Электрические и магнитные свойства твердых растворов сульфидов марганца с редкоземельными элементами RexMn1-xS(Re=Sm,Yb) тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

На правах рукописи

БУРЕНИНА Ольга Юрьевна

Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillus subtilis: сравнительный анализ свойств и функций

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

МОСКВА-2014

1 5 МАЙ 2014

005548375

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» и в Институте фармацевтической химии Марбургского Университета имени Филиппа (г. Марбург, Германия) в группе профессора Р. Хартманна.

Научный руководитель:

Кубарева Елена Александровна, доктор химических наук, профессор, главный научный сотрудник Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Официальные оппоненты:

Туницкая Вера Леонидовна, доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Кульбачинский Андрей Владимирович, доктор биологических наук, заведующий Лабораторией молекулярной генетики микроорганизмов Отдела молекулярной генетики клетки Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук

Ведущая организация:

Лаборатория биохимии нуклеиновых кислот Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук

Защита состоится 17 июня 2014 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ, НИИ ФХБ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова и на сайте Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова www.chern.msu.ru.

Автореферат разослан а мая 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции является одним из важнейших механизмов в клетках прокариот. До недавнего времени считалось, что данный процесс контролируется в первую очередь факторами белковой природы, а также зависит от особенностей конкретных промоторов ДНК. Неожиданным стало открытие нового класса малых некодирующих РНК (нкРНК), так называемых 6S РНК, которые способны ингибировать транскрипцию за счет непосредственного связывания с холоферментом РНК-полимеразы (РНКП) и блокирования её активного центра (Wassarman et al., 2000). Так, в Е. coli в экспоненциальной фазе роста клеток 6S РНК практически отсутствует, в то время как при переходе в стационарную фазу уровень экспрессии 6S РНК резко возрастает, что приводит к ингибированию транскрипции большинства генов «домашнего хозяйства». Уникальной особенностью 6S РНК является возможность синтеза на её матрице коротких транскриптов - пРНК (от англ. «product RNA», pRNA), которые остаются связанными с 6S РНК благодаря комплементационным взаимодействиям. Образующийся комплекс 6S РНКгпРНК теряет сродство к РНКП, «свободный» фермент вновь способен вести транскрипцию, a 6S РНК и пРНК подвергаются деградации (Wassarman et al., 2006).

Кроме Е. coli наличие гена 6S РНК (ssrS) предполагается более чем в 130-ти видах бактерий (Barrick et al., 2005), но только для 16-ти их них этот факт подтвержден экспериментально. Немногочисленные данные, известные для 6S РНК из этих бактериальных систем, свидетельствуют о возможном отличии свойств и функций их 6S РНК от 6S РНК Е. coli. Наиболее интересным фактом является существование двух различных 6S РНК (6S-1 и 6S-2) в грамположительной бактерии Bacillus subtilis. 6S-1 РНК экспрессируется, главным образом, в стационарной фазе роста клеток, а максимальная экспрессия 6S-2 РНК приходится на экспоненциальную фазу (Barrick et al., 2005). Причины «появления» дополнительной 6S-2 РНК в условиях активного роста и деления клеток, а также её свойства и функции неизвестны и требуют детального исследования.

Аналоги 6S РНК были найдены и в клетках высших эукариот - Alu РНК человека и В2 РНК мыши. Общность функциональных свойств этих нкРНК позволяет использовать 6S РНК В. subtilis в качестве модели для понимания основ нкРНК-зависимых механизмов регуляции транскрипции.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось сравнение свойств и функций малых некодирующих 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis.

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:

■ исследовать способность 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis ингибировать транскрипцию in vitro,

■ сравнить сродство 6S-1 и 6S-2 РНК к РНКП В. subtilis,

■ установить возможность синтеза РНК-полимеразой коротких транскриптов (пРНК) на матрице 6S-1 и 6S-2 РНК,

■ изучить влияние 6S-1 и 6S-2 РНК на экспрессию белков В. subtilis in vivo.

Научная новизна и практическая значимость работы. В рамках исследования

впервые было показано, что 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis способны специфически ингибировать in vitro транскрипцию модельных промоторов различных генов В. subtilis. Все выбранные промоторы являлись аА-зависимыми' и содержали в стартовой позиции (+1) остаток dG или dA. Вне зависимости от наличия/отсутствия динуклеотида d(TG) в -12 положении и отличий -10 и -35 промоторных элементов от консенсусных последовательностей обе 6S РНК демонстрировали примерно одинаковую эффективность ингибирования транскрипции. Показано, что каждая из 6S РНК образует только один специфический комплекс с холоферментом РНКП В. subtilis, стабильный при добавлении гепарина как конкурирующего агента за связывание с ферментом. Определены константы диссоциации комплексов 6S-1 и 6S-2 РНК с РНКП. Их значения (/¡Td(6S-l РНК:РНКП) = 460 ± 50 нМ и Ä"d(6S-2 РНК:РНКП) = 400 ± 60 нМ) свидетельствуют о примерно одинаковом сродстве обеих 6S РНК к ферменту.

Впервые в условиях in vitro продемонстрирован синтез РНК-полимеразой коротких транскриптов на матрице 6S-1 и 6S-2 РНК и определены нуклеотидные последовательности образующихся пРНК. Транскрипция nPHKós-i начинается с остатка С40 в 6S-1 РНК, длина преобладающих транскриптов составляет 14 нуклеотидных остатков (и.о.). Стартовым нуклеотидом в 6S-2 РНК является остаток U41, наиболее эффективно синтезируются 13-16-звенные nPHKés-2- В случае 6S-2 РНК зафиксированы и более протяженные транскрипты длиной до 26 н.о. Обнаружено, что эффективность их синтеза прямо пропорциональна концентрации аденозинтрифосфата (АТР).

Как nPHKös-i, так и nPHKes-2 образуют комплексы с комплементарной 6S РНК. Установлено, что длина пРНК играет ключевую роль при формировании дуплекса с 6S РНК и блокировании доступа к ней РНКП. Только 14-звенная nPHK6s-i может образовывать стабильный комплекс с 6S-1 РНК, с уменьшением длины транскриптов стабильность комплексов резко падает. В случае 6S-2 РНК только комплексы с олигорибонуклеотидами длиной 20 н.о. не подвергаются диссоциации в присутствии РНКП. Вероятно, это связано с большим числом остатков А и U в nPHKés-2 по сравнению с nPHKes-i.

Изучено влияние делеций генов bsrA или/и bsrB (кодирующих 6S-1 и 6S-2 РНК, соответственно) и изменения их локализации в геноме В. subtilis на жизнеспособность и скорость роста клеток. Только клеточная линия с делецией обоих генов демонстрировала замедление скорости роста при переходе из экспоненциальной в стационарную фазу роста клеток. В результате анализа полных протеомов мутантных

1 Субъединица о* РНКП В. subtilis является гомологом с70-субъединицы РНКП Е. coli.

клеточных линий в сравнении с клетками дикого типа установлено, что 6S-1 и 6S-2 РНК оказывают существенное влияние на экспрессию многих белков. Методом масс-спектрометрии MALDI-TOF идентифицирован ряд белков, экспрессия которых подавляется в присутствии обеих 6S РНК (AhpC, KatA, Mdh, MntA, RplJ, SufC, TpiA, YvyD) или только 6S-2 РНК (AcoB, GapA и PyrG).

Полученные в настоящей работе данные о свойствах 6S РНК расширяют знания о принципах регуляции транскрипции. Результаты исследования могут быть использованы для объяснения механизмов взаимодействия эукариотических некодирующих РНК с РНК-полимеразой.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в международных периодических изданиях. Результаты были представлены на рабочих совещаниях «Enzymes and enzyme complexes acting on nucleic acids» (Вильнюс, Литва, май 2010), «Global and mechanistic approaches in nucleic acid biology» (Санкт-Петербург, Россия, сентябрь 2013) и отчетной конференции «Enzymes and multienzyme complexes acting on nucleic acids»» (Гиссен, Германия, сентябрь 2010), проводимых в рамках международной программы РФФИ-ННИО «Международные исследовательские группы с участием молодых ученых»; на 3-ей конференции «International Giessen Graduate School for the Life Sciences» (Гиссен, Германия, сентябрь 2010), 6-ом симпозиуме «Nucleic Acids Chemistry and Biology» (Кембридж, Великобритания, сентябрь 2011), рабочем совещании «Sensory and regulatory RNAs in prokaryotes»» (Кассель, Германия, сентябрь 2011), конференции «Ломоносов-2013» (Москва, Россия, апрель 2013) и 38-ом конгрессе FEBS «Mechanisms in Biology» (Санкт-Петербург, Россия, июль 2013).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен регуляции транскрипции генов прокариот и эукариот с помощью нкРНК), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 80 рисунками, 14 таблицами и 3 схемами. Библиографический указатель включает в себя 155 цитированных работ.

Работа выполнена при поддержке РФФИ и программы РФФИ-ННИО «Международные исследовательские группы с участием молодых ученых».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Характеристика объектов исследования

Объектами изучения в данной работе являются некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis длиной 190 и 203 и.о., соответственно, впервые выделенные в 2002 г. при иммуносоосаждении с РНКП В. subtilis (Suzuma et al., 2002; Ando et al., 2002). Обе 6S РНК В. subtilis с высокой вероятностью образуют характерную для 6S РНК Е. coli вторичную структуру, представляющую собой нерегулярную двойную спираль с обширным расплетенным участком в центре (TrotochaudWassarman, 2005).

6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis были получены ферментативным синтезом с помощью РНКП фага Т7. В качестве матриц для транскрипции использовали плазмиды, сконструированные на основе вектора pUC18, которые содержали ген bsrA или bsrB (кодирующий 6S-1 или 6S-2 РНК, соответственно) под контролем Т7-промотора.

Гомогенный препарат холофермента аА-РНКП В. subtilis был выделен по методике, разработанной в сотрудничестве с лабораторией проф. М. Салас (Центр молекулярной биологии имени С. Очоа, Автономный университет Мадрида, Испания). Принцип выделения РНКП из клеток дикого типа В. subtilis NA110 основан на различной растворимости целевого белка в присутствии ПЭГ-6000, NaCl и (NH4)2SC>4. Выделение РНКП после двух последовательных циклов осаждения-растворения проводили методом хроматографии низкого давления на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой и ДНК-целлюлозой. Для сравнительной характеристики эффективности транскрипции с модельных промоторов генов В. subtilis использовали препарат холофермента РНКП В. subtilis, содержащий дополнительную последовательность из 10 остатков гистидина на С-конце ß'-субъединицы. Выделение рекомбинантного белка проводили по упрощенной методике, описанной в работе (Anthony et al., 2000), методом аффинной хроматографии на Ni2+-NTA-arapo3e.

Для изучение влияния 6S-1 и 6S-2 РНК на экспрессию белков В. subtilis в условиях in vivo использовали мутантные клеточные линии В. subtilis PY79 с делециями или измененной локализацией генов bsrA и/или brsB, любезно предоставленные проф. Р. Хартманном (Институт фармацевтической химии, Марбургский Университет имени Филиппа, г. Марбург, Германия).

2. Изучение свойств 6S-1 и 6S-2 РНК in vitro 2.1. Комплексообразование 6S-1 и 6S-2 РНК с РНКП

Характерной чертой 6S РНК является специфическое связывание РНКП с образованием стабильного комплекса 6S РНК:РНКП, аналогичного «открытому» комплексу фермента с промотором ДНК. Для проверки способности 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis взаимодействовать с полимеразой изучали комплексообразование полученных Т7-транскрипцией 5'-[32Р]-меченных 6S РНК и холофермента РНКП В. subtilis. Методом «торможения в геле» в неденатурирующих условиях зафиксировано образование в каждом случае единственного комплекса с ферментом, стабильного в присутствии возрастающих избытков гепарина (предотвращающего неспецифические взаимодействия). Сродство 6S-1 и 6S-2 РНК к РНКП оценивали по зависимости эффективности связывания фиксированного количества РНК (100 нМ) от концентрации белка (50-3000 нМ) (рис. 1А). Определены равновесные константы диссоциации (K¿) образующихся комплексов 6S-1 РНЮРНКП (рис. 1Б) и 6S-2 РНК:РНКП. Они имели сравнимые значения (460 ± 50 нМ и 400±60нМ, соответственно) в пределах погрешности эксперимента.

[РНКП], нМ: о ячейки-»

6S-1 РНК:РНКП -

6S-1 РНК-НМЫиЫЫих

12 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14

С 80 X

о. 60

о.

« го / в о/

Кл= 460 ±50 нМ

1000 2000 3000

[РНКП], нМ

Рис. 1. Комплексообразование 68-1 РНК (100 нМ) с холоферментом РНКП (503000 нМ) в присутствии 100 нг/мкл гепарина (дорожки 2-14). Дорожка 1 - исходная 65-1 РНК. (А) Радиоавтограф 5%-ного ПААГ после электрофореза в неденатурирующих условиях. (Б) График зависимости степени образования комплекса 68-1 РНК:РНКП от концентрации РНКП.

2.2. Конкуренция между 6S-1/6S-2 РНК и промоторами ДНК в условиях транскрипции in vitro

Основной функцией 6S РНК является ингибирование транскрипции вследствие

конкуренции с промоторами ДНК за связывание РНКП (схема 1).

с активным центром

Экспоненциальная фаза роста клеток:

46S РНК, T4XNTP

пРНК

6S РНК

У.....Ч Г -N---

-^r-^j-

Высвобождение РНКП, деградация 6S РНК и пРНК

4- - уменьшение

концентрации Т - увеличение концентрации

\

РНКП ^

-35 -ю Транскрипция генов

6S РНК

Синтез пРНК

Схема 1.

i>

\

Стационарная фаза

роста клеток: t6SPHK, 4-4XNTP

ло---

w---

-35 -10 Ингибирование транскрипции многих генов

Выход из стационарной фазы: f 6S РНК, t4xNTP

Обладают ли 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis этой способностью? Была изучена транскрипция in vitro с природных промоторов восьми различных генов: rrnB, ггпО, veg, tuf, argC, appD и cspB В. subtilis и C2 фага <p29 в присутствии [ct-32P]UTP для детекции синтезирующихся транскриптов. В качестве матриц для транскрипции использовали полученные методом ПЦР ДНК-фрагменты длиной 200-400 нуклеотидных пар, содержащие промоторные области того или иного гена. Пять из выбранных промоторов содержат расширенный -10 элемент. Стартовой точкой транскрипции для четырех из восьми промоторов является остаток dA, и для трех -dG2. Промотор гена С2 фага ср29 содержит две альтернативные стартовые точки транскрипции dA (+1 ) и dT (+2). Добавление в реакционную смесь каждой из 6S РНК приводило к заметному ингибированию транскрипции с промоторов всех рассматриваемых генов со сравнимой эффективностью (рис. 2).

А

appD

pï к rrnO r>

TTGATT TAATAT |A > TTGACC TGtTACTAT G

192 н. о. ■

6S-1 РНК__ ___ 6S-2 РНК_ - 1 M — . —— __ РНК РНКазыЕ__ 1 M - ------""

appD

~180n.o.

rrnO

"130 и.о.

1 2 3 4 5

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

В

S5 £

Е loo

60 40 20 0

appD

□ 6S-1 РНК

□ 6S-2 РНК

□ РНК РНКазы Р

ггпО

о?

вг

i

О 0 0,1 0,25 0,5 1 2 о 0,1 0,25 0,5 1 2 и

[РНК],мкМ [РНКЬмкМ

Рис. 2. Сравнительный анализ ингибирования транскрипции с промоторов генов appD и ггпО в присутствии 6S-1 РНК, 6S-2 РНК или РНК РНКазы Р. (А) Организация промоторных областей генов appD и ггпО В. subtilis. Стрелками указаны направления и стартовые точки транскрипции. (Б) Результаты транскрипции in vitro с промоторов генов appD (верхняя панель) и ггпО (нижняя панель). Радиоавтографы 5%-ных ПААГ, содержащих 7 М мочевину. Дорожки 1, 8, 15 -транскрипция в отсутствие нкРНК. Дорожки 2-6, 9-13 и 1620 - различные концентрации (0,1; 0,25; 0,5, 1 и 2 мкМ) 6S-1 РНК, 6S-2 РНК и РНК РНКазы Р, соответственно. Дорожки 7 и 14 - маркер длины РНК (192 и.о., 5'-[32Р]-меченная 6S-1 РНК). (В) Диаграммы ингибирования транскрипции в присутствии возрастающих количеств 6S-1 РНК (голубая), 6S-2PHK (фиолетовая) и РНК РНКазы Р (серая). За 100% принимали выход транскрипта в отсутствие нкРНК.

2 В клетках В. subtilis 56% всех промоторов содержат остаток dA в +1 положении, 38% - dG, 4,5% - dT и 1,5% - dC (Krasny et al, 2008).

Присутствие в реакционной смеси нкРНК рибонуклеазы Р (РНКазы Р) В. subtilis, которая не способна взаимодействовать с РНКП, существенно снижало выход продуктов транскрипции (дорожки 16-20 на рис. 2Б) только при её максимальной концентрации. Таким образом, обе 6S РНК В. subtilis способны специфически ингибировать транскрипцию in vitro.

2.3. Особенности взаимодействия РНКП с 6S-1 и 6S-2 РНК: синтез пРНК

Транскрипция РНК на РНК-матрице нехарактерна для ДНК-зависимой РНК-полимеразы и является исключительной особенностью фермента, проявляемой в случае 6S РНК. Необходимо было проверить возможность транскрипции пРНК на матрицах 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis. Комплексообразование обеих 6S РНК с холоферментом РНКП В. subtilis проводили в присутствии четырех нуклеозидтрифосфатов (4*NTP) и [a-32P]UTP. Продукты транскрипции анализировали методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях (рис. ЗА).

А ^ ^ Б

(£? V > У у ? £ & # $

plVi.Hr: 50 20 - -р1265.2,нг: - - 50 20

jv JV

4? &

И.7-21 и.о.

пРНКк,

пРНК,

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

Рис. 3. Синтез пРНК in vitro. (А) Анализ продуктов транскрипции на матрице 6S-1 РНК (дорожка 3) и 6S-2 РНК (дорожка 4). Финальные концентрации (ф. к.): 1 мкМ РНКП; 1 мкМ 6S РНК; 200 мкМ 4><NTP; 0,5 мкКи [a-32P]UTP. Дорожки 2 и 5 - маркеры длины РНК, 5'-[32Р]-меченные олигорибонуклеотиды длиной 13 н.о. и 12 и.о. Дорожка 1 - реакционная смесь в отсутствие 6S РНК. Радиоавтограф 25%-ного ПААГ после электрофореза в денатурирующих условиях (7 М мочевина). (Б) Результаты блот-гибридизации продуктов транскрипции (ф.к.: 1 мкМ РНКП; 1 мкМ 6S РНК; 200 мкМ 4*NTP) с матрицы 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis (дорожки 5 и 6, соответственно). Дорожки 1-2 и 3-4 - синтетические олигорибонуклеотиды (pl46s-i и pl26S-2), аналоги nPHK6s-i и nPHK6s-2 длиной 14 н.о. и 12 н.о. (положительные контроли). Последовательности зондов к nPHKes-i и nPHK6s-2, соответственно: 5'-DIG-d(AGTTrrGilCCGA4C)-3' и 5,-DIG-d(G7TTrAACCT7T)-3', где N -остаток LNA, DIG - остаток дигоксигенина.

В случае 6S-1 РНК наблюдали синтез ряда олигорибонуклеотидов длиной до 14-16 н.о., причем транскрипция 14-звенных вариантов nPHKös-i происходила с максимальной эффективностью (рис. ЗА, дорожка 3). В случае 6S-2 РНК был зафиксирован синтез транскриптов длиной до 16 н.о. и более. Максимальный выход транскрипции наблюдали для 13-16-звенных продуктов (рис. ЗА, дорожка 4). Для определения природы стартового нуклеотида в 6S-1 и 6S-2 РНК аналогичные эксперименты проводили в присутствии [у-32Р]АТР и [y-32P]GTP, поскольку только первый из встраиваемых РНК-полимеразой NTP не гидролизуется с отщеплением пирофосфата с 5'-конца. Было установлено, что синтез пРНК на 6S-1 РНК начинается с остатка G, а синтез пРНК на 6S-2 РНК - с остатка А. Для определения нуклеотидных последовательностей пРНК транскрипцию проводили в присутствии различных [а-32Р]-меченных нуклеозидтрифосфатов, при этом длина первого из детектируемых транскриптов указывала на положение встраиваемого нуклеотида в цепи полноразмерной пРНК. Таким образом были выяснены позиции первых с 5'-конца остатков A, U, G и С в последовательностях nPHK6s-i и nPHK6s-2. В обоих случаях только один комплементарный участок в каждой из 6S РНК соответствовал установленному расположению нуклеотидов относительно друг друга. Первичная структура nPHK6s-i и пРНКбв-г была также подтверждена методом блот-гибридизации в варианте Нозерн (рис. ЗБ). В качестве зондов к nPHKes-i и nPHK6s-2 использовали синтетические олигодезоксирибонуклеотиды заданной нуклеотидной последовательности с включениями остатков ковалентно замкнутых нуклеозидов (LNA, «locked nucleic acid»). В результате проведенных экспериментов было выяснено, что транскрипция обеих пРНК начинается внутри центральной петли и продолжается в сторону 5'-конца 6S-1 или 6S-2 РНК (схема 2), аналогично тому, как это было обнаружено для 6S РНК Е. coli (Wassarman et al., 2006). Нуклеотидные последовательности nPHK6s-i и nPHK6s-2 содержат два идентичных участка 5'-GGU-3' и 5'-AAAACU-3', разделенных одним н.о.

5'-GUUCGGUCAAAACU-3' uu"uu

^ч. и и

пРНК #/ X

А ГА К_____At 9. А , А- -О CA

5 .AGU-CUGAU GUGUU GUJGUA CCD GliJUUGA ГС ÖGG ßГСС «JUUJUAAAU GUA CCUCUUU U

ШИШ Uli IIIIII III illlll! Iii III IIIIHI III UM и

MUOSGOJUUA C/>CGG CAACOU <«A CAAAACU, GG. CCC CGGO GAAAAUUUA С AU Ü6AGAAA

i-U U С А AA и О А А А О.А U А U _ г. С

rAA V Л- АС G С,

6S-1 РНК В. subtilis

5'-AAAGGUUAAAACUUAA-3'

ä.s'\ nPHKyJ *

и ее avil' cclac uaxx>gcoauUCU uaa !vcwü7mccu aggcacujuua сл>ссс aucuca ^cuc"

u It III Hill -Ii • IUI S • III Hill in II III • UM I I им и

и crux» гглш гаагг, если U-C, an иглмд uugg сс.с сам.г,и nur, аcur, gсаг, g

и С с с/. VC CU ии а а С С G CA а с

с A u G с AG

a A G и А

и и

\о'с 6S-2 РНК ß. subtilis

Схема 2.

Главным свойством пРНК является способность к образованию комплекса с 68 РНК и последующая потеря сродства такого комплекса к РНКП (схема 1). Возможность формирования комплексов 68 РНЮпРНК оценивали, анализируя взаимодействие 5'-[32Р]-меченных 6Б РНК с РНКП в присутствии четырех ЭТР методом гель-электрофореза в неденатурирующих условиях. На рис. 4 приведен результат эксперимента с 68-2 РНК. Аналогичные результаты был получены в случае 68-1 РНК. Для предотвращения неспецифических взаимодействий 68 РНК и РНКП в реакционную смесь добавляли гепарин (40 нг/мкл). В отсутствие 1ЧТР детектировались только комплексы 68 РНК:РНКП и «свободные» 68 РНК (рис. 4, дорожка 1). При добавлении четырех 1ЧТР в концентрации 200 мкМ каждого наблюдали появление дополнительной радиоактивной зоны, характеризующейся меньшей подвижностью в геле по сравнению со «свободными» 68 РНК (рис. 4, дорожки 2-7). По скорости миграции комплекс, образующийся при синтезе пРНК на матрице 68 РНК соответствовал контрольному, «искусственно» полученному комплексу с 5'-[32Р]-меченным синтетическим олигорибонуклеотидом - аналогом пРНК (рис. 4, дорожка 9).

+ NTP

Время, мин: о N^v^<о?'

65-2РНК:РНКП тттт ътшт тт т.;

6S-2 РНК:пРНК -6S-2 РНК -

/

6S РНК:пРНК

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 4. Анализ комплексообразования 5'-[32Р]-меченной 6S-2 РНК с холоферментом РНКП в присутствии 4><NTP (200 мкМ каждого). Дорожка 1 - комплексообразование РНКП (2 мкМ) с 6S-2 РНК (1 мкМ) в отсутствие NTP после инкубации при 37°С в течение 30 мин. Дорожки 2-7 - комплексообразование РНКП (2 мкМ) с 6S-2 РНК (1 мкМ) в присутствии 4><NTP после инкубации при 37°С в течение 10-180 мин. Дорожка 8 - исходная 6S-2 РНК. Дорожка 9 - комплекс 6S-2 РНК (1 мкМ) с 5'-[32Р]-меченным синтетическим аналогом nPHK6S-2 (1 мкМ) длиной 15 н.о. (р 156S-2). Радиоавтограф 7,5%-ного ПААГ после электрофореза в неденатурирующих условиях.

Через 180 мин после начала транскрипции большая часть «свободной» 6S РНК оказывается в комплексе с пРНК (рис. 4, дорожка 7), в то же время степень связывания 6S РНК с РНКП несколько уменьшается (-80%) по сравнению с исходной степенью связывания до добавления 4xNTP (рис. 4, дорожка 1). Это свидетельствует о частичном высвобождении РНКП из комплекса с 6S-2 РНК после синтеза пРНК. Незначительная степень вытеснения РНКП из её комплекса с 6S РНК может быть связана с нестабильностью комплексов 6S РНК:пРНК из-за недостаточной длины

пРНК. Для проверки этой гипотезы было изучено комплексообразование РНКП с предварительно сформированными дуплексами между 68-1 или 6в-2 РНК и синтетическими олигорибонуклеотидами - аналогами пРНКбз-1 и пРНКбэ-г. В случае 68-1 РНК было показано, что образование дуплекса 68-1 РНК:р14б8-1 практически полностью предотвращает связывание РНКП с 68-1 РНК (рис. 5А). Выход комплекса 68-1 РНК:РНКП в данном случае составляет меньше 3%. В то же время более короткие пРНК68-1 (12 и 13 н.о.) не способны также эффективно препятствовать образованию комплекса 68-1 РНК:РНКП. Вероятно, это связано с тем, что даже при 10-кратном избытке этих олигорибонуклеотидов не удалось добиться их 100%-ного связывания с 68-1 РНК с образованием дуплексов. По-видимому, в данном случае при добавлении РНКП фермент связывал свободную 68-1 РНК. Синтетическая 20-звенная пРНКбэ-! полностью исключала возможность взаимодействия РНКП с 68-1 РНК.

А

Длина пРНК6ы

с г ю

s ¥ О £ 60

ч: i:

S ? 40 2 t

6S PHK:nPHK

Длина пРНКБ5_2

ft

/* О О О л*

Рис.

предварительно

5. Анализ взаимодействия холофермента РНКП сформированными дуплексами между 6S-1 РНК или 6S-2 РНК и синтетическими пРНК различной длины. Диаграммы относительного выхода комплексов 6S-1 РНК:РНКП (А) и 6S-2 РНК:РНКП (Б) (за 100% принимали выход комплекса в отсутствие пРНК). Серым цветом отмечены некомплементарные для 6S РНК олигорибонуклеотиды.

Несмотря на 100%-ную эффективность связывания 5'-[32Р]-меченной 6S-2 РНК с 15-звенной и 16-звенной nPHK6s-2 (pl56s-2 и pl66s-2), РНКП способна образовывать комплекс с 6S-2 РНК с эффективностью до -30% (рис. 5Б). Такой результат можно было бы объяснить способностью РНКП связывать дуплекс 6S-2 PHK:pl5es-2 или дуплекс 6S-2 PHK:pl6is-2. Однако в контрольных экспериментах при использовании 5'-[32Р]-меченной 15-звенной nPHK6s-2 «тройной» комплекс PHKn:6S-2 PHK:pl56s-2 не детектировался. Это означает, что РНКП связывала 6S-2 РНК после её диссоциации из комплекса 6S-2 РНК:пРНК. 20-Звенный олигорибонуклеотид - аналог nPHKes-2 -практически полностью предотвращал взаимодействие фермента с 6S-2 РНК (рис. 5Б).

Исходя из полученных результатов, можно утверждать, что основные продукты транскрипции in vitro с матрицы 6S-2 РНК (13-16 н.о.) являются нефункциональными, т.к. при взаимодействии с 6S-2 РНК не могут предотвратить её связывание с РНКП. Однако, это возможно в случае синтеза 20-звенной пРНКбэ-г, по своим свойствам аналогичной 14-звенной nPHK6s-i. Следует ожидать, что более длинные варианты

nPHK6s-2 образуют еще более стабильные комплексы с 6S-2 и тоже препятствуют взаимодействию молекулы с РНКП. Тем не менее, в экспериментах in vitro выход nPHK6S-2 длиной больше 16 н.о. составляет менее ~3% от общего количества nPHK6s-2 разной длины (рис. ЗА). Мы предположили, что в определенных условиях (возможно, имеющих место in vivo) транскрипция пРНКбй-г может «сдвигаться» в сторону более длинных транскриптов. В первую очередь это может происходить при изменении концентрации нуклеозидтрифосфатов, главным образом АТР и GTP. Известно, что изменение их концентраций при переходе клеток В. sabtilis из экспоненциальной в стационарную фазу роста (понижение уровня GTP и возрастание АТР) вызывает существенные изменения в транскриптоме за счет активации транскрипции с альтернативных промоторов (Krasny et al., 2008). Для изучения зависимости выхода пРНК от концентрации АТР или GTP (Сатр или Cgtp) эксперименты по транскрипции in vitro с матрицы 6S-1 или 6S-2 РНК проводили, варьируя концентрацию этих нуклеозидтрифосфатов от 10 мкМ до 2 мМ в присутствии остальных трех NTP (200 мкМ каждого). Эффективность синтеза nPHKós-i практически не зависела от концентрации как GTP, так и АТР, хотя при Сатр = 1-2 мМ увеличивался выход 15- и 16-звенных nPHKes-i. Другая ситуация наблюдалась в случае 6S-2 РНК. Несмотря на то, что nPHK6s-2 содержат только два остатка G (в положениях 4 и 5), эффективность их синтеза возрастает при увеличении Cgtp и достигает максимума при 500 мкМ. При этом соотношение продуктов транскрипции разной длины не изменяется. Наиболее значимым результатом является обнаружение зависимости эффективности синтеза nPHK6s-2 от концентрации АТР. При Сатр = 10-20 мкМ транскрипция с матрицы 6S-2 РНК невозможна и лишь в присутствии 200-500 мкМ АТР выход транскрипции 13-16-звенных nPHKss-2 становится сравнимым с выходом nPHK6s-i с матрицы 6S-1 РНК. Дальнейшее увеличение концентрации АТР (1-2 мМ) приводит к заметному увеличению эффективности синтеза протяженных транскриптов длиной 17-18 и 2326 н.о. (рис. 6). Отметим, что транскрипция с матрицы 6S-2 РНК начинается с трех подряд остатков А, а полноразмерные пРНКбв-2 (13-26 н.о.) содержат в среднем 55% остатков А от общего числа нуклеотидов (схема 2).

Таким образом, в ходе изучения свойств 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis в условиях in vitro впервые удалось установить факт синтеза пРНК на обеих 6S РНК и определить нуклеотидные последовательности nPHKós-i и nPHK6s-2. Продемонстрирована способность синтезированных пРНК образовывать дуплексы с соответствующей 6S РНК и вытеснять РНКП из её комплекса с 6S РНК. Обнаружено важное отличие в функционировании 6S-1 и 6S-2 РНК. Преобладающий продукт транскрипции с матрицы 6S-1 РНК - 14-звенная nPHK6s-i - образует стабильный комплекс с 6S-1 РНК и блокирует доступ к ней РНК-полимеразы. Длина преобладающих при транскрипции nPHK6s-2 (13-16 н.о.) недостаточна для эффективного комплексообразования с 6S-2 РНК, а синтез более протяженных продуктов транскрипции, формирующих прочный дуплекс с 6S-2 РНК, незначителен и, вероятно, требует особых условий. Одним из

таких условий может являться высокая концентрация АТР, стимулирующая синтез пРНКбв-2 длиной 23-26 н.о. Тем не менее, обе 6S РНК со сравнимой эффективностью ингибируют транскрипционную активность РНКП.

~~[ДГР]. МКМ:|

15 н.о.-

3=;=: 23-26 н.о. ^j-15-18 н.о. I -12 н.о.

123456789 10

Рис. 6. Зависимость синтеза пРНК на матрице 6S-2 РНК от концентрации АТР. Ф. к.: 1 мкМ РНКП; 1 мкМ 6S-2 РНК; 100 нг/мкл гепарина; 200 мкМ каждого из СТР, GTP, UTP; 0,5 мкКи [a-32P]UTP. Дорожки 1 и 10 - маркеры длины РНК (М-15 и М-12), 5'-[32Р]-меченные олигорибонуклеотиды pl56S-2 и pl2ós-2. Дорожки 2-9 - транскрипция nPHKüs-2 при возрастающей концентрации АТР (10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 и 2000 мкМ, соответственно). Радиоавтограф 25%-ного ПААГ после электрофореза в денатурирующих условиях (7 М мочевина).

3. Исследование роли 6S-1 и 6S-2 РНК in vivo

На сегодняшний день существует крайне мало данных о физиологической роли 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis in vivo. Показано, что делеции генов bsrA и bsrB не приводят к существенным изменениям роста и жизнеспособности клеток В. subtilis (Suzuma et al., 2002; Cavanagh et al., 2011). Для выяснения биологической роли 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis нужно было установить, влияет ли их отсутствие на экспрессию клеточных белков. Кроме того, необходимо было подтвердить факт синтеза РНК-полимеразой пРНК с матриц 6S-1 и 6S-2 РНК в условиях in vivo.

Для проведения исследований использовали клеточные линии В. subtilis PY79 с делециями генов bsrA и/или brsB. Из клеток с двойным нокаутом (AbrsAB) были получены штаммы с измененной локализацией генов bsrA или brsB: AbrsAB+A и AbrsAB+B3. Таким образом штаммы AbrsAB+A и AbrsAB+B содержали «комплемент» гена bsrA или brsB. Нами показано, что проведенные манипуляции с геномом

3 Инсерции соответствующих фрагментов ДНК проводили в локус атуЕ, кодирующий а-амилазу и не являющийся необходимым для жизнедеятельности В. виЬИШ.

В. subtilis практически не влияют на жизнеспособность и скорость роста клеток. Различия значений оптической плотности клеточных культур в течение 48 ч выращивания являются сравнимыми в пределах погрешности измерения. Только клетки с двойным нокаутом генов bsrA и brsB замедляют скорость роста на стадии перехода из экспоненциальной в стационарную фазу.

3.1. Идентификация nPHKes 1 и nPHKes-2 В. subtilis in vivo

На первом этапе были проанализированы уровни экспрессии 6S-1 и 6S-2 РНК на различных стадиях клеточного роста В. subtilis PY79 (дикий тип). Для этого клетки культивировали в богатой питательной среде в течение 48 ч, отбирая апиквоты для выделения общей РНК через 3, 4,5, 6, 10, 24, 36 и 48 ч после инокуляции (рис. 7А). Затем проводили блот-гибридизацию общей РНК, выделенной из клеток в различные промежутки времени, с зондами к 6S-1 и 6S-2 РНК, а также с зондом к 5S РНК в качестве РНК сравнения.

г 14

ÍS 12

S ю

С 8

OI

1 б

§ 4

* 2

А 0

□ 6S-1 РНК

1 6S-2 РНК

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Время, ч

a b cdefg©

Точка отбора клеточной культуры

Рис. 7. Анализ уровня экспрессии 68-1 и 68-2 РНК в клетках В. впЬЧШ РУ79. (А) Кривая клеточного роста В. зиЫШз РУ79. Черными точками и буквами (а^) отмечено время отбора апиквот клеточной культуры для выделения общей РНК: 3, 4,5, 6, 10, 24, 36 и 48 ч, соответственно. Буквой г в круге отмечена аликвота клеточной культуры, использовавшаяся для моделирования стадии выхода из стационарной фазы роста клеток4. (Б) Диаграмма уровней экспрессии 68-1 и 68-2 РНК В. эиЫШэ РУ79 (на основе данных блот-гибридизации общей РНК (3 мкг) с зондами к 68-1 и 68-2 РНК), нормированных по количеству 58 РНК. За единицу принимали минимальную концентрацию 6в РНК (в точке а для 68-1 РНК и в точке g для 68-2 РНК).

Синтез 68-1 РНК аккумулируется в поздней экспоненциальной - ранней стационарной фазах роста клеток5. Максимальная концентрация 68-2 РНК, наоборот, наблюдается в средней экспоненциальной фазе роста клеток, затем снижается в ~ 7 раз при переходе в позднюю стационарную фазу, а при увеличении содержания питательных веществ в культуральной среде и выходе клеток из стационарной фазы

4 Аликвоту клеточной культуры, отобранную после 24 ч выращивания, разбавляли в соотношении 1:5 свежей питательной средой и инкубировали в течение 5 мин, а затем проводили выделение общей РНК (точка г).

5 После 24 ч культивации клеток зафиксирована сильная деградация 68-1 РНК (до 50%), затрудняющая оценку суммарного количества этой РНК.

вновь повышается (рис. 7Б). Те же самые образцы общей РНК были проанализированы методом блот-гибридизации с зондами к пРНКб8-1 и пРНКвз-г. В случае 68-1 РНК удалось детектировать слабые сигналы пРНК на протяжении практически всей стационарной фазы роста клеток, а максимальная концентрация пРНКбб-1 была зафиксирована на стадии выхода из стационарной фазы (рис. 8А). А

Ь с d е f е ®

пРНКо

р\79[\мт)

ДЬбгА

I

ДЬбгАВ+В

В

аЬсе)е?§®

Тонка отбора клеточной культуры

ф1 а Ь с с1 е fg®

abcdefg®

Точка отбора клеточной культуры

<Г а

пРНКс

пРНК6

ь

о-.г

ДЬзгА ДЬбгАВ+В

Рис. 8. Анализ наличия пРНКбв-! и пРНКбэ-г в клетках В. тЬНШ. (А) Результаты блот-гибридизации общей РНК (10 мкг), выделенной на различных стадиях роста В. .^иЫШ.ч РУ79, с зондом к пРНКб5-1. В качестве положительного контроля использовали синтетическую пРНКб5-1 длиной 14 н.о. (р14бз-1, 0,5 нг). (Б) Диаграммы уровней экспрессии 68-2 РНК в клетках АЬзгА и АЬ$гАВ+В (нормированы по концентрации 58 РНК) в промежутки времени, соответствующие точкам отбора клеточной культуры (см. рис. 7). За единицу принимали концентрацию 65-2 РНК в точке g. (В) Результаты блот-гибридизации общей РНК (10 мкг), выделенной на различных стадиях роста клеток АЬзгА, АЬягАВ+В с зондом против пРНКбэ-з. В качестве положительного контроля использовали синтетическую пРНКб$-2 длиной 15 н.о. (р15б$-2, 0,5 нг).

В случае 68-2 РНК статистически значимых сигналов детектировать не удалось. Мы предположили, что более эффективный синтез пРНКбэ-г может происходить в мутантных клеточных линиях АЪзгА и АЬзгАВ+В, поскольку в отсутствие 68-1 РНК концентрация 68-2 РНК оставалась высокой на протяжении всего времени культивирования клеток (рис. 8Б). Результаты блот-гибридизации общей РНК, выделенной из клеточных линий АЬягА и АЬягАВ+В, с зондом к пРНКбэ-г приведены на рис. 8В. Сигналы, обнаруженные в клеточной линии АЬягАВ+В с «комплементом» гена ¿ш'Б, достаточно интенсивны и могут рассматриваться как экспериментальное

свидетельство транскрипции пРНК с матрицы 6S-2 РНК in vivo. Однако длина детектируемых пРНК была несколько больше ожидаемой. Можно предположить, что они соответствуют протяженным nPHKös-2 длиной 23-26 н.о. В клетках дикого типа аналогичные сигналы не были обнаружены, поэтому вопрос об условиях, в которых синтез nPHK6s-2 происходит in vivo, остается открытым.

3.2. Влияние 6S-1 и 6S-2 РНК на экспрессию белков В. subtilis

Для установления роли 6S-1 и 6S-2 РНК в экспрессии белков В. subtilis был проведен сравнительный протеомный анализ клеточных линий, содержащих делеции генов bsrA или bsrB с клетками дикого типа. Отбор аликвот клеточных культур для выделения общего белка проводили после достижения значений оптической плотности Абоо ~ 1 O.E. (после ~ 3 ч от начала культивирования, средняя экспоненциальная фаза роста) и Абоо~ 4 O.E. (после ~ 8 ч от начала культивирования, ранняя стационарная фаза роста) (рис. 7). В белки из сравниваемых клеточных линий вводили лизин-специфичные флуоресцентные красители - гидроксисукцинимидные эфиры СуЗ (Хисп = 570 нм, зеленый) и Су5 (А,иСп = 670 нм, красный). Окрашенные образцы белков смешивали в эквимолярном соотношении и полученную смесь анализировали методом двумерного гель-электрофореза. В первом направлении белки разделяли методом изоэлектрического фокусирования. Во втором направлении проводили электрофорез в денатурирующих условиях, разделяя белки по молекулярным массам. На изображении геля белкам, содержащимся в сравниваемых образцах в равных количествах, соответствуют зоны желтого цвета за счет наложения флуоресценции СуЗ (зеленый цвет) и Су5 (красный цвет). Соответственно, белки, преобладающие в одном из образцов, визуализируются в виде зон красного или зеленого цвета.

Максимальные изменения протеома при делеции гена bsrB были зафиксированы в экспоненциальной фазе роста клеток - появлялось большое количество красных зон на геле, соответствующих белкам, экспрессия которых должна ингибироваться посредством 6S-2 РНК (рис. 9А). Методом масс-спектрометрии MALDI-TOF было идентифицировано 11 таких белков: АсоВ, AhpC, GapA, KatA, Mdh, MntA, RplJ, PyrG, SufC, TpiA и YvyD (табл. 1 и 2).

Таблица 1. Белки, идентифицированные методом масс-спектрометрии МАЬ01-Т0Р, экспрессия которых регулируется только 68-2 РНК.

Белок Предполагаемая функция

АсоВ - ацетоиндегидрогеназа Превращение ацетоина в диметилглиоксаль

GapA - глицерапьдегидфосфат-дегидрогеназа Окисление D-глицеральдегид-З-фосфата (гликолиз)

PyrG - СТР-синтетаза Синтез СТР

рн

10

\Л/Т/ ЛЬзгВ

| . ЧМ I /

•

♦ ^ * -

РугС

т .

А» •• •# . «

▼ - ♦ -

А>с -.Г - V

V.» . У\Л(0 МпЛ

ф ---- Яри

ул/Т/ЛЬЯГД

♦ •

• -»

/ Г*: •• •*

БиГС • • ' •

\ Г у

АЬрС Д Тр1А МША

Г * .

3 - рН -► 10

Рис. 9. Сравнительный протеомный анализ белковых фракций, выделенных из клеточных линий В. зиЫШй дикого типа (РУ79) и мутантного штамма АЬягВ в экспоненциальной фазе роста клеток (А) или мутантного штамма АЬзгА в стационарной фазе роста клеток (Б). Зоны красного и зеленого цвета на двумерном геле соответствуют белкам, уровень экспрессии которых, соответственно, увеличивается или уменьшается, при делеции гена ЬэгА или ЬзгВ. Идентифицированные с помощью масс-спектрометрии МАЬ01-Т0Р белки подписаны. Красным шрифтом выделены названия белков, экспрессия которых ингибируется обеими РНК, белым - только 68-2 РНК.

Таблица 2. Белки, идентифицированные методом масс-епектрометрии МА1Л)1-ТОР, экспрессия которых регулируется как 68-1, так и 6Э-2 РНК.

Белок Предполагаемая функция

AhpC - алкилгидропероксидредуктаза (малая субъединица) Восстановление Н2О2 в условиях окислительного стресса клетки

KatA - вегетативная каталаза Разложение Н2О2 в условиях окислительного стресса клетки

Mdh - малатдегидрогеназа Окисление маната в оксалоацетат (цикл Кребса)

MntA - Мп2+-связывающий липопротеин, АВС-транспортер Транспорт Мп2+ через клеточную мембрану

RpIJ - белок L10 508-субчастицы рибосомы Участие в клеточном ответе на холодовой шок и солевой стресс, структурная функция

SufC - АТРаза в составе клеточного аппарата мобилизации серы Гидролиз АТР, мобилизация железа и серы в условиях окислительного стресса клетки

TpiA - триозофосфатизомераза Превращение D-глицеральдегид-З-фосфата в дигидроксиацетонфосфат (гликолиз)

YvyD - ассоциированный с рибосомой белок модуляции транскрипционного фактора aL Ингибирование синтеза oL в условиях аминокислотного голодания

В тех же условиях при делеции гена ЬэгА существенных изменений зафиксировано не было. Такой результат был ожидаем, поскольку концентрация 68-1 РНК в экспоненциальной фазе роста клеток низка. Тем не менее, в отсутствие 68-1 РНК в значительной степени увеличивалась экспрессия как минимум 3 белков: АЬрС, Яри и Ка1А. Уровень экспрессии этих белков повышался и в отсутствие 68-2 РНК (рис. 9А).

Более заметные изменения в протеоме клеток ЛЬягА были зафиксированы в стационарной фазе роста, однако наблюдаемый эффект был слабее предполагаемого (рис. 9Б). Частично это может быть связано с глобальным уменьшением синтеза белков при переходе в стационарную фазу роста клеток и, как следствие, с меньшей интенсивностью сигналов флуоресценции. Несмотря на то, что концентрация 68-2 РНК в стационарной фазе роста клеток относительно низка, делеция гена Ь.чгВ в данном случае по-прежнему вызывала заметные изменения в клеточном протеоме. Экспрессия некоторых белков в стационарной фазе увеличивалась как в отсутствие 68-1 РНК, так и в отсутствие 68-2 РНК. Методом масс-спектрометрии МАЬ01-Т0Р были идентифицированы два таких белка - Мс1И и УууЭ. Некоторые белки эффективнее экспрессировались в отсутствие только 68-1 РНК (АИрС, 8иРС, Тр1А, МША) или только 68-2 РНК (Ка1А, варА). Входе протеомного анализа клеток АЬ$гАВ по сравнению с клетками дикого типа наблюдали «суммарный» эффект делеций ЬбгА и (¡¡ЬВ, обусловленный одновременным возрастанием экспрессии белков, зависящей от присутствия как 68-1, так и 68-2 РНК.

Таким образом, в результате сравнения общих протеомов штаммов AbsrA и AbsrB и клеток дикого типа было установлено, что обе 6S РНК влияют на экспрессию генов в В. subtilis. Большее количество белков с измененным уровнем экспрессии было зафиксировано в случае делеции гена bsrB, кодирующего 6S-2 РНК. Ингибирующее влияние 6S-1 РНК на биосинтез белков оказалось менее заметным. Анализируя функции идентифицированных белков (табл. 1 и 2), можно сказать, что большинство из них участвуют в процессах метаболизма или адаптации клетки к стрессовым условиям, то есть отсутствуют в клетке в «спокойном» состоянии. Таким образом, нами впервые была установлена физиологическая роль 6S-1 РНК и 6S-2 РНК как регуляторов экспрессии белков.

ВЫВОДЫ

1. Впервые продемонстрирована способность 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis ингибировать in vitro транскрипцию с модельных промоторов генов rrnB, rrnO, veg, tuf, argC, appD и cspB В. subtilis и C2 фага <p29. Установлено, что обе 6S РНК проявляют сравнимую эффективность ингибирования транскрипции вне зависимости от нуклеотидных последовательностей промоторных элементов выбранных генов и природы стартового нуклеотида.

2. Разработана методика выделения холофермента РНК-полимеразы (РНКП) В. subtilis, показано его специфическое взаимодействие как с 6S-1, так и с 6S-2 РНК В. subtilis. Константы диссоциации комплексов 6S-1 РНК:РНКП и 6S-2 РНК:РНКП имеют сопоставимые значения.

3. Впервые продемонстрирован in vitro синтез коротких фрагментов РНК (пРНК) на 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis в качестве матриц для транскрипции и определены их нуклеотидные последовательности. Длина преобладающих пРНК-транскриптов составляет 14 н.о. для nPHKes-i и 13-16 н.о. для nPHKes-2. В случае 6S-2 РНК возможен синтез длинных транскриптов до 26 н.о., эффективность которого прямо пропорциональна концентрации аденозинтрифосфата.

4. Установлено, что и nPHKes-i, и nPHK6s-2 формируют РНК-РНК дуплексы с 6S-1 и 6S-2 РНК, соответственно. Показано, что 14-звенная nPHKis-i образует стабильный комплекс с 6S-1 РНК и блокирует доступ к ней РНК-полимеразы. В случае 6S-2 РНК сравнимая стабильность комплекса с nPHK6s-2 наблюдается только для 20-звенных транскриптов.

5. Впервые показано, что делеции генов bsrA и bsrB, кодирующих 6S-1 и 6S-2 РНК, влияют на экспрессию белков в клетках В. subtilis. Установлено, что ингибирование экспрессии белков AhpC, KatA, Mdh, MntA, RplJ, SufC, TpiA и YvyD может быть вызвано влиянием как 6S-1, так и 6S-2 РНК. Снижение уровня экспрессии белков АсоВ, GapA и PyrG связано с присутствием в клетке 6S-2 РНК. Идентифицированные белки участвуют в процессах метаболизма, в частности, в условиях окислительного стресса, аминокислотного голодания и холодового шока.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Beckmann В.М., Burenina O.Y.. Hoch P.G., Kubareva E.A., Sharma C.M., Hartmann R.K. In vivo and in vitro analysis of 6S RNA-templated short transcripts in Bacillus subtilis. l/RNA Biology. 2011. V. 8. N 5. P. 839-849.

2. Буренина О.Ю.. Федотова E.A., Рязанова А.Ю., Проценко А.С., Захарова М.В., Карягина А.С., Солонин A.C., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. Особенности регуляции экспрессии генов в системе рестрикции-модификации Ecll8kl. И Acta naturae. 2013. Т. 5. № 2 (17). С. 72-82.

3. Burenina O.Y.. Hoch P.G., Damm К., Salas М., Zatsepin T.S., Lachner M, Oretskaya T.S., Kubareva E.A., Hartmann R.K. Mechanistic comparison of Bacillus subtilis 6S-1 and 6S-2 RNAs - commonalities and differences. // RNA. 2014. V. 20. N 3. P. 348-359.

4. Burenina O.Y.. Beckmann B.M., Kubareva E.A., Hartmann R.K. Investigation of transcription regulation by 6S RNAs from Bacillus subtilis. Abstract book of the Workshop «Enzymes and enzyme complexes acting on nucleic acids» of the International Research Training Group Giessen/Marburg-Moscow, 16.05.10-19.05.10, Vilnius (Lithuania). P. 43.

5. Burenina O.Y.. Beckmann B.M., Kubareva E.A., Hartmann R.K. Investigation of 6S-2 RNA of Bacillus subtilis. Abstract book of the One-site evaluation conference «Enzymes and multienzyme complexes acting on nucleic acids» of the International Research Training Group Giessen/Marburg-Moscow, 21.09.10-22.09.10, Giessen (Germany). P. 58.

6. Burenina O.Y.. Beckmann B.M., Kubareva E.A., Hartmann R.K. Investigation of 6S-2 RNA of Bacillus subtilis. Abstract book of the Third Conference of International Graduate School for the Life Sciences, 29.09.10-30.09.10, Giessen (Germany). P.125.

7. Kubareva E.A., Burenina O.Y.. Hoch P.G., Beckmann B.M., Hartmann R.K. Peculiarities of 6S RNAs from Bacillus subtilis functioning. Abstract book of the Sixth Cambridge Symposium on Nucleic Acids Chemistry and Biology, 04.09.11-07.09.11, Cambridge (UK). P. 47.

8. Hartmann R.K., Burenina O.Y.. Hoch P.G., Beckmann B.M., Kubareva E.A. Dissecting the differential roles of the two 6S RNAs from Bacillus subtilis. Abstract book of the Progress Report Meeting "Sensory and regulatory RNAs in prokaryotes", 26.09.1128.09.11, Reinhardswaldschule Kassel (Germany). P. 23.

9. Елкина Д.А., Буренина О.Ю. Сравнение функциональной роли 6S-1 и 6S-2 РНК Bacillus subtilis. Материалы международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2013». Секция «Химия». Подсекция «Химия живых систем и нанобиотехнологии». С. 18.

10. Elkina D., Burenina O. Proteomics as a possible way to elucidate physiological roles of Bacillus subtilis 6S-1 and 6S-2 RNAs in vivo. Abstract book of the Offsping-Meeting of the International Research Training Group Giessen/Marburg-Moscow, 26.06.1329.06.13, Moscow (Russia). P. 46.

11. Burenina O.Y.. Hoch P.G., Kubareva E.A., Hartmann R.K. Interaction of Bacillus subtilis 6S-1 and 6S-2 RNAs with RNA polymerase - comparative functional analyses and proteomics of 6S-1/2 knockout strains. Abstracts of the 38th FEBS Congress, 06.07.13-11.07.13, Saint Petersburg (Russia). FEBS Journal. V. 280 (Suppl. 1). P. 37.

12. Burenina P.. Hoch P., Nesterchuk M., Kubareva E., Dontsova O., Hartmann R. Comparative functional analyses of 6S-1 and 6S-2 RNAs from Bacillus subtilis. Abstract book of the Workshop "Global and mechanistic approaches in nucleic acid biology" of the International Research Training Group Giessen/Marburg-Moscow, 17.09.13-20.09.13, Saint Petersburg (Russia). P. 31.

Заказ № 117-Р/04/2014 Подписано в печать 25.04.14 Тираж 130 экз. Усл. п.л. 1,0

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru ; е-таИ: zakpark@cfr.ru

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный аэрокосмический университет

имени академика М.Ф. Решетнева»

На правах рукописи

04201459923

Харьков Антон Михайлович

ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ И МАГНИТНЫЕ СВОЙСТВА ТВЕРДЫХ РАСТВОРОВ СУЛЬФИДОВ МАРГАНЦА С РЕДКОЗЕМЕЛЬНЫМИ ЭЛЕМЕНТАМИ

КехМп,.х8 (Ые = вт, УЬ)

01.04.07 - физика конденсированного состояния

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель: д.ф.-м.н., профессор С.С. Аплеснин

Красноярск - 2014

Содержание

Введение...............................................................................................................3

Глава 1. Литературный обзор..................................................................................................7

1.1 Магнитные свойства и структура соединений с переменной валентностью...................7

1.1.1 Электрические свойства соединений с промежуточной валентностью

и их интерпретация......................................................................................................................10

1.1.2 Решеточные и кинетические свойства.........................................................12

1.1.3 Электронная структура и эффект Кондо............................................................16

1.2 Сульфиды редкоземельных элементов с переменной валентностью................................26

1.3 Магнитоемкость..................................................................................................39

1.4 Методика эксперимента и экспериментальная установка.............................................53

Глава 2. Экспериментальные результаты. Магнитные свойства твердых растворов SnixMni.xS.57

2.1 Магнитные восприимчивости и кривые намагничивания для слабо допированных образцов.............................................................................................................57

2.2 Состояние спинового стекла в твердых растворах 8тхМп1_х8...................................62

2.3 Экспериментальные результаты и обсуждение......................................................63

2.4 Модели и интерпретация результатов......................................................................69

2.5 Выводы......................................................................................................73

Глава 3. Электрические свойства твердых растворов 8тхМп1.х8.......................................74

3.1 Температурная зависимость электросопротивления в твердых растворах 8тхМп1_х8......74

3.2 Экспериментальные результаты и обсуждение......................................................75

3.3 Модели и сравнение с экспериментом................................................................76

3.4 Выводы......................................................................................................83

Глава 4. Корреляция магнитных и электрических свойств в твердых растворах УЪхМп).х8........85

4.1 Структура и магнитные свойства.......................................................................86

4.2 Электрические свойства.................................................................................91

4.3 Выводы......................................................................................................96

Глава 5. Гальваномагнитные свойства УЬХМП|.Х8..........................................................97

5.1 Экспериментальные результаты........................................................................97

5.2 Модель и обсуждение результатов....................................................................106

5.3 Выводы......................................................................................................110

Заключение........................................................................................................111

Библиографический список....................................................................................112

Введение

Актуальность темы. Поиск и исследование новых веществ, проявляющих свойства мультиферроиков и сильную взаимосвязь между магнитной, электронной и упругой подсистемами, проявляющихся в виде магнитоэлектрических и магниторезистивных эффектов в области комнатных температур, представляет интерес, как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения. Это позволит создавать эффективные сенсоры и элементную базу в микроэлектронике, в частности в спинтронике, в которой используются преимущества, как энергонезависимой магнитной памяти, так и быстродействующих электрических систем обработки информации. В спинтронике для преобразования электрического сигнала используется не только зарядовая степень свободы электрона, но также и спин, что позволяет создавать принципиально новые спинтронные устройства. К таким веществам относятся неупорядоченные системы, в которых наблюдаются переходы металл-диэлектрик (ПМД) и эффекты колоссального магнитосопротивления и магнитоемкости.

Перспективными материалами для решения этих задач служат магнитные полупроводники на основе сульфида марганца 11ехМп1_х8 (Ые = Бт, УЬ) замещенные 41- элементами с переменной валентностью. Двухвалентные ионы УЪ2+ имеют заполненную оболочку а УЬ2+ (4^3) - одну дырку в 1-оболочке. В этом случае существенно как кулоновское взаимодействие, так и обменные взаимодействия электронов при М гибридизации. Замещение ионов марганца ионами УЬ может привести к зарядовым флуктуациям, сопровождающимися изменением ионного радиуса и к сильному электрон-фононному взаимодействию. В Бт существенны многоэлектронные конфигурации 41"5 и для которых межэлектронные корреляции, спин-орбитальное взаимодействие может привести к андерсоновской локализации или к образованию волны плотности валентности. Энергии редкоземельных ионов могут быть расположены как вблизи валентной зоны, так и зоны проводимости сульфида марганца, что также отразится на магнитных и кинетических свойствах. Характерные времена флуктуации валентности совпадают с характерными фононными временами. В сульфиде марганца носителями тока являются поляроны, поэтому в твердых растворах возможно ожидать существенного взаимодействия между электронами на ионах марганца и редкоземельного элемента через решеточные степени свободы.

Электроны в узкой 41- подзоны при <1-1^ гибридизации обладают сильным спин-орбитальным взаимодействием, величина которого также будет зависеть от зарядового состояния иона с переменной валентностью. В результате, в отсутствие спинового порядка гигантский магниторезистивный эффект может быть обусловлен орбитальным упорядочением электронов на орбиталях, либо сильным спин-орбитальным взаимодействием, что связано с изменением подвижности электронов в магнитном поле в парафазе. Магнитоэлектрическое

3

взаимодействие может быть обусловлено смещением аниона на интерфейсе Мп-Яе при орбитальном упорядочении, либо Ян-Теллеровской модой редкоземельного иона с одним электроном в 5с1 оболочке или неоднородным распределением электронов вблизи границы раздела Мп-Яе связанного с флуктуацией валентности и соответственно с вариациями магнитного момента.

Поэтому актуально определение относительной роли этих эффектов, механизмов их взаимосвязи и создание методологии целенаправленного синтеза материалов с заданными свойствами.

Предметом исследования являются закономерности изменения магнитного момента, электросопротивления и установление эффектов магнитосопротивления и магнитоемкости в твердых растворах КехМп].х8 (11е = Бш, УЬ), х < 0.3 в зависимости от температуры и состава материала.

Объектом исследования являются поликристаллы твердых растворов 8тхМп]_х8 с концентрациями самария х = 0.01, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25 и ¥ЪхМп1_х8 с концентрациями редкоземельного иона иттербия х = 0.05, 0.1, 0.15 и 0.2, выращенные из расплава с использованием индукционного нагрева и контролируемым снижением мощности на многовитковом индукторе.

Цель работы: установить магнитное состояние и переход металл-диэлектрик в сульфидах марганца при замещении марганца ионами с переменной валентностью и изучить явление магнитозависимого электронного транспорта и магнитоемкости в твердых растворах "УЪхМп1_х8.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать поведение магнитного момента и восприимчивости в слабых и сильных магнитных полях в широком температурном диапазоне. Определить зависимости намагниченности от магнитного поля в полях до 9 Тл, магнитной восприимчивости в области частот 1 кГц - 100 кГц в интервале температур (4 - 300) К;

2. Исследовать транспортные, термоэлектрические свойства КехМп].х8 (0 < х < 0.3) и магнитотранспортные свойства твердых растворов УЬхМп1.х8 в диапазоне температур от 80 К до 1000 К.

3. Исследовать комплексную диэлектрическую проницаемость УЬхМп1_х8 (0 < х < 0.3) в зависимости от температуры, магнитного поля и частоты переменного электрического поля. Установить температурные и концентрационные области с гигантским магнитоемкостным эффектом.

Методы исследования:

1. Измерение магнитной восприимчивости и определение парамагнитной температуры Кюри и Нееля, магнитного момента иона в твердых растворах 11ехМп1_х8 в зависимости от температуры и состава. Измерение частотной зависимости магнитной восприимчивости для определения механизма релаксации магнитного момента.

2. Анализ полученных результатов в приближении молекулярного поля, моделирование температурного поведения магнитной восприимчивости и намагниченности в модели с конкурирующими обменными взаимодействиями.

3. Измерение электросопротивления и термоэдс твердых растворов 11ехМп1.х8 от температуры и магнитного поля. Моделирование экспериментальных данных в рамках модели примесного полупроводника с донорным уровнем.

4. Измерение электроемкости и тангенса угла потерь в твердых растворах 11ехМп1_х8 от температуры, частоты и магнитного поля.

Научная новизна работы:

1. В установлении нового магнитного состояния и механизма релаксации магнитного момента в твердом растворе Smo.25Mno.75S и в определении вкладов в электрическое сопротивление от магнитной и упругой подсистем при изменении концентрации самария в 8тхМп1.х8.

2. В определении закономерности изменения валентности (электронной структуры) редкоземельного иона иттербия в зависимости от состава в сульфидах УЪхМп).х8, смены знака носителей тока как по концентрации, так и по температуре.

3. В обнаружении смены знака магнитосопротивления с отрицательного на положительный с ростом температуры и гигантского магниторезистивного эффекта в парамагнитной области при температурах выше комнатных.

4. В установлении закономерности изменения диэлектрической проницаемости в магнитном поле от частоты в широкой области температур 80 К - 500 К.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Спин-стекольное состояние в твердом растворе Smo.25Mno.75S в области низких температур при Т < 40 К. Механизм релаксации магнитного момента в твердом растворе Smo.25Mno.75S.

2. Переход металл-диэлектрик в твердых растворах при концентрации х = 0.25 в 8тхМп1.х8, изменение механизма электрического сопротивления от магнитного на локализованных спинах к рассеянию на акустических фононах.

3. Концентрационная зависимость магнитного момента и валентного состояния ионов иттербия в твердых растворах УЬхМп1.х8 при концентрации х > 0.1.

5

4. Температурные и концентрационные зависимости энергии активации перехода электронов с примесного уровня в зону проводимости и типа носителей в твердых растворах YbxMni_xS для х < 0.1. Электроны проводимости в модели примесного полупроводника с 4f- донорным уровнем и с учетом сдвига дна зоны проводимости.

5. Электроемкость и электросопротивление твердого раствора YbxMni_xS в магнитном поле в области низких и высоких (выше комнатных) температур и критическая температура, при которой проводимость не зависит от внешнего магнитного поля.

Научная значимость работы:

Научную ценность составляет изменение валентности редкоземельных ионов в зависимости от концентрации, что приводит к магнитным и электрическим переходам в твердых растворах RexMni_xS. Исследованы механизмы релаксации магнитного момента и выяснены взаимодействия электронов проводимости с магнитной и упругой подсистемами. Обнаружено влияние магнитного поля на транспортные и диэлектрические характеристики выше температуры магнитного упорядочения, включая комнатные.

Практическая значимость работы:

Связана с обнаружением магниторезистивного и магнитоемкостного эффектов в твердых растворах YbxMni_xS, которые в перспективе могут использоваться в качестве сенсоров, датчиков, устройств записи-считывания информации. Изменение диэлектрической проницаемости в магнитном поле может найти применение при изготовлении СВЧ приборов. Магнитозависимые эффекты при комнатных температурах и в заданных частотных диапазонах перспективны для использования в устройствах спинтроники.

Достоверность результатов подтверждается согласием экспериментальных результатов, полученных при исследовании магнитных, электрических и структурных свойств различными методами и качественным согласием с теоретическими расчетами транспортных и магнитных характеристик твердых растворов RexMni_xS (Re = Sm, Yb).

Личный вклад автора заключается в проведении измерений транспортных свойств и диэлектрической проницаемости, обработке и интерпретации полученных результатов, подготовке их к публикации, участии в написании статей и докладов.

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены и обсуждались на следующих симпозиумах, конференциях и совещаниях: VI Euro-Asian Symposium «Trends in Magnetism»: Nanospintronics Eastmag, 2010; Байкальская международная конференция «Магнитные материалы. Новые технологии». - Иркутск, 2010, 2012; Международная научная конференция «Решетневские чтения». - Красноярск, 2009, 2010, 2011, 2012; Всероссийская научно-практическая конференция творческой молодежи «Актуальные проблемы авиации и космонавтики». - Красноярск, 2009, 2010, 2011; Межвузовская

б

региональная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых физиков «НКСФ». - Красноярск, 2009, 2010; IEEE Международная Сибирская Конференция по управлению и связи «SIBCON-2011»; Moscow International Symposium on Magnetism «MISM». -Москва, 2011», INTERMAG ASIA International Magnetics Conference. - Taipei, Taiwan, 2011; Международная конференция «Новое в магнетизме и магнитных материалах». - Астрахань, 2012, Euro-Asian Symposium «Trends in Magnetism»: Eastmag. - Владивосток, 2013.

Работа поддержана грантами: РФФИ - Тайвань. № 09-02-92001-ННС_а., РФФИ -Сибирь. № 11-02-98018-р_сибирь_а. РФФИ. № 12-02-00125-а., КГАУ, 2012. Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-технической деятельности «Многофункциональные материалы RexMni_xS (Re = Sm, Yb) для элементной базы в электронных устройствах. № 06 / 12 от 04.09.2012».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 работ, из них 3 в российских и 5 в международных журналах по списку ВАК 8 статей. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав основного текста, заключения. Объем диссертации составляет 124 страницы, включает 84 рисунка и библиографический список из 190 наименований.

Глава 1. Литературный обзор 1.1 Магнитные свойства и структура соединений с переменной валентностью

Структурные и электронные свойства сульфида самария изучались под давлением до 2.9 ГПа и при низких температурах до 4.5 К с помощью рентгеновской дифракции и методов поглощения. Измерения валентной зоны, магнитных переходов и структурное состояние сульфида самария проводились при низких температурах для «черной» и «золотой» фаз. Двухвалентное состояние БшЗ обнаружено при 58 К и 1.13 ГПа. Выше перехода валентность линейно возрастает с давлением. В частности, оказывается, самарий обладает промежуточной валентностью в магнитоупорядоченной фазе при 2.9 ГПа и 4.5 К. Резонансное рентгеновское магнитное рассеяние не обнаружили никаких доказательств существования магнитного порядка в магнитоупорядоченной фазе [1].

Рис. 1а показывает валентные состояния Бт в ЗтБ рассчитываемых по формуле:

° ' ^гг'це-е,)2 £!гр(1)+р(2к Я 0.5 г

Ниже перехода, белая линия в спектрах поглощения указывает на двухвалентное состояние. Это не обязательно точно, так как анализ данных показывает, что любая валентность до 2.2 будет отображаться как двухвалентная. Переход первого рода происходит при 58 К и 1.13 ГПа и сопровождается линейным увеличением валентности от 2.67 при 1.13 ГПа до 2.81 при 2.86 ГПа (рис. 1). Определение валентности при высоком давлении является более точным, поскольку отсутствует континуум слабых линии. Выше 2.0 ГПа, где магнитное упорядочение происходит в БгаБ, измерения ясно показывают промежуточную валентность, которое сохраняется и выше температуры перехода. Под давлением из измерения валентности, следует, что ЗтБ не становится трехвалентным, по крайней мере, до 6 ГПа.

При переходе под давлением наблюдался изоструктурный распад объема на 13 % и, хотя образец остается монокристаллом, мозаичность существенно возросла с 0.030° до 2.5°. Ниже перехода наблюдался один Брэгговский пик соответствующий «черной» фазе. В области перехода наблюдалось два пика связанных с разделением фаз в образце. При более высоких давлениях снова появлялся один пик связанный с возникновением однородной смешанной фазы. При дальнейшем увеличении давления наблюдалось равномерное сжатие объема. Используя резонанс рентгеновского магнитного рассеяния (ЮСМБ) можно получить информацию о типе магнитного упорядочения. Возможность ЮСМБ от объемного �