Биосенсоры на основе наноструктурированных пленок полиэлектролитов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

1,

J 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и свойства тирозиназы.

1.2. Фенольные биосенсоры на основе тирозиназы.

1.3. Структура и свойства холиноксидазы.

1.4. Детекция холина с использованием амперометрических биосенсоров.

1.5. Технология последовательного нанесения полиэлектролитов. ф 1.6. Факторы, определяющие структуру нанопленок: ионная сила, рН, гидратация и высушивание.

1.7. Биосенсоры на основе технологии последовательного нанесения полиэлектролитов (ПНП).

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Метод последовательного нанесения полиэлектролитов (ПНП).

2.2.2. Изготовление тирозиназных биосенсоров.

2.2.3. Модификация графита полидиэтиламинофосфазеном (ПФ).

2.2.4. Электромодификация графитовых электродов оксидом Mn(IV).

2.2.5. Изготовление холиноксидазных биосенсоров.

2.2.6. Приготовление образцов для АСМ.

2.2.7. Получение АСМ-изображений.

2.2.8. Обработка топографии поверхностей.

2.2.9. Силовое картирование нанопленок.

2.2.10. Электрохимический анализ фенола.

2.2.11. Определение количества тирозиназы в слое.

2.2.12. Электрохимический анализ пероксида водорода.

2.2.13. Электрохимический анализ холина.

2.2.14. Спектрофотометрическое определение активности холиноксидазы.

2.2.15. Анализ активности бутирилхолинэстеразы.

2.2.16. Обработка результатов. t 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Структурные особенности нанопленок, полученных методом последовательного нанесения полиэлектролитов.

3.1.1. Влияние ионной силы на структуру полимера на поверхности.

3.1.2. Влияние количества нанесений структуру полиэлектролитов на поверхности графита.

3.1.3. Силовое картирование полиэлектролитных нанопленок.

3.1.4. Нанопленки на основе белков.

3.1.5. Предобработка графита полидиэтиламинофосфазеном.

3.2. Тирозиназный биосенсор.

3.2.1. Разработка и оптимизация метода послойного нанесения полиэлектролитов для создания тирозиназного биосенсора.

3.2.1.1. Влияние природы полиэлектролита на активность тирозиназных электродов.

3.2.1.2. Влияния концентрации тирозиназы на величину аналитического сигнала тирозиназных электродов.

3.2.1.3. Влияние времени адсорбции тирозиназны и поликатиона на величину аналитического сигнала биосенсоров.

3.2.2. Кинетические параметры тирозиназы в пленках полиэлектролитов. ф 3.2.3. Аналитические характеристики тирозиназных биосенсоров.

3.2.4. Стабильность тирозиназных биосепсоров.

3.2.5. Применение тирозиназных биосенсоров для анализа активности ферментов.

3.2.6.1. Анализа активности бутирилхолинэстеразы в кинетическом режиме.

3.2.6.2. Количественный анализ щелочной фосфатазы.

3.3. Биосенсоры на основе холиноксидазы.

3.3.1. Оптимизация системы определения пероксида водорода на основе графитовых электродов, модифицированных оксидом Mn(IV).

3.3.1.1. Электрохимические особенности графитовых электродов, модифицированных оксидом Mn(IV).

3.3.1.2. Топографические характеристики графитовых электродов, модифицированных оксидом Mn(IV).

3.3.1.3. Оптимизация методики модификации графитовых ф электродов оксидом Mn(IV).

3.3.1.4. Аналитические характеристики и стабильность графитовых электродов, модифицированных оксидом Mn(IV).

3.3.2. Разработка и оптимизация метода послойного нанесения, полиэлектролитов для создания холипоксидазного биосенсора.

3.3.2.1. Влияние природы полиэлектролита иа активность холиноксидазных электродов.

3.3.2.2. Влияние концентрации холиноксидазы в растворе на величину аналитического сигнала тирозиназных электродов.

3.3.2.3. Влияние времени адсорбции холипоксидазы на величину аналитического сигнала биосенсоров. ф 3.3.3. Кинетические характеристики холинокидазы в пленках полиэлектролитов.

3.3.4. Аналитические характеристики и стабильность холинокидазных биосенсоров.

Биосенсорные технологии в настоящее время являются одним из наиболее перспективных направлений развития диагностических и биоаналитических систем. Биосенсорные устройства, содержащие в качестве "узнающих" элементов ферменты и другие биомакромолекулы, клетки и клеточные органеллы, способны обеспечить высокочувствительный и быстрый анализ химических соединений и микробиологических объектов с аналитическими и эксплуатационными характеристиками, недостижимыми при использовании обычных химических сенсоров и физических систем регистрации. Неоспоримыми преимуществами использования биосенсоров являются их низкая стоимость, минимизация числа необходимых для анализа реагентов, простота использования, мобильность и возможность эксплуатации неподготовленным персоналом.

К настоящему времени создан широкий спектр биосенсорных устройств на основе различных ферментативных систем. Пожалуй, самым удачным примером внедрения научных разработок в области создания биосенсоров в производство и повседневное использование является биосенсор для анализа глюкозы. Этот сенсор на основе фермента глюкозоксидазы благодаря своей высокой чувствительности, селективности и простоте получил распространение не только в химических лабораториях, но и активно используется в медицинских учреждениях для диагностики и непрерывного наблюдения больных диабетом, а также в промышленности при технологическом контроле микробиологической и пищевой продукции. Помимо глюкозоксидазного датчика, к настоящему моменту уже описано и успешно используется более десятка биосенсоров на основе других ферментов.

Вместе с тем, современные тенденции развития области биосенсорных технологий предъявляют повышенные требования не только к чувствительности и специфичности аналитических приборов. Одной из важнейших задач является переход к принципиально новому поколению приборов типа микроэлектромеханических устройств, представляющих собой интегрированные системы с малыми, менее 1 мкм, размерами сенсорных элементов. Поэтому в настоящее время активно ведутся разработки аналитических приборов на основе микроканальцев, микро- и нано- чипов и др. Ставшие очевидными в настоящее время тенденции к миниатюризации аналитических приборов требуют поиска новых эффективных методов создания сенсорных элементов. Для решения этих задач многими научными группами по всему миру разрабатываются подходы к созданию сенсорных элементов на основе стабильных и воспроизводимых наноструктур.

Среди множества современных методов, позволяющих решить поставленные задачи, специалистами особо выделяется технология последовательного нанесения полиэлектролитов (ПНП). Данный метод представляет собой простую и эффективную технику создания многослойных ультратонких органических пленок на твердой поверхности. Простота, технологичность и широкие возможности модификации дают возможность утверждать, что этот метод может быть успешно использован в области создания биосенсорных электродов при их массовом производстве.

Использование метода послойного нанесения полиэлектролитов (ПНП) в биосенсорных нанотехнологиях представляет интерес как с прикладной, так и с фундаментальной точек зрения. При этом оба вопроса к настоящему моменту не изучены в полной мере. Таким образом, исследование аналитических возможностей биосенсоров, создаваемых на основе метода ПНП, а также природы взаимодействий компонентов внутри самоорганизующихся полиэлектролитных нанопленок является одной из актуальных задач современной биоаналитической химии.

Целью настоящей работы являлась разработка фенольного и холинового биосенсоров на основе метода последовательного нанесения полиэлектролитов (ПНП), исследование факторов, влияющих на организацию полиэлектролитных и белковых наноструктур и кинетические параметры ферментов внутри нанопленок, а также изучение аналитических возможностей биосенсоров.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

Разработана и оптимизирована методика формирования тирозиназных биосенсоров на основе метода ПНП. Исследовано влияние природы полиэлектролитов на кинетические параметры тирозиназы в нанопленках. Получены основные аналитические характеристики биосенсоров. Линейный диапазон определяемых

A f концентраций фенола составил 1-10" М - 1-10* М, нижняя граница определяемых У содержаний фенола и чувствительность - 6 нМ и 0,9 А/(М-см ), соответственно.

Оптимизирована методика изготовления пероксид-чувствительных сенсоров на основе модифицированных оксидом Mn(IV) графитовых электродов. Получены основные аналитические характеристики биосенсоров. Линейный диапазон определяемых концентраций пероксида водорода составил 1-10~8 М - МО"4 М, нижняя граница определяемых содержаний пероксида водорода и чувствительность - МО"8 М и 1,2 А/(М-см2), соответственно.

Разработана и оптимизирована методика формирования холиноксидазных биосенсоров. Исследовано влияние природы полиэлектролитов на кинетические параметры холиноксидазы в нанопленках. Получены основные аналитические характеристики биосенсоров. Линейный диапазон определяемых концентраций

7 Я холина составил МО" М - 1-10" М, нижняя граница определяемых содержаний фенола и чувствительность - МО"7 нМ и 16 мА/(М-см ), соответственно.

Показано, что увеличение гидрофобности углеводородного радикала в ряду алкильных производных П4ВП приводит к уменьшению активности тирозиназы и увеличению активности холиноксидазы.

5. Изучены факторы, определяющие структуру и стабильность нанопленок полиэлектролитов и белков, полученных методом ПНП. Исследованы их механические и адгезивные свойства.

6. Разработан метод модификации поверхности графита полидиэтиламинофосфазеном, приводящий к стабилизации пленок белков и полиэлектролитов.

7. Показаны возможные приложения разработанных биосенсоров для анализа активности бутирилхолинэстеразы в кинетическом режиме и количественного анализа щелочной фосфатазы.

1. Sanchez-Ferror A., Rodriguez-Lopez J.N., Garcia-Canovas F., Garcia-Carmona F. Tyrosinase: a comprehensive review of its mechanism. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1247. P.1-11.

2. Himmelwright R.S., Eickman N.C., Lubien C.D., Lerch K., Solomon E. Chemical and spectroscopic studies of the binuclear copper active site of Neurospora Tyrosinase: comparison to hemocyanins. //J. Am. Chem. Soc. 1980. V. 102. P. 7339-7344.

3. Streffer K., Vijgenboom E., Tepper A., Makower A., Scheller F.W., Canters G.W., Wollenberger U. Determination of phenolic compounds using recombinant tyrosinase from Streptomyces antibioticus. // Anal. Chim. Acta. 2000. V. 427. P. 201-210.

4. Riley P.A. Tyrosinase kinetics: a semi-quantitative model of the mechanism of oxidation of monohydric and dihydric phenolic substrates. // J. Theor. Biol. 2000. V. 203. P. 1-12.

5. Kertesz D., Brunori M., Zito R., Antonini E. Transient kinetic studies of DOPA oxidation by polyphenoloxydase. // Biochem. Biophys. Acta. 1971. V. 250. P. 306-310.

6. Страйер JI. Биохимия. (Пер. с англ. М.Д. Гроздовой: Под ред. С.Е. Северина). М.: Мир, 1985. Т. 2. 177 с.

7. Wilcox D.E., Porras A.G., Hwang Y.T., Lerch К., Winkler M.E., Solomon E.I. Substrate analogue binding to the coupled binuclear copper active site in tyrosinase. // J. Am. Chem. Soc. 1985. V. 107. P. 4015-4027.

8. Eickman N.C., Solomon E.I., Larrabee J.A., Spiro T.G., Lerch K. Ultraviolet resonance raman study of oxytyrosinase. Comparison with oxyhemocyanins. // J. Am. Chem. Soc. 1978. V. 100. P. 6529-6531.

9. Jolley R.L., Evans L.H., Makino N., Mason H.S. Oxytyrosinase.//J. Biol. Chem. 1974. V. 249. №2. P. 335-345.

10. Duckworth H.W., Coleman J.E. Physicochemical and kinetic properties of mashroom tyrosinase. // J. Biol. Chem. 1970. V. 245. №7. P. 1613-1625.

11. Штрауб Ф.Б. Биохимия. (Пер. с венг.) Будапешт: Издательство АН Венгрии, 1963. 206-207 с.

12. Страйер Л. Биохимия. (Пер. с англ. М.Д. Гроздовой: Под ред. С.Е. Северина). М.: Мир, 1985. Т. 3. 339 с.

13. Cosnier S. Biomolecule immobilization on electrode surfaces by entrapment or attachment to electrochemically polymerized films. A review. // Biosens. & Bioelectron. 1999. V. 14. P. 443-456.

14. Parellada J., NarvaezA., Lopez M.A., DominguezE., Fernandez J.J., Pavlov V., Katakis I. Amperometric immunosensors and enzyme electrodes for environmental applications. //Anal. Chim. Acta. 1998. V. 362. P. 47-57.

15. Shan D., Mousty Ch., Cosnier S., Mu Sh. A composite poly azure B-clay-enzyme sensor for the mediated electrochemical determination of phenols. // J. Electroanal. Chem. 2002. V. 537. P. 103-109.

16. Cosnier S., Fombon J.-J., ЬаЬЬё P., Limosin D. Development of a PPO-poly(amphiphilic pyrrole) electrode for on site monitoring of phenol in aqueous effluents. // Sens. & Actuat. 1999. V. 59. P. 134-139.

17. Liu S., Yu J., Ju H. Renewable phenol biosensor based on a tyrosinase-colloidal gold modified carbon paste electrode. // J. Electroanal. Chem. 2003. V. 540. P. 61-67.

18. Wang G., Xu J.-J., Ye L.-H., Zhu J.-J., Chen H.-Y. Highly sensitive sensors based on the immobilization of tyrosinase in chitosan. // Bioelectrochem. 2002. V. 57. P. 33-38.

19. Ghindilis A.L., Gavrilova V.P., Yaropolov A.I. Laccase-based biosensor for determination of polyphenols: determination of catechols in tea. // Biosens. & Bioelectron. 1992. V. 7. P. 127-131.

20. Yaropolov A.I., Kharybin A.N., Emneus J., Marko-Varga G., Gorton L. Flow-injection analysis of phenols at a graphite electrode modified with co-immobilized laccase and tyrosinase. // Anal. Chim. Acta. 1995. V. 308. P. 137-144.

21. Freire R.S., Thongngamdee S., Duran N., Wang J., Kubota L.T. Mixed enzyme (laccase/tyrosinase)-based remote electrochemical biosensor for monitoring phenolic compounds. // Anal. 2002. V. 127. P. 258-261.

22. Chang S.Ch., Rawson K., McNeil C.J. Disposable tyrosinase-peroxidase bi-enzyme sensor for amperometric detection of phenols. // Biosens. & Bioelectron. 2002. V. 17. P. 1015-1023.

23. Uchiyama S., Hasebe Y., Shimizu H., Ishihara H. Enzyme-based catechol sensor on the cyclic reaction between catechol and 1,2-benzoquinone, using L-ascorbate and tyrosinase. // Anal. Chem. Acta. 1993. V. 276. P. 341-345.

24. Eremenko A.V., Makower A., Bauer Ch.G., Kurochkin I.N., Scheller F.W. A bienzyme electrode for tyrosine-containing peptides determination. // Electroanal. 1997. V. 9. №4. P. 1-5.

25. Wang J., Fang L., Lopez D., Amperometric biosensor for phenols based on a tyrosinase-graphite-epoxy biocomposite. // Anal. 1994. V. 119. P. 445-458.

26. Valentino R.J., LockridgeO., Eckerson H.W., LaDuB.N. Prediction of drug sensitivity in individuals with atypical serum cholinesterase based on in vitro biochemical studies. // Biochem. Pharmac. 1981. V. 30. P. 1643-1649.

27. Kotte H., Grundig В., Vorlop K.-D., Strehlitz В., Stottmeister U. Methylphenasonium-modified enzyme sensor based on polymer thick films for subnanomolar detection of phenols. // Anal. Chem. 1995. V. 67. №1. P. 65-70.

28. Cespedes F., Alegret S. New materials for electrochemical sensing II. Rigid carbon-polymer biocomposites. // Trends Anal. Chem. 2000. V. 19. №4. P. 276-275.

29. Sigolaeva L.V., Makower A., Eremenko A.V., Makhaeva G.F., Malygin V.V., Kurochkin I.N., Scheller F. Bioelectrochemical analysis of neuropathy target esterase activity in blood. //Anal. Biochem. 2001. V. 290. №1. P. 1-9.

30. Rogers K.R., Becker J.Y., Cembrano J., Chough S.H. Viscosity and binder composition effects on tyrosinase-based carbon paste electrode for of phenol and catechol. // Talanta. 2001. V. 54. P. 1059-1065.

31. Wang В., Zhang J., Dong S. Silica sol-gel composite film as an encapsulation matrix for the construction of an amperometric tyrosinase-based biosensor. // Biosens. Bioelectron. 2000. V. 15. P. 397-402.

32. Wang В., Dong S. Organic-phase enzyme electrode for phenolic determination based on functionalized so-gel composite. // J. Electroanal. Chem. 2000. V. 487. P. 45-50.

33. Ikuta, S., Imamura, S., Misaki, H., Hariuti, Y. Purification and characterization of choline oxidase from Arthrobacter globiformis. II J. Biochem. 1977. V. 82. P. 1741 -1749.

34. Ohishi, N., Yagi, K. Covalently bound flavin and prosthetic group of choline oxidase. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. V. 86. P. 1084-1088.

35. Yamada, H., Mori, N., Tani, Y. Properties of choline oxidase of cylindrocarpon didymium M-l. //Agric. Biol. Chem. 1979. V. 43. P. 2173- 2177.

36. Ohta-Fukuyama, M., Miyake, Y., Emi, S., Yamano, T. Identification and properties of the prosthetic group of choline oxidase from Alcaligenes sp. //J. Biochem. 1983. V. 88. P. 197-203.

37. Hatefi, Y., Stiggall, D.L. Metal-containing flavoprotein dehydrogenases. // The Enzymes, 3rd Ed. Boyer,P.D„ ed. 1975. 13. P. 175-297.

38. Gadda, G. Kinetic mechanism of choline oxidase from Arthrobacter globiformis. II Bioch. Bioph. Acta. 2003. V. 1646. P. 112-118.

39. A. Navas Diaz, M.C. Ramos Peinado, M.C. Torijas Minguez. Sol-gel horseradish peroxidase biosensor for hydrogen peroxide detection by chemiluminescence. // Analytica Chimica Acta. 1998. V. 363. P. 221-227.

40. С.-Х. Lei, S.-Q. Hu, G.-L. Shen, R.-Q. Yu. Immobilization of horseradish peroxidase to a nano-Au monolayer modified chitosan-entrapped carbon paste electrode for the detection of hydrogen peroxide. // Talanta. 2003. V. 59. P. 981-988.

41. Sakamoto, A., Alia., Murata, N. Metabolic engineering of rice leading to biosynthesis of glicinebetaine and tolerance to salt and cold. // Plant Mol. Bio.1998. V. 38P. 1011-1019.

42. Garguilo, M.G., Michael, A.C. Optimization of amperometric microsensors for monitoring choline in the extracellular fluid of brain tissue. // Anal. Chim. Acta. 1995. V. 307. P. 291-299.

43. A. Efitekhari. Electrocatalysis and amperometric detection of hydrogen peroxide at an aluminum microelectrode modified with cobalt hexacyanoferrate film. // Microchimica Acta. 2003. V. 141. P. 15-21.

44. J. Wang, L. Chen, D.-B. Luo. Electrocatalytic detection of hydrogen peroxide at a poly(m-phenylenediamine)-modified carbon paste electrode and its use for biosensing of glucose. //Analytical Communications. 1997. V. 34. P. 217-219.

45. A.A Karyakin, E.A. Puganova, I.A. Budashov, I.N. Kurochkin, E.A. Karyakina, V.A. Levchenko, V.N. Matvienko, S.D. Varfolomeyev. Prussian blue based nanoelectrode arrays for H202 detection. // Analytical Chemistry. 2004. V. 76. P. 474-478.

46. A.A. Karyakin, E.A. Karyakina. Prussian blue-based 'artificial peroxidase' as a transducer for hydrogen peroxide. Application to biosensors. // Sensors and Actuators B. 1999. V. 57. P. 268-273.

47. Alpeeva I.S., Niculescu-Nistor M., Leon J.C., Csoregi E., Sakharov I.Y. Palm tree peroxidase-based biosensor with unique characteristics for hydrogen peroxide monitoring. //Biosens. Bioelectron. 2005. V.21. P. 742-8.

48. A. Navas Diaz, M.C. Ramos Peinado, M.C. Torijas Minguez. Sol-gel horseradish peroxidase biosensor for hydrogen peroxide detection by chemiluminescence. // Analytica Chimica Acta. 1998. V. 363. P. 221-227.

49. С.-Х. Lei, S.-Q. Hu, G.-L. Shen, R.-Q. Yu. Immobilization of horseradish peroxidase to a nano-Au monolayer modified chitosan-entrapped carbon paste electrode for the detection of hydrogen peroxide. // Talanta. 2003. V. 59. 981-988.

50. Т. Ferri, A. Poscia. R. Santucci. Direct electrochemistry of membrane-entrapped horseradish peroxidase. Part II: Amperometric detection of hydrogen peroxide. // Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 1998. V. 45. P. 221-226.

51. D.T.V. Anh, W. Olthuis. P. Bergveld. Hydrogen peroxide detection with improved selectivity and sensitivity using constant current potentiometry. Sensors and Actuators B. 2004. V. 91. P. 1-4.

52. S. Sen, A. Gulce, H. Gulce. Polyvinylferrocenium modified Pt electrode for the design of amperometric choline and acetylcholine enzyme electrodes. // Biosensors & Bioelectronics. 2004. V. 19. P. 1261-1268.

53. Kulys J., Schmidt R. Bienzyme sensors based on chemically modified electrodes. // Biosens. Bioelectron. 1991. V. 6. P. 43-48.

54. A. Rahman, D.S. Park, Y.B. Shim. A performance comparison of choline biosensors: anodic or cathodic detections of H2O2 generated be enzyme immobilized on a conducting polymer. // Biosensors & Bioelectronics. 2004. V. 19. P. 1565-1571.

55. N. Kiba, S. Ito, M. Tachibana, K. Tani, H. Koizumi. Simultaneous determination of choline and acetylcholine based on a trienzyme chemiluminometric biosensor in a single line flow injection system. // Analytical Sciences. 2003. V. 19. P. 1647-1651.

56. Yang M, Yang Y, Yang Y, Shen G, Yu R. Bienzymatic amperometric biosensor for choline based on mediator thionine in situ electropolymerized within a carbon paste electrode. // Anal Biochem. 2004. V. 334. P. 127-34.

57. В. Leca, L.J. Blum. Luminol electrochemiluminescence with screen-printed electrodes for low cost disposable oxidase-based optical sensors. // The Analyst. 2000. V. 125. P. 789-791.

58. K.M. Mitchell. Acetylcholine and choline amperometric enzyme sensors characterized in vitro and in vivo. // Analytical Chemistry. 2004. V. 76. P. 1098-1106.

59. Iler, R. Multilayers of Colloidal Particles.// J. Colloid & Interface Sci. 1966,21, 569594.

60. Decher G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. (1997) Science, V. 277, p. 1232-1237.

61. Львов Ю.М., ДехерГ. Сборка мультислойных упорядоченных пленок последством чередующейся адсорбции противоположно заряженных макромолекул. // Кристаллогр. 1994. Т. 39. № 4. С. 696-716.

62. Decher, G.; Hong J.D.; Schmitt J. Buildup of ultrathin multilayer films by a self-assembly process: III. Consecutively alternating adsorption of anionic and cationic polyelectrolytes on charged surfaces. Thin Solid Films. 1992,210, 831-835.

63. McShane M.J., Lvov Y.M. Layer-by-layer electrostatic self-assembly and biomaterial applications. // Encyclopedia of nanoscience & nanotechnology. New-York: M. Dekker Publ. 2004. P. 1-26.

64. Keller S., Kim H., Mallouk, T. Layer-by-layer assembly of intercalation compounds and heterostructures on surfaces: towards molecular "beaker" epitaxy. // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 8817-8818.

65. Lvov, Y.; Ariga, K.; Ichinose, I.; Kunitake, T. Assembly of multicomponent protein films by means of electrostatic layer-by-layer adsorption. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 6117-6123.

66. Yoo, D.; Shiratori, S.; Rubner, M. Controlling bilayer composition and surface wettability of sequentially adsorbed multilayers of weak polyelectrolytes. Macromolecules. // 1998. V. 31. P. 4309-4318.

67. Cassagneau, Т.; Mallouk, Т.; Fendler, J. Layer-by-layer assembly of thin film Zener diodes from conducting polymers and CdSe nanoparticles. // J. Am. Chem. Soc. 1998 V. 120. P.7848-7859.

68. Mamedov, A.; Kotov, N. Free-Standing Layer-by-Layer Assembled Films of Magnetite Nanoparticles. // Langmuir. 2000. V. 16. P. 5530-5533.

69. Hesselink F. Adsorption from solution at the solid/liquid interface. // Eds Parfit G. and Rochester C. London-N.Y.: Academ. Press. 1983. 377 p.

70. Kotov, N.A.; Dekany, I.; Fendler, J.H.; Layer-by-layer self-assembly of polyelectrolytesemiconductor nanoparticle composite films. // J. Phys. Chem. 1995. V. 99. P.13065-13069.

71. Kerimo, J.; Adams, D.M.; Barbara, P.F.; Kaschak, D.M.; Mallouk, Т.Е. NSOM Investigations of the Spectroscopy and Morphology of Self-Assembled Multilayered Thin Films. // J. Phys. Chem. B. 1998. V. 102. P. 9451-9460.

72. Ostrander, J.W.; Mamedov, A. A.; Kotov, N.A. Two modes of linear layer-by-layer growth of nanoparticle-polyelectrolyte Multilayers and different interactions in the layer-by-layer deposition.//JACS. 2001. V. 123.P. 1101-1110.

73. Kotov, N.A. Ordered Layered Assemblies of Nanoparticles. // MRS Bulletin. 2001. P. 992-997.

74. Decher, G.; Eckle, M.; Schmitt, J.; Struth, B. Layer-by-layer assembled multicomposite films. // Curr. Opin. Coll. Interface Sci. 1998. V. 3. P. 32-39.

75. Hammond, P.T. Recent explorations in electrostatic multilayer thin film assembly. // Curr. Opin. Coll. Interface Sci. 1999. V. 4. P. 430-442.

76. Bertrand, P.; Jonas, A.; Laschewsky, A.; Legras, R. Ultrathin polymer coatings by complexation of polyelectrolytes at interfaces: suitable materials, structure and properties. // Macromol. Rapid Commun. 2000. V. 21. P. 319-348.

77. Lvov, Y. Protein Architecture: Interfacial Molecular Assembly and Immobilization Biotechnology. // Mohwald, H., Eds. Marcel Dekker Publ. NY. 2000. P. 1-394.

78. Sukhorukov, G.B.; Donath, E.; Davis, S.; Lichtenfeld, H.; Caruso, F.; Popov, V.I.; Mohwald, H. Step-Wise Polyelectrolyte Assembly on Particle Surfaces-A Novel Approach to Colloid Design. // Polym. Adv. Technol. 1998. V. 9. P. 759. .

79. Caruso, F.; Caruso, R.A; Mohwald, H. Nanoengineering of Inorganic and Hybrid Hollow Spheres by Colloidal Templating. // Science. 1998. V. 262. P. 1111-1114.

80. Lvov, Y.; Price, R.; Singh, A.; Selinger, J.; Spector, M.; Schnur, J. Imaging Nanoscale Patterns on Biologically Derived Microstructures. // Langmuir. 2000. V. 16. P. 59325935.

81. Lvov, Y.; Caruso, F. Biocolloids with Ordered Urease Multilayer Shells as Enzymatic Reactors. // Anal. Chem. 2001. V. 73. P. 4212-4217.

82. Lvov, Y.; Antipov, A.; Mamedov, A.; Mohwald, H.; Sukhorukov, G. Urease Encapsulation in Nanoorganized Microshells. //Nano Letters. 2001. V. 1. P. 125-128.

83. Sukhorukov, G.B.; Dahne, L.; Hartman, J.; Donath, E.; Mohwald, H. Controlled precipitation of dyes into hollow polyelectrolyte capsules based on colloids and biocolloids. // Adv. Mater. 2000. V. 12. P. 112-115.

84. Mendelsohn, J.; Barrett, C.; Chan, V.; Pal, A.; Mayes, A.; Rubner, M. Fabrication of Microporous Thin Films from Polyelectrolyte Multilayers. // Langmuir. 2000. V. 16. P. 5017-5023.

85. Losche, M.; Schmitt, J.; Decher, G.; Bouwman, W.G.; Kjaer, K. Detailed structure of molecularly thin polyelectrolyte multilayer films on solid substrates as revealed by neutron reflectometry. // Macromolecules. 1998. V. 31. P. 8893-8906.

86. Dubas, S.T.; Schlenoff, J.B. Factors controlling the growth of polyelectrolyte multilayers. // Macromolecules. 1999. V. 32. P. 8153-8160.

87. Steitz, R; Jaeger, W.; von Klitzing, R. Influence of charge density and ionic strength on the multilayer formation of strong polyelectrolytes. // Langmuir. 2001. V. 17. P. 44714474.

88. Schoeler, В.; Kumaraswamy, G.; Caruso, F. Investigation of the influence of polyelectrolyte charge density on the growth of multilayer thin films prepared by the layer-by-layer technique. // Macromolecules. 2002. V. 35. P. 889-897.

89. Yoo, D.; Shiratori, S.S.; Rubner, M.F. Controlling bilayer composition and surface wettability of sequentially adsorbed multilayers of weak polyelectrolytes. // Macromolecules. 1998. V. 31. P. 4309-4318.

90. Shiratori, S.S.; Rubner, M.F. pH-dependent thickness behavior of sequentially adsorbed layers of weak polyelectrolytes. // Macromolecules. 2000. V. 33. P. 4213-4219.

91. J. Hodak, R. Etchenique, E.J. Calvo, K. Singhal, P.N. Bartlett. Layer-by-layer self-assembly of glucose oxidase with a poly(allylamine) ferrocene redox mediator. // Langmuir. 1997. V. 13. P. 2708-2716.

92. Wang L., Hu N. Direct electrochemistry of hemoglobin in layer-by-layer films with poly(vinyl sulfonate) grown on pyrolytic graphite electrodes. // Bioelectrochem. 2001.V. 53. P. 205-212.

93. Hou S. F., Fang H. Q., Chem H. Y. Am amperometric enzyme electrode for glucose sensing using immobilized glucose oxidase in a ferrocene attached poly-4-vinylpyridine multilayer film.// Anal. Lett. 1997. V. 30. P. 1631.

94. Hou S. F., Yang K. S., Fang H.Q., Chen H.Y. Amperometric glucose enzyme electrode by immobilizing glucose oxidase in multilayers self-assembled monolayers surface.// Talanta 1998 V. 47 P. 561-567.

95. Nakano K., Doi K., Tamura K., Katsumi Y., Tazaki M. Self-assembling monolayer formation of glucose oxidase covalently attached on 11-aminoundecanethiol monolayers on gold// Chem Commun. 2003. PI544-1545 .

96. Xu X.H., Han В., Fu Y.S. Preparation of chitosan/glucose oxidase nanolayered films for electrode modification by the technique of layer-by-layer self-assembly. // J. Mater. Science Lett. 2003. V. 22. P.695-697.

97. Yang S., Li Y, Jiang X., Chen Z., Lin X. Horseradish peroxidase biosensor based on layer-by-layer technique for the determination of phenolic compounds.// Sens. & Actuat В 2005 (in press)

98. Zucolotto V., Pinto A., Tumolo Т., Moraes M., Baptista M., Araujo A. Catechol biosensing using nanostrutured layer-by-layer film containing Cl-catechol 1,2-dioxygenase.// Biosens. & Bioelectr 2005 (in press).

99. Ram M.K., Bertoncello P., Ding H., Paddeu S., Nicolini C. Cholesterol biosensors prepared by layer-by-layer technique. // Biosens. & Bioelectr. 2001. V. 16. P. 849-856.

100. Beissenhirtz M.K., Scheller F.W., Lisdat F. A superoxide sensor based on a multilayer cytochrome с electrode. // Anal. Chem. 2004. V. 76. P. 4665-4671.

101. Anzai J., Kobayashi Y., Suzuki Y., Takeshita H., Chen Q., Osa Т., Hoshi Т., Du X. Enzyme sensors prepared by layer-by-layer deposition of enzymes on a platinum electrode through avidin-biotin interaction. // Sens. & Actuat. 1998. V. 52. P. 3-9.

102. Forzani E., Teijilo M., Nart F., Calvo E., Solis V Effect of the polycation nature on the structure of layer-by-layer electrostatically self-assembled multilayers of polyphenol oxidase.// Biomacromol. 2003. V. 4. P. 869-879.

103. Forzani E.S., Solis V.M. Electrochemical behavior of polyphenol oxidase immobilized in self-assembled structures layer by layer with cationic polyallylamine. // Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 5300-5307.

104. Campuzano S., Serra В., Pedrero M., Manuel de Villena F.J., Pingarron J.M. Amperometric flow-injection determination of phenolic compounds at self-assembled monolayer-based tyrosinase biosensors. // Anal. Chim. Acta. 2003. V. 494. P. 187-197.

105. Raghavan D., Gu X., Nguyen Т., VanLandingham M., Karim A., Mapping Polymer Heterogeneity Using Atomic Force Microscopy Phase Imaging and Nanoscale Indentation //Macromolecules 2000, 33,2573-2583

106. Manfred Radmacher, Monika Fritz, Jason P. Cleveland, Deron A. Walters, Paul K. Hansma. Imaging adhesion forces and elasticity of lysozyme adsorbed on mica with the atomic force microscope.// Langmuir. -1994.- v.10. -pp. 3809-3814

107. Butt H.-J. Measuring electrostatic, van der Waals, and hydration forces in electrolyte solutions with an atomic force microscope. // Biophys. J. 1991. - v. 60. - pp. 1438-1444.

108. Frisbie C.D., Rozsnyai L.F. Noy A., Wrighton M.S., Lieber C.M. Functional group imaging by chemical force microscopy. // Science. 1994. - v. 265. - pp. 20712074.

109. Lee G.U., Chrisey L.A., Colton R.J. Direct measurement of the forces between complementary strands of DNA. // Science. 1994. - v. 266. - pp. 771-773.

110. Ландау Л.Д., Лифшиц E.M. Теория упругости. // M.: Наука,1987

111. Remizova Е., Pergushov D., Tur D., Papkov V., Zezin A. Properties of novel poly(dialkylaminophosphazene)s in aqueous media and their interaction with anionic polyelectrolytes. // European Polymer Congress, Moscow, 27 June- 1 July 2005.