Синтез и оптимизация структур пролинсодержащих пептидных аналогов пирацетама тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Российская Академия паук Ордена Трудового Красного Знамени Институт Органической Химии им. НДЗелиисхого

На правах рукописи УДК 615.214.3.105.4.07

Р Г Б ОД

ВАСИЛЕВИЧ НАТАЛЬЯ ИВАНОВНА

Синтез п оптимизация структур пролинсодеряащнх пептидных аналогов пн ранетам я

(02.00.10 - Бноорпшическая химия, химия природных и физиологически активных веществ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1996

Работа выполнена и Отделе химии фармакологически активных веществ, в Лаборатории гстероатомных структур Научно-исследовательского института фармакологаи РАМН, (директор - чл.корр.РАМН, профессор С.Б.Середенин).

доктор химических наук, профессор Г.Г.Розанцев, ведущий научи, сотр., кандидат химических наук ТАГудашева

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ю.И.Бауюов

доктор химических наук С.Г.Злотин

Ведущая организация: Федеральный научный центр "ГНИИ Генетика"

Защита состоится "26"о првЛЯ 1996 г. на заседании Диссертационного Ученого Совета К 002.62.02 по присуждению ученой степени кандидата химических наук в Институте Органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН по адресу: 117913, Москва, Ленинский проспект, 47, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН. Автореферат разослан мор то_1996 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета К.002.62.02

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

' Актуальность проблемы. В последнее время все большее внимание привлекают ноотроппые соединения, специфически активирующие высшие иптегративпые функции мозга, облегчающие процессы обучения и памяти. Иптерес связан с большим практическим значением ноотропов, которые применяются для лечения таких заболеваний как инсульт, болезнь Альцгей-мера, старческий маразм, черепно-мозговая травма, послеродовая травма и тд. Ноотропы имеют и существенное теоретическое значение для изучения механизмов памяти, поскольку специфически влияют на процессы обучения и памяти. Важнейшим представителем класса ноотропов является пирацетам (М-карбаш1дометилпнрролидон-2), открытый в 1972г. С. Ошгвеа, исследователем бельгийской фирмы иСВ.

Традицноппо поиск новых поотропов пирролидинового ряда осуществляется по пути химической модификации базовой структуры пирацета-ма. Такой подход привел к целому ряду И-замещенных пирролидонов (ра-цетамы). Исследовало около 1000 подобных соединений, среди них аналоги с заместителями в ппрролпдпновом цикле, боковой цепи или при экзоцик-лпчесюом азоте, гетероапалоги пирацетама и др. Однако, практика показывает, что при использовании метода химической модификации лишь незначительная часть вновь синтезированных соединений обладает преимуществами перед прототипом и может быть рекомендована в качестве потенциального лекарственного соединения. Так, из сотен аналогов пирацетама, полученных путем химической модификации исходной молекулы, до клинических испытаний были доведены лишь едпппцы.

Альтернативным подходом к созданию новых лекарств может быть пептидный драг-дизайн, т.е. конструирование пептидов с заданной фармакологической активностью, исходя из структуры непептидных фармакологически активных веществ. Этод подход на протяжении последних лет/разраба-

тыкается в отделе химии фармакологически активных веществ НИИ фармакологии РАМН. Так, в 1985 г. была выдвинута гипотеза (ТА-Гудашева, Р.У.Островская) о пептидерпгаеском механизме действия пирацетама. На основе этой гипотезы получены дашептщцше аналога пирацетама с Ы-кон-цевой пироглутаминовой кислотой, которые в экспериментах па животных оказались по уровню доз в 100-100000 раз активнее пирацетама. Кроме того, они действовали на память более специфично, нежели эталотгый ноо-троп, не проявляя агпигипоксической активности и действуя избирательно на отдельные фазы памяти.

Диссертация посвящена синтезу п оптимизации структур потенциальных ноотропных лекарственных веществ на основе иной пирролщпшсо-

держащей аминокислоты г пролина п является логическим развитием работ

>>

по получению новых типов ноотропных соедпнешш, пред ставляющих собой пептидные аналоги пирацетама. Разработка нового типа пептидных аналогов пирацетама на основе Ь-пролина имеет несомненное теоретическое значение, так как вносит вклад в изучение механизма действия ноотропов и выявление структурных требований, предъявляемых к ним.

Целью работы является поиск новых перспективных ноотропных веществ в ряду производных К-ацилпролина на основе концепции пептидного драг-дизайна и изучение взаимосвязи "структура-активность" в этом ряду с целью выхода на оптимальные соединения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Осуществлен обоснованный синтез потенциальных ноотропов -оригинальных линейных и бихщклических производных Ы-ацилпролина.

2. Разработана лабораторная пропись получения перспективного для клинических испытаний и удобного в синтезе потенциального ноотропного вещества - этилового эфира К-фенилацетилпролшшшщгаа.

3. Эп'лосый эфир К-фешиящетсотпролшгошщша можно рассматривать как пролекарство, превращающееся в организме в ноотропный циклический дгаептнд - пирроллднно [ 1,2-d]-2,5-диазац11Клогексапдион-1,4.

Научпая новизна. В работе впервые методом компьютерного конфор-мацпоппого анализа показано фармакофорное сходство фрагментов пираце-тама, pGlu и Ac-Pro; получены соединения пролина, обладающие ноотроп-ной активностью - N-ацилпролпиы и пролннсодержащие дипептиды. На основании анализа "структура-активность" в ряду N-ацилпролилпшцннов и данных по превращению одною из них в биологических средах показано, что активным началом может быть rpnaio-(Pro-Gly), образующийся в организме из этих соединений. Проведено изучение структурных требований к Еонформационно-жестким бициклическим. пирролидинсодержащим соединениям и показана оптимальность imiaio-(Pro-Gly) для проявления ноотроп-пой. активности в ряду пзученпых бицпклических соединений.

Практическая значимость работы. На основе N-ацилпролина получен ряд высокоактивных пептидных аналогов пирацетама, среди которых для расширенных фармакологических исследований отобрано эффективное и технологически доступное соединение-этиловый эфир N-фенилацетилпро-лилшщпна. Разработана лабораторная пропись получения этого соединения. Разработан удобный метод синтеза активного конформационно-жестко-го аналога пирацетама - nrnaro-(Pro-Gly), позволяющий получать это соединение в мягких условиях с высокой оптической чистотой.

Апробашш работы. Материалы диссертатпюнной работы положены ня II Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1995), Первом Европейском конгрессе по фармакологии (Милан, 1995), Международном конгрессе "Design of bioactive compounds. Possibilities for industrial application" (Потсдам, 1995).

Публикации. По результатам работы опубликовано 4 тезисов докладов на научных конференциях и 1 статья, еще 2 статьи находятся в печати.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, который насчитывает 183 наименования. Работа содержит 8 таблиц и 32 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Ранее в НИИ фармакологии РАМН на основе гипотезы о том, что классический ноотроп (т.е. вещество, облегчающее процессы обучения и памяти) нирацетам является экзогенным аналогом эндогенного нейропсптвда, получен ряд пептидных аналогов пирацетама на основе пироглутаминовой кислоты - пироглутамилсодержащие дипептиды. Наиболее активным из пироглу-тамилсодержащих дипептцдов оказался рС1и-Аза-ЫН2, совпадающий с 14-концевым фрагментом основного метаболита пептида памяти вазопрессина (ТАГудашева и др., 1985 и 1988).

Между те^ в ряду природных аминокислот имеется и друга;: пирроли-динсодержащая аминокислота - пролия, которая как и ее цстиловый эфир обладает влиянием на память. В опытах на крысах с обучением условному рефлексу пассивного избегания (УРПИ) цеггаловый эфир Ь-цролина при системном введении вызывает потерю памяти - амнезию (Р.У.Островская й др., 1985), которая снимается действием как пирацетама, так и пироглута-милдипептидов.

Из приведенных формул (рис.1) видно, что пирацетам, пирошутамилди-пептиды и цетиловый эфир нролина (I) имеют рад общих структурных элементов, необходимых для проявления активности. Все они содержат пкрро-лцднновый цикл (фармакофорная группа а), карбамидную пли карбалкок-

сильную группу (фармакофорпая группа р) и лактамный карбонил (фармакофорпая группа 7), отсутствие которого, как например, в случае центового эфира пролпна, приводит к проявлению амнестической акшвности. В химическом плане отсутствие лактамного карбопнла у приводит к изменению состояния пирролидтагавого азота, превращая его из ампдпого в амшшый.

"СУ' р-"^»---'^!!^ •-1Г- [Ь„С1бН*1

пирацетам пироглугалллсодаржашие цетнлояый эфир амид М-ацетил

дипепгндц пратта пролит

Рис.1. Основные фармакофорные группы тфацетама и его аминокислотных

аналогов.

Мы предположили, что недостающая фармакофорная группа у в соединениях па основе пролила может быть имитирована карбонилом М-ациль-ного заместителя пролила, что позволло перейти к новому типу ноотропных соединений па основе И-ацильных производных Ь-пролина.

1. Изучение фариакофорного сходства фрагментов пирацетама, рв!и и

Ас-Рго с помощью конформацпонного компьютерного анализа.

Для подтверждения возможности пространственного совмещения основных фармакофорпых групп пирацетама и его пептидных аналогов на основе пирролидипсодержащях аминокислот нами выполнен компьютерный копф фмационный анализ некоторых представителей указанных классов соединении. Для изучения выбраны следующие соединения: сам пирацетам, как наиболее типичный представитель класса ноотропных соединений; рИи-ИНг, как его простейший топологический пироглутамилсодержащпй аналог; р01и-01у->Ш2, как простейший дипептвдный аналог, рОЬ-Абп-НЩ, как наиболее активное соединение серии пиротутамилсодержащих догаепти-дов, н М-Ас-Рго-МЩ' как модельное соединение класса К-адильны^ произ-

а

а

водных пролина (рис.1). Для совмещения выбраны следующие критерии: а) максимальное перекрывание пирролидпновых циклоп с наиболее близким расположением лактамных атомов азота; б) лактамные атомы кислорода пи-рацетама и пироглутамилсодержахцнх соединений, а также N-ацетилышй атом кислорода Ac-Pro-NH2 должпы быть сближены в пространстве п ориентированы в одном направлении; в) пептидная связь pGlu-Asn-NIIi, pGlu-Gly-NHj, амццпые группы pGlu-NIi2, N-Ac-Pro-NTIa п карбампдная группа пирацетаыа также должны быть локализованы в одной области пространства, а векторы карбонильных групп и NH-связей направлены параллельно.

В результате конформацнонного анализа с использованием компьютерной программы PC MODEL*) навдены энергетически достпжшше конфор-мации (т.е. конформащш, отличающиеся от конформащш с глобальным минимумом энергии не более, чем па б ккал/моль), которые допускают совмещение в пространстве по указанным параметрам всех изученных соединений (т.н. фармаюофорные конформащш, см., например, рис.2 и 3),

Pnc.la. Наложение молекул N-Ac-Pro-NH2 и пнрацетама в фармакофор-ных конформациях.

н

') £>та часть работы проводилась совместно с jcx.ii. И.П.Еасюшьш и к jlh. В А. Патолташ под общим рукссодсттоц аиад. РАН Н.С.Зефмроьа, (кафедра органической хзапш химфака МГУ).

Рис.3. Наложение молекул N-Ac-Pro-NH2 и pGlu-Asn-NH2 в фармакофорных колформациях.

Таким образом, памп подтверждена возможность имитации лакгампого карбоппла пирацетама и шгротутамидднпептидов карбонилом в N-ацпльной группе N-Ac-Pro-NH2 п, следовательно, возможность проявления поотроп-пой активности при замене тшроглуташшового фрагмента в ноотропных пи-рогаугаюищппептидах па N-ацшшролиповьш фратмепт (см.рис.1).

2. Изучспнс взаимосвязи струхтура-ноотропнал антпвпость N-пцшгаро-лшсодсртащих соединений.

\

2.1. Эфпры п ампдн-Н-ашлпролпнод.

Нами осуществлен синтез эфпров и амидов ряда N-ацильных рроизвод-пых пролила: центового эфира Ы-ацетил-Ь-пролина (II), амидов N-ацетнл-L-прошша (III), N-npoxmonim-L-nponiraa (IV), Ы-бушрил-Ь-проллна (V), 1Ч-фсш1Лпцетпл-Ь-пролина (VI), а также амида Ы-ацетил-О-пролина (VII).

Синтезированные Ы-ацилпролины изучены на ноотропную активность в тесте УРПИ на крысах*>(ТаблЛ). Ноотропнаа активность соединений принималась равной относительному улучшению обучаемости исходно недообу-ченных животных в тесте УРПИ и выражалась в процентах от максимально возможного эффекта.

Табл.1. Ноотропная активность эфиров и амидов №ацилпротш.

^Ххж

Соед. И1 конфшу рация Доза6), ммоль/кг Дозаб>, мг/кг. Активность, %

11 ОС1бН33 сн3 Ь 0,078 30 +35 (Р а><0,05)

III мн2. сн3 ь 0,089 14 +50(Р<0,01)

IV С2н5 ь 0,088 15 недост.

V с,н7 ь 0,086 16 недост.

VI ЫНз с*н,-сн2 ь 0,082 19 -32 (Р<0,01)

VII N«2 сщ ь 0,080 12,6 - недост.

цетиловый эфир Ь-пролина (I)8) 8,8 30 -95 (Р<0,01)

пирацетам 2,113 300 +23(Р<0,05)

*)Р- достоверность, рассчитанная по методу Манна-Ушни (и-тест); знак (-) указывает на амнестическую активность. ^Внутрибрюшиннос введение (в/б)

»)см. Р.У.Островская и др., Бкшл.Эксп.Биол., 1985, №3, с.311-313.

Показано, что введение карбонильной группы в воде Ы-ацетильного остатка в цетиловый эфир Ь-лролина "(I) действительно приводит к обраще-ншо эффекта (Табл.1, срлсшвности I и II). Дальнейшая замена карбалкок-сильной группы в II на амидную приводит к увеличению ноотропной активности с 35% до 50% (соединение III), возможно, благодаря тому, что в огли-

*) Фориакоаоппесснс эксперименты проводились в ¡рулив проф. Р.У.Осгроаской (лаборатория проф.Т-\-Ворошшой НИИ фармакологии РАМН).

тае от icapíínj!таксилыюй ipynm-i, анццпоя группа может быть не только акцептором, но и донором протонов при образовании водородной связи с предполагаемым поотроппым рецептором.

Подобно пиротутамнлеодержащим аналогам пнрадетама, соединепия па основе N-ацшшролипа проявляют стереоспецифичность ноотропного эффекта: аьшд Ы-ацетил-Ь-пролипа (III) обладает ноотропной активностью, тогда как его эпантномер - амид К-ацетил-Б-пролина (VII) в той же дозе пеакшвеп.

Наблюдается ярко выраженная зависимость ноотропного эффекта амидов 1Я-ацш1-Ь-пролпта от размера и природы заместителя при пирро-лцдпновом азоте. Увеличение размера заместителя приводит к исчезновению (IV, V) или обращению (VI) ноотропной активности (Табл.1).

Различия в активности соединений III-V можно объяснить стерически-мп препятствиями со стороны дна полости рецептора, глубина которой не должна превышать длины ацетильной группы, а амнестическую активность соединепия VI - ферментативным отщеплением фенилацетильнои группы (ср. стр.18).

Другим возможным объяснением наблюдаемой зависимости активности среди амидов N-anjm-L-npojnmon от размера N-ацилъного заместителя может быть различное соотношение конформеров соединений III-VI. С точки зрения предполагаемого рецепторИого механизма действия исследуемых соединений наиболее важным фактором активности представляется пространственная структура молекул, которая во многом определяется транс-цис изомерией относительно третичной имидпой связи ацил-пролпн, в связи с чем мы провели конформацпонныи анализ соединений III-VI.

Конформашгонньш анализ N-аштлпролипоп методом ПМР.

Нами изучено влияние величины и природы N-ацшшюго заместителя на копформациошюе равновесие транс и дис конформеров в растворе методом ПМР в ряду соединений III-VI. В спектрах растворов этих соединении можно выделить по паре сигналов равной интенсивности от протонов NHj-группы, относящиеся к транс- и цис-конформерам относительно связл ацил-пролин.

— Q^C —

± NH* 1 т- I да

y-DODOpOT

цис-юэяформер траяс-копф орыор

Отнесение сигналов протонов амвдпой группы выполнено нами па примере амида N-адетил-L-пролина (III).

В спектре III в CDClj выделены две пары сигналов от. протонов NHa прй 7,1; 5,63 и 6,42; 6,09 м.д. Исследование температурной зависимости в интервале 20-50°С показало, что снльнопольное смещение сигналов NII первой пары составляет 0,09 и 0,19 ид., а второй - 0,28 и 0,32 м.д. Таким образом, температурный коэффициент оказался равным З Ю"3, б,З Ю"3 и 9,3-10'3; 10,610 3 мд./град. соответственно. Поскольку у соединений; содержащих изомеры с внутримолекулярной водородной связью (ВМВС) обычно наблюдаются слабые изменения химического сдвига от температуры, сигналы при 7,1 и 5,63 мд. отнесены к МЩ-протонам транс-конформера, один из которых частично связан водородной связью с карбонильным кислородом N-ацстильной группы.

Правильность такого отнесения подтверждается характером зависимости химических сдвигов сигналов NH2 и соотношения транс- и цпс-копформе-

ров от природы растворителя. Из литературы известно, что сигналы амидных протонов транс-конформсра, частично связанных ВМВС и поэтому экрани-роваппых от растворителя, при перехъде от растворов в CDCI3 к ДМСО сдвигаются псзпачитслыю в отличие от сильного смещения сигналов протонов цис-конформсра, по участвующих в ВМВС. Величина ннзкопольпого смещения снглалои протонов NH при переходе от CDCI3 к ДМСО составляет в нашем случае для цпс-конформера 2,48 и 1,63 мд., а для транс-кон-формера- 0,19 л 1,8 м.д, что свидетельствует об образовании ВМВС транс-копформером. Добавление ДМСО в CDCI3 увеличивает концентрацию цпс-конформера и растворе, соотношение транс/цис-йонформеров изменяется от 7,1 в CDCI3 до 2,1 для смеси (4:1) растворителей СОС1з/ДМСО. Дальнейшее увеличение концентрации ДМСО практически не влияет па соотношение, конформеров в растворе, и в чистом ДМСО оно равно 1,8.

.Проведенное далее изучение спектров ПМР соединений IV-V1I в CDCI3 показало, что количество транс-копформера с ВМВС практически не зависит от объема N-ацильного радикала и для всех исследованных соединений соотношение транс/цнс-конформеров в CDCI3 составляет 7:1.

Соединение III с высокой ноотроппой активностью, неактивные соединения IV и V, а также соединение VI, ухудшающее память, обладают одинаковым соотношением транс- и цпс-конформеров в растворе. Следовательно, зависимость поотропной активности N-ацильных производных амида L-пролина III-Vi от размера и природы заместителя при азоте не определяется положением конформанионпого равновесия в растворе.

2.2. N-Антглролппсодержацте дттептпдьт.

Поскольку ранее па примере ггарогаугамилсодержащпх аналогов пнра-цетама было показано, что введение второй аминокислоты приводит к увеличению поотропной активности, мы предположили, что аналогичная закономерность может наблюдаться и для N-ацилпролннсодерлхшшх аналогов

пирацетама. Мы синтезировли рад производных Ы-ацштролилдипешвдов (VIII-XXX), в которых вторая аминокислота представляет собой Gly, ß-Ala, GABA, Glu, Asp, Asn, Ala, Val, Leu, D-Ala в соответствии со схемой:

H-X-0H+R20H ^jX H-X-OR2

H-Pra-OH+ RlCOCl RlCO-Рю-ОН

i.i-Buocoa 2. H-X-0R2

т

Rl-CO-Pro-X-OH Rl-CO-Pro-X-OR2 (VIII-XX)

(XXX) . v

NHR3/ \NM62

Rl-CO-Pro-X-NHR3 Rl-CO-Pro-X-NMc2

(XX1-XXVIII) (XXIX)

VIII и villa: R^QHsCH^ R2=Et, X=GIy, где Pro находится в L-шш D-конфшурациях; x

IX: Ri-CßHs; R2-Et, X=Gly; XX: R^QHs; R2=Et, X=p-Ala;

X: R1=(CH3)2CIICH2; R2=Et; X=GIy; XXI: R^QHsCHí; R3=II, X=Gly;

XI: R1=CH3(CH2)4; R2=Et, X=Gly; XXII: R*=C6HsCH2; R3=Me, X=GIy;

XII: RI=l-Ad; R2=Et, X=Gly; XXIII: R^QIIs; R3=H, X=GIy;

XIII: R1=C6Hs(CH2)3; R2=Et, X=Gly; XXIV: R1=C6H5CH2; R3=H, X=ß-AIa;

XIV: Р^=С6Н5СН2; R2=Et, X=ß-Ala; XXV: R1=C6HS; R3=H, X=ß-Ala;

XV: R^QHsCHî; R2=Me, X=GABA; XXVI: R^CsHsCH^ R3=II,X=Asn; XVI: R^QHsC^; R2=Et, X=GluOEt; XXVII: R^CfiHsCI^; R3=H, X=Leu;

XVH:R1=C6H5CHa;R2-Et, X=AspOEt; XXVHER^CßtlsCH^R^H, X=D-AIa;

XVIII: Ri=C6H5CH2; R2=Et, Х=А1а; XXIX: R*= C6H5CII2; X=Gly

XIX: R1=C6HsCH2; R2=Et, X-Val; XXX: R1= C6HsCH2; R2-II; X=Gly

Полученные дипептиды изучены на ноотропную (аптиаьшестическую) активность. Фармакологическая активность некоторых N-адил- L-пролнл-дилептидов в тесте УРПИ представлена в Табл. 2.

Таблица 2. Зависимость ноотропной активности в ряду Ы-аци.тролип-содержащих дипептидое от:

а) М-концевого замещения КАСО-Рго-Иу-ОСгН",

N0. Активность, % (доза 0.1

иг/кг, в/б)

VIII С6Н5СН2 51*

IX. Сбн5 37*»

X (СН3)2СНСН2 28*

XI СН3(СН2)4 20*

XII 1-.М 13*

XIII С6Н5(СН2)3 13*

б) С-юотщевого замещения СбН5СН2С0-Рго-01у-112

N0. • К2 Активность, % (доза 0.1

иг/кг, в/б)

VIII ОС2Н5 51*

XXI Ш2 62**

XXX ОН 9.8

XXII ЫНСНз -7.6

XXIX N(0113)2 23.0

б) природы второй аминокислоты С6Н5СН2-СО-Р10-Х

- N0. X Активность, % (доза 0.1

мг/кг, в/б)

XIV 0-А1а-ОЕ1 . 66**

XXIV р-А1я-ЫН2 52*

XV ОАВА-ОМе 45*

XVII ЛБР(ОЕ1)2 34*

XXVI АБп-ынг 26*

XVI О1и(ОЕ02 58*

XVIII А1а-0Е1 10

XXVII Ьеи-ЫН2 8

XIX VaI-OEt 0

'^-Достоверность Р<0,05 (Л-тест) "^-Достоверность Р<0,01 (11-тест)

lia основании данных по ноотрошой активности, физико-химических свойств, отсутствия токсичности') и доступности исходного сырья для рас- ' ширенных фармакологических исследовании отобран этиловый эфир N-фс-ниладетилпролилглицина. В связи с этим разработана лабораторная пропись получения этой активной субстанции. Суммарный выход по трем стадиям, согласно этой прописи составляет.31%.

Анализ взаимосвязи "структура-активность" (Табл. 2) в раду N-amw-L-пролинсодержащих дипептвдов вгсявяяет следующее;

1. Размер и природа N-ацильного заместителя незначительно влияют на активность в ряду эфиров К-ащишролнлглшцшов.

2. Природа С-кондевого заместителя существенно влияет па активность N-фенилацетилпролилгяицинов. Эфир и незамещенный амид обладают ноо-тропной активностью, в то время как замещенные амиды и дипептнд со свободной карбоксильной хруппой неактивны.

3. Природа второй аминокислоты имеет ключевое значение. Акзшшы те пептиды, вторая аминокислота которых идентична (Asa) клн гомологична (Glu) второй аминокислоте дипентида pGlu-Asn.-NIÎ2, либо является фрагментом этих кислот (Gly, p-Ala. G ABA).

Кроме того, нами обнаружено, что, подобно ашщам N-ацешшшролина (III и VII, стр.8), ÎN-ацилиролинсодержащие дипептиды обладает стереоспе-цифичностью ноотропного эффекта. Так, этиловый эфир 1\т-фснш;ацетлл-Ь-пролнлпшцина (VIII) проявляет высокую аитиамнестическую активность, в то время как его энантиомер (Villa) неактивен.

Для субстанции VIII до 2 г на 1 кг seca мыши токсические эффекты не выявлены.

Конформаготопный анализ производных ЕТ-феинлапетил-Ь-протщл-пгтплгнп метолом ПМР.

Возможное объяснение наблюдаемых зависимостей между структурой и активностью в ряду замещенных нролилгшпщнов могао корениться во влиянии заместителей на копформацион^ое равновесие в растворе.

Для конформацнонного изучения мы выбрали С-пропзводные N-фениладетшшролилпнщина: Phac-Pro-Gly-OEt (VIH); Phac-Pro-Gly-NH2 (XXI), Pñac-Pro-Gly-NHMe (XXII); Phac-Pro-GIy-OH (XXX).

В спектрах большинства соединений данного ряда наблюдается двойной набор сигналов ампдпых протонов пептцдной связи, который, как известно, появляется благодаря тралс-дис-изомерин относительно имидной связи ацпл-пролин. Транс-конформер при том может находиться как в открытой форме, так и в конформации, стабилизированной ВМВС. Отнесение сигналов па основании изучения температурной зависимости химических сдвигов амядпых протонов в хлороформе проведено на примере этилового эфира N-феппладетил-Ь-пролилпподина (\Т11).Температурный коэффициент хим. сдвига амцдного протона транс-конформера VIII составляет 1.8И0-3 м.д./град., а цис-копформера - S.& 1Q-3 мд./град.,1что свидетельствует об учи стпи амвдпого протона транс-юЬнформера во ВМВС с образованием у-поворота.

Мы также изучили изменения хим. сдвигов сигналов амидных протонов во всех исследуемых Ы-феншсвдетилпролилглицинах при переходе от растворов в хлороформе к растворам в ДМСО. Полученные результаты указывают па то, что амидпые протоны пептидной связи транс-конформеров всех соединений (за исключением соединения XXII) частично вовлечены во внутримолекулярную водородную связь. Хим. сдвига амиднош протона транс-конформеров VIII, XXI и XXX при переходе от .хлороформа к ДМСО изменяют-

ся в пределах от 0.64 до 0.81, в то время как соответствующие сигналы цпс-конформеров - от 1.16 до 2.07 мд.

Доминирующей конформацпей Р1шс-Р1ю-О1у-ОЕ1 (VIII) и РЬдс-Рго-Иу-ОН (XXX) в хлороформе и ДМСО является транс-конформация относительно третичной имидной связи, которая стабилизирована внутримолекулярной водородной связью (тг-поворот). Эти соединения являются химически родственными, что позволяет предположить сходную пространственную структуру их молекулярного остова. При этом соединение VIII обладает высокой антиамнестической активностью, а соединение XXX не активно.

i N-!

i N-CHrCOR QHs CH/ О -Н

VIII (R=OC2H5), XXX (R=OH) На основании данных зависимости хим сдвигов амидных-прогонов при переходе от CDCI3 к ДМСО мы предполагаем для метиламида N-фенилаце-тилпролилпшцина (Д5 NH-Gly 1,81 и 1,76 мд.; А5 NHCH3 0,58 и 0,86 мд.) одну из следующих структур:

PhCH

PhCH-

p-шворог

XXII

a для амида N-фениладетилпролилглицина (Д5 NH-Gly 0,64; Д5 NH2 -0,09 и 0,77) - структуру с участием двух ВМВС: у

РЬСН;

XXI

Отмепш, что соединение XXI, отличаясь по юонформации от VIII, проявляет так же, как и последнее, выраженную ноотропную активность. Таким образом, корреляции между информационным составом и знтиамнестичес-кон активностью в ряду 1^-ацшшролинсодержаадих дипептидов не наблюдается.

3. Дпкегошшеразип цпоо-(Рго-С!у) - пошш базовая структура, проявляющая ноотропную активность.

Апализируя взаимосвязь "структура-активность" в ряду замещенных Ь-пролплтлицииоп, мы пришли к предположению, что активные соединения в этом ряду представляют собой "пролекарства", а реальным действующим веществом в живом организме является пирролидашо[1,2-а]-2,5-дпазацикло1ек-санднон-1,4 (XXXI), который образуется из замещенных пролилглицинов в ходе ферментативного отщепления М-ацпльнош радикала с последующей циклизацией.

щепленне не является стадией, лимитирующей циклизацию. Вмеете с тем,

УШ-ХШ, XXI: (К1=СбН5СН2, С6Н5, (СНзДОНСНг, СНз(СН2)4,

1-М, С6Н5(СН2)3. а2=ос2н5, Шг)

1

Отсутствие зависимости ноотропной активности от природы К-оцильного заместителя будет наблюдаться в том случае, когда подобное от-

С-концевые заместители, промотпрующие внутримолекулярную циклизацию (прежде всего -COOEt и -CONH2), способствуют проявлению фармаколо- • шчесюой активности.

3.1. Изучение превращения этилового эфира К-фенилаиетил-Ь-продял-1ШШЩа jQJU) -Р JQWQ-(Pro-Gly) (XXXI).в биолощческих средах*),

Для подтверждения предположения о возможности образования циюю-(Pro-Gly) в организме из эфиров и амидов N-ацилпролилппщшюв, мы попытались обнаружить с помощью ГЖХ указанный метаболит после инкубации в течение 1 часа 1 мг (3,15 мкмоль) этилового эфира М-фешшацстил-Ь-иролилгаицина (VIII) с плазмой крови (1 мл) я гомогенатом мозга (1/3 мозга) беспородных крыс-самцов.

При хроматографировании контрольных образцов плазмы и гомогспата мозга обнаружен пик с временем удерживания 8'25", который соответствует стандарту-свидетелю innaio-(Pro-Gly) (XXXI). После инкубации пик, соответствующий mnoio-(Pro-Gly), увеличился в 1,7 раза в плазме крови и в 5,5 рат в опытном образце гомогената мозга.

Таким образом, полученные экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что в плазме крови,и в еще большей степени в мозге соединение VIII метаболизируется до циюю-(Рго-Иу) (XXXI). Соединение XXXI и является истинны t ноогропом, который может образовываться в организме из таких "вролекарств", как этиловый эфир и амвд.И-фснилацетшс-Ь-про-лилгашщка (VIII и XXI).

В свете этих результатов становится понятным амнестичесюш эффект амида N-фенилацетилпролкна (VI) (Табл.1). По-видимому, и в этом случае наблюдается отщепление фенилацетильной группы с образованием в конеч-

Эти эксперимента проводитесь совместно с К.6.Н. С.С.Бойко (НИИ фармакологии РАМН тпКо.кггорш проф. Й.П.Жердева).

пом итоге Ь-пролипа, обладающего, как известно, ямнестнческим действием.

3.2. Синтез и биологическая активность (8а5)-ппрролидино[1,2-а]-2,5-лпазатпппгогекса'тптопа-1.4 (нпкгго-(Рго-С1у), XXXI).

Цшого-(Рго-С1у) получен нами с высоким выходом гццрогенолизом г-С1у-Рго-ОЕ1 в ДМ ФА п присутствии 10% Р<1/С, аналогичным способом синтезировал его энашиомер (XXXII) из 2-С1у-В-Рго-ОЕ1. Использование в

I

качестве исходпого соединения г-Рго-Иу-СЖ прггоодит к смеси продуктов, основным из которых является Рго-С31у-<Ж. При гндрогенолизе 2-С1у-Рго-ОЕ£ в спирте, а не в ДМФА образуется смесь дипептдда 01у-Рго-0Е1 и дике-тошгперазпна XXXI.

Данные фармакологического тестирования (Табл.3) подтвердили наличие антиашгестической активности у XXXI, причем активные дозы были на несколько порядков меньшими, чем у классического ноотропа пнрацетамя. 15 мшпшально действующих дозах (0,1 иг/кг, внутрибрюнпгано) глубина эффекта XXXI оказалась большей, чем у VIII (76% и 51% соответственно). Эпантномер ХХХ1-щ1Кло-(В-Рго-01у) (XXXII) оказался неактивным, так же как и этиловый эфир Ы-фенплацетил-О-иролплглшдша (УШа).

3.3. Стаггез и биологическая активность некоторых иирролидино[1.2-а]-лпазапнклоалкапонов - аналогов соединения XXXI,

Для решения вопроса об оптимальности структуры XXXI для проявления антпампестической активности, нами синтезированы и другие бициюш-ческне соединения. Все синтезированные вещества имеют в своем состаее ппрролидиновый цикл, характерный для аналогов пирацетама, конденснро-ваппый с другим диазациклоалкановым циклом, а также ряд лактамных атомов кислорода:

о

ш

XXXII

XXXIII

XXXIV

ын

(СН^СООЕ! XXXV

МС(0)СНз

XXXVIII XXXVI XXXVII

Поскольку щцрогенолиз 2-р-А1а-Ргг (Ж в ДМФА не приводит к пир-ролцдино[1,2-а]-2,6-циююгептацдиону-1,5 (XXXIII), последний был с выходом 43% получен циклизацией р-А1а-Рго-ОН в уксусном анщцриде при нагревании. Аналогичная циклизация проведена и для О1у-Рго-(Ш. Эта реакция сопровождается частичной рацемизацией (и на 25%), что установлено нами из сравнения углов вращения диюю-Рго-01у.

Существенно снизить степень рацемизации удалось при проведении циклизации в ДМФА с использованием дициклогексилкарбодшшвда в качестве конденсирующего средства в присутствии 4-(диметилампно)-1шрцдина. Так был получен ппрролвдино[1,2-а]-2,7-диазациклоокганд11он-1,б (XXXIV) с выходом 50% и углом вращения -142° (вода).

Соединение XXXV синтезировано нагреванием дипептида Рго-С1и(ОЕ02 в присутствии каталитических количеств 2-оксшшрцдина.

Для получения XXXVI и XXXVII использован достаточно жесткий метод циклизации рИи-Иу-ОН нагреванием в уксусном ангидриде. Мольное соотношение полученных пирроладино[1,2-а]-2,5-диазациклогексантриона-1,4,6 и его М-ацетильного производного составляет около 1,7:1.

Пиррогаадтю[1,2-а]-2,5-диазациклогексантрион-1,3,6 (XXXVIII) получен, с выходом 50% сплавлением амида Ы-карбамидометил-Ь-пирошутами-повой кислоты.

Данные фармакологического изучения соединений ХХХШ-ХХХУ приведены в Табл.3.

Таблица 3. Лоотропная активность бициклических соединений XXXI-ХХШН в тесте УРЛИ.

Соединение Доза, мг/кг, в/б Латентный период, с Активность, %

контроль амнезия амнезия+ вещество

XXXI 0,1 83,14±34,2б 18,17±7,69 67,50±25,77 +75,93*

XXXII 0,1 164,70±15,3 82,70±23,12 55,50±18,91 -33,17

XXXIII 0,5 11б,58±1б,09 55,58±13,77 72,07±14,80 +27,05

XXXIV 0,5 131,33±18,95 26,5±Ю,85 54,75±17,56 +26,95

XXXV 0,1 164,70±15,3 82,70±23,12 98,4±24,4б +19,15

XXXVI 0,5 131,33±18,95 26,5±10,85 33,77±14,90 +6,72

XXXVII 0,5 131,33118,95 2б,5±10,85 28,34±П,37 +1,79

XXXVIII 15,0 164,70±15,3 82,7±23,12 78,01±13,07 -6,22

ппрацетам 300 +22,9*

* - р<0,05 в сравнении с контролем (11-тест).

Как видно нз таблицы 3 цшага-(Рго-01у) (XXXI) проявляет высокую но-отропную активность, превосходящую активность эталонного ноотропа пи-рацетама по глубине эффекта втрое и по минимально действующей дозе а 3000 раз. Соединения с расширенными циклами XXXIII и XXXIV имеют лишь тендепцню к проявлению ноотропной активности даже в дозах, превышающих в 5 раз минимально действующую дозу XXXI. Эвантиомер цикло-(Рга-С1у) (XXXII), наоборот, имеет тенденцию к амнестической активности. Остальные соединения ХХХУ-ХХХУ!11 оказались неактивными. Получение

данные свидетельствуют о стсрической оптимальности roiKiio-(Pra-Gly) (XXXI) среди изученных бициюшческих структур для проявления ноотроп- » ной активности.

Таким образом, в результате проведенной работы нами получены свидетельства в пользу того, что проявляющие ноотропную активность N-ацил-пролилглицины могут представлять собой "иролекарства", превращающиеся в организме в конформационно-жесткий пирролидино[1,2-а]-2,5-диазадик-логександион-1,4 с высокой ноотуопной активностью.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен обоснованный синтез не унциальных ноотронов - оригинальных линейных, и бициютических производных N-ацшшролина.

2. Анализ взаимосвязи структуры и активности в ряду эфиров и амидов N-ацилпролинсодержащих дипептидов показал, что активныдолько N-ацил-пролиддипентвды, содержащие в качестве второй аминокислоты Asn, Glu или их фрагменты: Gly, р-А1а или GABA. Показано также, что ноотропная активность N-ацилпролилглицинов практически не зависит от природы и размера N-ацильного заместителя, но существенно зависит от природы С-концевого заместителя.

3. На основании анализа зависимости "структура-активность" в раду N-ащштролилшицинов и превращения одного из них в биологических средах еде чан вывод, что ноотропная активность этих соединений может быть обусловлена общим метаболитом, nraoio-(Pro-Gly), проявляющим высокую ноотропную активность.

4. Синтезирован ряд конформационно-жестких пирролидино[1,2-а]диазацик-лоалканонов, аналогов цикло-(Рго-С1у). Изучена взаимосвязь структуры и активное m в зависимости от размера цикла, положения атомов азота в нем, а также положения и числа карбонильных трупп. Показано, что цик-

.Tio-(l>ro-Gly) является оптимальной среди них структурой для проявления поотропной активности. 5. Разработана лабораторная пропись получения перспективного для клинических исследований потенциального ноотропа - этилового эфира N-фе-нилацетилпролилпшцина.

Основные результаты диссертагош изложены в следуетишх публикапиях:

1). ТАГудашева, Н.И.Василевич, К.Н.Золотов, В.ПЛезина, С.Г.Розенберг, Е.В.Кравченко, Р.У.Островская, ТАВорошша, Г.Г.Розанцев, АП.Сколдн-нов. О механизме ноотропнош действия топологических аналогов пираце-тама на основе пролипа. - Хим -фарм. журн., 1991, №6, 12-15.

2). ТАГудашева, Н.И.Василевич, Г.Г.Розанцев, АП.Сколдинов, Р.У.Островская, Е.В.Кравченко, ТАВоронпна. Дизайн ноотропных ппрролидино[1,2-а]дназациклоалкандионов на основе анализа структура-активность в ряду N-ацилпролинсодержащих дипептидов. - Тез. докл. II Рос. Нац. Конгресса "Человек и лекарство", Москва, 10-15 апр. 1995, с.14.

3). Т A. Gu da she va, N.I.Vasilevich, A.P.Skoldinov, G.G.Rozantsev, R.U.Ostrov&-kaya, TAVoionina. The design of nootropic pyirolidono[l,2-a]diazacyeloall£ane-diones. - Pharmacological research, 1995, v.31 Suppl., p.265.

4). TAGudasheva, N.I.Vasilevich, AP.SJcoldinov, G.G.Rozantsev. Use of SAR in N-acylproline-Containing dipeptides series for the design of nootropic pyrrolidino-fl,2-a]diazaalkanediones.- Proceeding of the conf. "Design of bioactive compounds. Possibilities for industrial application", Potsdam, Germany, 4-7 Sept. 1995.

5). Н.И.Василевич, ТАГудашева, АП.Сколдинов, Г.Г.Розанцев. Синтез пир-ролцщто[1,2-а]диазациклоалюшдионов с потенциальной ноотропной активностью.- Сб.:"Химия азотистых гетероциклов" (Тез. докл.межинстшуг-ского коллоквиума, Черноголовка, 18 окг.1995), Черноголовка, 1995, с.64.

6). TAGudasheva, TAVoronina, ILU.Ostrovskaya, G.G.Rozantsev, N.I.Vasile-vich, S.S.Trolimov, E.V.Rravchenko, AP.Skoldinov, S.D.Seredenin. Synthesis and' antiamnesio activity of a series of N-acylprolyi-containing dipeptides. -EurJ.Med.Chem-, 1996, in press.

7). ТАГудашева, Н.И.Василевич, Р.У.Островская, С.С.Трофимов, ТАВоро-нина, АП.Сколдинов, Г.Г.Розанцев. Синтез пирролидино[ 1,2-а]диазащпс-лоалканонов н изучение их ноотропной активности. - Збш.-фарм. жури., 1996, в печати.

8). Г.Г.Розанцеь, ТАГудашева, Н.И.Василевич. Лабораторная пропись получения этилового эфира N-фенилацетшшролшотшципа (ГВС-111). Москва, НИИ фармакологии РАМН, 1994, 25 стр.

Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Подп. к печати 20.J.96

Тираж <00 экз.

Заказ