Дизайн и синтез коротких пептидов с ноотропной и нейропротективной активностью тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

МОРОЗОВА АННА АНАТОЛЬЕВНА

ДИЗАЙН И СИНТЕЗ КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ С НООТРОПНОЙ И НЕЙРОПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2009

003465032

Работа выполнена в отделе химии Государственного учреждения научно-исследовательского Института фармакологии имени В.В.Закусова Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Гудашева Татьяна Александровна

доктор химических наук Филиппова Ирина Юрьевна

доктор химических наук, профессор,

член-корр. РАН

Цетлин Виктор Ионович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии

наук Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится 31 марта 2009 года. В 16 час. 00 мин. На заседании Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 199991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ, Лабораторный корпус "А", аудитория 501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан H.Lгода

Учёный секретарь Совета кандидат химических наук

И.Г.Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В настоящее время физиологически активные пептиды рассматриваются как "лекарства будущего". Наряду с богатым спектром фармакологических свойств, этот класс соединений обладает такими важными преимуществами перед непептидными соединениями, как высокая активность, малая токсичность, невыраженность синдрома отмены и, как правило, мягкий модуляторный характер действия. На сегодняшний день имеется всего около 50 пептидных лекарственных препаратов. Использование биологически активных эндогенных пептидов в качестве лекарственных препаратов ограничено их низкой стабильностью в биологических средах и малой способностью проникать через гастро-интестинальный и гемато-энцефалический барьеры (ГЭБ). Чтобы избежать этих недостатков, при создании пептидных лекарственных препаратов используют различные приемы. Для увеличения энзиматической стабильности в структуру пептида часто вводят остатки пролина и глицина, И-аминокислоты или неприродные аминокислотные остатки, модифицируют пептидную связь [Н.Ф.Мясоедов и соавт., 2006, 2007; И.П.Ашмарин и др., 2003, 2005; М.И.Титов и соавт., 1984, 1987; Е.И.Чазов и соавт., 1984; В.И.Дейгин и соавт., 2003]. Наиболее радикальным приемом является создание непептидных пептидомиметиков. Для увеличения способности проникать через ГЭБ повышают липофильность пептида путем введения гидрофобных заместителей. Почти все эти подходы уменьшают описанные выше преимущества пептидных препаратов.

Принципиально другим подходом является использование коротких, преимущественно ди-тетрапептидов. Они, как правило, способны проникать через биологические барьеры как за счет пассивного, так и активного транспорта. Коротким пептидам присуща повышенная энзиматическая стабильность. Всё это позволяет в ряде случаев создавать на их основе перорально активные лекарственные препараты. В связи с важностью коротких физиологически активных пептидов как основы для создания нового поколения лекарственных веществ развитие новых подходов к их поиску представляется актуальным.

Для поиска коротких биологически активных пептидов широко используется определение биологически активных коротких фрагментов более длинных пептидов. В НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН применяется оригинальный подход, состоящий в конструировании коротких пептидов - топологических аналогов непептидных психотропных лекарств [Т.А.Гудашева и др., 1985; Т.А.ОЫазЬеуа е1 а1., 1996, 1998; Т.А.Гудашева и А.П.Сколдинов, 2003; Р.У.Островская и др., 2000].

В данной работе развиваются такие подходы, как поиск новых дипептидов, генетически родственных известным активным пептидам, создание циклопептидных конформационных аналогов петлеобразных структур белков и М-ацилдипептидных миметиков Р-поворотных участков полипептидов.

В связи с высоким числом инсультов, сопровождающихся большим процентом смертности, для лечения и профилактики нейродегенеративных заболеваний необходимым является развитие лекарственных препаратов для их лечения, в первую очередь нейропротекторов (для уменьшения очага поражения) и ноотропов (для восстановления

нарушенных когнитивных функций). Кроме того, нейропротективные и ноотропные препараты необходимы для лечения других нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Лльцгеимсра и Паркинсона. Арсенал таких лекарственных средств ограничен.

В качестве одного из прямых регуляторов процессов обучения и памяти рассматривается основной метаболит вазопрессина AVP[4-9]. В НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМИ было показано, что наименьшим активным фрагментом AVP[4-9] является его N-концевой дипептид амид пироглутамиласпарагина. Получение новых активных аналогов этого дипептида может дать основу для создания новых ноотропных пептидных препаратов.

Важным эндогенным фактором, участвующим в противодействии нейродегенеративным заболеваниям, является фактор роста нервов (NGF), на основе которого ряд зарубежных фирм и университетов пытается создать современные нейропротективные средства [F.M.Longo et al., 1999, 2002, 2003; H.U.Saragovi et al., 2000, 2002,2004; S J.Pollack and S.J.Harper, 2002].

Поиск коротких пептидов, обладающих ноотропной и нейропротективной активностью, которые в дальнейшем могли бы стать базой для создания принципиально новых пептидных лекарственных препаратов, является актуальным.

Целью работы является дизайн и синтез новых коротких биологически активных пептидов, перспективных для создания лекарственных препаратов с ноотропной и нейропротективной активностью.

В соответствии с поставленной целью задачами исследования являлись:

1. Синтез дипептидов, соответствующих точечным мутантам дипептидного фрагмента AVP(4-5), и изучение взаимосвязи между видом точечной мутации и активностью дипептида;

2. Дизайн и синтез циклических тетра-, пента- и гексапептидов, содержащих трипептидный фрагмент ß-изгиба 4-й петли нейротрофина NGF;

3. Дизайн и синтез мономерных и димерных N-ацилдипептидных миметиков 4-й и 1-й петель NGF и изучение связи их структуры и активности.

Научная новизна исследования

Впервые получены ноотропные дипептиды, соответствующие точечным мутантам амида пироглутамиласпарагина. Впервые синтезированы активные тетра-, пента- и гексапептидные циклические миметики 4-й петли NGF, содержащие трипептидный фрагмент нейротрофина. Показано, что для проявления биологической активности достаточно трех аминокислотных остатков ß-изгиба 4-й петли NGF в составе тетра-гексапептидного циклоаналога. Впервые получена оригинальная группа мономерных и димерных N-ацилдипептидных миметиков NGF, обладающих агонистической и антагонистической активностью. Впервые показано, что миметики 4-й петли обладают селективной нейропротективной активностью, а миметики 1-й петли обладают как нейропротективной, так и дифференцирующей активностью. Практическая значимость

Получены оригинальные дипептиды с ноотропной активностью, которые могут стать основой для создания новых пептидных ноотропных препаратов. Разработан метод синтеза

диастереомерно чистых тетра-гексапептидных циклоаналогов NGF, обладающих антагонистической активностью, которые могут быть полезны для создания средств лечения нейротрофин-зависимых новообразований. Получена новая группа низкомолекулярных димерных N-ацилдипептидных миметиков NGF с высокой нейропротективной активностью, на основе которых могут быть созданы препараты для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера, Паркинсона, инсульты. Апробация работы

Результаты работы докладывались на Всероссийской конференции, посвященной 110-летию Героя Социалистического Труда, лауреата Ленинской и Государственной премий СССР, академика АМН СССР С.В.Аничкова "Психофармакология и биологическая наркология" (Москва, Россия, 2002), на 8-й Региональной конференции Европейской Коллегии Нейропсихофармакологии (Москва, Россия, 2005), на 4-й Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, Россия, 2006), на Ш-м Съезде Фармакологов России "Фармакология -практическому здравоохранению" (Санкт-Петербург, Россия, 2007), на 30-м Европейском пептидном симпозиуме (Хельсинки, Финляндия, 2008). Публикации

По результатам работы опубликовано 5 научных статей и 7 тезисов докладов на научных конференциях.

Структура н объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 4 схемы и 38 рисунков. Библиографический указатель включает 188 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Синтез дипептидов, соответствующих точечным мутантам AVP(4-5), и изучение взаимосвязи между видом точечной мутации и активностью дипептида

В НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН ранее был сконструирован суперактивный дипептидный аналог пирацетама, амид пироглутамиласпарагина [Т.А.Гудашева и др., 1995], который совпал с N-концевым фрагментом основного метаболита вазопрессина AVP(4-9). Этот эндогенный гексапептид в настоящее время рассматривается как один из основных регуляторов процессов обучения и памяти. Он входит в состав вазопрессинового семейства мнемотропных пептидов, включающего также AVP(4-8), AVP(5-9) и AVP(5-8) [D. de Wied, 1980; G.L.Kovacs and D. de Wied, 1994].

Мы предположили, что, наряду с вазопрессиновым семейством, может существовать генетически родственное ему семейство других нейропептидов, регулирующих обучение и память. Это гипотетическое семейство может отличаться от вазопрессинового заменами в аминокислотной последовательности, вызванными точечными мутациями соответствующего гена. В случае пироглутамилсодержащих дипептидов, родственных N-концевому фрагменту AVP(4-9), число вариантов таких мутаций невелико, что допускает

прямую экспериментальную проверку. Мы рассматривали только гипотетические мутации по трпплсту, соответствующему второму аминокислотному остатку, замены по которому (на глицин и небелковые аминокислоты), как было показано [Т.А.Гудашева и А.П.Сколдинов, 2003] при изучении структурно-функциональных отношений в группе аналогов этого дипептида, возможны без потери ноотропной активности.

AVP кодируется следующим участком ДНК: Cys Туг Phe Gin Asn Cys Pro Arg Gly TGС TAC TTC CAG AAC TGC CCG AGG GGC

Остаток Asn кодируется нуклеотидной последовательностью AAC. Хорошо известно, что при точечных мутациях чаще встречается замена одного пиримидинового основания на другое (С на Т или Т на С), или пуринового основания на другое пуриновое основание (А на G или G на А). Такие замены называются транзицией. Трансверсия, замена пуринового основания на пиримидиновое или пиримидинового на пуриновое, встречается гораздо реже. Как видно из таблицы 1, для амида пироглутамиласпарагина существует только 2 варианта транзиций по кодону второго аминокислотного остатка и 5 вариантов трансверсий.

Таблица 1. Возможные замены 2-ого аминокислотного остатка в дипептиде р01и-А5п-ЫН2, вызванные точечными мутациями __

Тип мутации Кодон АК.О. Боковой радикал Синтезированный дипептид

ААС Asn —CH2CONH2 pGlu-Asn-NH2

Транзиция по 1-му основанию (А-й) GAC Asp —CH2COO pGlu-Asp-NH2

Транзиция по 2-му основанию (А-в) AGC Ser —CH2OH pGlu-Ser-NH2

Трансверсия по 1-му основанию (А-С) САС His -v" pGlu-His-NH2

Трансверсия по 1-му основанию (А-Т) TAC Туг pGlu-Tyr-NH2

Трансверсия по 2-му основанию (А-Т) АТС Ile CH2CH3 —CH nch3

Трансверсия по 2-му основанию (А-С) АСС Thr —СН-СНз 1 OH

Трансверсия по 3-му основанию (С-А(О)) AAA AAG Lys —(CH2)4ta3

Дипептиды, которые при этом получаются, построены не из структурно близких аминокислотных остатков, как при традиционном методе конструирования функционально близких пептидов, а из генетически близких аминокислотных остатков, которые могут значительно отличаться по структуре. Например, аспарагиновая кислота, в отличие от аспарагина, несет отрицательный заряд. Для исследования мы использовали все варианты транзиций и, для сравнения, два варианта трансверсий. Нами были синтезированы дипептиды рИи-Азр-ИНг, рОЫ-Шз-ЫНг, р01и-Туг-МН2 и все диастереомеры рИи-Бег-ЫНг.

pGlu-Asp-NH2 был получен конденсацией сукцинимидного эфира пироглутаминовой кислоты и натриевой соли амида аспарагиновой кислоты с общим выходом 40%:

нп пгг „„ 1) H-Asp(ONa)-NH,/DMF , ....

dGIu-OH ho:s"'DCC>- pGlu-ОSu —-----2-pG lu-Asp-N H,

[JUIU ип Эиоксэн v 2) 10% hjso, 2

pGlu-His-NHj, pGlu-Tyr-NHj и все диастереомеры pGlu-Ser-NH2 были получены методом активированных эфиров, исходя из пентахлорфенилового эфира пироглутаминовой кислоты и метиловых или этиловых эфиров соответствующих аминокислот с последующим аммонолизом. После очистки колоночной хроматографией выходы составили 64-82%.

X-pGlu-OH POIjHF,'ffCC' X-pGlu-OPcp X-pGlu-Y-M-Oflk^^X-pGlu-Y-M-NH,

AA=Ser, His, Туг X,Y-LwihD Alk = CH3, C2H5 TEA - тргатиламин, NEM - N-этилморфолин

Для улучшения транспорта дипептидов через гематоэнцефалический барьер были синтезированы трет-бутиловые эфиры pGlu-Asp(OBu')-OBu' и pGlu-Ser(OBu')-OBu' из пентахлорфенилового эфира пироглутаминовой кислоты и соответствующих трет-бутиловых эфиров аминокислот.

Структура дипептидов была подтверждена данными 'Н-ЯМР-спектроскопии и элементным анализом, все соединения охарактеризованы физико-химическими константами (табл. 2). Диастереомерная чистота дипептидов по данным 'Н-ЯМР была не ниже 95%.

Для изучения влияния соединений на процессы обучения и памяти была использована модель постконвульсионной ретроградной амнезии условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) с электросудорожным шоком (ЭСШ) в качестве амнезирующего агента на белых беспородных крысах-самцах [R.Ader et al., 1972]. Тест основан на норковом рефлексе животного и позволяет определить ноотропную активность по величине таких показателей, как время пребывания животного в светлой или темной камере.

Из таблицы 2 видно, что дипептиды, полученные путем транзиции, pGlu-Asp-NH2 и pGlu-Ser-NH2, обладают ноотропной активностью в тесте УРПИ, тогда как дипептиды pGlu-His-NH2 и pGlu-Tyr-NH2, полученные путем трансверсии, неактивны. Интересно, что активен pGlu-Asp-NH2, несущий отрицательный заряд, в отличие от исходного pGlu-Asn-NH2. Введение гидрофобной трет-бутилыюй группы в боковой радикал аспарагиновой кислоты и в С-концевое положение вместо амидной группы pGlu-Asp-NH2 приводит к увеличению активности этого дипептида. В то же время в случае незаряженного серин-содержащего дипептида две /иреш-бутильные группы почти не оказывали влияния на активность. Данные по ноотропной активности диастереомеров pGlu-Ser-NH2 показывают, что эффект является стереоселективным и зависит от конфигурации первого аминокислотного остатка и не зависит от конфигурации а-углеродного атома серина, поскольку ноотропной активностью обладали LL, LD изомеры, в то время как DD, DL изомеры были неактивны.

Последовательность Gin-Asp встречается в 10 нейропептидах, в том числе в динорфине В. Последовательность Gln-Ser встречается в 13 нейропептидах, в том числе в бета-эндорфине, кортистатине-29 и пептиде, родственном тахикинину I (Uru-TK I)

[http://crop.inbi.ras.ru]. При процессинге некоторые из них могут образовывать соответствующие пнроглутамилсодержащие дипептиды.

Таким образом, нам удалось расширить группу ноотропных дипептидов на основе пироглутаминовой кислоты.

Таблица 2. Физико-химические свойства и ноотропная активность пироглутамилсодержащих дипептидов_

№ Дипептид Т. пл., °C [а]20п, град тех, V Ноотропная активность", %

Е Ж

1 ¿-pGlu-¿-Asn-NH2 215" -16,1 (с 1,0; вода) 0,28 0,34 +57*

2 ¿-pGlu-i-Asp-NH2 187 -21,4 (с 0,5; вода-метанол, 1:1) 0,30 0,39 + 19*

3 ¿-pGlu-I-Ser-NH2 176-178 -7,9 (с 0,5; метанол) 0,52 0,26 +20*

4 ¿-pGlu-D-Ser-NH2 165-167 +5,0 (с 0,5; метанол) 0,52 0,26 +31*

5 £>-pGlu-L-Ser-NH2 162-165 -5,4 (с 0,5; метанол) 0,52 0,26 -3

6 O-pGlu-D-Ser-NHj 176-177 +7,4 (с 0,5; метанол) 0,52 0,26 0

7 L-pGlu-I-His-NHj 213" +2,6 (е 0,5; этанол) 0,22 0,17 +8

8 ¿-pGlu-L-Tyr-NH2 207-210 +2,0 (с 1,0; метанол) 0,67 0,52 0

9 ¿-pGlu-i-AspíOBuVOBu' масло -11,2 (с 1,0; этанол) 0,50 0,64 +46*

10 ¿-pGlu-¿-Ser(OBu')-OBu' 103 -1,7 (с 1,0; этанол) 0,31 0,50 +22*

Примечания: а) с разложением; б) система Е - диоксан-вода, 10:1, система Ж - бутанол-уксусная кислота-вода, 4:1:1; в) активность рассчитывалась по формуле: А=(ТЭсш+.™ество - T?ciu+n.ci)/(Tn«ci - Txm+Naci)*100%, где Тэсш+Naci - среднее время пребывания в светлой камере животных, получивших 0,9% раствор NaCl и подвергнутых ЭСШ 24 часа назад, Тэсш+юивс™ " среднее время пребывания в светлой камере животных, получивших вещество и ЭСШ, Т№а - среднее время пребывания в светлой камере животных, получивших 0,9% раствор NaCl и ложный ЭСШ. Доза 0,1 мг/кг внутрибрюшинно, * р < 0,05 статистическая достоверность отличия от контроля по Манн-Уитни (Mann-Whitney U-тест).

2. Дизайн и синтез биологически активных циклических тетра-, цента- и гексапептидов, содержащих трипептидный фрагмент ß-изгиба 4-й петли NGF

2.1. Дизайн

Нашей задачей являлось синтезировать циклопептидные аналоги фактора роста нервов (NGF) (рис. 1), содержащие только 3 аминокислотных остатка из последовательности 4-й петли для выяснения его наиболее короткого активного фрагмента. NGF относится к семейству нейротрофинов, взаимодействует с рецепторами TrkA и р75, участвует в дифференцировке нейронов, усиливает рост дендритов и увеличивает выживаемость определенных видов нейронов в центральной и в периферической нервных системах.

В качестве объекта моделирования был выбран ß-изгиб 4-й петли NGF, образованный остатками 93-96: -Asp-Glu-Lys-Gln-, Этот участок наиболее экспонирован наружу, что делает его предположительно более доступным для взаимодействия с рецептором. Молекулярное моделирование с использованием программы HyperChem показало, что конформация ß-изгиба 4-й петли подобна конформации 4-членного модельного циклопептида cyclo(-Asp-Glu-Lys-Gly-) (рис. 2).

* Эксперименты in vivo были проведены в лаб. психофармакологии (зав. лаб. проф. Т.А.Воронина) д. б. н., вед. н. с. С.С.Трофимовым.

2 петля . 43-49

4 петля 91-98

3 петля 59-66

Рис. 1. Структура ЫОБ по данным РСА (файл из Брукхавенской базы данных http://www.rcsb.org/pdbl

Рис. 2. Совмещение тетрапептидного участка 93-95 4-й петли N0? (из данных РСА) и теоретической модели сус1о(-Авр-01и-Ьу8-01у-) (красный цвет)

В его состав были включены аминокислотные остатки, относящиеся к центральному дипептидному фрагменту (3-изгиба, и предшествующий ему остаток аспарагиновой кислоты - для того, чтобы выяснить их роль в активности NGF. В качестве четвертого остатка вместо Gin96 (для исключения влияния его бокового радикала, поскольку значение этого остатка для активности NGF известно [K.Kallander et al., 1997]) мы взяли глицин. Циклопеитиды более устойчивы к прогеолизу, чем линейные пептиды, так как не распознаются экзопептидазами. Отсутствие заряженных концевых групп облегчает их транспорт через клеточные мембраны и приводит к лучшему биоаккумулированию. Эти свойства дают значительные преимущества циклопентидам с точки зрения терапевтического применения но сравнению с соответствующими линейными аналогами.

Для более детального изучения влияния конформации пептида на активность мы синтезировали еще два циклонептида-гомолога, содержащие ту же самую последовательность Asp-Glu-Lys и, соответственно, два и три остатка Gly.

2.2. Синтез

Были синтезированы следующие циклические пептиды - миметики 4-й петли NGF: cyclo(-Gly-Asp-Glu-Lys-) (VIII), суclo(-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-) (IX) и cyclo(-Gly-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-) (X).

Защищенные по боковым группам линейные предшественники H-Gly-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Lys(Boc)-OH (I), H-Gly-Gly-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Lys(Boc)-OH (II), H-Gly-Gly-Gly-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Lys(Boc)-OH (III) были получены твердофазным методом.

ау

ау

Иу

10 Л*р

«1и

Ь>5

@-С1ТЛ

[■'тис

[пкх---

Н-

-ОН

Гтос-

Гпн>е

Н-

Н-

1:шос-Гшос-Н-

1:шос-

, Гпнк -ОВи'

-ОН НОВи'

ОВи'

ОВи'

ОВи'

ОВи'

ОПи' Пне -ОН Н-|-0-С|1® ОВи' Вне

ОВи'

Вое

Вое

ОВи'

-оси-®

-ОС1«® -О-СН® О-СИ®

оси® оси®

ОВи'

ОВи' Вое

ОВи'

ОВи'

ОВи' Вое

Вое _^

-ОН х ТТА (I)

- о-с11<5) — -о-си<£) —

-ОН X ТРА (II)

ОВи'

ОВи'

Вое

ОВи'

ОВи' Вое

-П-С1К® -ОН у ТГЛ (III)

Схема 1. Блок-схема твердофазного пептидного синтеза линейных пептидов (1}-(Ш)

В качестве твердофазного носителя использовали смолу, содержащую 2-хлортритильную якорную группу [К.Ваг1о8 й а1., 1989], модифицированную Вос-лизином. Высококислотолабильные 2-хлортритиловые эфиры могут быть селективно расщеплены 0,5% ТРА/'СН^СЬ, что должно было позволить нам получить защищенные по боковым цепям линейные пептиды, пригодные для последующей циклизации. Ступенчатое наращивание полипептидной цепи проводили, начиная от С-концевого остатка. Пептидный синтез выполняли в стеклянном реакционном сосуде Меррифилда в ручном варианте. Для синтеза была применена стандартная Ртос/Ви'-стратегия с использованием коммерчески доступных Ртос-АА(Ви'/Вос)-ОН (схема 1).

И-концевая Ятос-защитная группа легко отщеплялась 20% раствором пиперидина в Г)МР. Конденсацию проводили в растворе ЭМР с применением ВОР реагента в случае синтеза гексапептида и РуВОР - в случае одновременного синтеза пента- и тетрапептидов. Были применены 3-х кратные избытки карбоксильной компоненты в расчете на одну свободную аминогруппу. Полноту ацилирования на каждом шаге проверяли по нингидриновому тесту Кайзера, дополнительно проводили мониторинг хода синтеза, измеряя спектрофотометрически количество адцукта дибензофульвена с пиперидином в фильтрате после отщепления Ртос-защиты.

Пептиды были отщеплены обработкой пептидилполимера 0,5% ТРА/СРЬСЬ (2 х 30 мин). В этих мягких условиях были получены тетра-, пента- и гексапептиды (1)-(Ш) (схема 2), аминокислотный состав которых соответствовал ожидаемому. Однако ТСХ и аналитическая ВЭЖХ показали, что в каждом случае продукт синтеза содержал примеси. Очистку осуществляли с помощью ВЭЖХ на колонке Диасорб С16 9 мкм (рис. 3).

Ьу5(Вос)-ОСИ-11е5т Твердофазный пептидный синтез С1у„-А5р(ОВи')-01и(ОВи')-Ьу5(Вос)-ОСИ-Ке5т

Отщепление от подложки

01у„-А8р(ОВи')-С1и(ОВи')-Ьу8(Вос) С1у„-Л5р(ОВи')-С1и(ОВи')-Ьу5(Вос) С1у„-Л5р(ОВи')-С!и(ОВи')-Ьу5 С1у„-А5р(ОВи')-С1и(ОВи')-Ьуз Диастереомер 1 Диастереомер 2 Диастереомер 1 Диастереомер 2

(III), (Шг): п=3, (II): п=2, (I): п=1

(1116): п=3, (116): п=2

(Ша): п=3 Циклизация

-01уп-А8р(ОВи')-С1и(ОВи')-Ьу8(Вос)— .-_С1у„-Л5р(ОВи')-С1и(ОВи')-Ьу5(Вос)—

Ьу5(Вос)-С1и(ОВи')-А5р(ОВи')-С1у№ (VII): п=1

(Шв): п=3

(VI): п=3, (V): п=2, (IV): п=1

Деблокирование 1МНС1 в диоксане ГЛуп-Айр-СЛи-Ьу.ч

(X): п=3, (IX): п=2, (VIII): п=1

Схема 2. Общая схема синтеза циклических миметиков 4-й петли N0? (\'Ш)-(Х)

А

(Шб), (П1в)

(Ша), (III)

а)

(И)

J ^А......

б)

в)

Рис. 3. ВЭЖХ-хроматограммы выделения линейных пептидов из смеси после отщепления от подложки обработкой 0,5% ТРА/СН2С12 (2 х 30 мин): (III) - (а), (И) - (б) и (I) - (в)

Н-ЯМР-анализ показал, что в спектрах примесных соединений отсутствует характерный триплетный сигнал протона ЫеН-группы остатка Lys, а интенсивность сигналов в области 1,37-1,38 м.д. соответствует только двум Bu'-группам. Это позволило сделать вывод, что побочные соединения (Шб), (IIIb), (116), составляющие около 30% сырых продуктов синтеза 5- и 6-членных пептидов, образуются при отщеплении Вос-защитных групп от остатка лизина. Причиной этого, вероятно, явилась большая продолжительность обработки 0,5% TFA/CH2CI2 для полного удаления целевого пептида от смолы. В случае 4-членного пептида такой побочный продукт из-за малого содержания выделить не удалось. После очистки с помощью препаративной ВЭЖХ выход 6-, 5- и 4-членных линейных защищенных пептидов составлял 52, 56 и 87% соответственно.

Строение соединений (Ж)—(III), (Ша)-(Шв), (116) было подтверждено методом 'Н-ЯМР-спектроскопии. В данных условиях гексапептид получался в виде двух форм в соотношении 3:2. Эти формы были идентифицированы как диастереомеры (III) и (Ша), так как они имели одинаковые наборы сигналов в спектрах 'Н-ЯМР, соответствующие целевой структуре. Диастереомеры были легко различимы. Отличались не только химические

сдвиги почти всех протонов, но и константы спин-спинового взаимодействия. А также диастереомеры имели близкие времена удерживания при ВЭЖХ (рис. 3). Очевидно, что возникновение второго изомера связано с неожиданно высокой степенью эпимеризации в ходе присоединения одного из аминокислотных остатков, предположительно аспарагиновой кислоты. Это явление может быть связано с использованием ВОР-реагента, поскольку в случае 4- и 5-членных пептидов для активации тех же аминокислот применялся РуВОР-реагент и эпимеризации не наблюдалось.

Для получения диастереомерно чистого гексапептида был проведен синтез с использованием РуВОР в качестве конденсирующего реагента. Кроме того, была сделана попытка повысить выход целевого пептида за счет уменьшения количества соединений с частично снятой Вос-группой. Для решения этой задачи пептид отщепляли от полимерной подложки обработкой пептидилполимера смесью ледяной уксусной кислоты, 2,2,2-трифторэтанола в CH2CI2 (2:2:6) в течение 30 мин. После очистки методом препаративной ВЭЖХ (рис. 4) выход гексапептида (IHr) составил 88%. Совпадение данных ПМР спектров пептидов (Шг) и (III), а также одинаковые физико-химические показатели (R/, т. пл., [cc]o25) указывают на их идентичность. На основании этого можно заключить, что пептид (III) целиком состоит из I-аминокислотных остатков.

Рис. 4. ВЭЖХ-хроматограмма выделения линейного гексапептида (Шг), полученного после обработки смесью ледяной уксусной кислоты, трифторэтанола в СН2С12 (2:2:6) 30 мин

Таким образом, применение РуВОР-реагента исключило возможность эпимеризации и позволило получить диастереомерно чистый гексапептид (Шг), который был использован для последующей циклизации, а применение уксусной кислоты для отщепления пептида от смолы привело к отсутствию образования побочного соединения, представляющего собой гексапептид со снятой Вос-группой с остатка лизина, и к большему выходу целевого продукта (88%).

Все выделенные в условиях ВЭЖХ индивидуальные соединения были охарактеризованы температурой плавления, удельным углом вращения, значениями хроматографической подвижности в различных системах растворителей (табл. 3).

Хорошо известно, что циклизация пептидов существенно облегчается, если линейный предшественник образует в растворе псевдоциклическую конформацию, стабилизированную внутримолекулярными водородными связями. Из температурной зависимости химических сдвигов протонов МН-групп пептидных связей в БМвО-й^ (табл.

Таблица 3. Физико-химические свойства линейных пептидов (I)-(III), (Пб), (Ша-г)

Псщсстпо Выход, % Т. пл., °С [a]mD, град ТСХ Rr*

А Б

1 87 182 -23,0 (с 0,1; вода-этанол, 2:1) 0,90 0,94

II 56 178 -26,9 (с 0,16; вода) 0,82 0,84

1Ш 33 97-98 -30,0 (с 0,2 вода) 0,62 0,84

III 32 184 -30,0 (с 0,1 вода) 0,73 0,83

111а 20 185 -27,0 (с 0,1 вода) 0,73 0,83

1116 16 101-102 -22,3 (с 0,2 вода) 0,59 0,83

11 in 14 100-101 -22,0 (с 0,2 вода) 0,59 0,83

Шг 88 184 -29,8 (с 0,1 вода) 0,73 0,83

* система А - хлороформ-метамол-уксусная кислота-вода, 15:10:2:3; система Б - н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода, 15:10:3:6

Таблица 4. Разность химических сдвигов протонов ЫН-групп аминокислотных остатков линейных пептидов (I), (II), (IIIг) при температурах 18 и 60°С_

Пептиды (8U.-600OBDMSO4

Asp Glu Lys Glyl Gly2 Gly3

Тетрапептид (I) 0,39 0,37 0,00 а) — —

Пентапептид(И) 0,24 0,28 0,00 0,28 а) —

Гексапептид (Шг) 0,19 0,11 0,00 0,16 0,20 а)

Примечание: а) сигналы обмениваются с HDO.

4) видно, что сигналы протонов NH-группы остатка Lys практически не смещаются в сильное поле при повышении температуры, в отличие от сигналов NH-протонов остатков Asp, Glu и Gly. Это свидетельствует в пользу того, что в указанном растворителе в молекулах линейных пептидов (I)-(III) имеется внутримолекулярная водородная связь с участием NH-группы остатка Lys, что предполагает существование пептидных цепей в компактной псевдоциклическон коиформации.

Циклизацию линейных предшественников (I)-(III) для подавления межмолекулярных побочных реакций проводили согласно принципу разбавления Циглера при концентрациях пептида 10"3М в DMF. В качестве конденсирующих реагентов были выбраны ВОР, HBTU и DPPA (схема 2). Исходные соединения добавляли к раствору реагента и диизопропилэтиламина капельно в течение нескольких часов.

Ход реакций контролировался с помощью аналитической ВЭЖХ с использованием колонок Reprosil C|g 3 мкм и Диасорб Ск, 7 мкм. Все циклические пептиды были выделены с помощью препаративной ВЭЖХ на колонке Диасорб Ci6 9 мкм. Продукты каждой реакции циклизации были проанализированы и охарактеризованы данными ТСХ в различных системах растворителей, удельным углом вращения и температурой плавления (табл. 5). Структура и диастереомерная чистота были подтверждены данными 'Н-ЯМР-спектроскопии. Молекулярные массы защищенных циклопептидов были подтверждены методом масс-спектрометрии.

В ходе этой части работы были сделаны следующие наблюдения. С ВОР-реагентом конверсия исходных в циклические продукты (табл. 6) составляла от 70 до 90% для всех пептидов. С таким же выходом проходила циклизация 6-членного пептида с использованием HBTU. Выходы в присутствии более мягкого активирующего реагента DPPA составили 40-60%.

Таблица 6. Выходы защищенных циклопептидов (1V)-(VI), полученных в разных условиях

Пептиды Метод циклизации Выход, % Аналитическая ВЭЖХ (214 нм) Данные ES1-MS Содержание мономера по данным ВЭЖХ и ES1-MS, % ТСХ, R/ *

LD, т (мономер-димер) LE.T (мономер-димер) Соотношение высот пиков (мономер-димер) Найдено, [М+ Н]+ Вычислено, М В Г д

Циклогекса-пептид (VI) ВОР HBTU DPPA; 10 3М 92 74 62 12,00 и 12,20 12,08 и 12,15 12,38 11.25 и 11,27 11.26 и 11,27 11,57 1 : 3 1 : 3 756 и 1511 756 и 1511 756 755 75 75 100 0,55 0,36 0,54

Циклопента-пептид (V) ВОР DPPA; 10*'М 72 48 13,56 и 13,68 14,00 12,00 и 12,10 12,27 1 :3 699 и 1397 699 698 75 100 0,62 0,52 0,57

Циклотетра-пептид (IV) ВОР DPPA; 10"3М DPPA; 10"4М 81 40 10 17,02 17,32 и 17,40 17,48 14,93 15,00 и 15,10 15,35 3 : 1 1283 642 и 1283 642 641 0 25 100 0,90 0,93 0,74

* система В - хлороформ-метанол-вода, 80:10:1; система Г - хлороформ-этанол-уксусная кислота, 85:10:5; система Д - хлористый метилен-метанол, 10:1

Таблица 5. Физико-химические свойства защищенных мономерных циклопептидов

Встсство Т. пл., °С [a]:si> (с 0,1; вода-этанол, 1:1), град

Циклогексапсптнд (VI) 188 -30,0

Цпклопептапептнд (V) 213-214 -32,9

1 (икл отстранении (IV) а) а)

Примечание: а) показатели не определяли ввиду получения малого количества вещества.

Продукт циклизации пептидов при использовании ВОР- и HBTU-реагентов, а в случае 4-членного пептида и DPPA, содержал, кроме мономерного, димерный циклопептид. Димеры только незначительно отличались от мономеров по времени удерживания в условиях аналитической обращеппо-фазовой ВЭЖХ и элюнровались при препаративной ВЭЖХ одновременно с ними. Для идентификации мономеров и димеров использовался метод масс-спектрометрии. Их относительное количество в смеси определяли по данным аналитической ВЭЖХ (табл. 6). Степень димеризации зависела от природы активирующего реагента и размера цикла. Наибольшее количество димера давали ВОР- и HBTU-реагенты. В случае ВОР-реагента димер был единственным продуктом реакции 4-членного пептида, тогда как 5- и 6-членные пептиды образовывали около 25% димера. DPPA, в отличие от этих реагентов, при той же концентрации пептидов приводил к чистым 5- и 6-членным мономерным циклопептидам, а в случае 4-членного пептида была получена смесь с содержанием мономерного циклопептида около 25%. При разбавлении до 10"4М с применением DPPA был получен 4-членный циклопептид без примеси димера. Выход при этом составил 10% (табл. 6). Попытка повысить выход реакции путем увеличения времени реакции до 50 суток при тех же условиях не привела к желаемому результату и выход реакции составил также 10%.

В спектрах 'Н-ЯМР защищенных циклических пептидов протоны всех аминокислотных остатков дают индивидуальные сигналы, параметры которых соответствуют литературным данным, причем отсутствие лишних сигналов в спектрах этих пептидов указывает па отсутствие диастереомерных примесей, а совпадение КССВ сигналов однотипных протонов и удельных углов вращения предполагает идентичность диастереомерного состава образцов циклопептида, синтезированных разными методами.

Деблокирование циклопептидов проводили в условиях одновременного удаления Вос-и Bu'-групп путем обработки 4M HCl в диоксане. Структура полученных незащищенных циклопептидов была подтверждена данными 'Н-ЯМР-спектроскопии. Во всех спектрах отсутствовали сигналы, характерные для треяг-бутильной группы. Молекулярные массы соединений подтверждены масс-спектрометрически. Соединения охарактеризованы физико-химическими константами (табл. 7).

Таблица 7. Физико-химические свойства целевых мономерных циклических пептидов

Вещество Т. пл., °С ТСХ (А), Rf Данные ESI-MS

Найдено, [М+Н]+ Вычислено, \М+

cyclo(-Gly-Asp-Glu-Lys-) (VIII) 196-198 0,06 430 430

cycIo(-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-) (IX) 184-186 0,08 487 487

cyclo(-Gly-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-) (X) 170-172 0,12 544 544

Таким образом, в настоящей работе получены новые низкомолекулярные миметики NGF, имитирующие (5-изгиб его 4-й петли и содержащие всего 3 аминокислотных остатка этой петли, в том числе два центральных остатка р-изгиба и предшествующий им остаток Asp93, роль которых в проявлении нейропротективных свойств NGF до сих пор была мало изучена.

2.3. Биологическая активность циклических миметиков 4-й петли NGF

Циклопептидные миметики 4-й петли NGF были исследованы на нейропротективную активность в концентрациях 10"5-10"8М на культуре иммортализованных клеток гиппокампа мыши линии НТ22*. Тетрапептид снижал жизнеспособность нейронов в концентрации 10~8 М, пентапептид и гексапептид - в концентрации 10'5М (данные МТТ-теста). Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что для проявления нейропротектнвной активности миметиков, по-видимому, необходима димерная форма, как это известно для самого NGF.

Таким образом, показано, что для проявления биологической активности достаточно 3-х аминокислотных остатков р-изгиба 4-й петли NGF в составе тетра-гексациклопептидного миметика.

3. Дизайн и синтез биологически активных М-ашиднпептидных миметиков 4-й и 1-й петель нейротрофина NGF

3.1. Дизайн N-ацилдипептидных миметиков 4-й и 1-й петель NGF

Циклические миметики 4-й петли NGF показали антагонистическую активность и, косвенно, способность связываться с нейротрофиновыми рецепторами. Однако их синтез трудоемок, выходы невелики. С целью создания более технологичных пептидных миметиков NGF были сконструированы замещенные линейные дипептидные миметики петель NGF. Наиболее доступными для взаимодействия с нейротрофиновыми рецепторами являются петлеобразные участки, называемые 4-й (остатки 91-98) и 1-й (остатки 28-36) петлями. При конструировании выбирались остатки петель наиболее открытые для возможного взаимодействия с рецептором, то есть наиболее экспонированные в растворитель (рис. 5).

В случае 4-й петли был взят центральный дипептпдный фрагмент Р-изгиба, -Glu94-Lys95-. Прилегающий аминокислотный остаток для упрощения молекулы и увеличения биологической стабильности заменялся на его бионзостер. Так, остаток Asp93 заменялся на сукцинильный радикал. Заряд на С-конце сконструированного миметика удалялся путем перевода в амид. Так был сконструирован миметик 4-й петли Suc-Glu-Lys-NHî.

В случае 1-й петли Р-изгиб (-Asp30-Ile3l-Lys32-Gly33-) расположен относительно молекулы NGF так, что в растворитель более экспонированы боковые радикалы прилегающих к нему остатков (рис. 5). Взаимодействие же центральных остатков р-изгиба с рецептором, особенно остатка Lys32, судя по данным рентгеноструктурного анализа, должно быть затруднено. Вследствие этого мы имитировали остатки 1-й петли, экспонированные в растворитель и близкие к Р-изгибу. Были сконструированы дипептидные миметики 1-й петли Ac-Lys-Glu-NHî и Aca-Gly-Lys-NHî. В этих случаях остаток Gly33 был заменен на

# Эксперименты in vitro были проведены в лаб. нейропротекции (зав. лаб. к. б. н. Т.А.Антипова)

/Ч

Петля 4 (91-98)

Петля 1 (28-36)

ШШ"' ши

г'у№1Тч 1

г- ж

, л \

к" [ y

- Ч-г V«-

Рис. S. Расположение петель 1 и 4 в молекуле NGF по данным РСА (файл lbtg из Брукхавенской базы данных lntp://w ww.rcsb.org/pdb')

биоизостер - ацетильный остаток, а остаток Lys32 - на остаток с-аминокапроновой кислоты. Заряд на С-конце удалялся также путем перевода в амид.

Поскольку есть данные, что нейротрофины взаимодействуют со своими рецепторами в гомодимерной форме, причем это взаимодействие необходимо для сближения двух рецепторов и их взаимного фосфорилирования, были сконструированы соответствующие димерные дипептидные миметики NGF, в которых мономерные участки были соединены спейсером по С-концу. В качестве спейсера, соединяющего дипептиды, брали гексаметилендиамин, его гомологи или его производные.

Были сконструированы и синтезированы следующие соединения:

Миметики 4-й петли (-Thr -Thr Мономерный ГК1 Suc-Glu-Lys-NHî

-Asp93-Glu94-Lvs95-Gln96-Ala97-Ala';8-) Димерные

ГК 2, ГК 26-A(Suc-Glu-Lys-NH-)2(CH2)n, п = 2-6 ГК 2а (Suc-Glu-Lys-NH-(CH2)5-CO-NH-)2(CH2)3

Миметики 1-й петли (-Ala28-Thr29-Asp30-Ile3'-Lvs32-Glv"-Lvs34-Glu35-Val36-) Мономерные Димерные

ГК 3 Ae-Lys-Glu-NH2 ГК 4 (Ac-Lys-Glu-NH-)2(CH2)6

ГК 5 Aca-Gly-Lys-NH2 ГК 6 (Aca-Gly-Lys-NH-)2(CH2)6

Примечания. Ас - ацетил, Suc - монозамещенный остаток янтарной кислоты, Аса - остаток б-аминокапроновой кислоты. Жирным шрифтом выделен центральный участок р-изгиба. Подчеркиванием выделены аминокислотные остатки, вошедшие в дипептидные фрагменты миметиков NGF.

3.2. Синтез N-ацилдипептидных миметиков 4-й и 1-й петель нейротрофина NGF

Дипептидные миметики NGF были синтезированы классическими методами пептидного синтеза в растворе. Конденсация осуществлялась методом активированных эфиров.

Для синтеза миметиков 4-й петли (рис. 6) использовали N-гидроксисукцинимидные производные. В случае мономера ГК1 проводили аммонолиз Z-Lys(Boc)-OSu и получали амид, а в случае димера ГК2 присоединяли гексаметилендиаминовый спейсср. После удаления Z-группы гидрогенолнзом присоединяли Z-Glu(OBu')-OSu. Полученные Z-защищенные дипептиды снова подвергали гидрогенолизу и ацилировали янтарным ангидридом в DMF при комнатной температуре. Вое, Bu' защитные группы снимали обработкой 4M НС1 в диоксане. Для изучения влияния длины цепи спейсера на эффект были синтезированы гомологи ГК26-Д и соединение с более длинным спейсером ГК2а, для синтеза которых также был использован метод активированных сукцинимидных эфиров.

NH./DMF

Z-lys(Boc)-OSu

Z-Lys(Boc)-NH2

H2N-(CHJ,-NH, z-Lys(Boc)-NH DMF (¿H2)s

Z-Lys(Boc)-NH

1) Hj, 10% Pd/C

2) Z-Glu(OBu')-OSu DMF

Z-Glu(OBu')-Lys(Boc)-NH2

1) Нг. 10% Pd/C

- HOOC-CH2-CH2-CO-Glu(OBuf)-l_ys(Boc)-N H2

HOOC-CH2-CH2-CO-Glu(OBu')-Lys(Boc)-NH

(¿H2),

Z-Glu(OBu')-Lys(Boc)-NH CH OH (ÇH2)6

Z-Glu(OBu')-Lys(Boc)-NH HOOC-CH2-CH2-CO-Glu(OBu')-Lys(Boc)-NH -». HOOC-CH2-CH2-CO-Glu-Lys-NH2

2'6

4 M HCl / диоксан

HOOC-CH,-CH,-CO-Glu-Lys-NH

---(СН2,6ГК2

HOOC-CH2-CH2-CO-Glu-Lys-NH

Рис. 6

Для получения ГКЗ (рис. 7) использовали и-нитрофениловые эфиры защищенных аминокислот. Аммонолиз Boc-Glu(OBzl)-ONp проводили выдерживанием соединения в растворе водного аммиака в среде DMF. После освобождения а-аминогруппы действием TFA присоединяли Boc-Lys(Z)-ONp. Далее был введен остаток уксусной кислоты в виде п-нитрофенилового эфира. Защитные Bzl, Z группы боковых функций удаляли

гидрогенолизом в присутствии палладиевого катализатора. ГК4 получали аналогично ГКЗ, предварительно присоединив гексаметилендиаминовый спейсер (рис. 7).

ЫН,/ОМР

Вос-С1и(ОВг1)-ОМр

Вос-С1и(ОВг1)-МН2

Н,П-(СН,),-ЫН, Вос-61и(ОВг1)-МН омр <СН2)6

Вос-01и(ОВг1)-МН

1) ТРА

2) Вос-1.уз(2 )-0 N р ТЕА / ОМР

Вос-1_уз(г)-С1и(ОВг1)-МН2

Вос-|_уз(2)-01и(С>Вг1)-МН

(СН2)б

В0С-1_уз(2)-01и(0Вг1)-МН

1) ТРА 2) Н,С-СО-ОЫр

ТЕА / ОМР

Н3С-СО-1_уз(г)-С1и(ОВг1)-МН2

Н3С-СО-1.уз(2)-С1и(ОВг1)-МН

(СН2)6

Н3С-СО-иуз(2)-С1и(ОВг1)-МН

нг. 10% Р<1/С

сн,он

Н3С-СО-1.уз-С1и-МН2 ГКЗ Н3С-СО-1_уз-С1и-МН

(СН2)6 Н3С-СО-1.уз-С1и-МН

ГК 4

Рис.7

На первоначальном этапе синтеза ГК5 (рис. 8) 2-Ьу$(Вос)-ОЗи переводили в амид путем взаимодействия с аммиаком в среде ОМР. Деблокирование а-аминогруппы проводили гидрогенолизом в присутствии палладиевого катализатора и затем присоединяли 2-в1у-СЖр. Полученный амид защищенного дипептида вновь подвергали гидрогенолизу и конденсировали с сукцинимидным эфиром Вос-в-аминокапроновой кислоты. Вос-защитные группы удаляли, растворяя полученное соединение в ТРА. В случае ГК6 2-Ьу5(Вос)-08и конденсировали с 1,6-диаминогексаном и далее синтез осуществляли аналогичным путем.

---— г-|-уз(Вос)-МН;

2-1_уз(Вос)-05и

нг/у-(сн2;,-л/нг г-Ьуэ(Вос)-^ н - (СН2)6

г-1_уз(Вос)-МН

1) Нг, 10% РШС 2) Т-в!у-0Чр

СН,ОН ОМР

ОМР

г-С1у-1-у5(Вос)-МН

2 V н,. 10% Рб/с

2-С1у-1_уз(Вос)-МН

(СН2)в г-С1у-|.у5(Вос)-МН

Вос-МН-(СН2)5-СО-01у-1.уз(Вос)-МН2

Вос-МН-(СН2)5-СО-С1у-1_уз-1ЧН

(СН2)6

Вос-МН-(СН2)5-СО-С1у-1_уз-МН

сн,он

2) Вос-ЫН-(СНг),-С005и

Н2М-(СН2)5-СО-С1у-1.уз-МН2 ГК 5

(СН2)6 ГК6 Н2М-(СН2)5-СО-С1у-1.уз-МН

Рис.8

Строение целевых соединений было подтверждено методом 'Н-ЯМР-спектроскопии и элементным анализом, вещества охарактеризованы значениями хроматографической подвижности и физико-химическими константами (табл. 8).

Таблица 8. Физико-химические свойства дипептидных миметиков NGF

Вещество Выход, % Т. пл., °С [а]25п, град ТСХ, R,

А Б

ГК 1 41 216 (с разложением) -37,0 (с 0,1; вода) 0,50 0,22

ГК 2 36 120-128 -47,0 (с 0,1; вода) 0,41 0,20

ГК2а 42 118-121 -30,0 (с 1,0; вода) 0,41 0,20

ГК 26 40 гигроскопичные кристаллы -35,2 (с 0,5; вода-метанол, 1:1) 0,41 0,20

ГК 2в 42 гигроскопичные кристаллы -33,3 (с 1,0; вода) 0,41 0,20

ГК 2г 41 гигроскопичные кристаллы -35,2 (с 0,5; вода-метанол, 1:1) 0,41 0,20

ГК2д 43 гигроскопичные кристаллы -31,6 (с 0,5; вода-метанол, 1:1) 0,41 0,20

ГКЗ 40 198-199 -32,3 (с 1,0; вода) 0,43 0,27

ГК 4 63 205-206 -39,3 (с 1,0; вода) 0,15 0,30

ГК 5 39 50-52 -7,8 (с 0,17; вода) 0,65 0,51

ГК 6 72 масло -129,6 (с 0,17; вода) 0,50 0,08

3.3. Изучение связи структуры и активности мономерных и димериых N-ацилдипептидных миметиков 4-й и 1-й петель NGF

3.3.1. Изучение нейропротективных свойств пептидов in vitro

Нейропротективные свойства синтезированных соединений определяли in vitro в условиях оксндативного стресса, вызванного перекисью водорода, на культуре иммортализованных клеток гиппокампа мыши линии НТ22 [Т.А.Зенина и др., 2007]. Вещества добавляли к культуре клеток за 24 часа до перекиси водорода. Жизнеспособность клеток определяли по тесту с MIT красителем (окрашивание живых клеток бромидом 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия) [P.Maher and J.B.Davis, 1996]. Результаты определения нейропротективной активности N-ацилдипептидных аналогов NGF представлены в таблице 9 (в таблице приведен активный нижний порог исследованных концентраций).

Таблица 9. Нейропротективная активность N-ацилдипептидных миметиков NGF в условиях оксндативного стресса на культуре клеток НТ22

Примечания. Активность рассчитывалась по формуле: А = фэксп - Он2о:) / (Оконтр - Он2о2) х 100%, где Оэксп - оптическая плотность раствора в опыте, Он2о2 - оптическая плотность раствора активного контроля (НзО;),

Оконтр - оптическая плотность раствора контроля (без Н202),

*р £ 0,05 по /-тесту Стьюдента, светопоглощение измеряли при ?.=600 нм, [С] Н202 конечная = '.5 ммоль.

# Эксперименты in vitro были проведены в лаб. нейропротекции (зав. лаб. к. б. н. Т.А.Антипова)

Вещество Концентрация, М Активность*, % *

ГК 1 10" -61*

■5 10 94*

ГК 2 -И 10 196*

10 36*

ГК 2а -J 10 52*

-J 10 103*

ГК 26 10 112*

10 51*

ГК 2г 10 43*

ГК2д -i 10 33*

ГК 5 10 24*

10 54*

ГК 6 10 57*

10 41*

NGF ■ч 10 37*

Мономерный миметик 4-й петли ГК1, внесенный в концентрации снижал

жизнеспособность нейронов. В то же время днмер ГК2, внесенный в тех же условиях в концентрациях до 10"'М, увеличивал жизнеспособность клеток НТ22. Это подтверждает важность димернои структуры для проявления агонистической активности миметиков NGF. Как удлинение (ГК2а), так и уменьшение длины спейсера (ГК2б-д) приводило к снижению активности, Так, удлинение спейсера в соединении ГК2а по сравнению со спейсером соединения ГК2 привело к уменьшению активной концентрации в 10000 раз. В ряду миметиков 1-й петли достоверной нейропротективной активностью обладал как мономерный днпептид ГК5, так и димер ГК6. Их дипептидный фрагмент включает аминокислотные остатки, приближенные к центру р-изгиба, в отличие от соединений ГКЗ и ГК4, которые оказались неактивными. Наиболее активный миметик NGF, ГК2, моделирующий центральный участок р-изгиба 4-й петли, по действующей концентрации (в молях) и выраженности нейропротективного эффекта не уступает самому природному нейротрофнну. Полученные результаты подтверждают важность р-изгнбов полипептидной цепи в белок-белковом взаимодействии.

3.3.2. Влияние миметиков NGF на дифференцировку клеток феохромоцитомы коры надпочечников крысы линии РС-12

Для оценки дифференцирующего эффекта были выбраны клетки феохромоцитомы коры надпочечников крысы линии РС-12. Клетки РС-12 при добавлении фактора роста нервов способны дифференцироваться по нейрональному типу, в связи с чем они применяются как объект исследования для выяснения дифференцирующей способности различных препаратов.

В среду культивирования добавлялись препараты ГК1-ГК5 в конечных концентрациях 10"5-10"8М. В качестве положительного контроля использовался NGF в конечной концентрации 100 нг/мл (10"9М). Результаты были получены путем подсчета количества дифференцированных и недифференцированных клеток.

Было показано, что соединения ГК1-ГК4 не вызывали дифференцировку клеток линии РС-12 ни в одной из исследованных концентраций. Однако ГК1 в концентрации 10"5М

снижал дифференцирующий эффект NGF на 50%. ГК5 обладал дифференцирующим действием в конечных концентрациях 10'5М и Ю^'М.

Таким образом, димерные N-ацилдипептидные миметики 4-й петли обладают выраженной нейропротективной активностью, а миметики 1-й петли при наличии слабых нейропротективных свойств могут обладать также дифференцирующей активностью. Это свидетельствует в пользу того, что разные петли NGF ответственны за разные функции этого белка.

ВЫВОДЫ

1. С помощью оригинального метода конструирования биологически активных пептидов, заключающегося в замене аминокислотных остатков на остатки, соответствующие точечным мутациям, получены новые пироглутамилсодержащие дипептиды, родственные N-концевому дипептидному фрагменту эндогенного регулятора памяти AVP(4-9). При этом дипептиды pGlu-Asp-NHi и pGlu-Ser-NH2, полученные в

результате транзиции, обладают ноотропной активностью, тогда как дипептиды pGlu-His-NH2 и pGlu-Tyr-NHî, полученные в результате трансверсии, неактивны.

2. Впервые получены биологически активные циклические тетра-, пента- и гексапептидные миметики ß-изгиба 4-й петли NGF, содержащие только 3 его аминокислотных остатка: cyclo(-Gly-Asp-Glu-Lys-), cyclo(-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-), cyclo(-Gly-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-). Показано, что наиболее активным является циклотетрапептидный миметик, конформационно подобный ß-изгибу 4-й петли, образованному остатками -Asp93-Glu94-Lys95-Glu96-. Циклотетрапептид снижал жизнеспособность нейронов на культуре иммортализованных клеток гиппокампа мыши линии НТ22 в интервале концентраций 10"5-10"8М.

3. Изучено влияние природы конденсирующего реагента (ВОР, HBTU и DPPA) и степени разбавления на циклизацию. Показано, что использование DPPA позволяет полностью подавить образование циклодимеров в синтезе пяти и шестичленного циклопептида, однако для достижения такого эффекта в случае четырехчленного пептида потребовалось дополнительное десятикратное разбавление реакционной смеси.

4. Получена новая группа биологически активных низкомолекулярных миметиков NGF, мономерных и днмерных N-ацилдипептидов, соответствующих наиболее экспонированным наружу участкам 1-й и 4-й петель нейротрофина NGF. При этом N-ацильный радикал имитирует соседний третий аминокислотный остаток.

5. Миметики 4-й петли NGF обладают большей нейропротективной активностью, чем аналоги 1-й петли. Активность миметиков 4-й петли на культуре нейронов проявлялась в концентрациях 10"5-Ю"9М. Показано, что димерные N-ацилдипептидные аналоги 4-й петли NGF увеличивают жизнеспособность нейронов.

6. Впервые показано, что миметики 4-й петли обладают селективной нейропротективной активностью, а миметики 1-й петли обладают как нейропротективной, так и дифференцирующей активностью.

Автор выражает глубокую благодарность д. х. н., вед. н. с. Г.А.Коршуновой (НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ имени М.В.Ломоносова) и к. х. н„ с. н. с. Н.В.Сумбатян (химфак МГУ гшени М.В.Ломоносова, кафедра химии природных соединений) за научно-техническую и консультативную помощь при выполнении работы. Автор глубоко признателен сотрудникам ГУ НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН к. х. н., с. н. с. В.П.Лезиной за помощь в ана1изе данных, полученных методом 'Н-ЯМР• спектроскопии, д. б. н„ вед. н. с. лаборатории психофармакологии С.С.Трофимову и к. б. н„ заведующей лабораторией нейропротекции Т.А.Антиповой за выполнение исследований в области изучения биологической активности соединений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Морозова A.A., Сумбатян Н.В., Лезина В.П., Акпаров В.Х., Коршунова Г.А., Гудашева Т.А. Синтез циклических аналогов 4-й петли фактора роста нервов. // Биооргаиическая Химия, 2008,34 (5), с. 617-629.

2. Гудашева Т.А., Трофимов С.С., Морозова A.A., Никитин C.B., Островская Р.У., Воронина Т.А., Середенин С.Б. Дизайн ноотропных дипептидов с использованием

эно.'ноцпомио-гспстнчсского подхода. // Химико-фармацевтическнн журнал, 2006, 40 (1),с. 18-22.

3. Giulasheva Т.Л., Morozova Л.Л., Trofimov S.S., Ostrovskaya R.U. The stereoselectivity of cognition-activating effeet exerted by pGlu-Asn-NIh as an N-cnd dipeptide fragment of the major Vasopressine metabolite. II Peptides 2004 / Eds. M. Flegel et al. Geneva 1, Switzerland. 2004.1' 854-855.

4. Карапыш Л.Л. (Моро юна A.A.), Трофимов С.С., Гудашева Т.А., Островская Р.У. Стереоселективность ноотропного эффекта N-концевого дипептидного фрагмента основного метаболита вачоирессина pGlu-Asn-NH2. // Материалы Всероссийской конференции, посвященной 110-летию Героя Социалистического Труда, лауреата Ленинской и Государственной премий СССР, академика АМН СССР С.В.Аничкова "Психофармакология и биологическая наркология", Москва, 2002, № 3-4, с. 401.

5. Чепкова А.Н., Капай H.A., Дорелн Н.В., Карапыш A.A. (Морозова A.A.), Гудашева Т.А., Скребицкий В.Г. Эффект пироглутамиласпарагинамида на пластические характеристики синаптической трансмиссии в гнипокампе. // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2003, 136 (1), с. 59-61.

6. Капай H.A., Чепкова А.П., Гудашева Т.А., Морозова A.A., Скребицкий В.Г. Амид пироглутамиласпарагина нормализует развитие длительной потенциации в срезах гиппокампа крыс. // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2004, 138 (2), с. 154-157.

7. Gudasheva Т.А., Morozova A.A., Trofimov S.S., Ostrovskaya R.U. The stereoselectivity of cognition-activating effect exerled by pGlu-Asn-NH2 as an N-end dipeptide fragment of the major Vasopressine metabolite. // Journal of Peptide Science, 2004, p 483.

8. Morozova A.A., Trofimov S.S., Nikitin S.V. Design of nootropic dipeptides using the evolutional-genetic approach. // European Neuropsychopharmacology, Москва, 2005, 15 (2), p 235.

9. Морозова A.A., Букрееи Я.С., Соколенко Н.И., Лезина В.П., Гудашева Т.А. Синтез циклических аналогов 4-й петли фактора роста нервов. // Материалы 4-й Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам", Москва, 2006, с. 53.

10. Дорофеев A.M., Трофимов С.С., Морозова A.A., Никитин С.В., Гудашева Т.А. Новые ноотропные дипептиды, сконструированные с использованием эволюционно-генетического подхода. // Материалы 4-й Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам", Москва, 2006, с. 27.

11. Морозова A.A., Зснина Т.А., Никитин С.В., Гудашева Т.А. Дизайн и синтез циклических аналогов ß-поворота 4-й петли фактора роста нервов. // Психофармакология и Биологическая Наркология (Материалы 111 съезда фармакологов России), Санкт-Петербург, 2007, т. 7, спецвыпуск ч. 2, с. 1860.

12. Gudasheva Т., Morozova A., Antipova Т., Akparov V. Synthesis of biological active cyclopeptides corresponding to 4lh loop of nerve growth factor. // Journal of Peptide Science, 2008, 14 (8), pp 52-53.

Заказ № 146/02/09 Подписано в печать 25.02.2009 Тираж 110 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Страницы

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Нейротрофины.

1.1.1. Члены семейства нейротрофинов.

1.1.2. Структура нейротрофинов.

1.2. Рецепторы нейротрофинов.

1.2.1. Тирозинкиназные рецепторы.

1.2.1.1. Структура тирозинкиназных рецепторов.

1.2.1.2. Механизм передачи сигнала посредством Тгк рецепторов и биологические ответы.

1.2.2. Рецептор р75.

1.2.2.1. Структура р75 рецептора.

1.2.2.2. Механизм передачи сигнала посредством р75 рецептора и биологические ответы.

1.3. Вовлеченность нейротрофина NGF в патогенез нейродегенеративных заболеваний.

1.3.1. Фармакологические данные NGF при применении его на различных моделях.

1.3.2. Перспективы генной терапии NGF.

1.3.3. Клинические испытания NGF.

1.4. Низкомолекулярные миметики нейротрофина NGF.

1.4.1. Развитие низкомолекулярных миметиков нейротрофина NGF.

1.4.2. Низкомолекулярные миметики 1 и 4 петель NGF.

Глава 2. Обсуждение результатов.

2.1. Синтез дипептидов, соответствующих точечным мутантам АУР(4-5), и изучение взаимосвязи между видом точечной мутации и активностью дипептида.

2.2. Дизайн и синтез биологически активных циклических тетра-, пента- и гексапептидов, содержащих трипептидный фрагмент Р-изгиба 4-й петли NGF.

2.2.1. Дизайн.

2.2.2. Синтез.

2.2.2.1. Синтез линейных предшественников.

2.2.2.2. Синтез циклических пептидов.

2.2.3. Биологическая активность циклических миметиков 4-й петли NGF in vitro.

2.3. Дизайн и синтез биологически активных N-ацилдипептидных мономерных и димерных миметиков 4-й и 1-й петель NGF.

2.3.1. Дизайн.

2.3.2. Синтез.

2.3.2.1. Синтез миметиков 4-й петлиNGF.

2.3.2.2. Синтез миметиков 1-й петли NGF.1.

2.3.3. Биологическая активность синтезированных миметиков NGF.

2.3.3.1. Нейропротективные свойства пептидов in vitro.

2.3.3.2. Влияние пептидов на дифференцировку клеток.

2.3.3.3. Влияние пептидов на фосфорилирование тирозинкиназы А.

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1. Синтез пироглутамилсодержащих дипептидов.

3.1.1. Синтез пентахлорфенилового эфира ¿-пироглутаминовой кислоты и пентахлорфенилового эфира D-пироглутаминовой кислоты.

3.1.2. Синтез амида£-пироглутамил-£-аспарагина.'.

3.1.3. Синтез амида £-пироглутамил-£-аспарагиновой кислоты.

3.1.4. Синтез амида £-пироглутамил-£-серина.

3.1.5. Синтез амида £)-пироглутамил-£-серина.

3.1.6. Синтез амида£-пироглутамил-1)-серина.

3.1.7. Синтез амида £>-пироглутамил-1)-серина.

3.1.8. Синтез амида ¿-пироглутамил-^-гистидина.

3.1.9. Синтез амида ¿-пироглутамил-^-тирозина.

3.1.10. Синтез /яре/я-бутилового эфира 1-пироглутамил-/я/?е/я-бутил-/<аспарагиновой кислоты.

3.1.11. Синтез /яре/я-бутилового эфира /,-пироглутамил-/яре/я-бутил-/,-серина.

3.2. Синтез циклопептидных аналогов фактора роста нервов.

3.2.1. Получение линейных предшественников H-Gly-Gly-Gly-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Lys(Boc)-OH, Н-С1у-С1у-А8р(ОВи')-С1и(ОВи')-Ьу8(Вос)-ОН) HH-Gly-Asp(OBu)-Glu(OBu)-Lys(Boc)-OH.

3.2.2. Циклизация пептидов.

3.2.2.1. cyclo(-Gly-Gly-Gly-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Lys(Boc)-).

3.2.2.2. cyclo(-Gly-Gly-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Lys(Boc)-).

3.2.2.3. cyclo(-Gly-Asp(OBu)-Glu(OBu')-Lys(Boc)-) и димер.

3.2.3. Удаление защитных групп.

3.2.3.1. cyclo(-Gly-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-).

3.2.3.2. cyclo(-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-).-.

3.2.3.3. cyclo(-Gly-Asp-Glu-Lys-).

3.3. Синтез мономерных и димерных N-ацилдипептидных миметиков фактора роста нервов.

3.3.1. Миметики 4-й петли.

3.3.1.1. Синтез амида N-моносукцинил-глутамил-лизина.

3.3.1.2. Синтез гексаметилендиамида бг/с-(К-моносукцинил-глутамил-лизина).

3.3.1.3. Синтез триметилендиамида бис-(ТЧ-моносукцинил-глутамил-лизил-6-аминогексановой кислоты).

3.3.1.4. Синтез гексаметилендиамида (пентаметилен, тетраметилен, пропилен, этилен) бмс-(моносукцинил-глутамил-лизина).

3.3.2. Миметики 1-й петли.

3.3.2.1. Синтез амидаN-ацетил-лизил-глутаминовой кислоты.

3.3.2.2. Синтез гексаметилендиамида бг/с-(1Ч-ацетил-лизил-глутаминовой кислоты).

3.3.2.3. Синтез амида 6-аминокапроил-глицил-лизина.

3.3.2.4. Синтез гексаметилендиамида бмс-(6-аминокапроил-глицил-лизина)

В настоящее время физиологически активные пептиды рассматриваются как "лекарства будущего". Наряду с богатым спектром фармакологических свойств, этот класс соединений обладает такими важными преимуществами перед непептидными соединениями, как высокая активность, малая токсичность, невыраженность синдрома отмены и, как правило, мягкий модуляторный характер действия. На сегодняшний день имеется всего около 50 пептидных лекарственных препаратов. Использование биологически активных эндогенных пептидов в качестве лекарственных препаратов ограничено их низкой стабильностью в биологических средах и малой способностью проникать через гастро-интестинальный и гемато-энцефалический барьеры (ГЭБ). Чтобы избежать этих недостатков, при создании пептидных лекарственных препаратов используют различные приемы. Для увеличения энзиматической стабильности в структуру пептида часто вводят остатки пролина и глицина, Б-аминокислоты или неприродные аминокислотные остатки, модифицируют пептидную связь [Н.Ф.Мясоедов и соавт., 2006, 2007; И.П.Ашмарин и др., 2003, 2005; М.И.Титов и соавт., 1984, 1987; Е.И.Чазов и соавт., 1984; В.И.Дейгин и соавт., 2003]. Наиболее радикальным приемом является создание непептидных пептидомиметиков. Для увеличения способности проникать через ГЭБ повышают липофильность пептида путем введения гидрофобных заместителей. Почти все эти подходы уменьшают описанные выше преимущества пептидных препаратов.

Принципиально другим подходом является использование коротких, преимущественно ди-тетрапептидов. Они, как правило, способны проникать через биологические барьеры как за счет пассивного, так и активного транспорта. Коротким пептидам присуща повышенная энзиматическая стабильность. Всё это позволяет в ряде случаев создавать на их основе перорально активные лекарственные препараты. В связи с важностью коротких физиологически активных пептидов как основы для создания нового поколения лекарственных веществ развитие новых подходов к их поиску представляется актуальным.

Для поиска коротких биологически активных пептидов широко используется определение биологически активных коротких фрагментов более длинных пептидов. В НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН применяется оригинальный подход, состоящий в конструировании коротких пептидов -топологических аналогов непептидных психотропных лекарств [Т.А.Гудашева и др., 1985; T.A.Gudasheva et al., 1996, 1998; Т.А.Гудашева и А.П.Сколдинов, 2003; Р.У.Островская и др., 2000].

В данной работе развиваются такие подходы, как поиск новых дипептидов, генетически родственных известным активным пептидам, создание циклопептидных конформационных аналогов петлеобразных структур белков и N-ацилдипептидных миметиков (3-по воротных участков полипептидов.

В связи с высоким числом инсультов, сопровождающихся большим процентом смертности, для лечения и профилактики нейродегенеративных заболеваний» необходимым является развитие лекарственных препаратов для их лечения, в первую очередь нейропротекторов (для уменьшения очага поражения) и ноотропов (для восстановления нарушенных когнитивных функций). Кроме того, нейропротективные и ноотропные препараты необходимы для лечения других нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона. Арсенал таких лекарственных средств ограничен.

В качестве одного из прямых регуляторов процессов обучения и памяти рассматривается основной метаболит вазопрессина AVP[4-9], В НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН было показано, что наименьшим активным фрагментом AVP[4-9] является его N-концевой дипептид амид пироглутамиласпарагина. Получение новых активных аналогов этого дипептида может дать основу для создания новых ноотропных пептидных препаратов.

Важным эндогенным фактором, участвующим в противодействии нейродегенеративным заболеваниям, является фактор роста нервов (NGF), на основе которого ряд зарубежных фирм и университетов пытается создать современные нейропротективные средства [F.M.Longo, et al., 1999, 2002, 2003; H.U.Saragovi et al., 2000, 2002, 2004; S.J.Pollack and S.J.Harper, 2002].

Поиск коротких пептидов, обладающих ноотропной и нейропротективной активностью, которые в дальнейшем могли бы стать базой для создания принципиально новых пептидных лекарственных препаратов, является актуальным.

Целью работы является дизайн и синтез новых коротких биологически активных пептидов, перспективных для создания лекарственных препаратов с ноотропной и нейропротективной активностью.

В соответствии с поставленной целью задачами исследования являлись:

1. Синтез дипептидов, соответствующих точечным мутантам дипептидного фрагмента АУР(4-5), и изучение взаимосвязи между видом точечной мутации и активностью дипептида;

2. Дизайн и синтез циклических тетра-, пента- и гексапептидов, содержащих трипептидный фрагмент Р-изгиба 4-й петли нейротрофина КОР;

3. Дизайн и синтез мономерных и димерных К-ацилдипептидных миметиков 4-й и 1-й петель КОБ и изучение связи их структуры и активности.

Выводы

1. С помощью оригинального метода конструирования биологически активных пептидов, заключающегося в замене аминокислотных остатков на остатки, соответствующие точечным мутациям, получены новые пироглутамилсодержащие дипептиды, родственные N-концевому дипептидному фрагменту эндогенного регулятора памяти AVP(4-9). При этом дипептиды pGIu-Asp-NH2 и pGlu-Ser-NH2, полученные в результате транзиции, обладают ноотропной активностью, тогда как дипептиды pGlu-His-NH2 и pGlu-Tyr-NH2, полученные в результате трансверсии, неактивны.

2. Впервые получены биологически активные циклические тетра-, пента- и гексапептидные миметики Р-изгиба 4-й петли NGF, содержащие только 3 его аминокислотных остатка: cyclo(-Gly-Asp-Glu-Lys-), cyclo(-GIy-Gly-Asp-Glu-Lys-), cyclo(-Gly-Gly-Gly-Asp-GIu-Lys-). Показано, что наиболее активным является циклотетрапептидный миметик, конформационно подобный Р-изгибу 4-й петли, образованному остатками -Asp93-Glu94-Lys95-Glu96-. Циклотетрапептид снижал жизнеспособность нейронов на культуре иммортализованных клеток гиппокампа мыши

5 8 линии НТ-22 в интервале концентраций 10" -10" М.

3. Изучено влияние природы конденсирующего реагента (ВОР, HBTU и DPPA) и степени разбавления на циклизацию. Показано, что использование DPPA позволяет полностью подавить образование циклодимеров в синтезе пяти и шестичленного циклопептида, однако для достижения такого эффекта в случае четырехчленного пептида потребовалось дополнительное десятикратное разбавление реакционной смеси.

4. Получена новая группа биологически активных низкомолекулярных миметиков NGF, мономерных и димерных N-ацилдипептидов, соответствующих наиболее экспонированным наружу участкам 1-й и 4-й петель нейротрофина NGF. При этом N-ацильный радикал имитирует соседний третий аминокислотный остаток.

5. Миметики 4-й петли NGF обладают большей нейропротективной активностью, чем аналоги 1-й петли. Активность миметиков 4-й петли на культуре нейронов проявлялась в концентрациях 10"5—10"9М. Показано, что димерные N-ацилдипептидные аналоги 4-й петли NGF увеличивают жизнеспособность нейронов.

6. Впервые показано, что миметики 4-й петли обладают селективной нейропротективной активностью, а миметики 1-й петли обладают как нейропротективной, так и дифференцирующей активностью.

Заключение

Таким образом, в данной работе впервые сконструированы и синтезированы биологически активные низкомолекулярные миметики N0?, представляющие собой циклические тетра-, пента- и гексапептиды и линейные мономерные и димерные Ы-ацилдипептиды. Разработан метод циклизации. С помощью оригинального подхода к дизайну биологически активных пептидов, заключающегося в замене аминокислотных остатков на остатки, соответствующие точечным мутациям, расширена группа ноотропных пироглутамилсодержащих дипептидов.

Работа выполнена частично при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 06-04-48683).

Автор выражает глубокую благодарность доктору химических наук, ведущему научному сотруднику Г.А.Коршуновой (НИИ физико-химической биологии имени

A.Н.Белозерского) и кандидату химических наук, старшему научному сотруднику Н.В:Сумбатян (химический факультет, Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова, кафедра химии природных соединений) за научно-техническую и консультативную помощь при выполнении работа.

Автор глубоко, признателен сотрудникам ГУ НИИ фармакологии имени

B.В.Закусова РАМН кандидату химических наук, старшему научному сотруднику В.П.Лезиной за помощь в анализе данных, полученных методом ^-ЯМР-спектроскопии, доктору биологических наук ведущему научному сотруднику лаборатории психофармакологии С.С.Трофимову и кандидату биологических наук, заведующей лабораторией нейропротекции Т.А.Антиповой за выполнение исследований в области изучения биологической активности синтезированных соединений.

1. Levi-Montalcini К, Hamburger V. / Selective growth stimulating effects of mouse sarcoma on the sensory and sympathetic nervous system of the chick embryo. // J. Exp. Zool. 1951. V. 116(2). P. 321-361.

2. Cohen S., Levi-Montalcini R, Hamburger V. IA nerve growth-stimulating factor isolated from sarcom as 37 and 180.-//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1954. V. 40(10). P. 1014-1018.

3. Levi-MontalciniR., AngelettiP.U. / Nerve growth factor. //Physiol. Rev. 1968. V. 48(3), 534569.

4. Gorin P.D., Johnson E.M. / Experimental autoimmune model of nerve growth factor deprivation: effects on developing peripheral sympathetic and sensory neurons. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76(10). P. 5382-5386.

5. Smeyne R.J., Klein R., SchnappA., LongL.K., Biyant S., LewinA., Lira S.A., BarbacidM. / Severe sensory and sympathetic neuropathies in mice carrying a disruptedTrk/NGF receptor-gene. //Nature. 1994. V. 368. P. 246-249.

6. Campenot KB. / Local control of neurite development by nerve growth factor. // Proc. Natl: Acad. Sci. USA. 1977. V<. 74(10). P.' 4516-4519.

7. Hencby LA., Stockel K., Thoenen H., Lversen L.L. / The retrograde axonal transport of nerve growth factor //Brain. Res. 1974. V. 68(1). P. 103-121.

8. Black LB. / Regulation of autonomic development // Annu. Rev. Neurosci. 1978. V. 1. 183214.

9. Gnahn H., Hefti F., Heumann R., Schwab M.E., Thoenen H. /NGF mediated increase of choline acetyltransferase (ChAT) in the neonatal rat forebrain: evidence for a physiological role ofNGF in the brain? // Brain Res. 1983. V. 285(1). P. 45-52.

10. Barde Y.A. / Trophic factors and neuronal survival //Neuron. 1989: V. 6. P. 1525-1534.

11. Alderson R.F., Alterman A.L., Barde Y.A. / Nerve growth factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture. //Neuron. 1990. V. 3. P. 297306.

12. Lewin-G.R., Barde Y.A. / Physiology of the neurotrophins. // Annu.' Rev. Neurosci. 1996. V. 19. P. 289-317.

13. Ventimiglia R., Mather P.E. / The neurotrophins BDNF, NT-3 and NT-4/5 promote survival andmorphological and biochemical differentiation of striatal neurons in vitro. //Neurosci. 1995. V.7. P. 213-222.

14. GötzR., Köster R., Winkler C., RaulfF., Lottspeich F., Schart IM., ThoenenH. / Neurotrophin-6 is a new member of the nerve growth factor family. // Nature. 1994. V. 372(6503). P. 266-269.

15. GötzR., Köster R, Winkler C., RaulfF., Lottspeich F., SchartlM., ThoenenH. / Neurotrophin-6 is a new member of the nerve growth factor family. // Nature. 1994. V. 372(6503). P. 266-269.

16. LiX., Franz J., Lottspeich F., Götz R. / Recombinant fish neurotrophin-6 is a heparin-binding glycoprotein: implications for a role in axonal guidance. //Biochem. J. 1997. V. 324(2). P. 461466.

17. Nilsson A.S., Fainzilber M., FalckP., Ibänez C.F. / Neurotrophin-7f a novel member of the neurotrophin family from the zebrafish. // FEBS Lett. 1998. V. 424(3). P. 285-290.

18. Saragovi H.U., Zaccaro M.C. / Small Molecule Peptidomimetic Ligands of Neurotrophin Receptors, Identifying Binding Sites, Activation Sites and Regulatory Sites. // Current Pharmaceutical Design. 2002. V. 8. P. 99-110.

19. ShivanandP.L., Kenneth E.N., Mufson E.J. / Nerve Growth Factor: Structure, Function and Therapeutic Implication for AlzheimersDisease. //Neurological Disorders. 2003. V. 2. P. 315334.

20. Pattarawarapan M., Burgess K. / Molecular basis of neurotrophin-receptor interactions. // J. Med. Chem. 2003. V. 46(25). P. 5277-5291.

21. HollandD. R., Cousens L.S., Meng W, Matthews B. W. / Nerve Growth Factor in Different Crystal Forms Displays Structural Flexibility and Reveals Zinc Binding Sites. // J. Mol. Biol. 1994. V. 239. P. 385-400.

22. Wiesmann C., deVosA.M. / Nerve growth factor: structure and function. // Cell. Mol. Life Sei. 2001. V. 58. P. 748-759.

23. Eide F.F., Lowenstein D.H., Reichardt L.F. / Neurotrophins and Their Receptors Current Concepts and Implications for Neurologic Disease. //Exp. Neurol. 1993. V. 121. P. 200-214.

24. ManessL.M., KastinA.J., Weber J.T., Banks W.A., BeckmanB.S. / The Neurotrophins and Their Receptors: Structure, Function, and Neuropathology. //Neurosci. Biobehav. Rev. 1994. V. 18. 145-159.

25. FradeJ.M., Barde Y.A. / Genetic evidence for cell death mediated by nerve growth factor and the neurotrophin receptor p75 in the developing mouse retina and spinal cord. // Development. 1999. V. 126. P. 683-690.

26. Ibanez C.F. / Emerging themes in structural biology of neurotrophic factors. // Trends Neurosci. 1998. V. 21. P. 438-444.

27. McDonald N. О., Lapatto R., Murray-Rust J., Gunning J., Wlodawer A. / New Protein Fold Revealed by a 2.3-Ä Resolution Crystal Structure of Nerve Growth Factor. // Nature. 1991. V. 345. P. 411-414.

28. Николлс Д.Г., Мартин A.P., Валлас Б.Дж., Фукс П.А. / От нейрона к мозгу. Пер. с англ. М.: УРСС, 2003. (Nicholls J.G., Martin A.R, Wallace B.G., Fuchs P.A. From Neuron to Brain. Sunderland, Massachusetts, USA. Sinauer Associates, Inc.: 2001.)

29. Taylor S., Srinivasan В., Wordinger R.J., Roque R.S. / Glutamate stimulates neurotrophin expression in cultured Müller cells. // Mol. Brain Res. 2003. V. 111. P. 189-197.

30. Lee F.S., Kim A.H., Khursigara G., Chao M.V. / The Uniqueness of being a neurotrophin receptor. // Curr. Opin. Neurobiol. 2001. V. 11. P. 281-286.32. (5) BarbacidM. / The Trk Family of Neurotrophin Receptors. // J. Neurobiol. 1994. V. 25. P. 1386-1403.

31. Arevalo J.C., Conde В., HempsteadB.I., Chao M. V., Martin-Zanca D. / A novel mutation within the extracellular domain of TrkA causes constitutive receptor activation. // Oncogene. 2001. V. 20. P. 1229-1234.

32. BaxB., Blundell T.L., Murray-Rust J., McDonaldN.O. / Structure of mouse 7S NGF: a complex of nerve growth factor with four binding proteins. // Structure. 1997. V. 5. P. 12751285.

33. Holden, P.H., Asopa V., Robertson A.G.S., Clarke A.R, Tyler S. / Immunoglobulin-like Domains Define the Nerve Growth Factor Binding Site of the TrkA Receptor. // Nat. Biotechnol. 1997. V. 15. P. 668-672.

34. UrferR., Tsoulfas P., O'ConnellL., HongoJ.-A., Zhao W. / High-Resolution Mapping of the Binding Site of TrkA for Nerve Growth Factor and TrkC for Neurotrophin-3 on the Second Immunoglobulin-like Domain of the Trk Receptors. // J.

35. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 5829-5840.

36. Saragovi H. U., Gehring К. / Development of pharmacological agents for targeting neurotrophins and their receptors.// Trends Pharmacol. Sei. 2000. V. 21(3). P. 93-98.

37. Pollack S., Harper S. / Small Molecule Trk receptor agonists and other neuroptrophic factor mimetics. // Curr Drug Targets CNS&Neurogical Disorders. 2002. V. 1. P. 59-79.

38. Windisch J.M., Auer В., Marksteiner R, LangM.E., Schneider R. / Specific neurotrophin binding to leucine-rich motif peptides of TrkA and TrkB. //FEBS Lett. 1995. V. 374. P. 125129.

39. Perez P., Coll P.M., Hempstead B.L., Martin-Zanca D., ChaoM.V. /NGF Binding to the Trk Tyrosine Kinase Receptor Requires the Extracellular Immunoglobulin-like Domains. // Mol. Cell. Neurosci. 1995. V. 6. P. 97-105.

40. Ibanez C.F., Ebendal Т., Persson H. / Chimeric Molecules with Multiple Neurotrophic Activities Reveal Structural Elements Determining the Specificities of NGF and BDNF. // EMBO J. 1991. V. 10. P. 2105-2110.

41. Dai J., Buijs R.M., Kamphorst W., Swaab D.F. / (2002) Impaired axonal transport of cortical neurons in Alzheimer's disease is associated with neuropathological changes. // Brain Res. V. 948. P. 138-144

42. Salehi A., Delcroix J.D., Swaab D.F. / Alzheimer's disease and NGF signaling, // J. Neural. Transm. 2004. V. 111. P. 323-345

43. Фаллер Д.М., Шилдс Д. Молекулярная биология. М.: Бином-пресс, 2006. (Fuller G.M. and Shields D. Molecular Basis of Medical Cell Biology. Stamford, Connecticut: Appleton&Lange, 1998.)

44. Smith C.A., Farrah Т., Goodwin R.G. / The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins. //Cell. 1994. V. 76. P. 959-962.

45. ZaccaroM., Ivanisevic L., Perez P., MeakinS., Saragovi H. // p75 co-receptors regulate ligand-dependent and ligand-independent Trk receptor activation, in part by altering Trk docking subdomains. //J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 31023-31029.

46. Bamji S.X., MajdanM., Belliveau C.D., AloyzD.J., Kohn R. / The p75 neurotrophin receptor mediates neuronal apoptosis and is essential for naturally occurring sympathetic neuron death. // J. Cell Biol. 1998. V. 140. P. 911-923. '

47. TwissJ.L., Wada H. G., Fok K.S., Chan S.D.H., Verity A.N. / Duration and Magnitude of Nerve Growth Factor// J. Neurosci. Res. 1998. V. 51. P. 442-453.

48. HeftiF. / Nerve growth factor promotes survival of septal cholinergic neurons after fimbrial transections. //Journal ofNeuroscience. 1986. V. 6. P. 2155-2162.

49. Apfel S.C., ArezzoJ.C., BrownleeM., FederoffH., KesslerJ.A. / Nerve growth factor administration protects against experimental diabetic sensory neuropathy. // Brain Res. 1994. V. 634(1). P. 7-12.

50. Apfel S.C., LiptonRB., Arezzo J.C., KesslerJ.A. / Nerve growth factor prevents toxic neuropathy in mice. // Ann. Neurol. 1991. V. 29(1). P. 87-90.

51. Pechan P.A., Yoshida T., Panahian N., MoskowitzM.A., BreakefieldX.O. / Genetically modified fibroblasts producing NGF protect hippocampal neurons after ischemia in the rat. // Neuroreport. 1995. V. 6(4). P. 669-72.

52. Fischer W., BjorklundA. / Loss of AChE- and NGFr-labeling precedes neuronal death of axotomized septal-diagonal band neurons: reversal.by intraventricular NGF infusion. // Exp. Neurol. 1991. V. 113. P. 93-108.

53. Hirata Y., Meguro T., Kiuchi K. / Differential effect of nerve growth factor on dopaminergic neurotoxin-induced apoptosis. // J. Neurochem. 2006. V. 99(2). P. 416-425.

54. Maksimovic I.D., Jovanovic M.D., Malicevic Z, Colic M., NinkovicM. / Effects of nerve and fibroblast growth factors on the production of nitric oxide in experimental model of Huntington's disease. //Vojnosanit Pregl. 2002. V. 59(2). P. 119-23.

55. KiistB.M., CoprayJ.C., BroiiwerN., TroostD., Boddeke H. W."/Elevated levels of neurotrophins in human biceps brachii tissue of amyotrophic lateral sclerosis. // Exp. Neurol.2002. V. 177(2). P. 419-427.

56. Crutcher K.A. / Sympathetic sprouting in the central nervous system: A'model for studies of axonal grouth in the mature mammalian brain. // Brain Res. Rev. 1987. V. 12, P. 203-233.

57. Williams L. R / Hypophagia is induced by introcerebroventricular administration of nerve grouth factor. // Exp. Neurol. 1991. V. 113. P. 31-37.

58. RosenbergM.B., Friedmann T., Robertson RC., TuzsynskiM., Wolff J.A., BreakefieldX.O., and Gage F.H. / Grafting genetically nodified cells to the damaged brain: restorative effects of NGF expression. // Science. 1998. V. 242. P. 1575-1578.

59. Smith D.E., Roberts J., GageF.H., Tuszynski M.H. / Age-associated neuronal atrophy occurs in the primate brain and is reversible by growth factor gene therapy. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96(19). P. 10893-10898.

60. Tuszynski M.H. andBleschA. /Nerve growth factor: from animal models of cholinergic neuronal degeneration to gene therapy in AIzheimes;s disease. // Progress in Brain Research. 2003. Vol. 146. P. 28."

61. Menei P., PeanJ.M., Nerriere-Daguin V., JollivetC., Brachet P., BenoitJ.P. / Intracerebral implantation of NGF-releasing biodegradable microspheres protects striatum against excitotoxic damage. // Exp. Neurol. 2000. V. 161(1). P. 259-272.

62. Galpern W.R., Matthews R.T., BealM.F., Isacson O. /NGF attenuates 3-nitrotyrosine formation in a 3-NP model of Huntington's disease. //Neuroreport. 1996. V. 7(15-17). P. 26392642.

63. ApfelS.C., Kessler J.A., AdornatoB.T., Litchy W.J., Sanders C., Rask C.A. / Recombinant human nerve growth factor in the treatment of diabetic polyneuropathy. NGF Study Group. //Neurology. 1998. V. 51(3). P. 695-702.

64. JdnhagenM.E. / Nerve growth factor treatment in dementia. // Alzheimer Dis. Assoc. Disord. 2000. V. 14(1). P. 31-38.

65. Tnszynski M.H. / Nerve growth factor gene therapy in Alzheimer disease. // Alzheimer Dis. Assoc. Disord. 2007. V. 21(2). P. 179-89.

66. Estenne-Bouhtou G., Kullander K., Karlsson M, Ebendal T., Hacksell U. / Design, Synthesis, Tandem Mass Spectrometric Sequencing and Biological Activity of NGF Mimetics. Int. // J. Pept. Protein Res. 1996. V. 48. P. 337-346.

67. Saragovi H. U., Greene M.I. / Constrained Peptides and Mimetics as Probes of Protein Secondary Structure. // Immunomethods. 1992. V. 1. P. 5-9.

68. Saragovi H. U., Greene M.I., Chrusciel R.A., KahnM. / Loops and Secondary Structure Mimetics: Development and Applications in Basic Science and Rational Drug Design: // Biotechnology. 1992. V. 10. P. 773-778.

69. MaliartchoukS., Feng Y., Ivanisevic L., Debeir T., Cuello A.C., BurgessK., SaragoviH.U. / A designed peptidomimetic agonistic ligand of TrkA nerve growth factor receptors. // Mol. Pharmacol. 2000. V. 57(2). P. 385-391.

70. HollandD.R., Cousens L.S., Meng W., Matthews B.W. /Nerve Growth Factor in Different Crystal Forms Displays Structural Flexibility and Reveals Zinc Binding Sites. //J. Mol. Biol. 1994. V. 239. P. 385-400.

71. Wiesmann C., UltschM.H., Bass S.H., de VosA.M. / Crystal Structure of Nerve Growth Factor in Complex with the Ligand-Binding Domain of the TrkA Receptor. // Nature. 1999. V. 401. P. 184-188.

72. Holden P.H., Asopa V., Robertson A.G.S., Clarke A. R, Tyler S. / Immunoglobulin-like Domains Define the Nerve Growth Factor Binding Site of the TrkA Receptor. // Nat. Biotechnol. 1997. V. 15. P. 668-672.

73. Shih A., Laramee G.R, Schmelzer C.H., Burton L.E., Winslow J. W. / Mutagenesis Identifies Amino-terminal Residues of Nerve Growth Factor Necessary for Trk Receptor Binding and Biological Activity. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 27679-27686.

74. RydenM., Ibanez C.F. / A Second Determinant of Binding to the p75 Neurotrophin Receptor Revealed by Alanine-Scanning Mutagenesis of a Conserved Loop in Nerve Growth-Factor. // J. Biol: Chem. 1997. V. 2821 P. 33085-33091.

75. Ibanez C. F. Ebendal T., Persson H. / Chimeric Molecules with Multiple Neurotrophic Activities Reveal Structural Elements Determining the Specificities of NGF and BDNF. // EMBO J. 1991. V. 10. P. 2105-2110.

76. Ryde 'nM., Ibanez C.F. / A Second Determinant of Binding to the p75 Neurotrophin Receptor Revealed by Alanine-Scanning Mutagenesis of a Conserved Loop in Nerve Growth Factor. 111. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 33085-33091.

77. Ibanez C.F., Ebendal T., Persson H. / Chimeric Molecules with Multiple Neurotrophic Activities Reveal Structural Elements Determining the Specificities of NGF and BDNF. // Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991. V. 10. P. 2105-2110.

78. Drinkwater C.C., Barker P. A., Suter U., Shooter E.M. / The Carboxyl Terminus of Nerve Growth Factor Is Required for Biological Activity. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P.* 2320223207.

79. Kruttgen A., Heymach J.V., Jr., Kahle P. J., Shooter E.M. /The Role of the Nerve Growth Factor Carboxyl Terminus in Receptor Binding and Conformational Stability. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 29222-29228.

80. Kahle P. J., Burton L.E., Schmelzer, C.H., Hertel C. / The Amino Terminus of Nerve Growth Factor Is Involved in the Interaction with the Receptor Tyrosine Kinase pl40trkA. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 22707-22710.

81. IlagLL., Lonnerberg P., Persson H., Ibanez C.F. / Role of Variable a-Hairpin Loop in Determining Biological Specificities in Neurotrophin Family. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 19941-19946:

82. Ibanez C.F., EbendatT., Persson H. / Structural studies of nerve growth factor: Functional importance of highly conserved amino acid residues. //EMBO J. 1990. V. 9. P. 1477-1483.

83. Lambiase A., Rama P., Bonini S., Caprioglio G., Aloe L. / Topical treatment with nerve growth factor for corneal neurotrophic ulcers. //N. Engl. J. Med. 1998. V. 338(17). P. 1174-80.

84. Wrighton N.C., FarrellF.X., ChangR., Kashyap A.K., Barbone F.P., Mulcahy L.S., Johnson D.L., Barrett R. W, Jolliffe L.K., Dower W.J. / Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin. // Science. 1996. V. 273(5274). 458-464.

85. Chaiken I.M., Williams W.V. / Identifying structure-function relationships in four-helix bundle cytokines: towards de novo mimetics design. //Trends Biotechnol. 1996. V. 14(10). P. 369-75.

86. LeSauteur L., CheungN.K., LisbonaR., SaragoviH.U. / Small molecule nerve growth factor analogs image receptors in vivo. // Nat Biotechnol. 1996. V. 14(9). P. 1120-1122.

87. Veber D.F., Johnson S.R, ChengH.-Y., Smith B.R, WardK. W. / Molecular Properties That Influence the Oral Bioavailability of Drug Candidates. // J. Med. Chem. 2002. V. 45. P. 26152623.

88. Jing S., Tapley P., BarbacidM. / Nerve Growth Factor Mediates Signal Transduction through TrkHomodimer Receptors. //Neuron. 1992. V. 9. P. 1067-1079.

89. LeSauteur L., Wei L., GibbsB.F., Saragovi H.U. / Small Peptide Mimics of Nerve Growth Factor Bind TrkA Receptors and Affect Biological Responses. // J: Biol. Chem. 1995. V. 270(12). P. 6564-6569.

90. Debeir T., Saragovi H. U., CuelloA.C. / A nerve growth factor mimetic TrkA antagonist causes withdrawal of cortical cholinergic boutons in the adult rat. // Proc. Natl: Acad. Sci. USA.1999. V. 96(7). 4067-4072.

91. Longo F.M., Vu T.K., Mobley W.C. / The in vitro biological effect of nerve growth factor is inhibited by synthetic peptides. // Cell Regul. 1990. V. 1(2). P. 189-195.

92. Longo F.M., Manthorpe M., Xie Y.M., Varon S. / Synthetic NGF peptide derivatives prevent neuronal death via a p75 receptor-dependent mechanism. // J. Neurosci. Res. 1997. V. 48(1). P." 1-17.

93. Xie Y., TisiM.A, Yeo T.T., LongoF.M. / Nerve growth factor (NGF) loop 4 dimeric mimetics activate ERK and AKT and promote NGF-like neurotrophic effects. // J. Biol. Chem.2000. V. 275(38). P. 29868-29874.

94. BeglovaN., Maliartchouk S., EkielL, Zaccaro M.C., Saragovi H.U., GehringK. /Design and solution structure of functional peptide mimetics of nerve growth factor. // J. Med. Chem. 2000. V. 43(19). P. 3530-3540.

95. BeglovaN., LeSauteur L., EkielL, Saragovi H.U., GehringK. / Solution structure and internal motion of a bioactive peptide derived from nerve growth factor. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273(37). P: 23652-23658.

96. Pattarawarapan M., Reyes S., XiaZ., Zaccaro M.C., Saragovi H.U., Burgess K. / Selective formation of homo- and heterobivalent peptidomimetics. //J. Med. Chem. 2003. V. 46(17). P. 3565-3567.

97. Lee H.B., Pattarawarарап М., Roy S., Burgess К. / Syntheses of second generation, 14-membered ring beta-turn mimics. // Chem Commun (Camb). 2003. V. 14. P. 1674-1675.

98. Гудашева T.A., Островская P. У., Трофимов С. С., Косой М.Ю., Иенкина Ф.Е., Буров Ю.В., Сколдинов А.П. / Пептидные аналоги пирацетама как лиганды предполагаемых ноотропных рецепторов. //Химико-фармацевтический Журнал. 1985. Т. 19(11). Стр. 13221329.

99. Гудашева Т.А., ОстровскаяР. У., Максимова Ф.В., Трофимов С.С., КосойМ.Ю., Молодавкин Г.М., Сколдинов А.П. / О возможной структурно-функциональной связи пирацетама и вазопрессина//Химико-фармацевтический Журнал. 1988. Т. 22(3). Стр. 271275.

100. Гудашева Т.А., Сколдинов А.П. / Стратегия создания дипептидных нейропсихотропных лекарственных препаратов. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2003. Т. 66(2). Стр. 15-20.

101. Dietrich A., Allen J.D. / Vasopressin and memory. I. The vasopressin analogue AVP4-9 enhances working memory as well as reference memory in the radial arm maze. // Behav. Brain Res. 1997. V. 87(2). P. 195-200.

102. Nakayama Y„ Takano Y, Shimohigashi Y. //Brain Res. 2000. V. 858(2). P. 416-423.

103. Чепкова A.H., Капай H.А., Скребицкий В.Г. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2001. Т. 131(2). Р. 167-169.

104. Burbach J.P.H., Kovacs G.L., D.DeWiedll Science. 1983 V. 221. P. 1310-1314.

105. Fujiwara M., Ohgami Y.,.ItiadaK, IwasakiK. / Peptidergic modulation of learning and memory processes. Pharmacological Reviews. //Behav. Brain Res. 1997. V. 83(1-2). P. 91-96.

106. Kovacs G.L. andD. de Wied. / Peptidergic modulation of learning and memory processes. // Pharmacological Reviews. 1994. V. 46(3). P. 269-291.

107. D. de Wied. / Behavioural actions of neurohypophysial peptides. // Proc. R. Soc. Lond. 1980. V. 210. P. 183-195.

108. Sausville E., Carney D., Battey J. / The human vasopressin gene is linked to the oxytocin gene and is selectively expressed in a cultured lung cancer cell line. // J. Biol.

109. Chem. 1985. V. 260(18). P. 10236-10241.13 6. Ader R, Weijnen J.A.W.M., MolemanP. //Psychol. Sei. 1972. V. 26. P. 125-128.

110. Замятины A.A. Специализированный банк данных EROP-Moscow, http://erop.inbi.ras.ru.

111. Pattarawarapan M., Burgess K. / Molecular basis of neurotrophin-receptor interactions. // J. Med. Chem. 2003. V. 46(25). P. 5277-5291.

112. Lad Sh.P., NeetK., Mufson EJ. II Curr. Drug Targets -CNS & Neurological Dis. 2003. V. 2. P. 315-334.

113. SaragoviH. U., Gehring K. / Development of pharmacological agents for targeting neurotrophins and their receptors. // Trends Pharm. Sei. 2000. V. 21(3). P. 93-98.

114. Apfel S.C. / Is the therapeutic application of neurotrophic factors dead? // Ann. Neurol. 2002. V. 51(1). P. 8-11.

115. McDonald N.O., Lapatto R, Marray-Rust J., Gunning J., Wlodawer A., Blundell T.L. / New protein fold revealed by a 2.3-A resolution crystal structure of nerve growth factor. // Nature. 1991. V. 354(6352). P. 411-414.

116. Holland D.R., Cousens L.S., Meng W., Matthews B.W. / Nerve growth factor in different crystal forms displays structural flexibility and reveals zinc binding sites. // J. Mol. Biol. 1994. V. 239(3). P. 385-400.

117. Kallander К., Kaplan D., Ebendal Т. II J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P: 9300-9307.

118. Longo F.M., ManthorpeM. II US patent 5,958,875. 1999.

119. ПолакЭ. Численные методы оптимизации. Единый подход: Пер. с англ. М.: Мир, 1974. (Е. Polak. Computational Methods in Optimization. A Unified Approach. New York, London: Academic Press, 1971.)

120. Barlos К., GatosD., KallitsisJ., Papaphotiu G., Sotiriu P., Wenging Y, Schafer W. / Darstellung Geschützter Peptid-fragmente unter Einsatz substituierter Triphenylmethyl-Harze.// Tetrahedron Lett. 1989. V. 30. P. 3943-3946/

121. Barlos К, Gatos D., Kapolos S., Poulos C, Schäfer W, Yao W.O.I

122. Application of 2-chlorotrityl resin in solid phase synthesis of(Leul5)-gastrin I and unsulfated cholecystokinin octapeptide. Selective O-deprotection of tyrosine. // Int. J. Pept. Protein Res. 1991. V. 38(6). P. 555-61.

123. Lee Т.К., Ryoo S.J., Lee YS. / A new method for the preparation of 2-chlorotrityl resin and' its application to solid-phase peptide synthesis. //Tetrahedron Letters. 2007. V. 48(3). P. 389391.

124. The Bachem Practice of SPPS / Eds Mergler M., Durieux J.P. Switzerland, Bubendorf: Bachem AG, 2000.

125. Han S.Y., Kim Y.A. / Recent development of peptide coupling reagents in organic synthesis. // Tetrahedron Letters. 2004. V. 60. P. 2447-2467.

126. Coste J., Le-Ngnyen D., Castro B. / PyBOP new peptide coupling reagent devoid of toxic-product. // Tetrahedron Letters. 1990. V. 31(2). P. 205-208.

127. Knorr R., TrzeciakA., Bannwarth W, Gillessen D. / New coupling reagents in peptide chemistry. //Tetrahedron Letters. 1989. V. 30(15). P. 1927-1930.

128. Castro В., DormoyJ. R, Evin G., Selve C. /Reactifs de couplage peptidique l (1) -l'hexafluorophosphate de benzotriazolyl N-oxytrisdimethylamino phosphonium (B.O.P.) // Tetrahedron Letters. 1975. V. 16(4). P. 1219-1222.

129. Kaiser E., Colescott RL., Bossinger C.D., Cook P.I. / Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis, of peptides. // Anal. Biochem. 1970. V. 34(2). P. 595-598.

130. Meienhofer J., WakiM., HeimerE.P., Lambross T.J., MakofskeRS., ChangC.D. //Int. J. Peptide Protein Res. 1979. V. 13. P. 33^2.

131. Бови Ф.А. ЯМР высокого разрешения макромолекул: Пер. с англ. М.: Химия, 1977. С. 265-269. (Frank A. Bovey. High Resolution NMR of Macromolecules. Academic Press New York and London, 1972.)

132. БыстроеВ.Ф. //Биоорган, химия. 1984. Т. 10. С. 997-1043.

133. Barlos К., Chatzi О., GatosD., Stavropoulos G. / 2-Chlorotrityl chloride resin. Studies on anchoring of Fmoc-amino acids and peptide cleavage. // Int. J. Pept. Protein Res. 1991. V. 37(6). P. 513-520.

134. Гауптман 3., Грефе Ю., Ремане X. Органическая химия: Пер. с нем. М.: Химия, 1979. С. 211-213. (Hauptmann S., Graefe J., Remane H. Lehrbuch der organischen Chemie. Leipzig: VEB Deutscher Verlag für Grundstoffindustrie, 1976.)

135. Якубке Х.Д., ЕшкайтХ. Аминокислоты, пептиды, белки. Пер. с нем. Москва: Мир. 1985. С. 201.

136. Ziegler К., Eberle H, Ohlinger H. I Uber vielgliedrige Ringsysteme. I. Die praparativ ergiebige Synthese der Polymethylenketone mit mehr als 6 Ringgliedern. // Ann. 1933. V. 504. P. 94-103.

137. Dourtoglou F., Gross B. / O-Benzotriazolyl-A^A^A^'.A^'-tetramehyluronium Hexafluorophosphate as Coupling Reagent for the Synthesis of Peptides of Biological Interest. // Synthesis Communications. P. 572-574. HB TU

138. Shioiri Т., Yamada S-i. / Amino Acids and Peptides. IX. Phosphorus in Organic Synthesis.1.. Dipenyl Phosphorazidate. A New Convenient Reagent for the Peptide Synthesis. // Chem. Pharm. Bull. 1974. V. 22(4). P. 849-854.

139. Shioiri Т., Yamada S-i. / Amino Acids and Peptides. IX. Phosphorus in Organic Synthesis.

140. V. On the Mechanism for the Peptide Synthesis by Diphenyl Phosphorazidate. // Chem. Pharm. Bull. 1974. V. 22(4). P. 855-858.

141. Shioiri Т., Yamada S-i. / Amino Acids andPeptides. IX. Phosphorus in Organic Synthesis.

142. VI. Application of Diphenyl Phosphorazidate to the Synthesis of Peptides containing Various Functions. // Chem. Pharm. Bui

143. Theodora W. Greene and Peter G.M. Wilts. / Protective groups in organic synthesis. 2nd ed. John Wiley&Sons. Inc. 1991. P. 246.

144. BryanD.B., HallR.F., HoldenKG., Huffman W.F., andGleason J.G. 111. Am. Chem. Soc. 1977. V. 99. P. 2353.

145. Зенина T.A., Гудашева T.A., БукреевЯ.С., Середенин С.Б. /Нейропротективный эффект дипептида AVP(4-5)-NH2 связан с фактором роста нервов и белком теплового шока HSP70. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007. Т. 144(10). С. 424-426.

146. GongY., WuJ., QiangH., Liu В., ChiZ, Chen Т., Yin В., PengX., Yuan J. /BRI3 associates with SCG10 and attenuates NGF-induced neurite outgrowth in PC 12 cells. // В MB Rep. 2008. V. 41(4). P. 287-93.

147. Maher P. and Davis J.B. / The role of monoamine metabolism in oxidative glutamate toxicity. // J. Neurosci. 1996. V. 16(20). P. 6394-6401.

148. JacovinaA.T., ZhongF., KhazanovaE., LevE., DeoraA.B., HajjarK.A. /Neuritogenesis and the nerve growth factor-induced differentiation of PC-12 cells requires annexin П-mediated' plasmin generation. //J. Biol. Chem. 2001. V. 276(52). P. 49350-8.

149. LiuH., NowakR., Chao W., Bloch K.D. / Nerve growth factor induces anti-apoptotic heme oxygenase-1 in rat pheochromocytoma PC12 cells.// J: Neurochem. 2003. V. 86(6). P. 1553-63.

150. Титце JI., Айхер Т. Препаративная органическая химия. М.: Мир, 1999.162 -ff

151. Органикум. Практикум по органотесКойМшмии П: Пер. с нем. М.: Мир, 1979. (Organikum. Organisch-chemisches Grundpraktikum. Berlin: VEB Deutcher Verlag der Wissenschaften, 1976.)

152. Патент 1503680, 1978, Англия.

153. Смирнова А.П., Фунтова C.M., Князева B.B., Швачкин Ю.П. / Синтез структурного аналога тиротропин-рилизинг-гормона. //Химико-фармацевтический Журнал. 2001. Т. 35(8). Стр. 32-33.

154. Смирнова А.П., Краснощекова С.П., Никитина A.M., Швачкин Ю.П. / Синтез трипептидамида, родственного тиролиберину. // Химико-фармацевтический Журнал. 2001. Т. 35(7). Стр. 46-47.

155. Davis N.C. / Action of Proteolytic enzymes on some peptides and derivates containing Histidine. // J. Biol. Chem. 1956. V. 223. P. 935.

156. Гершкович A.A., Кибирев B.K. Химический синтез пептидов. Киев: Наук, думка, 1992. Стр. 199.

157. RivierJ., Vale W., Burgus R. etal. // J. Med. Chem. 1973. V. 16(5). P. 545-549.

158. KurathP., Thomas A.M. / N-Carbobenzoxy-L-pyroglutamyl-L-histidyl Peptides. //Helv. Chim. Acta. 1973. V. 56(162). P. 1656-1661.

159. Hirschmann R, Yao W., CascieriM.A., Strader C.D., Maechler L., Cichy-KnightM.A., HynesJ., Jr., Rachel D. vanRijn, Sprengeler P.A., Smith A.B. / Synthesis of Potent Cyclic Hexapeptide NK-1 Antagonists. // J. Med. Chem. 1996. V. 39. P. 2441-2448.

160. Schmidt R., Neubert К. / Cyclization studies with tetra- and pentapeptide sequences corresponding to ß-casomorphins. // Int. J. Peptide Protein Res. 1991. V. 37. P. 502-507.

161. Linstead RP., Weedon B.C.L., and B.Wladislaw. / Anodic Syntheses. Part Х1П. Chain Extension of Fatty Acids by Electrolysis with Benzyl Half Esters. // J. Chem. Soc. 1955. P. 1097-1100.

162. Hanby W.E., Waley S.G., Watson J. / Synthetic Polypeptides. Part П. Polyglutamic Acid. // J. Chem. Soc. 1950. P. 3239-3249.