

3.2. Влияние потенциала внешнего донора электронов на реакцию восстановления ацетилена, катализируемое FeMoco вне белка и MgMo комплексом. Температурная зависимость.

3.3. Влияние кислотности и химической природы реагента на скорость восстановления ацетилена, катализируемого выделенным из белка FeMoco.

3.4. Алкоксидные комплексы молибдена, образующиеся при первичном взаимодействии M0CI5 с №ОСНз: синтез, молекулярные структуры, ИК спектры.

Актуальность проблемы

Нитрогеназа является ферментом, катализирующим восстановление атмосферного азота до аммиака, который необходим живым организмам для биосинтеза аминокислот и других жизненно важных азотсодержащих молекул. Более 60% связанного азота на земле образуется в результате деятельности азотфиксирующих микроорганизмов. Нитрогеназу изучают более 30 лет, при этом механизм действия этого фермента еще далеко не ясен. Одним их главных нерешенных вопросов нитрогеназного катализа является механизм восстановления субстратов в активном центре фермента.

Среди подходов, используемых для получения информации о работе энзимов, особое место занимает биомиметический подход, подразумевающий изучение более простых — неферментативных, химических модельных систем на основе комплексов переходных металлов, созданных с использованием принципов и методов ферментативного катализа.

Объектами исследования в данной диссертационной работе выбраны уникальные биомиметические азотфиксирующие системы. В состав одной из них входит природный, выделенный из MoFe-белка нитрогеназы активный центр фермента - кластер состава [(|1-Х)МоРе789Томоцитрат], так называемый, FeMo-кофактор. Вторая является функциональной моделью нитрогеназы, роль катализатора в которой выполняет полиядерный магний-молибденовый кластер, образующийся при восстановлении комплекса Мо (V) известной структуры [Mg2Mo8022(MeO)6(MeOH)4][Mg(MeOH)6]-6MeOH. В оптимальных условиях эта система восстанавливает азот с высокими скоростями и является на сегодняшний день самой эффективной среди протонных азотфиксирующих систем.

В попытках понять функции самого кластера FeMoco и вклад, вносимый белковой матрицей в целом и ближайшими к кофактору аминокислотами в процесс восстановления азота в мягких условиях, в лаборатории акад. А. Е. Шилова было предложено и реализовано исследование каталитической реакционной способности отделенного от белка FeMoco в реакциях восстановления субстратов нитрогеназы в небелковой среде, обеспечивающей возможность доступа электронов, протонов и субстрата. Было установлено, что восстановленный амальгамой европия FeMoco вне белкового окружения! способен обратимо координировать N2. Проведенное изучение кинетических закономерностей катализируемой FeMoco реакции восстановления С2Н2 с последующим* сравнением каталитического поведения^ выделенного кофактора и нитрогеназы in vitro в реакциях восстановления-С2Н2 и ингибирования этого процесса СО' и N2 показало значительное сходство основных закономерностей этих реакций для обеих систем с участием FeMoco. Исследование этой уникальной системы продолжено в настоящей работе.

Химический механизм активации азота в- азотфиксирующих системах на основе кластерных соединений- молибдена, также как и строение их активных центров, остается до сих пор неизвестным. Известно только ограниченное количество структур предшественников кластеров, образующих активные в катализе восстановления азота соединения при восстановлении. То же самое можно сказать и про другие протонные азотфиксирующие системы, в которых молекулярное строение активирующих азот соединений также неизвестно. Поэтому выяснение состава и структурных особенностей алкоксидных комплексов молибдена, лежащих в основе абсолютного большинства известных протонных азотфиксирующих систем, является важным направлением исследований. Следует также отметить, что алкоксидные комплексы переходных металлов, в частности, молибдена, представляют значительный самостоятельный интерес, поскольку химия их богата, необычна и мало изучена. При этом в последнее время расширилось практическое использование этих комплексов в качестве соединений-предшественников при синтезе оксидов высокой чистоты.

В данной диссертационной работе проводится сравнительное экспериментальное исследование реакционной способности и каталитических свойств железо-молибденового кофактора — природного кластера, выделенного из фермента, и моделирующих его функцию полиядерных комплексов молибдена в реакциях восстановления "малых" молекул - субстратов нитрогеназы. Такое параллельное изучение и сравнительный анализ каталитического действия изолированного кофактора нитрогеназы и синтетических магний-молибденовых кластеров, в одинаковых, небиологических условиях позволяет определить сходства и различия в механизме активации и восстановления инертной молекулы азота природными и искусственными системами, а также понять причины уникальной эффективности ферментативного восстановления молекулярного азота.

Цель работы

Данная работа была направлена на получение информации о механизме превращения субстратов нитрогеназы при катализе гетеробиметаллическими молибден-содержащими кластерами: природным - FeMo кофактором и синтетическим, моделирующим функцию нитрогеназы — MgMo комплексом.

Работа включала следующие задачи.

1. Изучение кинетических закономерностей реакции восстановления ацетилена, катализируемой MgMo комплексом, и ее ингибирования молекулярным азотом и оксидом углерода (II) в тех же самых условиях и с участием тех же восстановителей, что были использованы ранее при изучении каталитической реакционной способности выделенного из фермента FeMoco.

2. Исследование влияния потенциала внешнего донора электронов, а также кислотности и химической природы протонирующего агента на реакцию восстановления С2Н2, катализируемую FeMoco вне белка.

3. Сравнение каталитического поведения природного (FeMoco) и модельного (MgMo) кластеров на основе результатов, полученных в одинаковых небиологических условиях.

4. Синтез и исследование состава и строения соединений молибдена, участвующих в активации азота в протонных азотфиксирующих системах.

Научная новизна

В работе впервые проведено подробное исследование каталитических свойств магний-молибденового комплекса, входящего в активный центр самой эффективной на сегодняшний день модельной азотфиксирующей системы, посредством изучения кинетических закономерностей восстановления альтернативного субстрата нитрогеназы - ацетилена. На основе полученных результатов проведено сравнение свойств как катализаторов и показано значительное сходство выделенного из белка активного центра нитрогеназы - FeMo кофактора и синтетического MgMo комплекса в реакции восстановления С2Н2 и ингибирования ее оксидом углерода (II). В работе впервые приведены экспериментальные подтверждения механизма опосредованного протонирования субстрата при катализе металлическими кластерами, предсказанного ранее теоретическими расчетными методами, а также показано, что кластерные катализаторы благоприятствуют протеканию многоэлектронных окислительно-восстановительных реакций. Впервые выделены и охарактеризованы методом РСА молибден-содержащие комплексы — продукты первичного взаимодействия' M0CI5 с №ОСНз в метаноле, являющиеся предшественниками каталитически-активных азотвосстанавливающих комплексов.

Практическая г{енность

Все полученные результаты по изучению каталитического восстановления субстратов нитрогеназы с участием в качестве катализаторов отделенного от белковой матрицы активного центра фермента - кофактора FeMoco и уникального модельного кластера являются абсолютно оригинальными, как в смысле объектов исследования, так и в смысле использованных подходов. Понимание реального химического механизма одного из самых красивых и сложных ферментативных процессов* -восстановления молекулярного азота нитрогеназой - не только представляет интерес для фундаментальной науки само по себе, но и, в свою очередь, могло бы стать научной основой создания принципиально' новых экологически чистых катализаторов и процессов, основанных на использовании принципов, найденных в ходе эволюции живой природы.

Состав и структура диссертации

Данная диссертационная работа содержит введение, четыре главы, выводы и список цитируемой литературы из 185 названий. Глава 1 посвящена анализу имеющейся литературы в области функционирования природного фермента нитрогеназы, его строения и свойств, а также истории и развитию химических молибден-содержащих азотфиксирующих систем. В главе 2 описаны экспериментальные методики очистки исходных реагентов и растворителей, синтеза Мо-содержащих комплексов и выделения FeMo кофактора, методики проведения реакции восстановления субстратов нитрогеназы, а также аналитические методы, использованные в работе. В главе 3 приведены результаты изучения каталитических свойств синтетического MgMo комплекса и выделенного из белка железо-молибденового кофактора. В главе 4 проведен заключительный анализ полученных результатов, основанный на сравнении каталитического поведения природного (FeMoco) и модельного (MgMo) кластеров в реакциях с субстратами и ингибиторами нитрогеназы.

выводы

1. Изучена кинетика восстановления С2Н2 и ингибирование этого процесса N2 и СО при катализе модельным MgMo комплексом в условиях, аналогичных для системы на основе экстрагированного из фермента активного центра нитрогеназы (FeMoco). Сравнение основных параметров реакций показало значительное сходство механизмов каталитического восстановления субстратов в присутствии природного и синтетического кластеров.

2. Изучено влияние потенциала внешнего донора электронов на каталитическое восстановление С2Н2 в присутствии FeMoco вне белка. Показано, что в зависимости от кислотности протонирующего агента, лимитирующей стадией может быть как перенос электрона от катода на каталитический кластер, так и стадия переноса протона в катализатор-субстратном комплексе.

3. Изучено влияние кислотности и химического строения источника протонов на реакции, катализируемые FeMoco вне белка. Установлено, что протонирование субстрата, координированного на каталитическом кластере, происходит через стадию первичного протонирования атомов катализатора, то есть опосредованно.

4. Исследованы температурные зависимости скоростей реакций, катализируемых FeMoco вне белка и MgMo комплексом. Показано, что строение и состав обоих кластеров благоприятствуют протеканию многоэлектронных реакций.

5. Впервые получены и охарактеризованы методом РСА монокристаллы двух алкоксо-комплексов молибдена, образующихся при разном соотношении МоС15 и NaOCH3 в реакционном растворе Показано, что при соотношении MoCl5:NaOCH3 1:3 образуется редкий представитель димерных алкоксидов молибдена (V), Мо2(ОСН3)8С12, не содержащий оксо-групп, а при соотношении MoCl5:NaOCH3 = 1:5 — анионный биядерный комплекс, [Мо202(ОСН3)7]~, связанный в кристаллической решетке в цепи посредством взаимодействия с катионной группировкой [Na (СН3ОН)]+.

6. . На основании расчета методом функционала плотности найдено, что структура наинизшего по энергии изомера синтезированного биядерного комплекса молибдена (V) совпадает с экспериментальной. Также показано, что комплекс, является устойчивым к диссоциации в среде метилового спирта и его состав обусловлен реакциями сольволиза.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты настоящей работы и работ [54,164] позволяют провести сравнительный анализ каталитических свойств комплексов - природного FeMoco, выделенного из белка, и моделирующего его действие в составе самой эффективной на сегодняшний день азотфиксирующей системы -синтетического MgMo.

Можно выделить ряд сходных черт: обе системы являются эффективными катализаторами восстановления ацетилена до этилена и этана со сходными параметрами образования комплекса «катализатор-субстрат». Причем, продукты образуются по параллельным маршрутам, по-видимому, из одной и той же частицы [Cat(H)PhS(C2H2)], Cat = FeMoco или MgMo комплекс. При этом эффективная энергия активации образования этана в полтора раза меньше, чем этилена, что является необычным, и наблюдалось в настоящей работе впервые для металлокомплексных каталитических систем. Было показано, что' лимитирующая стадия процесса в обеих системах в присутствии тиофенола - электрохимическая, а именно, перенос электрона от катода на кластер. И FeMoco, и MgMo комплекс в изучаемых системах имеют несколько взаимосвязанных субстрат (ингибитор) координирующих центров. Оксид углерода (И) ингибирует восстановление ацетилена, при этом сам в системах не восстанавливается. Использование различных соединений в качестве доноров протонов показало, что только те, которые каким-либо образом могут взаимодействовать с катализатором, способны эффективно протонировать его и координированный субстрат, причем, кислотность агента может находиться в достаточно широком диапазоне. Механизм протонирования в обеих системах сложный, включает промежуточное протонирование атомов катализатора с последующим переносом протона на координированную молекулу ацетилена.

Главные различия системы проявляют в отношении реакции с молекулярным азотом. При катализе выделенным из белка FeMoco наблюдается только обратимое комплексообразование азота с восстановленным кластером, тогда как в присутствии- MgMo комплекса происходит восстановление N2 до гидразина и аммиака. Нам не удалось получить каких-либо характеристик первичного комплексообразования N2, поскольку в данной системе не наблюдается ингибирования восстановления ацетилена азотом. По-видимому, уже в условиях далеких от насыщения по азоту, характер образующегося диазотного комплекса таков, что он>'быстро и необратимо протонируется с образованием N2H4 и NH3.

Значения некоторых параметров восстановления субстратов нитрогеназы при катализе и выделенным из белка FeMoco для сравнения приведены в таблице 6.

Исследование взаимодействия хлорида молибдена (V) с метилатом натрия в метаноле показывает, что "щелочной раствор M0CI5" - основа большинства азотфиксирующих систем в протонных средах — в зависимости от условий его приготовления и способов восстановления, содержит соединения молибдена разной ядерности и разного состава. В настоящей работе при различном соотношении СН3СГ / Мо в реакционной смеси, выделено два комплекса молибдена. Предварительные эксперименты показывают, что раствор, полученный восстановлением этих комплексов амальгамами европия, натрия или в электрохимической ячейке способен катализировать восстановление ацетилена, но структура активных комплексов пока не изучена. Поэтому очевидна необходимость продолжения данных исследований с целью определения механизма восстановления азота протонными азотфиксирующими системами, в частности, определения, какие именно соединения молибдена ответственны за проявление азотфиксирующей активности и почему.

1. Беррис Р. Ранний период развития биохимии фиксации азота. В кн.:

2. Проблемы фиксации азота. М.: Мир, 1982, С. 337-351.

3. Иди Р., Смит Б. Физико-химические свойства нитрогеназы и еекомпонентов. В кн.: Проблемы фиксации азота. М.: Мир, 1982, С. 352.432.

4. Einsle О., Tezcan F.A., Andrade S.L.A., Schmid В., Toshida N., Howard J.B.,

5. Rees D.C. The nitrogenase MoFe-protein at 1.16 A resolution: a central ligand in the FeMo-cofactor. Science, 2002, V. 297, P. 1696-1700:

6. Sen S., Igarashi R., Smith A., Johnson M.K., Seefeldt L.C., Peters J.W.

7. A conformational mimic of the MgATP-bound "on state" of the nitrogenase iron protein. Biochemistry, 2004, V. 43, P. 1787-1797.

8. Schmid В., Einsle O., Chiu H.-J., Willing A., Yoshida M., Rees D.C., Howard

9. J.B. Biochemical and structural characterization of the crosslinked complex of nitrogenase: comparision to the ADF-A1F4" stabilized structure. Biochemistry, 2002, V. 41 P. 15557-15565.

10. Kim J., Woo D., Rees D. C. X-ray crystal structure of the nitrogenasemolybdenum-iron protein from Clostridium pasteurianum at 3.0 A resolution. Biochemistry, 1993, V. 32, P. 7104-7115.

11. Mayer S.M., Lawson D.M., Gormal C.A., Roe S.M., Smith B.E. New insightsinto structure-function relationships in nitrogenase: a 1.6 A resolution X-ray crystallographic study of Klebsiella pneumoniae MoFe-protein. J. Mol. Biol., 1999, V. 292, P. 871-891.

12. Chan M.K., Kim J., Rees D.C. The nitrogenase FeMo-cofactor and P-clusterpair-2.2 A resolution structures. Science, 1993, V. 260, P. 792-794.

13. Howard J.B., Rees D.C. Structural basis of biological nitrogen fixation. Chem.

14. Rev., 1996, V. 96, P. 2965-2982.

15. Burgess В. K., Lowe D. J. Mechanism of molybdenum nitrogenase. Chem.

16. Rev., 1996, V. 96, P. 2983-3011.

17. Burns R.H. Nitrogenases. J. Biol. Chem., 1991, V. 266, No.15, P. 9339-9342.

18. McLean P.A., True A., Nelson M.J., Lee H.-I., Hoffman B.M., Orme-Johnson

19. W.H. Effects of substrates (methyl isocyanide, C2H2) and inhibitor (CO) on resting-state wild-type and NifV{^Klebsiella pneumoniae MoFe proteins. J. Inorg. Biochem., 2003, V. 93, P. 18-32.

20. Peters J.W., Fisher K., Dean D.R. Nitrogenase structure and function: abiochemical-genetic perspective. Ann. Rev. Microbiol., 1995, V. 49, P. 335366.

21. Igarashi R.Y., Seefeldt L. C., Nitrogen Fixation: The Mechanism of the Mo

22. Dependent Nitrogenase. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2003, V. 38, P. 351-384.

23. Watt G.D., Reddy K.R.N. Formation of an all Ferrous Fe4S4 Cluster in the Iron Protein Component of Azotobacter vinelandii Nitrogenase. J. Inorg. Biochem., 1994, V. 53, P. 281-294.

24. Angove H. C. Mossbauer and EPR Evidence for an All-Ferrous Fe4S4 Clusterwith S = 4 in the Fe Protein of Nitrogenase. J. Am. Chem. Soc., 1997, V. 119, P. 8730-8731.

25. Rees D.C., Tezcan F.A., Haynes C.A., Walton1 M.Y., Andrade S., Einsle O.,

26. Howard J.B. Structural basis of biological nitrogen fixation. Phil. Trans. R. Soc. A, 2005, V.363, P.971-984.

27. Peters J.W., Stowell M.H.B.,,Soltis S.M., Finnegan M.G., Johnson M.K., Rees D.C. Redox-dependent structural changes in the nitrogenase P-cluster: Biochemistry, 1997, V. 36, P. 1181-1187.

28. Hagen W.R., Wassink H., Eady R.R., Smith B.E., Haaker H. Quantitative EPRof an S=7/2 system in thionine-oxidized MoFe proteins of nitrogenase. Aredefinition of the P-cluster concept. Eur. J. Biochem., 1987, V. 169; P. 457465.

29. Burgess B.K. The iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. Chem. Rev.,1990, V. 90, P. 1377-1406.

30. Bulen W.A., Burns R.C., LeComte J.R. Nitrogen fixation: hydrosulfite aselectron* donor with cell-free preparations of Azotobacter vinelandii and Rhodospirillum rubrum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1965, V.53, P. 532-539.

31. Druzhinin S.Yu., Syrtsova L.A., Uzenskaja A.M., Likhtenstein G.I. Thephotoreduction of nitrogenase. Biochem. J., 1993, V. 290, 627-631.

32. Дружинин С.Ю., Сырцова JI.A., Денисов H.H., Шкондина Н.И., Гак В.Ю.

33. Ксантеновые красители как фотохимические доноры для нитрогеназной реакции. Биохимия, 1998, Т. 63, вып. 8, С. 1164-1175.

34. Kim J., Rees D.C. Structural models for the metal centers in the nitrogenasemolybdenum-iron protein: Science; 1992, V. 257, P. 1677-1682.

35. Bolin J.T., Campobasso N., Muchmore. S.W., Morgan T.V., Mortenson L.E.

36. Hinnemann В., Norskov J.K. Modeling a Central Ligand in the Nitrogenase

37. FeMo Cofactor. J. Am. Chem. Soc., 2003, V. 125, P. 1466-1467.

38. Dance I. The consequences of an interstitial N atom in the FeMo cofactor of nitrogenase. Chem. Commun., 2003, P. 324-325.

39. Lovell Т., Liu Т., Case D.A., Noodleman L. Structural, spectroscopic, and redox consequences of a central ligand in the nitrogenase MoFe cofactor. J. Am. Chem. Soc., 2003, V. 125, P. 8377-8383.

40. Huniar U., Ahlrichs D., Coucouvanis D. Density functional theory calculations and exploration of a possible mechanism of N2 reduction by nitrogenase. J. Am. Chem. Soc., 2004, V. 126, P. 2588-2601.

41. Шестаков А. Ф. Уникальные особенности структуры Fe-Мо-кофакторанитрогеназы, благоприятные для многоцентровой координации молекулы азота. Изв. АН, Сер. хим., 1996, № 8, С. 1928-1933.

42. Lee H.-I., Benton Р.М.С., Laryukhin М., Igarashi R.Y., Dean D:R., Seefeldt

43. C., Hoffman B.M. The interstitial atom of the nitrogenase FeMo-cofactor: ENDOR and ESEEM show it is not an exchangeable nitrogen. J. Am. Chem. Soc., 2003, V. 125, P.5604-5605.

44. Schultz F. A., Gheller S.F., Burgess B.K., Lough S., Newton W.E. Electrochemical characterization of the iron-molybdenum cofactor from Azotobacter vinelandii nitrogenase. J. Am. Chem. Soc., 1985, V. 107, P. 5364-5368.

45. Newton W.E., Schultz F.A., Gheller S.F., Lough S., McDonalds J.W.,

46. Conradson S.D., Hedman В., Hodgson K.O. Iron molybdenum cofactor of Azotobacter vinelandii nitrogenase oxidation-reduction properties and structural insights. Polyhedron, 1986, V. 5, № 1-2, P. 567-572.

47. Сырцова JLA., Тимофеева E.A. Перенос электрона, сопряженный сгидролизом ATP, в нитрогеназе. Изв. АН, Сер. хим., 2001", №10^ С.1706-1711.

48. Schimpl J., Petrilli Н.М., Blochl Р.Е. Nitrogen binding to the FeMo-cofactor of nitrogenase. J. Am. Chem. Soc., 2004, V. 126, P. 15772-15778.

49. Shah V.K., Brill W.J. Isolation of an iron-molybdenum cofactor from nitrogenase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1977, V. 74, P. 3249-3253.

50. Rawlings J., Shah V.K., Chisnell J.R., Brill W.J., Zimmerman R., Miinck E.,

51. Orme-Johnson W.H. Novel metal cluster in the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. J. Biol. Chem., 1978, V. 253, № 4, P. 1001-1004.

52. Newton W.E. Isolated iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. In:

53. Biological Nitrogen Fixation, Stacey G., Bunis R. H., Evans H. J. (Eds.), Chapman & Hall, New York, 1992, P. 877-928.

54. Walters M.A., Chapman S.K., Orme-Johnson W.H. The nature of amideligation to the metal sites of FeMoco. Polyhedron, 1986, V. 5, № 1-2, P. 561565.

55. Pickett C.J., Vincent K.A., Ibrahim S.K., Gormal A.G., Smith B.E., Best S.P.

56. Electron-Transfer Chemistry of the Iron-Molybdenum Cofactor of Nitrogenase: Delocalized and localized Reduced States of FeMoco which Allow Binding of Carbon Monoxide to Iron and Molybdenum. Chem. Eur. J., 2003, V.9, No.l, P.76-87.

57. Баженова M.A. Каталитическое поведение FeMoco вне белка. Дисс. Канд.хим. наук, Москва: МГУ, 2001, 124с.

58. Хидридж Д. Электрохимия металлов в неводных растворах, под ред. Я.

59. М. Колотыркина. М.: Мир, 1974, С. 166.

60. Pickett C.J., Vincent К.А., Ibrahim S.K., Gormal A.G., Smith B.E., Fairhurst

61. S.A., Best S.P. Synergic Binding of Carbon Monoxide and Cyanide to the FeMo Cofactor of Nitrogenase: Relic Chemistry of an Ancient Enzyme. Chem. Eur. J., 2004, V.10, P.4770-4776.

62. Ibrahim S. K., Vincent K., Gormal C.A., Smith B.E., Best S.P., Pickett C.J.

63. The isolated iron-molybdenum cofactor of nitrogenase binds carbon monoxide upon electrochemically accessing reduced states. Chem. Commun., 1999, P. 1019-1020.

64. Gronberg K.L.C, Gormal C.A, Smith B.E., Henderson R.A. A new approachto identifying substrate binding sites on isolated FeMo-cofactor of nitrogenase. Chem. Commun, 1997, No 7, P. 713-714.

65. Smith В. E., Bishop P.E., Dixon R.A., Eady R.R., Filler W.A., Lowe D.J.,

66. Richards A.J.M., Thomson A.J., Thorneley R.N.F., Postgate J.R. The iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. In: Evans H.J., Bottomley P.J., Newton W.E. (Eds.), Nitrogen fixation research progress, Nijhoff, Dordrecht, 1985, P. 597-603.

67. Conradson S.D., Burgess B.K., Vaughn S.A., Roe A.L., Hedman В., Hodgson K.O., Holm R.H. Cyanide and methylisocyanide binding to the isolated iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. J. Biol. Chem., 1989, V. 264, P. 1596715974.

68. Smith B.E., Durrant M.C., Fairhurst S.A., Gormal C.A., Gronberg K.L.C.,

69. Henderson R.A., Ibrahim S.K., Le Gall Т., Pickett C.J. Exploring the reactivity of the isolated iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. Coord. Chem. Rev, 1999, V. 185-186, P. 669-687.

70. Henderson R.A. Combined versus individual labilising effects of H4", Na+ and nucleophile on catalysed substitution reactions: studies on1. Fe4S4X4. (X = CIor PhS). J. Chem. Soc, Dalton Trans, 1999, P. 119 125.

71. Almeida V.R, Gormal C.A, Gronberg K.L.C, Henderson R.A, Oglieve K.E,

72. Smith B.E. Protonation and substitution reactions of Fe-S 'basket' clusters including extracted FeMo-cofactor of nitrogenase. Inorg: Chim. Acta, 1999, V. 291, P. 212-225.

73. Schultz F.A, Feldman B.J, Gheller S.F, Newton W.E. Effects of oxidation state, solvent acidity and thiophenol on the electrochemical properties of iron- molybdenum cofactor from nitrogenase. Inorg. Chim. Acta., 1990, V.170, P. 115-122.

74. McKenna C.E., McKenna M.-C., Higa M.T. Chemical probes of nitrogenase.

75. Cyclopropene. Nitrogenase-catalyzed reduction to propene and cyclopropane. J. Am. Chem. Soc., 1976, V. 98, P. 4657-4659.

76. Le Gall Т., Ibrahim S.K., Gormal C.A., Smith В E., Pickett C.J. The isolatediron-molybdenum cofactor of nitrogenase catalyses hydrogen evolution at high potential. Chem. Commun., 1999, P. 773-774.

77. Shah V.K., Chisnell J.R., Brill W.J. Acetylene reduction by the iron-molybdenum cofactor from nitrogenase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1978, V. 81, №1., P. 232-236.

78. McKenna C.E., McKenna M.-C., Huang C.W. Low stereoselectivity inmethylacethylene and cyclopropene reductions by nitrogenase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, V. 76, № 10, P. 4773-4777.

79. Weathers B.J., Grate J.H., Strampach N.A., Schrauzer G.N. Chemicalevolution of a nitrogenase model. 18. Reduction of molecular nitrogen with molybdoinsulin catalysts. J. Am. Chem. Soc., 1979, V. 101, P. 925-928.

80. Corbin J.L., Pariyadath N., Stiefel E.I. Ligand effects and product distributionsin molybdothiol catalyst systems. J. Am. Chem. Soc., 1976, V. 98, № 24, P. 7862-7864.

81. Newton W. E., Corbin J. L., Schneider P. W., Bulen W. A. On potential modelsystems for the nitrogenase enzyme. J. Am. Chem. Soc., 1971, V. 93, P. 268269.

82. Баженова M.A., Баженова T.A., Петрова Г.Н., Миронова С.А. Взаимноевлияние субстратов и ингибиторов в реакциях, катализируемых железо-молибденовым кофактором нитрогеназы вне белка. Кинетика и катализ, 2002, Т.43, № 2, С.219-230.

83. Rivera-Ortiz J.M., Bums R Н. Interactions among substrates and inhibitors ofnitrogenase. J. Bacterid., 1975, V. 123, № 2, P. 537-545.

84. Vol'pin М.Е., Shur V.B. Nitrogen fixation by transition metal complexes.

85. Nature, 1966, V. 209, P. 1236-1239.

86. Вольпин M.E., Шур В.Б. Фиксация молекулярного азота в апротонныхсредах. В кн.: Новое в химической фиксации азота. М.: Мир, 1983, С. 77113.

87. Allen A.D., Senoff C.V. Nitrogenpentaaminoruthenium(II) complexes. J.

88. Chem. Soc., Chem.Commun., 1965, № 24, P.621-622.

89. Шилов A.E., Шилова A.K., Бородько Ю.Г. Прямое получение комплексовмолекулярного азота с соединениями рутения. Кинетика и катализ, 1966, Т.7, №4, С.768-769.

90. Van Tamelen Е.Е., Fechter R.B., Schneller S.W., Boche G., Greeley R.H.,

91. Akermark B. Titanium(II) in the fixation-reduction of molecular nitrogen under mild conditions. J. Am. Chem. Soc., 1969, V.91, №6, P.l551-1552.

92. Шилов A.E., Шилова A.K., Квашина Е.Ф. Промежуточные комплексы вреакциях восстановления азота. Кинетика и катализ, 1969, Т. 10, № 6, С. 1402.

93. Shaver М.Р., Fryzuk М. D. Activation of molecular nitrogen: coordination,cleavage and functiolization of^madiatedby metal complexes. Adv., Synth. Catal.,2003, V.345, P.1061-1076.

94. Hidai. M., Mizobe Y. Recent advances in the chemistry of dinitrogencomplexes. Chem. Rev., 1995, V. 95, P. 1115-1133.

95. Боттомли Ф. Диазотные комплексы переходных металлов. В кн.:

96. Проблемы фиксации азота. М.: Мир, 1982, С. 104-154.

97. Chatt J., Pearman A.J., Richards R.L. The Reduction of Mono-Coordinated Molecular Nitrogen to Ammonia in a Protic Environment. Nature, 1975, V. 253, P.39-40.

98. Chatt J., Pearman A.J., Richards R.L. Conversion of dinitrogen in its molybdenum and tungsten complexes into ammonia and possible relevance to the nitrogenase reaction. J. Chem. Soc. Dalton Trans., 1977, P. 1852-1860.

99. Pickett C.J., Talarmin J. Electrosynthesis of ammonia. Nature, 1985, V. 317, P.652.653.

100. Barriere F. Modeling of the molybdenum center in the nitrogenase FeMocofactor. Coord. Chem. Rev., 2003, V. 236, P. 71-89.

101. Henderson R.A., Leigh G.J., Pickett C.J. The chemistry of nitrogen fixationand models for the reactions of nitrogenase. Adv. Inorg. Chem. Radiochem., 1983, V. 27, P. 197-292.

102. Pickett C.J. The Chatt cycle and the mechanism of enzymic reduction of molecular nitrogen. J. Biol. Inorg. Chem., 1996, Y.l, P. 601-606.

103. Richards R.L. Reactions of small molecules at transition metal sites: Studies relevant to nitrogenase, an organometallic enzyme. Coord. Chem. Rev., 1996, V. 154, 83-97.

104. Hidai M., Mizobe Y. Chemical nitrogen fixation by using molybdenum andtungsten complexes. Pure Appl.Chem., 2001, V. 73, P. 261-263.

105. Nishibayashi Y., Iwai S., Hidai M. A model for protonation of dinitrogen by nitrogenase: Protonation of coordinated dinitrogen on tungsten with hydrosulfido-bridged dinuclear complexes. J. Am. Chem. Soc., 1998, Y.l20, P. 10559-10560.

106. Kuwata S., Hidai M. Hydrosulfido complexes of transition metals. Coord.

107. Chem. Rev., 2001, Y. 213, P. 211-305.

108. Yoo S.J., Angove H.C., Papaefthymiou V., Burgess B.K., Munck E. J. Mossbauer study of the MoFe protein of nitrogenase from Azotobacter vinelandii using selective Fe-57 enrichment of the M-centers. J. Am. Chem. Soc., 2000, V. 122, P.4926-4936.

109. Schrock R.R. High oxidation state coordination chemistry with triamidoaminetungsten and molybdenum complexes. Pure Appl. Chem., 1997, V. 69, P. 2197-2203.

110. Schrock R.R., Kolodziej R. M., Liu A.H., Davis W.H., Vale M.G. Preparationand. characterization of two high oxidation state molybdenum dinitrogen complexes: МоСр*Ме3.2(ц-К2) and |MoCp*Me3](|i-N2)[WCp,Me3]: J. Am. Chem. Soc., 1990, V. 112, P. 4338-4345.

111. Schrock R.R., Glassman Т.Е., Vale M.G. Cleavage of the N-N bond in a highoxidation state tungsten or molybdenum hydrazine complex and the catalytic reduction of hydrazine. J. Am. Chem. Soc., 1991, V. 113, P. 725-726.

112. Greco G.E., Schrock R.R. Synthesis of triamidoamine ligands of the type

113. ArylNHCH2CH2)3N and molybdenum, and tungstem complexes that contain an (ArylNCH2CH2)3N.3- ligand. Inorg. Chem., 2001, V. 40, P. 3850-3860.

114. Yandulov D.V., Schrock R.R. Reduction of dinitrogen to ammonia at a wellprotected reaction site in a molybdenum triamidoamine complex. J. Am. Chem. Soc., 2002, V. 124, P. 6252-6253.

115. Yandulov D.V., Schrock R.R., Rheingold A.L., Ceccarelli C., Davis W.M.

116. Synthesis and reactions of molybdenum triamidoamine complexes containing hexaisopropylterphenyl substituents. Inorg. Chem., 2003,V. 42, P. 796-813.

117. Yandulov D.V, Shrock R.R. Catalytic reduction of dinitrogen to ammonia at a single molybdenum center. Science, 2003, V. 301, P. 76-78.

118. Cummins C.C. Reductive cleavage and related reactions leading tomolybdenum-element multiple bonds: new pathways offered by three

119. J coordinate molybdenum(III). Chem. Comm., 1998, V. 17, P. 1777-1786.

120. Laplaza C.E, Cummins C.C. Dinitrogen cleavage by a 3-coordinate molybdenum (III) complexes. Science, 1995, V. 268, P. 861-863.

121. Laplaza C.E, Johnson M.A, Peters J.S, Odom A.L, Kim E, Cummins C.C, George G.N, Pickering I.J. Dinitrogen cleavage by three-coordinate molybdenum(III) complexes: Mechanistic and structural data. J. Am. Chem. Soc, 1996, V. 118, P. 8623-8638.

122. Шилов A.E. Каталитическое восстановление молекулярного азота в растворах. Изв. АН, Сер. хим., 2003, №12, С.2417-2424.к

123. Nikonova L.A, Isaeva S.A, Pershikova N.I, Shilov A.E. A comparison of the1 reduction of dinitrogen by a vanadium(II)-catechol system with that by theactive centre of nitrogenase. J. Mol. Cat, 1975/76, V. 1, P. 367-374.

124. Didenko L.P, Gavrilina O.K., Yablonskaya E.E, Shilova A.K, Shilov A.E. Phospholipid-dependent catalytic dinitrogen reduction in the presence of molybdenum complexes. Nouv. J. Chim, 1983, V. 7, № 7, P. 605-611.

125. Денисов Н.Т., Шувалов В.Ф., Шувалова Н.И., Шилова А.К., Шилов А.Е. Каталитическое восстановление молекулярного азота в протонных средах. Кинетика и катализ, 1970, Т. 11, № 3, С. 813-817.

126. Shilov А.Е., Denisov N.T., Efimov O.N., Shuvalov V.F., Shuvalova N.I., Shilova A.K. New nitrogenase model for reduction of molecular nitrogen in protic media. Nature, 1971, V. 231, P.460-461.

127. Денисов H.T., Бурбо E.M., Кобелева С.И. Влияние рН среды на восстановление молекулярного. азота молибденсодержащими гидроокисями металлов. Кинетика и катализ, 1982, Т. 23; №41, С. 874880.

128. Denisov N.T., Shilov А.Е., Shuvalova N.I., Panova T.P. Mechanism of electron transfer in dinitrogen fixation in the system Ti(III)-Mo(III). React. Kinet. Catal. Lett., 1975, V.2, No. 3, P.237-241.

129. Ю.Денисов H.T., Коростелева А.И., Морозов Ю.И., Кобелева С.И. О механизме проводимости азотфиксирующей титанмолибденовой гидроокисной системы. Кинетика и катализ, 1977, Т. 18, Вып. 3, С. 758761.

130. Denisov N.T., Shuvalova N.I. Kinetic investigation of dinitrogen reduction in the system Ti3+-Mo3+. React. Kinet. Catal. Lett., 1976, V. 4, No. 4, P. 431435.

131. Николаева Г.В., Ефимов O.H., Денисов H.T., Брикенштейн Х-М. А. Восстановление N2 на системе Ti(OH)3- Мо(ОН)3 -амальгама натрия Ж. физ. химии, 1976, Т. 50, №11, С. 3009-3012.

132. Nikolaeva G.V., Efimov O.N., Brikenshtein Kh.-M. A., Shilov A.E. Parallel formation of hydrozine and ammonia in dinitrogen reduction in the system Na(Hg)-Ti(OH)3-Mo(III). React. Kinet. Catal. Lett., 1977, V.6, No. 3, P.349-356.

133. Ефимов O.H., Царев B.H., Брикенштейн X.-M. А. Электровосстановление азота в присутствие системы Ti(OH)3-Mo(OH)3. Ж. физ. химии, 1977, Т. 51, С.1200-1207.

134. Бурбо Е.М., Денисов Н.Т., Кобелева С.И., Шилов А.Е. Восстановление молекулярного азота гидроокисью Сг(ОН)2 Мо(ОН)3. Кинетика и катализ, 1981, Т. 22, Вып 6, С. 1401-1406.

135. Петрова Г.Н., Ефимов О.Н., Денисов Н.Т. Восстановление азота в системе Мо(Ш)-Тл(Ш)-пирокатехин амальгама натрия в водном растворе. Изв. АН СССР, Сер. хим., 1983, №7, С. 1683.

136. Петрова Г.Н., Ефимов О.Н., Денисов Н.Т. Амальгамное восстановление азота в системе Мо(Ш)-Т1(Ш)-пирокатехин в водных растворах. Изв. АН СССР, Сер. хим., 1987, С. 2670.

137. Петрова Г.Н. Электрокаталитическое восстановление малых молекул с кратными связями с участием комплексов молибдена. Дисс.канд.хим.наук, 1986, Черноголовка: ОИХФ АН СССР, 165 с.

138. Ефимов О.Н., Николаева Г.В., Шилов А.Е. Посмотрите, как активен азот! Химия и жизнь, 1977, №4, С.87-88.

139. Shilov А.Е., Shilova А.К., Vorontsova Т.A. Molybdenum complexes as catalysts for the reduction of molecular nitrogen in pro tic media. React. Kinet. Catal. Lett., 1975, V.3 No. 2, C.143-148.

140. Диденко Л.П., Овчаренко А.Г., Шилов A.E., Шилова А.К. Каталитическое восстановление азота под действием амальгамы натрия. Кинетика и катализ, 1977, Т. 18, №4, С. 1078-1079.

141. Диденко Л.П., Шилов А.Е., Шилова А.К. Кинетика и механизм каталитического восстановления азота амальгамой натрия с участием комплексов молибдена. Кинетика и катализ, 1979, Т. 20, № 6, С. 14881493.

142. Диденко Л.П., Шилова А.К., Шилов А.Е. Сокаталитическая роль фосфолипида в восстановлении азота в присутствии молибдена. Докл. АН СССР, 1980, Т. 254, №3, С. 643-645.

143. Шилова А.К., Махаев В.Д., Шилов А.Е. Каталитическое восстановление азота при комнатной температуре и атмосферном давлении. Докл. АН СССР, 1984, Т.277, С. 1414-1417.

144. Antipin M.Yu., Didenko L.P., Kachapina L.M., Shilov A.E., Shilova A.K., Struchkov Yu.T. Polynuclear molybdenum(VI)- molybdenum(V) complex: a precursor of the catalyst for dinitrogen reduction. J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1989, P. 1467-1468.

145. Shilov A.E. Catalytic dinitrogen reduction by amalgams. In: Electron transfer in Chemistry, V. Balzani Ed., Wiley-VCH, Weinheim, 2001, P.899-903.

146. Antipin M.Yu., Struchkov Yu.T., Shilov A.E., Shilova A.K. Geterometallic bi~ and polymolybdenum complexes: precursors of the catalysts for dinitrogen reduction. Gazz. Chim. Ital., 1993, V. 123, P. 265-270.

147. Гаврилов А.Б. Электрохимическое изучение полиядерных комплексов молибдена катализаторов восстановления молекулярного азота. Дисс. канд. хим. наук., Черноголовка: ОИХФ АН СССР, 1991, 119 с.

148. Pope M.T. Heteropoly and isopoly oxometalates. Berlin, Springer, 1983, 124 p.19.

149. Ardon M., Pernik A. Molybdenum (V) in aqueous solutions. Inorg. Chem., 1973, V.12, No. 10, P.2484-2485.

150. Villata L.S., Feliz M.R., Capparelli A.L. Photochemical and catalytic properties of dimeric species of molybdenum(V). Coord. Chem. Rev., 2000, V. 196, P. 65-84.

151. Денисов H.T., Шувалова Н.И., Шувалов В.Ф. Взаимодействие МоС15 с метанолом. Ж. Физ. химии, 1971, Т. 45, №11, С.2796-2798.

152. Limberg С., Parsons S., Downs A.J., Watkins DJ. Isolation and crystal structure of a dimeric oxomolybdenum (V) complex containing two ethoxy bridges and one ethanol bridge. J. Chem. Soc., Dalton Trans., 1994, P. 11691174.

153. Chisholm M.H. Metal-metal bonds and metal-carbon bonds in the chemistry of molybdenum and tungsten alkoxides. Polyhedron, 1983, V. 2, No.8, P.681-721.

154. Nannelli P., Block B.P., Molybdenum (II) cluster compounds involving alkoxy groups. Inorg. Chem., 1968, V.7, P. 2423-2426.

155. Pinkerton A.A., Schwartsonback D., Hubert-Pfalzgraf L.C., Reiss J.G. Crystal and molecular structure of niobium pentamethoxide a structure with two different conformers in the unit cell. Inorg. Chem., 1976, V. 15, No.5, P.l 196-1199.

156. Turova N.Ya., Turevskaya E.P., Kessler V.G., Yanovskaya M.I. Oxoalkoxides-true precursors of complex oxides. J. Sol-Gel Science and Technology, 1994, V. 2, P.17-23.

157. Bradley D.C. Metal alkoxides as" precursors for electronic and ceramic materials. Chem. Rev., 1989, V. 89, P. 1317-1322.

158. Руководство по препаративной неорганической химии. Под ред. Брауера Г. М.: Иностр. лит-ра, 1956. С. 165.

159. Сырцова JI. А., Попко E. В., Лихтенштейн Г. И., Дружинин С. Ю. Изучение химического состава Fe-Мо-кофактора нитрогеназы новым флуориметрическим методом анализа тиосоединений, Биохимия, 1983, Т. 48, Вып. 7, С. 1195-1202.

160. Hawkes Т. R., Smith В. Е. Purification and characterization of the inactive MoFe protein (NifB-Kpl) of the nitrogenase from nifВ mutants of Klebsiella pneumoniae. Biochem. J., 1983, V. 209, P. 43-50.

161. Руководство по препаративной неорганической химии. Под ред. Брауера Г. М.: Иностр. лит-ра, 1956, С. 861.

162. Dilworth M. J., Eady R. R., Eldridge M. The vanadium nitrogenase of Azotobacter chroococcum. Reduction of acetylene and ethylene to ethane. Biochem. J., 1988, V. 249, P. 745-751.

163. Бусев А. И. Аналитическая химия молибдена. M.: Изд-во АН СССР, 1962, 205 с.

164. Алексеевский Е. В., Гольц Р. К., Мусакич А. П. Количественный анализ. Л.: Госхимиздат, 1957, 391с.

165. Волынец В. Ф., Волынец А. П. Аналитическая химия азота. М.: Наука, 1977, С. 90.

166. Баженова Т. А, Баженова М. А, Петрова Г. Н, Миронова С. А. Кинетика и механизм реакции восстановления ацетилена амальгамой европия, катализируемой активным центром нитрогеназы, выделенным из фермента. Кинетика и катализ, 2002, Т.43, № 3. С.1-12.

167. Варфоломеев С. Д, Гуревич К. Г. Биокинетика: практический курс. М.:Фаир-Пресс, 1999, С.101.

168. Диксон М, Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982, т. 2, С. 627.

169. Беррис Р. Ингибирование. В кн. Проблемы фиксации азота. М.: Мир, 1982, С. 511.

170. Баженова Т. А, Баженова М. А, Петрова Г. Н, Шилова А. К, Шувалова Н. И, Шилов А. Е. Роль тиофенола в каталитическом восстановлении ацетилена амальгамой цинка. Развитие химических моделей нитрогеназы. ДАН, 1997, Т. 354, № 1, С. 51-54.

171. Дамаскин Б. Б, Петрий О. А, Цирлина Г. А. Электрохимия: учебник для вузов, М.: Химия, 2001, С.343.

172. Burgess В. К, Stiefel Е. I, Newton W. Е. Oxidation-reduction properties and complexation reactions of the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. J. Biol. Chem, 1980, V. 255, P. 353-356.

173. Le Gall T, Ibrahim S. K, Gormal C. A, Smith В. E, Pickett C. J. The isolated iron-molybdenum cofactor of nitrogenase catalyses hydrogen evolution at high potential. Chem. Commun, 1999, P. 773-774.

174. March J. Advanced Organic Chemistry, 3rd ed. New York.: John Wiley & Sons, 1985, P. 1087-1136.

175. Bordwell F. G. Equilibrium Acidities in Dimethyl Sulfoxide Solution. Acc. Chem. Res., 1988, V. 21, P. 456-463.165.1zutsu K. Acid-base dissociation constants in dipolar aprotic solvents. Oxford.: Blackwell Scientific, 1990.

176. Бейтс P. Определение рН: теория и практика. JI.: Химия, 1972, С.160.

177. Henderson R.A. Protonation of Hydrocarbon Ligands. Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1996, V. 35, P. 946-967.

178. Харди P. Восстанавливаемые субстраты нитрогеназы. В кн.: Проблемы фиксации азота. М.: Мир, 1982, С. 455-503.

179. Pham D. N., Burgess В. К. Nitrogenase reactivity: effects of рН on substrate reduction and CO inhibition. Biochemistry, 1993, V. 32, P. 13725-13731.

180. Dance I. The Hydrogen Chemistry of the FeMo-co Active Site of Nitrogenase J. Am. Chem. Soc., 2005, V.127, P. 10925-10942.

181. Henderson R.A. Mechanistic Studies on Synthetic Fe-S-Based Clusters and Their Relevance to the Action of Nitrogenases. Chem. Rev., 2005, V. 105, P.2365-2437.

182. Rod Т. H., Norskov, J. K. Modeling the nitrogenase FeMocofactor. J. Am. Chem. Soc., 2000, V. 122, P. 12751-12763.

183. Mayer S. M., Niehaus W. G., Dean D. R. Reduction of short chain alkynes by a nitrogenase a-70Ala-substituted MoFe protein. J. Chem. Soc., Dalton Trans., 2002, P. 802-807.

184. Barney В. M., Igarashi R. Y., Dos Santos P. C., Dean D. R, Seefeldt L. C. Substrate Interaction at an Iron-Sulfur Face of the FeMo-cofactor during Nitrogenase Catalysis. J. Biol. Chem., 2004, V. 279, P. 53621-53624.

185. Фиалков Ю.Я. Растворитель как средство управления химическим процессом. JL: Химия, 1990. С.220.

186. Дерягина Э.Н. Тиофенол. В кн.: Химическая энциклопедия в 5т.: т.4, Зефиров Н.С. и др. (ред.). М.: Большая российская энцикл., 1995, С. 1158.

187. Rillema D.P., Brubaker C.H. Complexes of molybdenum(V) and tungsten(V). Far-infrared spectra and some other properties. Inorg. Chem., 1969, V. 8, P. 1645-1654.

188. Stevens W.J., Krauss M., Basch H., Jasien P.G. Relativistic compact effective potentials and efficient, shared-exponent basis sets for the third-, fourth-, and fifth-row atoms. Can. J. Chem., 1992, V. 70, No. 2, P. 612-630.

189. Лайков Д. H., Устынюк Ю.А. Система квантово-химических программ «ПРИРОДА-04». Новые возможности исследования молекулярных систем с применением параллельных вычислений. Изв. АН, Сер. хим., 2005, №3, С. 804-810.

190. Термодинамические свойства индивидуальных веществ. Справочное издание в 4-х томах, отв. ред. Глушко В.П., М.: Наука, 1978-1982.

191. Накамото К. ИК-спектры и спектры КР неорганических и координационных соединений. М.: Мир, 1991, С. 256.

192. Limberg С., Downs A., Blake A. J., Parsons S. Modelling the Formation of Molybdenum Oxides From Alkoxides: Crystal Structures of Mo404Cl4(|j.2-0Et)4(H0Et)2(n3-0)2. and [PPN]+[Et3NH]+[Cl2(0)Mo(|a2-0)2Mo(0)Cl2]2". Inorg. Chem., 1996,V. 35, P. 4439-4448.