Каталитическое поведение железо-молибденового кофактора нитрогеназы вне белка тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ 3

Сокращения

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

Биологическая фиксация азота

Состав и строение белковых компонентов нитрогеназ 7

Железо-молибденовый кофактор нитрогеназы (FeMoco) 13

Альтернативные нитрогеназы 25

Субстраты и ингибиторы нитрогеназы 27

Функционирование нитрогеназы 40

Химические модели нитрогеназы 43

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 47

Методы получения и очистки реагентов 47-50 Получение образцов FeMoco: выделение из белка и оценка качества препарата 50

Электрохимические измерения 52 Проведение экспериментов по изучению каталитической активности FeMoco вне белка 52-54 Определение активности системы (II) к восстановлению молекулярного азота

Аналитические процедуры 54

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 56-100 Выбор и особенности систем, позволяющих изучать каталитическую активность FeMoco вне белка 56

Выделение FeMoco из белка 59 Электрохимическое и биохимическое исследование отделенного от белка FeMoco 59-61 Кинетические закономерности восстановления ацетилена, катализируемого FeMoco вне белка 61

Ингибирование 86

Актуальность проблемы

Биологическая фиксация азота, осуществляемая ферментом нитрогеназой, является одним из важнейших природных процессов. Ключевой стадией этого сложного процесса является восстановление атмосферного азота до аммиака, который затем используется в синтезе разнообразных азотсодержащих соединений, в частности, белков. Участвуя в кругообороте азота в природе, нитрогеназа выполняет важнейшую функцию обогащения почвы связанным азотом и, таким образом, обеспечивает поддержание жизни на планете.

Всестороннее изучение фермента нитрогеназы активно ведется уже более тридцати лет, и к настоящему времени получена обширная информация о составе, структуре, физико-химических свойствах и функциях составляющих нитрогеназу белков, однако реальный химический механизм активации и восстановления азота и других субстратов в активном центре фермента - на железо-молибденовом кофакторе нитрогеназы (FeMoco) - до сих пор не известен. Существует несколько подходов к изучению механизма превращения субстратов в активном центре: во-первых, ведутся исследования нитрогеназных систем in vitro, как нативной, так и мутантных; во-вторых, проводят исследования модельных металлокомплексных систем, способных к фиксации азота в обычных химических условиях, либо исследования химических свойств металлокластеров, сходных по составу и структуре с кластером FeMoco; в-третьих, изучают возможности взаимодействия субстратов и ингибиторов нитрогеназы с FeMoco, отделенным от белка.

Задача введения выделенного из белка FeMoco в реакции с субстратами нитрогеназы и изучения его как катализатора этих реакций к началу наших исследований решена не была. Исследование поведения металлокластера FeMoco вне белковой матрицы позволяет преодолеть кинетические ограничения, существующие в белковой нитрогеназной системе, которые препятствуют полной расшифровке детального механизма превращения субстратов в активном центре фермента. Также такой подход позволяет прояснить роль белкового окружения активного центра нитрогеназы в осуществлении ферментом его функции. Понимание реального химического механизма одного из самых красивых и сложных ферментативных процессов - восстановления молекулярного азота нитрогеназой - не только представляет интерес для фундаментальной науки само по себе, но и, в свою очередь, могло бы стать научной основой создания принципиально новых экологически чистых катализаторов и процессов, основанных на использовании принципов, найденных в ходе эволюции живой природы.

Цель работы

Данная работа была направлена на получение информации о механизме превращения субстратов в продукты в активном центре нитрогеназы, посредством изучения реакционной способности отделенного от белковой матрицы FeMoco в чисто химических условиях.

Работа включала следующие задачи:

1. Нахождение условий, в которых выделенный из белка FeMoco способен катализировать реакции восстановления субстратов нитрогеназы.

2. Изучение кинетических закономерностей найденных реакций, а также реакций FeMoco с ингибиторами нитрогеназы, с целью сравнения каталитического поведения FeMoco вне белка и в составе фермента.

3. Получение информации о механизме превращения субстратов на FeMoco.

4. Изучение возможности восстановления на отделенном от белка FeMoco основного субстрата нитрогеназы - молекулярного азота.

Научная новизна

В работе впервые найдены условия и показана принципиальная возможность введения FeMoco, отделенного от белковой матрицы, в реакции с субстратами нитрогеназы в чисто химических условиях. Показано, что железо-молибденовый кофактор является активным катализатором восстановления ацетилена и других субстратов нитрогеназы, если обеспечены условия сохранения кластерной структуры катализатора в ходе реакции, а также перенос электронов и протонов к активированной молекуле субстрата. Проведено изучение кинетических закономерностей катализируемой FeMoco реакции восстановления ацетйлена, изучено влияние СО - ингибитора нитрогеназы - на эту реакцию; на основании полученных данных предложен механизм восстановления ацетилена с участием FeMoco, а также сделан ряд заключений относительно характера взаимодействия субстратов и ингибиторов с отделенным от белка FeMoco. Сравнение каталитического поведения выделенного FeMoco в реакциях восстановления ацетилена и ингибирования этого процесса оксидом углерода (II) и молекулярным азотом с таковым для ферментативной системы показало значительное сходство основных закономерностей этих реакций для фермента и химических систем с участием кофактора. Сделан вывод, что наблюдаемые особенности в первую очередь определаются составом и структурой FeMoco, и проявляются им независимо от природы (белковой или небелковой) восстановителя и среды реакции. Впервые установлено, что FeMoco и вне белкового окружения способен эффективно координировать молекулярный азот. 5

Практическая ценность

Полученные результаты являются абсолютно оригинальными и вносят существенный вклад в понимание механизма каталитического действия активного центра фермента нитрогеназы. Предложенный в работе подход - исследование каталитической активности FeMoco вне белка - является исключительно плодотворным для изучения механизма превращения субстратов нитрогеназой. Практический интерес представляет нахождение и разработка новых систем для изучения каталитической активности выделенного из белка FeMoco, а также разработка модифицированного хроматографического метода получения препаративных количеств FeMoco с использованием техники Шленка.

Данная диссертационная работа состоит из литературного обзора, экспериментальной части, главы, содержащей результаты работы и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из 155 названий.

выводы

1. Впервые найдены условия и показана принципиальная возможность вовлечения железо-молибденового кофактора нитрогеназы (FeMoco), отделенного от белковой матрицы, в реакции с субстратами нитрогеназы в чисто химических условиях. Показано, что FeMoco вне белка является активным катализатором восстановления ацетилена и некоторых других субстратов нитрогеназы, если обеспечены условия сохранения кластерной структуры катализатора в ходе реакции, а также перенос электронов и протонов к FeMoco и активированной на нем молекуле субстрата

2. Установлено, что восстановленный амальгамой европия FeMoco и вне белкового окружения способен обратимо координировать молекулярный азот

3. На основе проведенного кинетического исследования предложен механизм реакции восстановления ацетилена амальгамой европия, катализируемой отделенным от белка FeMoco

4. Показано значительное сходство основных закономерностей реакций каталитического восстановления С2Н2 и ингибирования этого процесса оксидом углерода (II) и молекулярным азотом для нитрогеназы и химических систем с участием выделенного из белка FeMoco. Найдено, что наблюдаемые особенности поведения FeMoco в изучаемых реакциях определяются его составом и структурой, и проявляются им независимо от природы (белковой или небелковой) восстановителя и среды реакции

5. На основе данных о каталитическом восстановлении ацетона на отделенном от белка FeMoco найден новый субстрат нитрогеназы: показано, что нитрогеназа in vitro, как и FeMoco вне белка, способна восстанавливать ацетон с образованием метана

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенные в данной работе результаты изучения стационарной кинетики реакции восстановления ацетилена амальгамой европия (система (II)), катализируемой выделенным из нитрогеназы активным центром фермента - FeMoco, позволяют предложить следующую Схему превращения.

Стадия 1 реакции - присоединение молекулы тиофенола к кластеру FeMoco в полувосстановленном состоянии с образованием соединения {FeMoco(H)(PhS)}, которое затем может адсорбироваться на поверхности амальгамы (стадия 2), восстанавливаться амальгамой (стадия 3), а затем координировать С2Н2 (от 1 до 3-х молекул одновременно, в зависимости от давления ацетилена) (стадия 4). На следующей стадии происходит восстановление и протонирование координированного НС=СН, причем сначала протонируются атомы серы кофактора, а затем, путем внутримолекулярного переноса водорода на субстрат, образуются этилен и этан. Мы считаем, что во время каталитического цикла десорбции катализатора не происходит, так как в стационарных условиях зависимость скоростей образования С2Н4 и СгНб от концентрации катализатора выглядит как изотерма адсорбции, то есть зависит от поверхностной концентрации катализатора (Рис. 15 в Главе 3). Заметим здесь, что в конечном итоге адсорбция обратима, так как после окончания реакции

Eu/Hg

Схема 3 путем прекращения перемешивания амальгама «схлопывается», катализатор выходит в раствор, причем структура его сохраняется неизменной, что показано обратным встраиванием его в дефектный MoFe белок.

Можно отметить ряд сходных черт между процессами превращения ацетилена разнообразными нитрогеназами и системой (II) с участием отделенного от белка FeMoco. Во-первых, в обоих случаях субстрат способен координироваться только с восстановленным кофактором - с FeMoco(s-r), получившим один или несколько электронов либо от Fe белка, либо от амальгамы. Без восстановления FeMoco координации не происходит. Во-вторых, подача на субстрат электронов от внешнего восстановителя и протонов от донора Н+ идет не напрямую, а опосредованно, с участием промежуточного акцептора: в нитрогеназе электроны поступают на субстрат по цепочке «внешний восстановитель —> Fe белок —> Р-кластер MoFe белка —> FeMoco —> субстрат», в системе (II) - «амальгама европия —> FeMoco —> субстрат». Промежуточным акцептором протонов в системе (II) являются атомы серы кофактора, в нитрогеназе предполагают участие так же атомов серы, или атомов железа кофактора. В-третьих, в обеих системах осуществляется диссоциативный механизм распада комплекса катализатор-субстрат с образованием продуктов: выброс этилена и этана идет без вытеснения координированного продукта новой молекулой ацетилена [Глава 3, 152, 77]. В-четвертых, оба продукта восстановления, этилен и этан, образуются из одной и той же исходной частицы {FeMoco(H)(PhS)(C2H2)}, то есть этан является продуктом восстановления именно ацетилена, а не этилена. Этилен является очень плохим субстратом в обеих системах: в системе (II) наблюдается лишь его стехиометрическое восстановление, в нитрогеназе Azotobacter vinelandii Кт составляет 1.2 атм С2Н2. В-пятых, в обеих системах основным продуктом восстановления C2D2 является цис-1,2-дидейтероэтилен, что говорит об аналогичном (боковом) способе координации ацетилена на FeMoco, и сходном механизме протонирования координированного субстрата. Кроме того, и в системе (II), и в нитрогеназе показано существование нескольких одновременно работающих взаимозависимых активных центров на восстановленном FeMoco. И, наконец, и в нитрогеназе, и в системе (II) коэффициент распределения электронов в случае ацетилена как субстрата практически равен единице, то есть ацетилен способен почти полностью подавлять катализируемое FeMoco выделение водорода.

Сравнение количественных параметров реакции восстановления ацетилена с участием FeMoco в качестве катализатора (вне белка и в составе разнообразных белковых систем) представлено в Таблице 3, где собраны данные о специфической активности и составе продуктов восстановления ацетилена для небелковых систем (I) и (II) с участием FeMoco, классической Мо-содержащей нитрогеназы, альтернативных нитрогеназ, содержащих в качестве активных центров аналогичные кластеры, но с Fe или V в качестве гетероатомов, и для гибридных систем, полученных встраиванием выделенного из классической нитрогеназы FeMoco в дефектный белок альтернативных нитрогеназ.

1. Беррис Р. Ранний период развития биохимии фиксации азота. В кн.: Проблемы фиксации азота. М.: Мир, 1982, С. 337-351.

2. Иди Р., Смит Б. Физико-химические свойства нитрогеназы и ее компонентов. В кн.: Проблемы фиксации азота. М.: Мир, 1982, С. 352-432.

3. Kim J., Rees D. С. Structural models for the metal centers in the nitrogenase molybdenum-iron protein. Science, 1992, V. 257, P. 1677-1682.

4. Kim J., Rees D. C. Crystallographic structure and functional implications of the nitrogenase molybdenum-iron protein from Azotobacter vinelandii. Nature, 1992, V. 360, P. 553-560.

5. Peters J. W., Stowell M. H. В., Soltis S. M., Finnegan M. G., Johnson M. K., Rees D. C. Redox-dependent structural changes in the nitrogenase P-cluster. Biochemistry, 1997, V. 36, P. 11 Bill 87.

6. Kim J., Woo D., Rees D. C. X-ray crystal structure of the nitrogenase molybdenum-iron protein from Clostridium pasteurianum at 3.0-A resolution. Biochemistry, 1993, V. 32, P. 7104-7115.

7. Howard J. В., Rees D. C. Structural basis of biological nitrogen fixation. Chem. Rev., 1996, V. 96, P. 2965-2982.

8. Georgiadis M. M., Komiya H., Chakrabarti P., Woo D., Kornuc J. J., Rees D. C. Crystallographic structure of the nitrogenase iron protein from Azotobacter vinelandii. Science, 1992, V. 257, P. 1653-1659.

9. Burgess В. K., Lowe D. J. Mechanism of molybdenum nitrogenase. Chem. Rev., 1996, V. 96, P. 2983-3011.

10. Watt G. D., Reddy K. R. N. Formation of an all Ferrous Fe4S4 Cluster in the Iron Protein Component of Azotobacter vinelandii Nitrogenase. J. Inorg. Biochem., 1994, V. 53, P. 281-294.

11. Angove H. C. Mossbauer and EPR Evidence for an All-Ferrous Fe4S4 Cluster with S = 4 in the Fe Protein of Nitrogenase. J. Am. Chem. Soc., 1997, V. 119, P. 8730-8731.

12. Burgess В. K. The mechanism of molybdenum nitrogenase: an overview. In: Nitrogen fixation: from molecules to crop productivity, F. O. Pedrosa et al, Eds., Kluwer Academic Publishers, 2000, P. 13-18.

13. Burgess В. K. The iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. Chem. Rev., 1990, V. 90, P. 1377-1406.

14. Баженова Т. А., Шилов А. Е. Фиксация молекулярного азота в растворах. Ж. Росс. хим. об-ва, 1995, Т. 39, С. 50-80.

15. Chan M. K., Kim J., Rees D. C. The nitrogenase FeMo-cofactor and P-cluster pair-2.2-A resolution structures. Science, 1993, V. 260, P. 792-794.

16. Schindelin H„ Kisker C., Schlessman J. L., Howard J. В., Rees D. C. Structure of ADP A1F4"-stabilized nitrogenase complex and its implications for signal transduction. Nature (London), 1997, V. 387, P. 370-376.

17. Peters J. W., Fisher K., Newton W. E., Dean D. R. Involvement of the P cluster in intramolecular electron transfer within the nitrogenase MoFe protein. J. Biol. Chem., 1995, V. 270, № 45, Iss. 10, P. 27007-27013.

18. Shah V. K., Brill W. J. Isolation of an iron-molybdenum cofactor from nitrogenase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1977, V. 74, P. 3249-3253.

19. Hoover Т. R„ Robertson A. D., Cerny R. L., Hayes R. N. Imperial J., Shah V. K., Ludden P. W. Identification of the V-factor needed for synthesis of the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase as homocitrate. Nature, 1987, V. 329, P. 855-857.

20. Шестаков А. Ф. Уникальные особенности структуры Fe-Мо-кофактора нитрогеназы, благоприятные для многоцентровой координации молекулы азота. Изв. Акад. Наук, Сер. хим., 1996, № 8, С. 1928-1933.

21. Shah V. K., Davis L. C., Gordon J. K., Orme-Johnson W. H., Brill W. J. Nitrogenase. 3. Nitrogenaseless mutant of Azotobacter vinelandii: activities, cross-reactions and EPR spectra. Biochim. Biophys. Acta, 1973, V. 292, P. 246-255.

22. Rawlings J., Shah V. K., Chisnell J. R., Brill W. J., Zimmerman R., Miinck E., Orme-Johnson W. H. Novel metal cluster in the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. J. Biol. Chem., 1978, V. 253, № 4, P. 1001-1004.

23. Newton W. E. Isolated iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. In: Biological Nitrogen Fixation, Stacey G., Burris R. H., Evans H. J. (Eds.), Chapman & Hall, New York, 1992, P. 877-928.

24. Walters M. A., Chapman S. K., Orme-Johnson W. H. The nature of amide ligation to the metal sites of FeMoco. Polyhedron, 1986, V. 5, № 1-2, P. 561-565.

25. Lee H.-I., Hales B. J., Hoffman В. M. CO binding to and metal-ion valencies of the FeMo-cofactor in СО-inhibited nitrogenase. In: Biological nitrogen fixation for the 21st century, C. Elmerich et al, Eds., Kluwer Academic Publishers, 1998, P. 55-56.

26. Lee H.-I., Hales B. J., Hoffman В. M. Metal-ion valencies of the FeMo cofactor in CO-inhibited and resting state nitrogenase by 57Fe Q-band ENDOR. J. Am. Chem. Soc., 1997, V. 119, P. 11395-11400.

27. Schultz F. A., Gheller S. F., Burgess В. K., Lough S., Newton W. E. Electrochemical characterization of the iron-molybdenum cofactor from Azotobacter vinelandii nitrogenase. J. Am. Chem. Soc., 1985, V. 107, P. 5364-5368.

28. Сырцова Jl. А., Тимофеева Е. А. Перенос электрона, сопряженный с гидролизом АТР, в нитрогеназе. Изв. РАН, Сер. хим., 2001, в печати.

29. Ibrahim S. К., Vincent К., Gormal С. A., Smith В. Е., Best S. P., Pickett С. J. The isolated iron-molybdenum cofactor of nitrogenase binds carbon monoxide upon electrochemically accessing reduced states. Chem. Commun., 1999, P. 1019-1020.

30. Hawkes T. R., McLean P. A., Smith В. E. Nitrogenase from nijV mutants of Klebsiella pneumoniae contains an altered form of the iron-molybdenum cofactor. Biochem. J., 1984, V. 217, P. 317-321.

31. Leigh G. J., Jimenez-Tenorio M. Exchange of Dinitrogen between Iron and Molybdenum Centers and the Reduction of Dinitrogen Bound to Iron: Implications to the Chemistry of Nitrogenases. J. Am. Chem. Soc., 1991, V. 113, P. 5862-5863.

32. Yoo S. J., Angove H. C., Papaefthymiou V., Burgess В. K., Munsk E. Mossbauer study of thecn

33. MoFe protein of nitrogenase from Azotobacter vinelandii using selective Fe enrichment of the M-centers. J. Am. Chem. Soc., 2000, V. 122, P. 4926-4936.

34. Deng H., Hoffmann R. How N2 might be activated by FeMo-cofactor in nitrogenase. Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1993, V. 32, P. 1062-1065.

35. Dance I. Theoretical investigations of the mechanism of biological nitrogen fixation at the FeMo cluster site. J. Bioinorg. Chem., 1996, V. 1, P. 581-586.

36. Rod Т. H., N0rskov J. K. Modeling the nitrogenase FeMo cofactor. J. Am. Chem. Soc., 2000, V. 122, P. 12751-12763.

37. Pickett C. J. The Chatt cycle and the mechanism of enzymic reduction of molecular nitrogen. J. Bioinorg. Chem., 1996, V. 1, P. 601-606.

38. Stavrev К. K., Zerner M. C. A theoretical model for the active site of nitrogenase. Chem. Eur. J., 1996, V. 2, № 1, P. 83-87.

39. Durrant M. С. A molybdenum-centred model for nitrogenase catalysis. Inorg. Chem. Commun,, 2001, Y. 4, P. 60-62.

40. Davis L. C., Henzl M. Т., Burris R. H., Orme-Johnson W. H. Iron-sulfur clusters in the molybdenum-iron protein-component of nitrogenase electron-paramagnetic resonance of the carbon-monoxide inhibited state. Biochemistry, 1979, V. 18, P. 4860-4869.

41. Lowe D. J., Eady R. R., Thorneley R. N. F. Electron-paramagnetic-resonance studies on nitrogenase of Klebsiella pneumoniae. Evidence for acetylene- and ethylene-nitrogenase transient complexes. Biochem. J., 1978, V. 173, P. 277-290.

42. Gronberg K. L. C., Gormal C. A., Smith В. E., Henderson R. A. A new approach to identifying substrate binding sites on isolated FeMo-cofactor of nitrogenase. Chem. Commun., 1997, № 7, P. 713-714.

43. Le Gall Т., Ibrahim S. K., Gormal C. A., Smith В. E., Pickett C. J. The isolated iron-molybdenum cofactor of nitrogenase catalyses hydrogen evolution at high potential. Chem. Commun., 1999, P. 773-774.

44. Ryle M. J., Lee H.-I., Seefeldt L. C., Hoffman В. M. Nitrogenase reduction of carbon disulfide: freeze-quench EPR and ENDOR evidence for three sequential intermediates with cluster-bound carbon moieties. Biochemistry, 2000, Y. 39, P. 1114-1119.

45. Conradson S. D., Burgess В. K., Vaughn S. A., Roe A. L., Hedman В., Hodgson К. O., Holm R. H. Cyanide and methylisocyanide binding to the isolated iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. J. Biol. Chem., 1989, V. 264, P. 15967-15974.

46. Christie P. D., Lee H.-I., Cameron L. M., Hales B. J., Orme-Johnson W. H., Hoffman В. M. Identification of the СО-binding cluster in nitrogenase MoFe protein by ENDOR of 57Fe isotopomers. J. Am. Chem. Soc., 1996, V. 118, P. 8707-8709.

47. Kim C.-H., Newton W. E., Dean D. R. Role of the MoFe protein a-subunit histidine-195 residue in FeMo-cofactor binding and nitrogenase catalysis. Biochemistry, 1995, V. 34, P. 2798-2808.

48. Shen J., Dean D. R., Newton W. E. Evidence for multiple substrate-reduction sites and distinct inhibitor-binding sites from an altered Azotobacter vinelandii nitrogenase MoFe protein. Biochemistry, 1997, V. 36, P. 4884-4894.

49. Lee H.-I., S0rlie M., Christiansen J., Song R., Dean D. R., Hales B. J., Hoffman В. M. Characterization of an intermediate in the reduction of acetylene by the nitrogenase a-Gln195

50. MoFe protein by Q-band EPR and 13C, !H ENDOR. J. Am. Chem. Soc., 2000, V. 122, P. 55825587.

51. Christiansen J., Seefeldt L. C., Dean D. R. Competitive substrate and inhibitor interactions at the physiologically relevant active site of nitrogenase. J. Biol. Chem., 2000, V. 275, № 46, P. 36104-36107.

52. Christiansen J., Cash V. L., Seefeldt L. C., Dean D. R. Isolation and characterization of an acetylene-resistant nitrogenase. J. Biol. Chem., 2000, V. 275, № 15, P. 11459-11464.

53. S0rlie M., Christiansen J., Dean D. R., Hales B. J. Detection of a new radical and FeMo-cofactor EPR signal during acetylene reduction by the a-H195Q mutant of nitrogenase. J. Am. Chem. Soc., 1999, V. 121, P. 9457-9458.

54. Christiansen J., Goodwin P. J., Lanzilotta W. N., Seefeldt L. C., Dean D. R. Catalytic and biophysical properties of a nitrogenase apo-MoFe protein produced by a ш/B-deletion mutant of Azotobacter vinelandii. Biochemistry, 1998, V. 37, P. 12611-12623.

55. Hawkes T. R., Smith В. E. Purification and characterization of the inactive MoFe protein (NifB-Kpl) of the nitrogenase from nifB mutants of Klebsiella pneumoniae. Biochem. J., 1983, V. 209, P. 43-50.

56. Shah V. K., Ugalde R. A., Imperial J., Brill W. J. Inhibition of iron-molybdenum cofactor binding to component I of nitrogenase. J. Biol. Chem., 1985, V. 260, P. 3891-3894.

57. McKenna С. E., McKenna M.-C., Higa M. T. Chemical probes of nitrogenase. 1. Cyclopropene. Nitrogenase-catalyzed reduction to propene and cyclopropane. J. Am. Chem. Soc., 1976, V. 98, P. 4657-4659.

58. Shah V. K., Chisnell J. R., Brill W. J. Acetylene reduction by the iron-molybdenum cofactor from nitrogenase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1978, V. 81, № 1, P. 232-236.

59. McKenna С. E., McKenna M.-C., Huang C. W. Low stereoselectivity in methylacethylene and cyclopropene reductions by nitrogenase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, V. 76, № 10, P. 4773-4777.

60. Weathers B. J., Grate J. H., Strampach N. A., Schrauzer G. N. Chemical evolution of a nitrogenase model. 18. Reduction of molecular nitrogen with molybdoinsulin catalysts. J. Am. Chem. Soc., 1979, V. 101, P. 925-928.

61. Corbin J. L., Pariyadath N., Stiefel E. I. Ligand effects and product distributions in molybdothiol catalyst systems. J. Am. Chem. Soc., 1976, V. 98, № 24, P. 7862-7864.

62. Newton W. E., Corbin J. L., Schneider P. W., Bulen W. A. On potential model systems for the nitrogenase enzyme. J. Am. Chem. Soc., 1971, V. 93, P. 268-269.

63. Eady R. R. Structure function relationships of alternative nitrogenases. Chem. Rev., 1996, V. 96, P. 3013-3030.

64. Eady R. R., Robson R. L., Richardson Т. H„ Miller R. W., Hawkins M. The vanadium nitrogenase of Azotobacter chroococcum. Purification and properties of the VFe protein. Biochem. J., 1987, V. 244, P. 197-207.

65. Chisnell J. R., Premakumar R., Bishop P. E. Purification of a 2nd alternative nitrogenase from a NIFHDK deletion strain of Azotobacter vinelandii. J. Bacterid., 1988, V. 170, P. 27-33.

66. Rehder D. Vanadium nitrogenase. J. Inorg. Biochem., 2000, V. 80, P. 133-136.

67. Харди P. Восстанавливаемые субстраты нитрогеназы. В кн.: Проблемы фиксации азота. М.: Мир, 1982, С. 455-503.

68. Stiefel Е. I., George G. N. Ferredoxins, Hydrogenases and Nitrogenases: Metal-Sulfide Proteins. In: I. Bertiny, H. B. Gray, S. Lippard, J. Valentine (Eds.), Bioinorganic Chemistry, University Science Books, Mill Valley, California 1994, P. 365-453.

69. Seefeldt L. C., Rasche M. E., Ensign S. A. A carbonyl sulfide and carbon-dioxide as new substrates, and carbon-disulfide as a new inhibitor, of nitrogenase. Biochemistry, 1995, V. 34, P. 5382-5389.

70. Rivera-Ortiz J. M., Burris R. H. Interactions among substrates and inhibitors of nitrogenase. J. Bacteriol., 1975, V. 123, № 2, P. 537-545.

71. Hwang J. С., Chen С. H., Burris R. H. Inhibition of nitrogenase-catalyzed reductions. Biochira. Biophys. Acta, 1973, V. 292, P. 256-270.

72. Newton W. E., Corbin J. L., McDonald J. W. Nitrogenase: mechanism and models. In: Proceedings of the First International Symposium on Nitrogen Fixation, Newton W. E., Nyman C. J., Eds., Washington State University Press: Pullman, WA, 1976, P. 53-74.

73. Dilworth M. J., Thorneley R. N. F. Nitrogenase of Klebsiella pneumoniae. Hydrazine is a product of azide reduction. Biochem. J., 1981, V. 193, P. 971-983.

74. Thorneley R. N. F., Lowe D. J. Kinetics and mechanism of the nitrogenase enzyme system. Spiro T. G., Ed., In: Molybdenum enzymes, Wiley-Interscience, New York, 1985, P. 221-284.

75. Dilworth M. J. Acetylene reduction by nitrogen-fixing preparations from Clostridium pasteurianum. Biochim. Biophys. Acta, 1966, V. 127, P. 285-294.

76. Ashby G. A., Dilworth M. J., Thorneley R. N. F. Klebsiella pneumoniae nitrogenase. Inhibition of hydrogen evolution by ethylene and the reduction of ethylene to ethane. Biochem. J., 1987, V. 247, P. 547-554.

77. Schneider K., Muller A., Krahn E., Hagen W. R„ Wassink H., Knuttel K.-H. The molybdenum nitrogenase from wild-type Xanthobacter autotrophicus exhibits properties reminiscent of alternative nitrogenase. Eur. J. Biochem., 1995, V. 230, P. 666-675.

78. Cameron L. M., Hales B. J. CO inhibition of nitrogen fixation. In: Nitrogen fixation: fundamentals and applications, I. A. Tikhonovich et al, Eds., Kluwer Academic Publishers, 1995, P. 109-113.

79. Cameron L. M., Hales B. J. Unusual effect of CO on C2H2 reduction by V nitrogenase from Azotobacter vinelandii. J. Am. Chem. Soc., 1996, V. 118, P. 279-280.

80. Miiller A., Schneider K., Gollan U., Krahn E., Drottboom M. Characterization of the "iron only" nitrogenase from Rhodobacter capsulatus. In: Iron-sulfur proteins. New York: Wiley, 1982. P.551.

81. Moore V. G., Tittsworth R. C., Hales B. J. Construction and characterization of hibrid component 1 from V-nitrogenase containing FeMo cofactor. J. Am. Chem. Soc., 1994, V. 116, P. 12101-12102.

82. Баженова Т. А., Баженова M. А., Петрова Г. Н., Шилова А. К., Шувалова Н. И., Шилов А. Е. Роль тиофенола в каталитическом восстановлении ацетилена амальгамой цинка. Развитие химических моделей нитрогеназы. ДАН, 1997, Т. 354, № 1, С. 51-54.

83. Lind C. J., Wilson P. W. Mechanism of biological nitrogen fixation. УШ. Carbon monoxide as an inhibitor for nitrogen fixation by red clover. J. Am. Chem. Soc., 1941, V. 63, № 11-12, P. 3511-3514.

84. Беррис P. Ингибирование. В кн.: Проблемы фиксации азота. М.: Мир, 1982, С. 504536.

85. Pollock R. С., Lee H.-I., Cameron L. M., DeRose V. J., Hales B. J., Orme-Johnson W. H., Hoffman В. M. Investigation of CO bound to inhibited forms of nitrogenase MoFe protein by 13C ENDOR. J. Am. Chem. Soc., 1995, V. 117, P. 8686-8687.

86. Cameron L. M., Hales B. J. Investigation of CO binding and release from Mo-nitrogenase during catalytic turnover. Biochemistry, 1998, V. 37, P. 9449-9456.

87. George S. J., Ashby G. A., Wharton C. W., Thorneley R. N. F. Time-resolved binding of carbon monoxide to nitrogenase monitored by stopped-flow infrared spectroscopy. J. Am. Chem. Soc., 1997, V. 119, P. 6450-6451.

88. Fisher K., Hare N. D., Newton W. E. Mapping the catalytic surface of A. vinelandii MoFe protein by site specific mutagenesis. In: Biological nitrogen fixation for the 21st century, C. Elmerich et al, Eds., Kluwer Academic Publishers, 1998, P. 23-26.

89. Dilworth M. J., Eady R. R. Hydrazine is a product of dinitrogen reduction by the vanadium-nitrogenase from Azotobacter Chroococcum. Biochem. J., 1991, V. 277, P. 465-468.

90. Дружинин С. Ю., Сырцова JI. А., Рубцова Е. Т., Шкондина Н. И. Фотостимулирование внутримолекулярного переноса электрона в нитрогеназе. Биохимия, 1996, Т. 61, вып. 12, С. 2170-2178.

91. Thorneley R. N. F., Lowe D. J. The mechanism of Klebsiella pneumoniae nitrogenase action-pre-steady-state kinetics of an enzyme-bound intermediate in N2 reduction and of NH3 formation. Biochem. J., 1984, V. 224, P. 887-894.

92. Duyvis M. G., Mensink R. E., Wassnik H., Haaker H. Evidence for multiple steps in the pre-steady-state electron transfer reaction of nitrogenase from Azotobacter vinelandii. Biochim. Biophys. Acta (Bioenergetics), 1997, V. 1320, P. 34-44.

93. Druzhinin S. Yu., Syrtsova L. A., Uzenskaja A. M., Likhtenstein G. I. The photoreduction of nitrogenase. Biochem. J., 1993, V. 290, 627-631.

94. Дружинин С. Ю., Сырцова Л. А., Денисов Н. Н., Шкондина Н. И., Гак В. Ю. Ксантеновые красители как фотохимические доноры для нитрогеназной реакции. Биохимия, 1998, Т. 63, вып. 8, С. 1164-1175.

95. Duyvis М. G., Wassnik Н., Haaker Н. Nitrogenase of Azotobacter vinelandii: Kinetic analysis of the Fe protein redox cycle. Biochemistry, 1998, V. 37, P. 17345-17354.

96. Сырцова Л. А., Надточенко В. А., Денисов H. Н., Тимофеева Е. А., Шкондина Н. И., Гак В. Ю. Кинетика элементарных стадий переноса электрона в нитрогеназной системе с фотодонором. Биохимия, 2000, Т. 65, вып. 10, С. 1353-1362.

97. Вольпин М. Е., Шур В. Б. Фиксация азота на комплексных катализаторах. ДАН СССР, 1964, Т. 156, №5, С. 1102-1104.

98. Vol'pin М. Е., Shur V. В. Nitrogen fixation by transition metal complexes. Nature, 1966, V. 209, P. 1236-1239.

99. Вольпин M. E., Шур В. Б. Фиксация молекулярного азота в апротонных средах. В кн.: Новое в химической фиксации азота. М.: Мир, 1983, С. 77-113.

100. Coucouvanis D. Use of preassembled Fe/S and Fe/Mo/S clusters in the stepwise synthesis of potential analogs for the Fe/Mo/S site in nitrogenase. Acc. Chem. Res., 1991, V. 24, № 1, P. 16.

101. Денисов H. Т., Шувалов В. Ф., Шувалова Н. И., Шилова А. К., Шилов А. Е. Каталитическое восстановление молекулярного азота в протонных средах. Кинетика и катализ, 1970, Т. 11, № 3, С. 813-817.

102. Nikonova L. A., Isaeva S. A., Pershikova N. I., Shilov А. Е. A comparison of the reduction of dinitrogen by a vanadium(II)-catechol system with that by the active centre of nitrogenase. J. Mol. Cat., 1975/76, V. 1, P. 367-374.

103. Didenko L. P., Gavrilina О. K., Yablonskaya E. E., Shilova A. K., Shilov A. E. Phospholipid-dependent catalytic dinitrogen reduction in the presence of molybdenum complexes. Nouv. J. Chim., 1983, Y. 7, № 7, P. 605-611.

104. Руководство по препаративной неорганической химии. Под ред. Брауера Г. М.: Иностр. лит-ра, 1956, С. 165.

105. Сырцова JI. А., Попко Е. В., Лихтенштейн Г. И., Дружинин С. Ю. Изучение химического состава Fe-Мо-кофактора нитрогеназы новым флуориметрическим методом анализа тиосоединений, Биохимия, 1983, Т. 48, Вып. 7, С. 1195-1202.

106. Burk D., Lineweaver Н. The influence of fixed nitrogen on Azotobacter. J. Bacteriol., 1930, V. 19, P. 389-395.

107. Сырцова JI. А., Левченко Л. А., Фролов E. H. и др. Исследование структуры и функций компонентов нитрогеназы Azotobacter vinelandii. Молекул, биология, 1971, Т. 5, Вып. 5, С. 726-734.

108. Dilworth М. J., Eady R. R., Eldridge М. The vanadium nitrogenase of Azotobacter chroococcum. Reduction of acetylene and ethylene to ethane. Biochem. J., 1988, V. 249, P. 745-751.

109. Bulen W. A., Le Comte J. R. The nitrogenase system from Azotobacter. two enzyme requirement for N2 reduction, ATP-dependent H2 evolution and ATP hydrolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1966, V. 56, P. 979-986.

110. Волынец В. Ф., Волынец А. П. Аналитическая химия азота. М.: Наука, 1977, С. 90.

111. Pickett С. J., Ryder К. S., Talarmin J. Electron-transfer reactions in nitrogen fixation. Part 2. The electrosynthesis of ammonia: identification and estimation of products. J. Chem. Soc. Dalton Trans., 1986, № 7, P. 1453-1457.

112. Fawcett J. K., Scott J. E. A rapid and precise method for the determination of urea. J. Clin. Pathol., 1960, V. 13, P. 156-159.

113. Хидридж Д. Электрохимия металлов в неводных растворах, под ред. Я. М. Колотыркина. М.: Мир, 1974, С. 166.

114. Лурье Ю. Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Госхимиздат, 1962, С. 201.

115. Шилов А. Е. Фиксация азота в растворах в присутствии комплексов переходных металлов. В кн.: Проблемы фиксации азота. М.: Мир, 1982, С. 37-103.

116. Burgess В. К., Stiefel Е. I., Newton W. Е. Oxidation-reduction properties and complexation reactions of the iron-molybdenum cofactor of nitrogenase. J. Biol. Chem., 1980, V. 255, P. 353356.

117. Almeida V. R., Gormal C. A., Gronberg K.L.C., Henderson R. A., Oglieve К. E., Smith B. E. Protonation and substitution reactions of Fe-S 'basket' clusters including extracted FeMo-cofactor of nitrogenase. Inorg. Chim. Acta, 1999, V. 291, P. 212-225.

118. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г. Биокинетика. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999.

119. Физическая химия, под ред. Б. П. Никольского. JL: Химия, 1987, С. 768.

120. Henderson R. A. Protonation of unsaturated hydrocarbon ligands: regioselectivity, stereoselectivity, and product specificity. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1996, V. 35, P. 946967.

121. Смирнов В. А. Восстановление амальгамами. JI.: Химия, 1970, С. 22.

122. Стрелец В. В., Царев В. Н. Особенности катализируемого ванадоценом амальгамного восстановления окиси углерода до метана. Кинетика и катализ, 1984, Т. 25, Вып. 4, С. 821-829.

123. Пугачевич П. П., Тимофеевичева О. А. Поверхностное натяжение предельно разбавленных амальгам щелочных металлов. ДАН СССР, 1955, Т. 104, № 1, С. 98-100.

124. Измайлов Н. А. Электрохимия растворов. Харьков: Изд. Харьковского Университета, 1959, С. 327.

125. Rakowski Dubois М. Catalytic applications of transition-metal complexes with sulfide ligands. Chem. Rev., 1989, V. 89, № 1, P. 1-9.

126. Bronsted J. N., Kane N. L. R. On the dissolution of metals in acids. J. Am. Chem. Soc., 1931, V. 53, № 10, P. 3624-3644.

127. Свердлов Л. M., Ковнер М. А., Крайнов Е. П. Колебательные спектры многоатомных молекул. М.: Наука, 1970, С. 218-290.

128. Benton Р.М.С., Christiansen J., Dean D.R., Seefeldt L.C. Stereospecificity of acetylene reduction catalyzed by nitrogenase. J. Am. Chem. Soc., 2001, V. 123, P. 1822-1827.

129. Trimmel G., Slugovc C., Wiede P., Mereiter K., Sapunov V. N., Schmid R., Kirchner K. Labile complexes of the RuTp(pn).+ (Tp = tripyrazolylborate, pn = Ph2PCH2CH2NMe2) fragment including the dinitrogen ligand. Inorg. Chem., 1997, V. 36, P. 1076-1083.

130. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма. М.: Мир, 1966.124

131. Thorneley R. N. F., Eady R. R., Lowe D. J. Biological nitrogen fixation by way of an enzyme-bound dinitrogen-hydride intermediate. Nature, 1978, V. 272, P. 557-558.

132. Thorneley R. N. F., Lowe D. J. Nitrogenase: substrate binding and activation. J. Bioinorg. Chem., 1996, V. 1, P. 576-580.

133. Hales B. J., Case E. E., Morningstar J. E., Dzeda M. F., Mauterer L. A. Isolation of a new vanadium-containing nitrogenase from Azotobacter vinelandii. Biochemistry, 1986, V. 25, № 23, P. 7251-7255.

134. Эткинс П. Физическая химия. Часть 2. М.: Мир, 1980, С. 506.