Физико-химические свойства и структурные особенности полирибогуаниловой кислоты в растворе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

МОСКОВСКИМ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЙБРЬСКОИ РЕЕОЛЩИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗШШЕИТ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи УЖ 547.963.3

КОЗЛОВ АЛЕКСАНДР ГЕОРГИЕВИЧ

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПОЛИРИЕОГУАЕИЛОВОИ КИСЛОТЫ В РАСТВОРЕ

Стадиальность Q2.00.G4. - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ ;зссертации нз соискание ученой степени хандаигта химических наук

М01КБА 1994. г.

-збота выполнена на кафедре физической химии Химического 'факультета МГУ.

Научный руководитель: доктор химических наук,

ихзфессср ¿'дан Алексеевич!

Офкш^льные оппонента: доктор химических на..к,

гоофессср ЗЕЗИН Александр Борисович

доктор химических наук, 'Профессор ЕВДОКШОВ Юрий Михайлович

Ведусгя организация: Институт теоретической и эксперименталь»

биофизики РАН (г. Пушино)

на заседании Специализированного Ученого Совета Д 053.05.59 пр: МГУ ек. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП-3, В-23 Ленинские горы, МГУ, Химический факультет.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Химическог факультета МГУ.

Защита состоится " " ✓и-сх^е, 1994 г. в

Автореферат разослан

1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат химических наук

Ю.А.Коваленко

Оссая характеристика работы.

Актуальность темы. Нуклеиновые кислоты, являющиеся носителям: генетической информацзп: б гзиой ^ прстоде, по праву считаются важнейшими биологическими макромолекулами. 'Ключевым фактором, олределяыз"! многообразие функций нуклеиновых кислот "in vivo", является их структурный полиморфизм. В свою очередь, структурные особенности полилуклеотидов во многом зависят от внешних факторов, таких как ионное окружение, температура, рН среды и др. Именно поэтому изучение полпзлектролитнкх свойств нуклеиновых кислот, получение информации об их селективности к ионам металлов и гидро-коония уже более 4-х десятилетий вызывает неослабевающий интерес исследователей. В силу неоднородности состава природных полкнухле-стидов (ДНК, РНК) исследователи часто обращаются к модельным системам, в роли которых выступают гомополикуклеотиды, содержащие лппь один тил оснований. В ряде случаев это позволяет лучше понять процессы, происходящие с более сложными гетерополимерами. С другой стороны, протяженные участки, содержащие основания одного типа, часто встречаются в более сложных последовательностях и могут выполнять вакные биологические функции. В сравнении с' другими гомо-полинуклеотидами, изучению полирибогуаниловой кислоты (nojni(G)) посвящено меньшее количество работ. Имеется мало данных о структурах голи(С), отличных от четырехцэпочечных. Практически не изучено состояние nojM(G) в достаточно концентрированных растворах, в растворах с низким содержанием поддерживающего электролита и в кислой среде. Не утешены места связывания и механизмы взаимодействия с псли(0 ионов ЕдО+ и Ag+, оказывающих на вторичную структуру поли-нуклеотидов сильное влияние. Не полностью выяснены причины селек-тизности различных форм полн;0) к ионам щелочных металлов. Решение этих вопросов приобретает особую актуальность в связи с большим интересом, который проявляется в последние годы к изучению гуанин-содержащих полинуклеотидов. Это связано с тем, что обогащенные гуанином последовательности были обнаружены практически во всех хромосомных ДНК. Выяснилось, что эти последовательности принимают участие в образовании необычных структур, играющих важную роль в целом ряде клеточных процессов.

Цель -работы заключалась в получении структурных и транспортных характеристик поли(С), а также изучении особенностей взаимодействия поли(0 с ионами щелочных металлов и аммония, Ag+ и НдО+ и влияния их на вторичную структуру полней) в изоиоиных, бессолевых и содержащих в низкой концентрации поддерживавший

Электре.":? ргсгнорах.

Научная новизна работы. В работе впервые иссследованы нзепокные растворы поли(0, полученные ионообменным методе?.:. Показано, что в изоионном растворе (рК 3,2) H+-xiojdi(G) обладает устойчивой вторичной структурой, отличной от четырехспиральной. Изучение кислотно-основных сеойстз Hf-no.i;i(G) с привлечением ряда физпко-хнмнчесюгх методов позволило уточнить детали этой структуры; места связывания протонэв, количество цепей, вовлеченных во взаимодействие, и тип водородных связей ме;-:ду основаниями. Проведено кондуктометрическое исслэдование Оессолевых и содержащих в небольшой концентрации поддерживающий электролит раствошв различных ионных форм поли(С), также полученных ионообменным методом. Для расчета структурных и транспортных характеристик пелпнуклеотидев на оскоЕе кокдуктсметрических данных впервые предложено использовать подходы Бикка и "аннинга. Справедливость использования последнего успешно проверена в системе ДКК-нпзкомолекулярный электролит для перехода спираль-клубок, вызываемого повышением температуры и разбавлением. Показано, что б нейтральных растворах при низком содержании соли и в ее отсутствие поли(0 более склонна к образованию двухцепочэчкых структур. Обнаружено, что ионы Li+ и Cs+ отличаются по своему влиянию на вторичную структуру nojtn(G) от ионов К+, Rb+, и

Na+. Впервые детально изучено взаимодействие Ag+ с поли(0. Показано образование комплекса со стехиометрией Ag:G=1:2 в лзоиокнкх и бессолевых растворах поли(С). Определены места и константы связывания Ag+ с обеими формами поли(0, предложен механизм ксмплексообразованид.

Практическая ценность Работы. Предложенные в диссертации методы получения лзоионных и бессолевых растворов полтС), очистки ее от солевых попмесей и низкомолекулярных фракций, а также метод определения концентрации, основанный на анализе кривой титрования, могут использоваться в научных и заводских лабораториях, связанных с синтезом и изучением полннуклеотидов. Результаты представляют интерес для развития теории полиэлектролитов, лучшего понимания клеточных процессов, пртекаяхпх с участием полинуклеотлдов и могут использоваться в спецкурсах до физической химии ДНК.

Апробация таботы и публикации. Основные результаты работы догадывались на VIII Всесоюзном симпозиуме пэ ме;таэлекулярному взаимодействию г. кок+егмадалн молекул, (Новосибирск, 1&?0 г.) и VII Кснфетгекциз! по спектроскоп;:;'. биополимеров (Харьков, 199' г.;. По

материалам диссертации опубликовано пять печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной часта, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (162 наименования). Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, содэрзсит 32 рисунка и 5 таблиц.

Содержание работы.

Сбзор литературы. В первой главе рассмотрены физико-химические свойства и структурные особенности поли(С), ее аналогов (поли-(I), ноли (ас-) и химически модифицированных олиго- и полн(С)), э также гуанинсодержазих полинуклеотвдов. Проанализированы результаты спектральных, ренгеноструктурных, электронномикроскопических и целого ряда других методов исследования. Уделено внимание вопросам взаимодействия поли(О и ее аналогов с ионами металлов. 3 первом разделе четвертой главы проведен сравнительный анализ различных моделей и теорий полиэлектролитоз в применении к кондуктометричес-ким исследованиям полинуклеотвдов.

Експериментальнзя часть. Приведены характеристики объекта исследования. Описаны ионообменные методы получения различных ионных форм поли(в). Представлены методики физико-химических исследований, охарактеризованы вещества и реагенты, использованные в работе.

Получение и физико-химические свойства изоионных рзствороз поли(С). Изоионые растворы В+-поли(С) получали, пр-опуская водные растворы исходного препарата К+-поли(С) через колонку со смешанным слоем ионитоз: анионита АВ-17 в 0Н~-фэрме и катионита КУ-2-8 з Н+-форме, взятых в соотношении 1:1 по объему. При этом все низкомолекулярные анионы обмениваются на ОН-, а катионы на Н+. Изоион-ные растворы, таким образом, характеризуются тем, что не содержат низкомолекулярных примесей, а в качестве противоионов имеют ионы Н+, количество которых строго соответствует содержанию нуклеинового фосфора. Изоионные раствооры поли (О имеют кислую реакцию (рН 3,2 при Ср=2,1 мМ). УФ-спектры изоионных растворов, снятые в диапазоне концентраций от 2,1 до 0.021 мМ, характеризуются максимумом поглощения при 254- нм и минимумом при 223 нм. Их отличие от спектров, полученных в нейтральной среде, заключается в смещении минимума поглощения на 4 км в сторону больших длин волн и некотором увеличении -поглощения в области 260-290 нм. Последнее наблюдается при подкислении нейтральных растворов поли(О и связано с протони-рованием N(7) атомов гуанина. Свидетельством того, что, как в ней-

Рис.1. КД спектры растворов: ;-Г-поли(а) - 1, к+-поли(о -2, К~-поли (С-) в присутствии сверхз:-:вивзлентного количества Си-+- 3, Н+-псли(0 в С,? М ;;аС1 (прерывистая кривая ) -

210

250

290 а. ни

тральной среде, так и в изспоннсм растворе, поли(С) сЗладает упорядоченной втсрячной структурой, является резкое увеличение поглощения (пшерхрсмный эффект) при увеличении рН растворов до 12,5. При таких значениях рН происходит депротонирсвание Щ1)Н групп гуанина, включенных в Еодоводнсе взаимодействие, и разрушение структур. В то же время сами структуры, присущие обеим фермам, должны различаться. Это очевидно из различия их спектров КД (рис.1). Следует отметить, что в КД спектре еодного раствора К+-поли(С) (кривая 2) положение и интенсивность полос практически совпадают с литературными данными. 3 то Еремл, спектр изоионно-го раствова (кривая !), хотя и совладеет по полевению основных полос со спектрами подкисленных растворов поли(С-), характеризуется гораздо 'олыэм1 их интексивностямн. Такз; образом, мскно говорить о том, что з нзеионнем состоянии "кислая" структура выражена наиболее четко. Зта ферма так;:е достаточно устойчива. I- спектр не меняется при хранении раствора в течении у.есяпа при 4"с. Разрушения обе;IX форм удается добитвтя при добавлении в раствор СЕерхэк-Еивалентного количества иоксв меди (кривая 3, рис.1).

Результаты щелочного титтозания изононного раствора Кт-полиIС-), полученные различными методами, ггревставленн на рис.2. На кривой 1 пстенциомэтркческого титрования в координатах рЕ от г (рис.2.а), где г - количество молей щелочи, добавленное на моль оснований, наблюдается два неоеги'а при г=0,5 и г=1 ,С. 0ш1 .могут отражать наличие мест связывания птотонсв двух ~птов с различными рК, или являться результатом структурной перестройки Е -пол:-;С) в процессе нейттвлизаптгд, так:;:е приводящей н изменению тг?1 ^. В пользу

1 5

Рис.2. Изменения рН (а), Ае (б) и удельной электропроводности К (в) в зависимости от г; а - потенцисметрическое титрование: I -Н+-поли(0 0,04 К раствором КаОН, 2 - обратное титрование 0,05 и раствором НСЬ от г=1,12, 3 - титрование К+-поли(0 (рН 6,2) 0,05 М НС1; б - изменение интенсивности полос КД при 223, 252 и 283 нм; в - кондуктометрическое титрование Н+-поли(0 0,04 М НаОН.

последнего предположения свидетельствует изменение спектра КД изо-нонкого раствора 5 диапазона г=0,5-0,8 (рис.2.б), приводящее к возникновению спектра характерного для нейтральных водных растворов, (рис.1, кривая 2 и прерывистая кривая). Обратимость кривой потенциоыетрнческого титрования Н'-полиСО наблюдается лишь до степени нейтрализации не выще г=0,5. При больших г, кривые обратного титрования раствором НС1 (например, кривая 2 на рис.2.а) ке ссшздгзт с кривей прямого титсовзняя и приближаются к кривой титрования бессолевого водного тастБорэ К^-ползЦС) раствором КС1 (кривая 3, рис.2.а). Это могло объяснить тем, что структурный переход К*-поли (С-) под действием кислоты протекает гораздо медленнее, чем противоположный процесс перевода "изоионной" формы в "нейтральную". Это доказывает Г2:-:::-:е и тот факт, что заметные изменения спектра КД £т-полней) в сторону "кислого" начинаются лиь через 2 часа после добавления в раствор избытка кислоты, ¿'злемы на кривой конлуктс;,метрического титрования (рис.2.в) согласуются с данными потенцисметрм и КД. На участке abe происходит понижение удельной электропроводности (К). Это связано с резким уменьшением количества свободных Н+-ионов на линейном участке со (его Беличика в едакгцах г составляет 0,3 и соответствует концентрации свободных протоков, рассчитанной, исходя из рН изоионного раствора равного 3,2 при Ср=2,1*1и Е~-ионов, диссоциирующих в процессе нейтрализации на участке Ьс (г=0,3-0,5). Увеличение К на участке ей (г=0,5-1 ,0) связано с ростом концентрации в растворе только ионов ,\'ат, s то вгемя как обладающие высокой подвижностью оставшиеся Н~-ионы, по-видимому, сильно связаны изменяющейся в процессе перехода структурой. Резкое увеличение 7. нз участке de, объясняется появлением в растворе подвижных гндроксил-ионов, котрке больне не 5за;с.юдеГгстЕукт с протонами.

Согласно электронно-микрсскогегческим данным в кислой среде псли(0 существует в виде даухцепочечной структуры И]. Детали зтой структуры оставались до настоящего Бремени неясными. Полученные результаты, в том числе: характер кривых потеншюметрического и кондуктсмэтрэтеского титооЕанид, положение на них точек перегиба и изломов, низкое значение рН изоионных растворов и спектры КД, полученные в разных условиях, в сочетании с литературными данными позволяет считать наиболее приемлемой структуру, в которой образуются водородные связи мекду N(1;Н - 0(5) атомами соседних гуанинов, а протонироЕнние происходит по ]í(7) атомам азота (рис.3, структура с). Тогда конфорыэционннй переход, происходящий под действием пелочл, лег:-:: представить схемой, изображенной на рис.3.

в

-2Н-, А X

ГУ*

<1

л Ъ •

С1

Рис.3. Предложенная схема структурных"превращений поли(С) в процессе щелочного титрования изоионного раствора.

После нейтрализации половины протонов, связанных с N(7) атомами гуанина (а->Ь), появляется возможность для перестройки водородных связей. То есть, происходит разрыв одной связи N(1)11- 0(6) и фор мирование новой связи Ж2)Н-К(7). Этот процесс (Ь->с) должен сопро-вонщяться поворотом оснований друг относительно друга в плоскости рисунка, то есть изменением угла спирального закручивания. Такая перестройка должна протекаить легче' по сравнению с образованием дзухцепочечных структур с другими типами водородного связывания [1]. После образования двухцепочечной структуры и постепенного удаления протонов в процессе титрования открывается возможность объединения пары' двухцелочечных молекул в одну четырехцепочечную (переход с-кЗ). Однако в условиях низкой ионной силы такой переход может и не происходить. Согласно [1] структурно-динамическое равновесие перехода с+й сдвигается вправо только при достаточно высокой концентрации поддерживающего электролита. Образование нейтральной формы можно наблюдать в изслонном растворе при СМаС1=0,9 М (прерывистая кривая, рис.1).

е

¡■.спользовподхода Мановнсга для анализа кондуктометрпчес-ш данных. Для получения структурных л транспортных характеристик исследуемых полжукдеотидсв использовал;! следующий подход. Согласно ^гннинт1;- 12,3], полезность лине£~:ого. полшкша, моделируемого бесконечным линейным ка5ором дискретных зарядов, для случая однозарядных прст;гвспснов в бессолевых разбавленных растворах выражается фсомулой:

3,£сб-? • А ' Иг.ОсЬ;

-и '0"* +■ С,'34 • 7 • А • (л! ) 1 ;1п(зе-Ь; а в попсутствии одновалентной соли:

• а)

^-Г—:-------, (1.6)

?

го4 + ({>.; гК(\'гг')}тх-ъ)

где, А = ¿е, ьКГ/Згз , в - диэлектрическая проницаемость растворителя, > - константа Больпмвна, Т - абсолютная температура, ?} - вязкость растворителя, е - элементарный заряд, Р - число ФарадеяД^ -предельная подвинность протиьснзна н.лн катиона солк, л? - предельная подвижность аниона, Ъ - расстояние мекду зарядами вдоль осп пслпиена; ж - параметр экранирования дебая, определяемый по формуле:

р2 о ? 1/2

р -1 * 0 -1 где л С^р = ? Ср (бессолевые растворы), 2 С^ = 20^ I Ср (из-

бытск 1:1 валентного электролита), - число Авогадро, £ - пара-

метт плотности заояда полигона:

" О

- • (2)

-0= ВХДО

Рассматриваемые формулы стлячгзтся от соотношений, приводимых в работах [2,3], в связи с использованием в нашем случае системы единил СИ у введением в них числа Сородея в явном виде, для эквивалентной электссгсвоьоднсстп и кснцентоаоыси сохоанены традиционные единицы - с}.г/Си ■ у.олъ и моль/л.

Удельная электропроводность бессолевого раствора полиэлектро-литз и оаствооа, содердадего 1:1 ьадентнуэ соль, согласно [2,3] выражается соответственно формула.«!:

К = Ко+ 0,866-+ Ар), (л-а)

К = V <4"б)

где и Кс - удельные глектоопроводностн еоды и раствора соли, определяемые экспериментально. Подставляя в них выражения (1) и проведя преобразования с использованием соотношений (2) и (3), педугнм:

к=ко+:,8бб--!0~3Г1ь.

0,366-F-A- |¿ln(C¿g -ЧВ1 ^_

'pl 1 0,134-F-A-Г1 |¿ln-C^r¿)+B|

) , (5.a)

7-А- 2+ C¿g 3)+В[

10"

(5.0)

1-F-A- ((?.* )"1 + (>4)-1)¡Un(2Csr¿+ С Г где коэффициент В зависит только от температуры.

Псдставляя в уравнения (5) экспериментальные значения К и К , можно итерационным методам рассчитывать зависимости параметра плотности заряда £ (и вычисляемых из него по формулам (3) и (1) значений Ь и >.„) от одного из параметров CL, Сс или Т, пги усло-

р р Ь

вии, что остальные два фиксированы.

Изучение перехода спигэль-клубок на основе кондуктомэтоичес-ких данных в системе ДНК-К=С1. 3 целях проверки рассмотренного выше подхода, провели температурное и концентрационное плавление ДНК при низком содержании соли в растворе. Рассчитанные из кондук-тометрических данных по формуле (5.6) зависимости Ь от Т и -lgC имеют S-образный вид, типичный для спектрофотометрических кривых плавления. Температура плавления ДНК в 1 мМ рзствор-э NaGl (С =2'мМ) составляет 49° С, ширина перехода <«12°. При разбавлении 2 vid раствора Ка+-ДНК (С^с!^*5 ^ переход спираль-клубок нэблюда-ется в диапазоне CD= 1мМ-0,1мМ.

Таблица 1. Сравнение величин Ъ, полученных при кондуктометри-ческом исследовании денатурации ДНК, вызываемой повышением температуры (1) и разбавлением (2), с литературными данными (3).

Р

Состояние ' Ь, %.

ДНК 1 1 п с. 3

натизн. ' 2,1 2,3 1,7*

денатур. I 4,2 4,2 4,1**

К

* Принято на основании рентгеноструктурных данных ** По данным работы 14].

Из таблицы видно, что значения Ъ, рассчитанные для денатурированного состояния, хорошо согласуются с литерагурными данными, а для нативного состояния превышают данные рентгеноструктурного анализа волокон на 20-ЗС5, что может являться свидетельством "вытягивания" двойной спирали ДНК з растворе при низком содержании соли под действие?/ электростатического отталкивания фосфатных зарядоЕ. Завышенные значения Ь т могут, впрочем, являться и результатом

присущих подходу Маннинга. Тем ке менее, следует отметить, что рассмотренный подход достаточно удовлетворительно описывает -состояние ДНК в растворе и может использоваться -для других •полинуклэотидов, близких по своим параметрам к ДНК, и, в частности, поди (О.

Ксндуктсметопчаское исследование различных ионных форм пол:!(С) в бессолевом саствосэ. Бессолевые растворы Ме+-поли(С), где Ме~=Ы+,Хат, Х+,ш|,1?Ь+,Сз"г, получали ионообменным методом, пропуская исходный водный растьор Кг-полп(С) чесез катионит КУ-2-8 в соответствующей форме. Полноту обмена контролитовзли методом пламенной фотометрии. На рис.4 представлены зависимости £ от /С , рассчитанные на основе экспериментальных данных с использованием формулы (5.а). Видно, что значения | для л+,НЬ+,ШГ[ и Ыа+- солей поли(С) лежат в диапазоне от 4,2 до 5,3, а для Сз+и И+- солей - з интервале 2,- - 3,3, и практически ке зависят от концентрации поликукле отида. Согласно рентгеноструктурыым данным расстояние между сканированными основаниями в четырехспиральной структуре поли(С) составляет 3,4 1 [51. С учетом того, что на это расстояние приходится 4 фосфатных заряда, получаем Ь=0,85 1, или 1=8,4-. Более низкие значения подученные наш для исследованных солей, могут свидетельствовать в пользу структуры, отличающейся от четырехспи-ральной. На электрокномикроскопических снимках, полученных для бессолевых растворов поли(О [1], были обнаружены протяженные дзухцепочечные участки расплетенной четырехцепочечной структуры, причем обнаруженные дефекты, как оказалось, исчезают с увеличением концентрации добавленной соли. Тагам образом, незначительное изменение внешних условий может, по-видимому, вызывать обрати?,ый переход из четырехцепочечной в двухцепочечнуэ конформацкю без существенного изменения параметров структуры при разрушении половины '."(1 )Н-С(б) и ^'(2)Н-2;(Т) связей между основаниями четыр-ехцепочечной спирали (переход <5—*с на рис.3).Значение соответствующее такой структуре, разно 4,2.

Полученные нами значения | для К+,ЙЬТ,Ш^ и Иа+поли(С) дают основания полагать, что в отсутствие поддерживающего электролита эти соли полг(С) могут иметь структуру, промежуточную между двух-2 четырехсшгральной формами, причем склоиность к образованию муль-•шепираля убывает в ряду катионов в порядке: К+>Ш5+>Ш+>На+>Сз+> П+. В этом ряду особняком стоят Сз+-и Ы+- соли. Ее личины полученные для этих ионных форм, лежат ниже значения 4,2, приписываемого -нами двухцепочечной структуре. Возможность понижения £ за

г

Рис.4. Зависимости параметра £ от концентрации полинуклеотида в Сессблс-Еых растворах для К+-(*),КЬ+- (□),

Сз+- (+) и Ы+- (ф) солей пз-лиСС), рассчитанные из экспериментальных данных с использованием формулы (5.а).

,'/2102,М,/г

4.0 :

Рис.5. Изменение параметра ? в зависимости от температуры, рассчитанное из кондуктометри-ческих данных для бессолеЕОГО растЕора К+-поли(й) (0^= 2,1-10_3Ы): 1 - нагревание, 2 -охлаждение.

100 I, с

л -I -1

,\Р,ем Ом моль

100

Рис.5. Зависимости подвижности полииона от рассчитанные по формуле с использованием полученных значений | при различных Ср: 1 - 0,2; 2 н 0,5; 3 1,5; 5 - 2 Ш.

где г=С3/С , (1.0)

0,8; г -

счет денатурации поли и) в присутствии этих ионов следует исключить, так как УС-спектры в этом случае совладают со спектрами других солей, а увеличения поглощения, связанного с эазрусением структуры, не удается наблюдать вплоть до 80°С. Заниженные значения | можно объяснить специфическим связыванием ионов Сб+ и Ы+ с полиионом. Теория Ыайнднга Ее приникает текое связывание во внимание и рассматривает специфически связанные ионы как единое целое с полиионом, что приводит к занижению рассчитанных значений Коны щелочных кеталлсз по-разному воздействуют на вторичнус структуру полн(С) в растворе, что находит свое отражение в спектоах КЛ. Интенсивность полосы в области 280-290 нм (рис.1, кривая 2), которую связывают с изменением геометрии спиральной структуры, в зависимости от протизоиона уменьшается в порядке Ш4>ЕЬ+>Е+>На+> Сз4>Ь1+. Причем у Сз+- и 11т-поли(С) полоса в длинноволновой области практически отсутствует. В то ке время интенсивность полосы при 260 нм, характеризующей стэкинг оснований, у этих солей в 1,4 раза больше, чем у остальных. Таким образом, с учетом кондуктомет-рических данных можно предположить, что ионы Ы+н Сз+, специфически связываясь с конкретными группами полииона, могут способство-• вать образовании устойчивой структуры, отличной от той, которая существует в присутствии противоионов первой группы.

Кондуктометрическое исследование плавления бессолевых растворов К-пЙлк(и). Выведенная ранее формула (5.а) позволяет рассчитать зависимость параметра £ от температуры бессолевого раствора поли (О, исходя из экспериментальных значений удельной электропроводности. Она представлена на рис.5. При расчетах учитывались зависимости еэличин Ц, е и 7) от температуры, которые приближались полиномами на основе справочных данных. Из рисунка видно, что значение приписываемое нами дзухцепочечной структуре поли(О, сохраняется приблизительно до 80°С, а затем начинает уменьшаться и при 98°С составляет примерно 2,3, что свидетельствует о том, что при этой температуре процесс плавления еще не закончен (для ДНК ^денТ 1 >7-1,8, исходя из табл.1 и формулы (3)). Как уже упоминалось, на электронномикроскопических фотографиях, полученных для бессолевых растворов поли(С), были обнаружены протяженные двухце-почечные участки расплетенной четырехцепочечной структуры [13. Прогревание таких раствороз при температуре 80° С в течение получаса. приводило к полному переходу в -двухцепочечную конформацию, а при 100°С - к денатурации препарата. Таким образом, полученные на;® результаты согласуются с литературными данными, однако свиде-

тельству^т в подъсу ?сго, что при низких температурах з бессолевых растворах поля (С) находится преимущественно в дзухцепочечной ксн-формацри.

Кондуктомзтсичосксз исследование р астророз К^-полл^'С) поп низком содержании соли. Сравнение подходов Ринка и Мэнн;гкга. Согласно В;!нку [6], удельная электропроводность раствора полиэлектро-дпта, содеожадего простуд соль, ьшгзказтся 'формулой:

к="(1-а)[л:с3+ аа>^)сэ].10"3,

где а-от-эпень ¿згессшк.'.гж псетз.-.екгролита, А.,-предельная подвижность противолона, а -псдвихность пэлииока, Л^-ЦтА-о- эквивалентная электропроводность простой соли при бесконечном разбавлении, а С, и концентрации cc.pi и пслиэлектролита соответственно. Коэффициент 1СГ" появляется з формуле (5) в связи с использованием для эквивалентной электропроводности едины см^/См-мсль. Величина 3 отражает понижение электропроводности са счет мззспснных взаимодействий и включает в себя злектрсфсретнческ:пТ и релаксационный эффекты. Зксгариментгдькнз сависимости К от С3, полученные при добавлении раствора КС1 к бессолевому раствору К-поли(С-) до соотношения С^С1/Ср- 2 для нести фиксированных концентраций ползгну:-:-леотида, лежащих в диапазоне от до 2'10_3М, хорепо аппрок-

симируются прямыми линиями с коэффициентами корреляции не менее 0,999. Таким образом, поскольку сК/йС =сопз1;, изменение концентрации соли в растворе с фиксированной концентрацией поли(С) не влияет на межионные взаимодействия (¡3) и эквивалентную элентрсппсвод-нсеть полиэлектролнта ¿А ).

Величины 1-3 и +Я. ), получение из коэффициентов линейных зависимостей К от С , обработанных по методу наименьшее квадратов, для разных концентраций дели(С) представлены з таблице 2. 2 то время как величина р утаньпгется при понижении концентрации п:„о:-нуклестида, отражая уменьшение эффектов межпонното взаимодействия, некоторое увеличение значений а(;Ц-Лр) может Сыть связано кг:-: о ростом степени диссоциации пелиэлектролитэ, так и увеличением подвижности полииснз. Однако, учитывая высокую плотность заряда молекулы поли(и) (|>1) и устойчивость ее вторичной структуры в исоле-дованном диапазоне концентраций полинуклеотида и соли, можно предположить, что степень ее диссоциации существенно не меняется. В таком случае увеличение значений й(;Ц+А.р) может быть связано с ростом подвижности полпиона при разбавлении.

Не посредственно оценить значения а и \р по методу Бинкз, исходя из полученных результатов, не представляется возможным без

Гзблща 2. Значения 1-р и ), полученные из коэффициентов .тиевйных зависимостей К от С3> обработанных по методу наименьших квадратов1 г (^^р). рассчитанные с использованием подхо-подгола Маннинта. _

:р(Ю 1-р ) (Винк-г' (Маннинг)

2,:- ю-3 0,891¿0,014 33,9±0,5 34,9+2,8

1.5-1 о-3 900+0,005 34,2+0,2 32,5+2,3

1.2*10-3 0,910+0,009 33,1+0,3 35,0+2,3

0.5-10-3 0,920+0,008 39,2±0,3 36,9+2,6

0,5- Ю-3 С,933+0,006 37,0+0,2 39,3+1,7

0,2-10-3 0,947+0.005 41.1+0.3 35,2+1,5

Доверительные интервалы рассчитаны с использованием

коэффициентов распределения Стьюдэнта для 55% вероятности.

Таблица 3. Средние значения параметров £ и а=£-1, рассчитанных по формуле (5.6) из зависимостей К от С3 для разных концентраций поли (С).__

ср(М)__С__а

2,0-10-3 4.(37+0,45 0,25+0,03

1,5-10~3 4,41 ±0,36 0,23±0,02

1,2-Ю-3 4,12+0,36 0,24+0,02

0,3-10~3 3.93±0,26 0,25±0.02

С,5-10~3 3,77±0,20 0,27+0.01

С, 2 • 10~3__. 4,39+0,23 _0,23±0,01

привлечения дополнительных данных. Однако такую оценку позволяет сделать предложенный выше подход Маннинта. Подставляя в уравнение (5.0) экспериментальные значения К, К0,Ср,С3 и Т, и решая его относительно £ методом итераций, получали зависимости £ и вычисляемых из £ параметроз - X (формула (1.6)) и а=£~1 ( степень диссоциации согласно Маннингу 12,3]) от Сд. Как оказалось, значения £ и а в пределах экспериментальной ошибки почти не зависят от концентраций соли и полинуклеотвда (их средние значения приведены в таблице 3). Полученные величины £ хорошо согласуются со значения?®, полученными для бессолевых растворов. Зависимости А.р от г, где г=Сд/Ср, рассчитанные для нескольких фиксированных концентраций полинуклеотвда приведены на рис.б. Как и следовало окидать. в соответствии с формулой (1.6), для 5=сопб^ наблюдается некоторое увеличение подеикюстй полииона при уменьшении концентрации как соли, так и полинуклеотида. Однако довольно Оольпие ошибки, получаемые

при расчет? не позволяют с-ni тать изменение Х^ при пони?:ен::н С,, достаточно достоверным. С целью сравнения подходов Винка к Манкс-ш-га интересно сопоставить величины полученные из .т. шейных

зависимостей К от Cs, в первсм случае, и рассчитанные из значений t_ - во втсром (табл.2). Хорошее совпадение -этих величин дает основание предполагать, что параметры а и А,,, рассчитанные с использованием теории Маннпнга, отрао-.акт реальную степень диссоциации и подвижность пслжсна при низкой концентрации пслдерхгзгвдегз электролита .

Изучение взаимодействия поли(С) с иондми сесебоа. Потенпио-метрическсе титрование раствороз Н^-полиСО и Хг-поли(С} раствором AgNO-, проводили с использованием Ая^-селективного электрода. Результаты тировання представляли в виде завись,юстей Скзтчерда Н/'[А£~]=/(?.) (р;:с.7), где R - число молей серебра, связанных с макромолекулой и отнесенных к молю нукдеспгдсв. Зависимости имеют кодсюолообразный вид для обен_х ферм, что является отведением кооперативного характера взаимодействия Ag~ с гголк(С). Экстраполяция ниспадающей части кривых на ось абцисс дает значение F.-D.5. Тзьзгм образом, стехиометрия комплекса, образующегося на зтем участке, составляет Ag:G=1:2. Из полученных графиков очевидно таюке, что взаимодействие ионов Ag+ с поли(0 имеет ?,:есто и вкде R=0,5, одна-, ко носит несколько иной характер. В случае Н+-поли(0 насыщение происходит при R-3,6-0,65, а в случае К+-поли(С) - при R=0,7-0,9 (в разных экспериментах). Наиболее вероятны?.! местом связывания ионов Ag~ с гуанином являются N(1) и M(7) атомы азота [7,81. 3 пер-Еом случае, в соответствии с преддсг:екны?о: ранее схемам спаривания оснований в изоионном и нейтральном растворах (дуплексы z и о(не протсннроЕанный по Х(7)) кэ рис.З) вза^одействие с обеими формам: доли(С: долзеэ приводить к вытеснению в раствор пр:токов. Зо втсром случае зктесненде протонов будет происходить только для -поли.G). Данные ксндуктсметрип и рН-метрии убедительно сеиде тельствуют в пользу второго предположения. Резкое увеличение удельной электропроводности, связанное с появлением в растворе подвио-оных Н~-ионоз, вытесняемых ионами серебра с протовдрованных N(7) атомов гуанина, происходит в изспоннсм раотЕоре до сооткоде-ния числа молей добавленного серебра на мель нуклэотадоз г=0,5-0,6. 3 этом хе диапазоне наблюдается пзнизекие рН изоискного раот-вооа, в то время как рН нейтральнных растворов полп;0) птоктич;с ни не меняется до г=',5. Е изоионном растворе един добавленный дон А5+ вытесняет более одного протона (стнопенхе числа молей проса-

гзс.7. Зависиюсти Скэгчарда, рассчитанные по результатам титрования Н*-поли(С-) ) и к+-поли(С) (Д) раствором А^Ж)-.

1е(к/[Аг+](п-Ю)

6.0 «г-зг* 0-Н+—ро1у(С)

5.0 Л-К+-ро1у(0

4.0 -

Я.П 1 1

0.0

0.4

0.8

.8. Результаты расчета констант связывания с Н+-поли(0 и Е^-полиСО из потенциометрических данных.

к

\

н:з, Еыделндщи.хся на моль добавленного серебра, рассчитанное из изменения рН, составляет 1,4). С учетом того, что в исходном изои-сннсм растворе часть 5+-ионов находится- в диссоциированном состо-янил ("23%), следует полагать, что ион Ag+ вз amo действует не с едким, а с двумя И(7) атомами полинуклеотида. Это еозмокно, если rS~ координируется между плоскостями соседних по цеп*.: оснований. Ггксе взаимодействие, как одно наиболее вероятных, предложено для комплекса Ag1": пол: I) в кислой среде C9Í. Координация между соседили GC л А'Т дарами оснований в В-спирали ДНК, не приводящая к ее разрушению, предложена также для комплекса Ag+:HHK первого типа (низкая степень насыщения) [81. 5 обоих случаях наблюдается появление КД-спектров, характеризующихся наличием отрицательных полос в областях 24С-250 и 260-2~0 км. Появление отрицательных полос в спектрах КД неоднократно отмечено при образовании комплексов ceoetna с различными поликуклестидамн. Хотя положение и ;:нтен-сивнсств полос з этих спектрах варьируют, их общий вид позволяет предположить, что изменения, вызываемые ионами серебра, в известном приближении носят общий характер и касаются геометрии спиральной структура. Взаимодействие ионоз серебра как с кислой, так и с нейтральной формам: псли(С) приводят к аналогичному изменению спектров КД. Они начинаются сразу после добавления первой порции раствора AgN0o и в основном заканчиваются при г«0,5-0,б (для Е^-поли С-)) и^0.7-0.3 (для К+-~оли(С)) Для обеих форм конечные спектры характеризуются появлением двух отрицательных полос при £""4-275 км и 223 км. Однако з случае Х+-поли(С) эти полосы менее всажены (особенно при 233 ел), что может быть связано с некоторым различием структур, образующихся пои взаимодействии серебра с кисло,! и нейтральней формами поли(0. Важно отметить, что структура, образующаяся в кнелей среде, довольно устойчива. Ее спектр, снятый чеоез 4 суток после приготовления рэстеорз, имеет тот же вил. Он не меняется также и при добавлении серебра выше соотношения г=1. В то же время для гГ-поли(0 наблюдается медленные изменения спектра пои доле AgT, добавленного на нукдеотид, вычле 0,5. По прошествии двух суток после добавления Ag+ (г=1,2) в спектре К+-поли(0 происходит исчезновение полос при 22с и 275 ем. Это может свидетельствовать о неустойчивости комплекса Ая:пели(С) в нейтральной среде пои высоком содержании добавленного серебра.

Таким образом, взаимодействие с доли (С-) можно представить следующей схемой. Свя.зыЕнпе ионов серебра с двухцепочечными Е'-полп' 3и гГ-по.ппЗ) происходит по !í:7) атому гуанинсЕого остатка. ~ои зточ атомы серебра кгдодккнгуются меэду плоскостями

взаимодействупдих гуанинов через пару оснований по цепи. сто обуславливает стехиометрию образующегося комплекса :2 и в случае Н+- поли(О приводит к выделених в раствор протонов. При связывании Ag+ выше И=0,5 с Н+-поли(3) и Е~-поли(3) происходит, по-видимому, встраивание ионов серебра в оставшиеся незаполненными межплоскостные промежутки по цепи пэлинуклэотида. В случае К+-поли(0 (й =0,8-0,9) это приводит к ее дальнейшему искажению и з конечном итоге к ее разрушению с течением времени. Б случае Н+-поли(3) образующийся комплекс более устойчиз и дополнительное связывание ионов серебра происходит лишь в незначительной степени.

Определение констант связывания под (О с ионами Ад"1". Расчет констант проводили на основе данных титрования растворов Н+-поли(С) и К+-поли [3) с Ал-селективным электродом по методу [10] а соответствии с формулой:

—_Б-=1£К-ь)«Н, (7)

1Ав+](п-Е)

где п - число мест связывания в расчете на нуклэотид, а ш - подгоночный эмпирический параметр, характеризующий кооперативность связывания. Общее количество мест связывания принимали равным эдини-'це. Однако расчет констант проводили раздельно для двух участков п= п.,+ п2= 0,5+ 0,5 в связи со стехиометрией образующегося на первом участке комплекса А£:С=1:2. Зависимости от И приведены на рис.8. Для Н+-поли(С) значения и на первом участке титрования составляют 5,3 и 2,0 соответственно. Для К+-поли(С) - 5,7 и 1,0. Полокительный наклон прямых в обоих случаях отражает кооперативный характер взаимодействия, а величины наклонов близки к значению -о)=1,65, полученному для олиго(0 в Ю'^М фосфатном буфере дауном и др. [101. Величина рассчитанная .в работе ПО] для

этих же условий, составила 6,0 и близка к значению 1§К^=5,7, полученному нами для нейтральной формы поли(С). Более низкое значение константы для Н+- форга объясняется, по-видимому, конкуренцией ионов с протонами за места связывания на полинуклеотиде. Характерно, что по мэре увеличения К величина для Н+- поли (С) приближается к величине для К+-поли(С) и уже при Н= 0.4 их значения совпадают и составляют 6,1. Различные значения кажущейся константы связывания в .кислой и нейтральной средах получены также при изучении взаимодействия А§+ с поли(1) [9]. При И= 0.3 значения 1£К составляли 6,4 (рН 4,0) и 7,3 (рН 8,0).

(

ВЫВОДЫ

■ 1. Ионообменный метод впервые попользован для получения изои-

OHinix растворов псл;:;а), а та;со:е различных солевых ферм

(ЬГ-,!1а+-, X+-,Rb"'"-,CsT- н !И+-солеП).

2-. Изоионные растворы й+-полн(С) исследованы методами потен-циометрического и кондуктомэтрзпеского тирования, кругового дихре-измз и УС-спектрсфотомзтрии в диапазоне концентраций от 2-1G-^ д; 2-10^М. Показано, что в изсионнсм растворе гго.та(0 облвлает стабильней двухпепочечной коп^осмацией, устойчивей к изменении ннет-гок услов/.й и нагревания и полностью саззушагсеЯся только ври добавлении свесхоквнзолентнсго количества ионов меди или в енльноше-лочной среле (рй 13,0). Показано, что при титрован:!:! лзсисннст: растЕсра щелочью происходит переход "кислой" формы в "нейтральную". Предложенный механизм перехода включает разрушение однс£ парной N(1)Н-0(6) водородной связи, поворот ссксзакий друг относительно друга и образование новой М(2)К-л'(Т) связи при гепро тонировании !i(7) атома гуанина. Образующаяся двухшепочечная структур: способна к самоассоциации с сСразоБаше-м классической четырехспи-ральной формы. Обнаружено такке, что переход в "нейтр »льнут" Форму происходит при создании' высокой концентрации пзддержиззюсэг: электролита (не менее 0,5 М).

3. Предложен новый метод расчета из кондуктометрических данных структурных и транспортных характеристик полинуклеотидов в растворе, опирающийся на подход Ыаннинга.

4. С целью проверки указанного подхода проведено кендуктомет-

рическое исследование, температурной и концентрационной денатурацпг

ZHK в растворах с низкой ионной силой при исходной концентрацпг

полинуклеотидз С = 2 мМ. Получено ховешее согласие патаметвев, ха-Р

рзктернзуюоих процесс денатурации, с литературными данными. Прт температурном плавлении -Г = 49"С, ширина перехода ссогэеиль -•< 12"С, а величина Ь менялась от 2,1 до -,2 1. При разбавлении пе-теход спираль-клубок происходил з диапазоне концентраций НУ. от ' до 0,1 -мМ, а значение b менялось от 2,3 до 4,2 I.

5. Изучено плавлен:« бессолевого раствора К+-по.тл(С-;. Показано, что плавление двухпепочечной структуры начинается выше £0°С г не заканчивается при S3"С. Обнаружено, что при медленном остывании раствора структура полностью восстанавливается.

6. Исследованы различные ионные фермы пели (С-) в нейтральней среде. Обнаружено, что в диапазоне концентраций полЕеуклеотшдз от С, 1 до 2,'2-мЛ ( а такгэ поддерживающего электролита при С4 С для К'-дол;* (С-)) - lis"1-, Х+-, Р.Ь4"- и ШП-соли шоли(С) характеризуется параметрами плотности ¡заряда, лежащими в диапазоне 4,2-5,3, что приблизительно в два таза меньше, чем для четырехнешочечной

конфсомацид (С = 8,4). Это позволил: предположить существование двухпепочечной кенформаюш полп(0'н условиях низкой ионной силы. Более низкие значения t, полученные для Ъ1+- и Cs^-солей, а также отличие их спектров КД от остальных солей, позволили сделать вывод о возможном специфическом взаимодействии этих ионов с поли(С). j

7. Показано, что подвижность полииона нелинейно зависит от концентрации полинуклеотида и уменьдается при увеличении его концентрации, а также концентрата! поддерживающего электролита.

8. Методам}! потенпиометрическего и кондукгокетрического■титрования, КГ и УФ—спектрометрии исследовано взаимодействие изоион-ной ("кислей") и "нейтральной" форм доли(0, полученных ионообменными методами, с ионами .Ag+. Обнаружено, что Ag+ кооперативно взаимодействует с кзоионнсй и нейтральной формами noj3î(G) до соотношения [Ag+]/Cp=1:2 (значения рХо , рассчитанные из кривых потенцло-метрического титрования с использованием метода Скэтчарда, составили 5,3; 5,7 соответственно); далее взаимодействие происходит некооперативно до соотношения 0,6-0,7 в изоионном растворе и 0,80,9 в нейтральном. Дальнейшее добавление серебра вызывает медленное разрушение комплекса, образовавшегося в нейтральной среде, и не оказывает существенного влияния на устойчивость "кислого" комплекса.

9. Показано, что добавление серебра вызывает выделение протонов только в случае "кислой" формы, причем один ион Ag+ Еытесняет более одного протона, а общее количество выделившихся протонов (с учетом диссоциации) эквивалентно содержанию нуклеинового фосфора.

10. На основе полученных данных предложена схема образования комплекса Ag:G=1:2, который образуется при координации ионов Ag+ между N(7) атомами соседних по цепи оснований двухцепочечной структуры поли(С). Исходя из стехиометрии комплекса следует считать, что такое внутрицепочечное взаимодействие происходит через пару оснований.

Цитируемая литература:

1. Лесник Е.А., Кочкина И.М., Тихоненко A.C., Варшавский Я.М.// Молекуляр. биология, 1980, т. 14, .VU, с.820-829.

2. Manning G.S.// J.Phys.Chem. 1975, v.79, Js3, p.262-265.

3. Manning G.S.// J.Plys.Chem., 1931, v.85, Je11, p.1506- 1515.

4. Record M.T.Jr., Woodbury C.P., Lohaan T.M.// Blopolymers, 1976, v. 15, JÉ5, p.893-915.

5. Zimmerman S.B., Cohen G.H., Davies D.R.// J.Moi.Biol., 1975,'

7.92, Jt2, p. 181-192. j

6. VIrik. H.// J.Chem.Soc.Faraöay Trans.1, 1984 , 7.80, Js2l p.507-514.

7. Matsuoka Y., Norden 3., Kurucsev f.// J.Phys.Cfcem., 1534, v.S3, Je5, p.971-976.

8. Korden B., Matsuoka Y.// Biopolyners, 1986, v.25, JS, p.1531-1545.

9. Silin Y.A., Eichhorn G.I.// Biopolpiers, 1980, v.19, Jö, p.539-556.

10.Daune M., Dekker C.A., Schachman H.K.// Bicpolymers, 1966, v.4, J61, p.51-76.

1. Козлов А.Г., Кузнецов И.А. Структурные особенности полиСО в изоионном растворе: спектры КД, потенциометрическое и кондукто-метрическое исследования// VIII Всесоюзный симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул. Тезисы докладов и стендовых сообщений, Новосибирск, 1990, т.2, с.136.

2. Козлов А.Г., Кузнецов И.А. Структура гомополинуклеотвдов в изоионном растворе и ее изменение при щелочном титровании. Спектры КД// VII Конференция по спектроскопии биополимеров. Тезисы докладов и стендовых сообщений, Харьков, 1991, с.136-137.

3. Козлов А.Г., Кузнецов И.А. Вторичная структура полирибогуакило-вой кислоты в кзоионных растворах: кислотно-основные свойства и спектры кругового дихроизма// Журн.физ.хим., 1991, т.65, .№4, с. 1047-1056.

4. Козлов А.Г., Давыдова О.В., Каргов С.И. Исследование бессолевых растворов полирибогуаниловой кислоты в растворе методом кондук-тометрии// Журн.физ.хим., 1993, т.67, Ш, с.1692-1696.

5. Козлов А.Г., Давыдова О.В., Каргов С.И. Кондуктометрическое исследование растворов полирибогуаниловой кислоты при низкой концентрации поддерживающего электролита. Сравнение подходов Винка и Маннинга// Журн.физ.хим., 1993, т.67, Ю, с.1697-1700.

Основное содеркание работы изложено в следующих печатных работах