Функциональная роль неканонических белковых факторов р50 и РТВ в инициации трансляции у млекопитающих

Писарев, Андрей Владимирович

Функциональная роль неканонических белковых факторов р50 и РТВ в инициации трансляции у млекопитающих тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Писарев, Андрей Владимирович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2003 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Функциональная роль неканонических белковых факторов р50 и РТВ в инициации трансляции у млекопитающих»

Автореферат диссертации на тему "Функциональная роль неканонических белковых факторов р50 и РТВ в инициации трансляции у млекопитающих"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА.

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ПИСАРЕВ Андрей Владимирович

Функциональная роль неканонических белковых факторов р50 и РТВ в инициации трансляции у млекопитающих

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2003

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического '

факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Иван Николаевич Шатский

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Борис Павлович Готтех доктор биологических наук, профессор Алексей Анатольевич Аграновский

Ведущая организация: Новосибирский институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится " 23 " декабря 2003 г. в 16* на 'заседании Диссертационного совета Д.501.001.41 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан "21" ноября 2003 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

И.Г. Смирнова

\ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время наблюдается значительный подъём интереса к вопросам регуляции трансляции у млекопитающих Следует подчеркнуть, что основная регуляция трансляции происходит на стадии инициации. Исследование механизмов инициации трансляции очень актуально на сегодняшний день, так как они точно установлены лишь для простых матриц с короткими и слабоструктурированными 5'-НТО и ряда вирусов с ПЧЕБ-зависимой инициацией трансляции.

Безусловно, одним из наиболее перспективных методов в изучении инициации трансляции является реконструкция инициирующих комплексов из очищенных и охарактеризованных компонентов. Его сочетание с техникой тоупринта, применяемой для визуализации комплексов, позволяет убедиться не только в их наличии, но и в "правильности" положения рибосомы на стартовом А1Ю-кодоне (при седиментации в сахарозном градиенте нельзя установить "правильность" комплекса, так как метод позволяет определить лишь коэффициент седиментации). По интенсивности сигнала тоупринта в сравнении с суммарной интенсивностью сигналов в дорожке можно оценивать эффективность сборки инициаторного комплекса. А точно известный набор используемых в сборке факторов дает возможность исследовать механизмы инициации трансляции. Метод реконструкции инициирующих комплексов помимо перечисленных преимуществ ещё и совершенно незаменим при исследовании трансляционного аппарата млекопитающих, поскольку в данном случае использование генетических методов крайне затруднено.

Помимо канонических факторов инициации трансляции, для активности ряда матриц в трансляции необходимы дополнительные белковые факторы, которые регулируют клеточную активность в развитии клетки, делении и апоптозе. Такие неканонические факторы инициации трансляции специфичны в трансляции на определённой стадии клеточного цикла, специфичны для клеток тех или иных тканей, а также отвечают на характерный стресс. Есть лишь общие соображения, касающиеся функциональной роли таких белков в клетке при трансляции, механизм же их действия доподлинно не известен. Многообразие и загадочность поведения в -трансляции ставят по важности исследования неканонических факторов инициации трансляции в один ряд с каноническими.

По направленности действия в инициации трансляции есть специфические и

общие неканонические белковые факторы, нагучшлр, рляр ц р5р двяаывякггея с

[ РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ 1 I ВИБЛИОТЕКА

1 С.Петер!

1 03 МО

ом?

большинством или даже со всеми видами мРНК и в целом контролируют белковый синтез. Р50 является наиболее широко представленным белком и неактивных, и активных полисомальных глобиновых мРНП, хотя последние содержат его в два раза меньше в расчёте на молекулу РНК. Переходы мРНК из неактивного в активное состояние и обратно сопровождаются изменением содержания р50 в составе мРНП.

РТВ, La-аутоантиген, unr, поли(С)-связывающие белки РСВР1 и РСВР2, hnRNPK и другие, в отличие от р50, являются специфическими неканоническими белковыми факторами, и их функциональная роль в инициации трансляции проявляется лишь для ряда определённых матриц. РТВ, в частности, требуется для образования 48S комплекса с IRES-элементами РНК ряда пикорнавирусов и с клеточной мРНК Apaf-1, продукт которой вовлечён в регуляцию клеточного апоптоза.

Обладая навыками реконструкции инициирующих комплексов из очищенных и охарактеризованных компонентов в сочетании с техникой тоупринта, мы поставили своей целью в данной работе исследовать по одному примеру неканонического фактора того и другого класса (р50 и РТВ) и выявить их функциональную роль и механизм действия в инициации трансляции у млекопитающих.

Цели исследования.

1. Определение условий активации и ингибирования неканоническим белковым фактором р50 образования 48S предынициаторного комплекса.

2. Изучение влияния неканонического белкового фактора РТВ на характер взаимодействия IRES-элемента РНК ВЭМК с компонентами трансляционного аппарата клетки.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе данной работы было показано, что неканонический белковый фактор р50 при низких концентрациях активирует, а при высоких- ингибирует образование 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов in vitro. Мы определи, что р50 стимулирует сборку 48S комплекса на стадии связывания 40S субчастицы с 5'-концом матрицы и, по-видимому, не оказывает влияния на процесс сканирования. Экспериментально найдено, что механизм стимуляции сборки заключается в эффективной конкуренции р50 с факторами инициации трансляции elF2 и elF4F за неспецифические места связывания и существенно меньшей конкуренцией за функциональные для последних участки взаимодействия на мРНК. При этом р50 связывается с мРНК по сахаро-фосфатному остову, предпочитая участки с

полностью неспаренными нуклеотидными основаниями, согласно нашим данным химического зондирования.

Вторая часть работы была посвящена исследованию неканонического белкового фактора РТВ в инициации трансляции у млекопитающих. Нами впервые показано, что РТВ значительно активирует сборку 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов in vitro на РНК ВЭМК и практически не оказывает влияния на аналогичную сборку с другим представителем пикорнавирусов, PTV-1. Стимуляция сборки на РНК ВЭМК обусловлена влиянием РТВ на характер взаимодействия IRES-элемента РНК ВЭМК с одним из основных

факторов инициации трансляции elF4G, о чём свидетельствуют наши эксперименты по тоулринту и УФ-сшивкам.

* Полученные результаты представляют несомненную значимость, так как

проливают свет на механизм действия двух представителей неканонических белковых факторов в инициации трансляции млекопитающих на молекулярном уровне, что абсолютно необходимо для дальнейшего изучения регуляции инициации трансляции мРНК в целом.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на заседании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ 23 мая 2003. Материалы работы докладывались на международной конференции "Translational control", Колд Слринг Харбор, США 2000г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 печатные работы. Структура и объём работы. Диссертационная работа изложена на 102 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор

f литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы, список

литературы. Материал иллюстрирован 21 рисунком. Библиографический указатель включает 236 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I I. PS0 в инициациии трансляции

1. р50 влияет на связывание 40S рибосомной субчастицы с инициаторным кодоном в сборке 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов in vitro.

Для выявления роли р50 в инициации трансляции был поставлен ряд экспериментов по его влиянию на сборку 48S предынициаторного комплекса на р-Glo мРНК. При сборке комплекса использовали очищенные и охарактеризованные

нативные и рекомбинантные факторы инициации трансляции (е1Р1, е1Р1А, е1Р2, е1РЗ, е1Р4Р, е1Р4А и е1Р4В), ретикулоцитные 40Э рибосомные субчастицы, Суммарную тРНК из печени телёнка, в которой только инициаторная тРНК была заряжена метионином; нативную глобиновую мРНК (р-в1о мРНК) и рекомбинантный р50. Сборку проводили при избыточных количествах факторов над матрицей и \ варьировали количество р50 в интервале 6-100 молекул белка на молекулу мРНК. В качестве контроля сборки 488 предынициаторного комплекса использовали весь набор компонентов за исключением инициаторной метиониновой-тРНК. При её -отсутствии 488-комплекс не собирается, и это позволяет судить о нулевом сигнале сборки. При сборке 488 предынициаторного комплекса в районе +16 - +18 открытой рамки считывания от А1Ю-кодона появляется сигнал тоупринта из трёх полос приблизительно одинаковой интенсивности. Именно по суммарной интенсивности 1 тройного сигнала и судят об эффективности сборки 48в-комплекса.

При сборке 488-комплекса в условиях избытка по факторам инициации трансляции лишь при 100-кратном избытке р50 над матрицей было обнаружено приблизительно 50%-ингибирование сборки 488-комплекса, тогда как вплоть до 30-кратного избытка никаких изменений в сборке по сравнению с контролем без р50 обнаружено не было (данные не показаны). В данном эксперименте не удалось обнаружить активирующего влияния р50 на сборку 488-комплекса. Было выдвинуто предположение, что избыточное количество факторов инициации не позволило обнаружить регулирующего механизма р50. В то же время данный эксперимент выявил ингибирующий эффект р50 на сборку. Так как ингибирование, причём незначительное, наблюдается лишь при гораздо больших избытках р50 по сравнению с остальными факторами, то на данном этапе исследований вполне правомерно можно отбросить выдвигаемую в литературе гипотезу о том, что р50 воздействует на инициацию трансляции путём прямого взаимодействия с факторами инициации трансляции (Еуйокотюуа, 1998). •

Полученные на предыдущем этапе исследований данные не смогли пролить свет на вопрос о позитивном влиянии р50 на инициацию трансляции, поэтому в -последующих экспериментах было решено понизить количество факторов инициации трансляции по сравнению с матрицей. В частности, заметно понизить (в 3 раза) количества ключевых мРНК-связывающих факторов инициации трансляции-е1Р2, е1РЗ и е1Р4Р- до 7,1,8 и 0,8пмоль, соответственно, на 1пмоль мРНК.

При сборке 488 предынициаторного комплекса в этих условиях также решено было поставить контроль на функциональность всех используемых факторов в отсутствие р50 при сборке 488-комплекса (все факторы инициации трансляции без

р50) и контроль на отсутствие сборки 488-комплекса при исключении одного из факторов (исключали еДО).

В систему с лимитирующими количествами факторов добавляли р50 в интервале 2-30-кратного молярного избытка по сравнению с матрицей. Полученные данные позволяют судить, что по мере увеличения количества р50 над матрицей растёт интенсивность сигнала сборки 488-комплекса. Причём наблюдается равномерный рост интенсивности сборки, без каких-либо скачков. Уже при 4-кратном избытке р50 над матрицей собирается на 20% больше комплекса по сравнению с контролем без р50. При 15-кратном избытке р50 сигнал вырастает в 2, а при 30-кратном избытке - в 4 раза (все данные - по сравнению с контролем без белка) (рис.1). (Следует заметить, что выход 48Э комплекса оценивался как процент суммарной радиоактивности полос тоупринта к суммарной радиоактивности в данной дорожке; таким образом исключаются любые позитивные и негативные эффекты р50 на саму реакцию обратной транскрипции, используемойпри тоупринте).

12345678СТАв

'дЦ^^ЦЛ^Р^^ тЛ ф

«w шш щт •

принтС

рбО/мРНК 0 2 4 8 15 30 60 К

48S комплекс % выхода 4 5 6 8 10 16 5 0

Рис.1 Влияние р50 на реконструкцию 48S предынициаторного комплекса на р- тобиновой мРНК. В подписи указано молярное соотношение р50/мРНК. К- контрольный эксперимент, в котором опущен elF2. Положение инициаторного AUG кодона показано в правой части рисунка. Выход 48S комплекса рассчитывали с помощью фосфоримиджера.

Уже на данном этапе исследований можно было сделать вывод, что р50 участвует в инициации трансляции не на стадии присоединения бОБ-субчастицы к 486 предынициаторному комплексу. Эффект проявляется на более раннем этапе инициации трансляции- на этапе сборки 48Б предынициаторного комплекса.

Данные, полученные в предыдущих экспериментах, обнаружили в одном случае лишь ингибирующий эффект, в другом - лишь активирующий эффект р50 в инициации трансляции. В следующем эксперименте решено было сохранить условия ограничения по факторам инициации, но при этом расширить диапазон концентраций р50, чтобы попытаться обнаружить оба эффекта и активации, и ингибирования в одном опыте. По сравнению с предыдущим экспериментом, к избыточным количествам р50 над матрицей было добавлено 2 новые точки: 60- и 100-кратный молярный избыток р50 над матрицей.

Полученные в этом опыте результаты полностью соответствовали данным двух предыдущих экспериментов. Вплоть до 30-кратного избытка р50 над матрицей наблюдался равномерный рост сигнала сборки 488 предынициаторного комплекса, после чего, однако, при 60-кратном избытке белка интенсивность сигнала сборки резко уменьшилась и составила лишь 125% от сигнала в случае отсутствия р50 в системе (см. рис.1), а при 100-кратном избытке белка уже 51%.

Из данного эксперимента можно сделать вывод, что в зависимости от количественного отношения р50 к мРНК, он может выступать в роли как активатора, так и ингибитора стадии инициации трансляции. При этом химическая природа белка в обоих случаях одинакова, и переход комплекса из активированного состояния в репрессированное никак не связан с посттрансляционной модификацией р50.

Наиболее правдоподобная гипотеза механизма действия р50, подтверждаемая полученными экспериментальными данными, предполагает, что неспецифическое сродство р50 к РНК и присутствие многих копий р50 на матрице может защищать матрицу от неспецифического связывания с факторами инициации трансляции по всей длине матрицы, таким образом, внося вклад в их функциональное связывание с 5'-нетранслируемой областью мРНК. Действительно, можно предположить, что по мере увеличения количества р50 над матрицей, поступающие в систему молекулы белка неспецифически, а поэтому более менее равномерно, количественно связываются вдоль всей молекулы мРНК, вытесняя с матрицы сидящие не на своих местах и также неспецифически связанные факторы инициации трансляции. Подобная тенденция наблюдается вплоть до 30-кратного

избытка р50 над матрицей, когда, по-видимому, все факторы инициации трансляции вытеснены из мест неспецифического связывания с матрицей.

РНК-связывающую способность любого фактора можно условно разделить на две составляющие: специфическую составляющую и неспецифическую составляющую. Специфическая составляющая отвечает за взаимодействие фактора с определённой нукпеотидной последовательностью или третичной • структурой матрицы в акте инициации трансляции. Неспецифическая составляющая отвечает за связывание фактора по сахаро-фосфатному остову матрицы. Вытесненные с матрицы белком р50 факторы инициации трансляции не могут далее конкурировать за неспецифическую составляющую связывания, что неизбежно ведёт к увеличению доли специфического, а значит функционального связывания факторов. Именно этим может объясняться рост интенсивности сигнала сборки 48Э предынициаторного комплекса по мере увеличения отношения количества р50 к матрице вплоть до 30 молекул на молекулу мРНК.

При больших концентрациях в системе р50 становится способен конкурировать и за места связывания с РНК, являющиеся функциональными для факторов инициации. Такая конкуренция упрощается при ограниченных концентрациях факторов инициации в системе, что и удаётся наблюдать в данных экспериментах.

Таким образом, логично предположить, что при высоких концентрациях р50 в системе конкуренция за места связывания, являющиеся функциональными для факторов инициации трансляции, идёт по закону действующих масс. Согласно этому предположению, добавление в систему РНК-связывающих факторов в условиях ингибирующего эффекта р50 на сборку 48Э предынициаторного комплекса, должно возвращать систему в состояние с максимальным сигналом сборки 485-комплекса. Поэтому в следующем эксперименте в систему с 48Б-комплексом в присутствии 60-кратного количественного избытка р50 над матрицей ' поочерёдно добавляли разные количества РНК-связывающих факторов. В частности, увеличивали в 2-3 раза количества следующих факторов: е1Р2, е1РЗ и е1Р4Р (рис.2).

Введение в систему избытка фактора е1Р4Р привело к ожидаемому эффекту. Появление дополнительного количества е1Р4Р обеспечило повышение конкурентной способности этого фактора за свой функциональный сайт на матрице (5'-конец), следствием чего явилось увеличение интенсивности сигнала сборки 48Б предынициаторного комплекса. Но всё же сигнал не был столь интенсивен, как в опыте с 30-кратным избытком р50 над матрицей.

12 3 4 5 6 7 8

# А # ^

-ЛЬ Шк ШЁк Шк

т -

ХЛшфшффтшЩ

р90/мРНК ! 0 301 во

§ & ч с • с » с •

я а д & я

Рис.2 е1Р2 и е!Р4Р обращают ингибирование образования 488 комплекса при высоких соотношениях р50/мРНК. Дорожки 1-3 содержал- стандартные концентрации факторов. Концентрация факторов е1Р2, е1РЗ или е!Р4Р в доракках 4-8 была в 2-3 раза больше, чем в стандартном протоколе сборки.

Появление в системе избыточного количества фактора е!Р2 резко усиливало

сигнал сборки 488 предынициаторного комплекса. Увеличение интенсивности

достигало значения, наблюдаемого в опыте с 30-кратным избытком р50 над мРНК.

Система оказалась очень чувствительной к концентрации фактора е1Р2. Сильное

увеличение сигнала сборки и полное обращение ингибирующего эффекта р50 ещё

раз подтвердили правомерность предполагаемой гипотезы о механизме

функционирования р50.

2. р50 способен стимулировать образование аберрантного 488 комплекса на 5'-конце мРНК. Пестовой и др. ранее было показано, что исключение инициаторных факторов е!Р1 и е1Р1А из реконструкционной смеси приводит к образованию аберрантного инициаторного комплекса на самом 5-конце мРНК. Для образования подобного аберрантного комплекса необходимы все другие факторы инициации трансляции, включая инициаторную мет-тРНК. Хотя такой комплекс не является промежуточным в образовании функционального инициаторного 488 комплекса, по его образованию и динамике можно судить о стадии, на которой в инициации трансляции функционирует р50: стимулирование связывания рибосомы с матрицей, или он необходим для сканирования 5-НТО матрицы в поисках стартового кодона. В

частности, обладая расплетающей активностью (Skabkin, 2001), участвует ли р50 в расплетании вторичной структуры 5'-лидера р-глобиновой мРНК в ходе сканирующего процесса?

Для ответа на поставленный вопрос нами был проделан эксперимент по реконструкции 48S инициаторного комплекса из очищенных компонентов по описанной выше методике, причём в конечную смесь не добавляли лишь факторы первой группы: elF1 и elF1A. В такой системе можно наблюдать образование аберрантного 48S комплекса на 5'-конце р-глобиновой мРНК (рис.3). В присутствии же факторов первой группы собирается функциональный 48S инициаторный комплекс на AUG кодоне. Добавление р50 в систему с аберрантным комплексом (вплоть до 30-кратного молярного избытка по отношению к матрице) приводит к пропорциональному нарастанию количества последнего. Дальнейшее увеличение р50 в системе до 60-кратного молярного избытка приводит уже к ингибирующему эффекту, по аналогии с реконструкцией функционального 48S инициаторного комплекса (см. выше).

12346СТА6

р-шнонмйюмммв g - | *

ttSastmntm У _ "у

- - . L ♦

pSWMPHK 0 0 ю|» н

+ --

б'-коицмой аомгеихс, выход % в М Мм 5

Рис.3 Влияние р50 на реконструкцию 5'-концевого аберрантного комплекса 408*р-глобиновая мРНК, образующегося при отсутствии факторов инициации е1Р1 и е1Р1А.

Таким образом, поставленный эксперимент позволяет сделать вывод, что стимулирующий эффект р50 не основан на участии белка в сканирующем процессе 5'-лидера р-глобиновой мРНК.

3. рбО связывается с сахаро-фосфатным остовом мРНК, проявляя предпочтение к последовательностям, содержащим полностью неспаренные нуклеотидные основания.

Опубликованные ранее результаты (Еус)о1атоуа, 1995) позволяют предположить, что р50 не узнаёт нуклеотидные основания мРНК. Проведённое нами химическое зондирование комплекса р50/р-глобиновая мРНК подтвердило это предположение. При обработке бинарного комплекса р50/мРНК реактивами йМЭ (А и С нуклеотидные остатки) и СМСТ (I/ остатки) защит нуклеотидных оснований выявлено не было.

При соотношении р50/мРНК около 30, сайты защиты белком р50 сахаро-фосфатного остова оказались распределены по всей длине р-глобиновой мРНК с предпочтением к некоторым последовательностям мРНК (данные не показаны). Такое предпочтение может быть объяснено различным потенциалом разных нуклеотидных последовательностей к спариванию оснований. В свою очередь, это может приводить к разной силе связывания р50 с различными участками мРНК. РбО, как известно, имеет намного большую аффинность к одноцепочечным, чем двуцепочечным нуклеиновым кислотам.

Рисунок 4 представляет очевидную иллюстрацию данного утверждения. В показанном эксперименте эффект р50 на сборку 48Э комплекса изучался на (САА)„-р-глобиновой мРНК. Эта мРНК отличается от природной р-глобиновой мРНК только 5'-нетранслируемой областью, СААСАА(САА)19САССА1ЮС...., которая составляет всего 1/10 от длины целой мРНК и не имеет поли(А) хвоста. (САА)„-лидер на все ~ 100% находится в одноцепочечной конформации (Тгагеуа, 1994). Такая особенность лидера понижает требования к некоторым факторам инициации и делает матрицу очень эффективной в образовании 48Б комплекса. С (САА)п-р-глобиновой гибридной мРНК заметное ингибирование тоупринта наблюдается уже при 10-кратном соотношении р50/мРНК (рис.4, дорожка 4), что в 6 раз меньше соотношения, при котором ингибируется сборка 488 комплекса в случае р-глобиновой матрицы (сравн. с рис.1 и 2). Для природной р-глобиновой матрицы при 10-кратном соотношении р50/мРНК напротив наблюдается стимулирующий, а не ингибирующий эффект.

СТА61134И

■ уев««-- пр«"т

| 0 12 {Д |10|301<50|р!И1ИРИК"|

Рис.4 Влияние р50 на сборку 48Б предынициаторного комплекса на (САА)п-р-гпобиновой мРНК.

Приведённые данные представляют убедительное доказательство о значительном предпочтении белком р50 последовательных участков из неспаренных нукпеотидов. Молекулы р50, связываясь с (САА)п-мРНК, концентрируются, прежде всего, в пределах её неструктурированного 5'-лидера и, таким образом, обеспечивают локальный ингибирующий эффект (см. рис.6). С этой точки .зрения неудивительно, что мы не наблюдали стимуляции белком р50 образования 488 комплекса с (САА)плидером при отношениях р50/мРНК меньших, чем 10. В данном случае, эффект стимуляции нивелировался конкурентным по отношению к факторам инициации связыванием р50 с (САА)„-лидером.

4. Связывание всего нескольких молекул р50 на молекулу р-глобиновой мРНК достаточно для стимуляции образования 488 предынициаторного комплекса.

Для подтверждения той или иной идеи о механизме действия р50 на образование 488 комплекса необходимо знать сколько молекул белка достаточно для связывания с мРНК, чтобы наблюдать эффект.

Экспериментальные условия для сборки 48Э комплекса включают добавление огромного избытка незаряженной тРНК, которая не принимает участия в процессе реконструкции. Хотя тРНК имеет очень низкую аффинность к р50, её высокая концентрация может секвестрировать некоторое количество белка.

Поэтому необходимо было оценить реальное количество молекул р50, связанных с р-глобиновой мРНК в присутствии большого избытка тРНК. Для этого 32Р-меченную р-глобиновую мРНК с известной удельной активностью' проинкубировали в буфере для реконструкции с р50 в присутствии всех

компонентов инициации трансляции, необходимых для сборки 48в предынициаторного комплекса. Было выбрано соотношение р50/мРНК равное 30. Комплекс мРНК*р50 был отделён от несвязавшихся р50 и тРНК -центрифугированием в сахарозном градиенте, и количество мРНК в пике мРНП определили по методу Черенкова. Аликвоты из трёх разных фракций пика мРНП с уже известными количествами РНК далее анализировали электрофорезом по Лэмли параллельно с серией взятого в известных количествах р50. После переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану, соответствующие полосы проявляли, используя коммерческий препарат для вестерн-блоттинга (рис.5В).

Рис.5 Количественное определение р50 иммуноблоттингом в комплексе

р50*р-гпобиновая мРНК. Комплекс р50*р-тобиновая мРНК собирали в

условиях 30-кратного молярного избытка белка над матрицей в присутствии

всех компонентов трансляции, необходимых для реконструкции

48Б комплекса и отделяли от несвязавшегося р50 центрифугированием в

сахарозном градиенте. (А) показывает профиль сахарозного градиента

комплекса р50*р-глобиновая мРНК в присутствии большого избытка тРНК

(заштрихованные квадраты) и в его отсутствии (полые кружки). Стрелками

показаны фракции, использовавшиеся для определения соотношения

р50/мРНК в пике мРНП Седиментация свободной р-глобиновой мРНК

показана заштрихованными треугольниками. (Б) показывает иммунный ответ

разных количеств р50 на антитела и соответствующий калибровочный график. 4

(С) показывает иммунный ответ антител на бОмкл аликвоты из трех разных

фракций пика мРНП, изображённого на рис 5А. Каждая бОмкп аликвота из

фракций 19-21 содержала около 20нг (~0,1пмоль) р-глобиновой мРНК. \

В серии независимых экспериментов соотношение р50/мРНК в пике мРНП варьировало в диапазоне 6-8. Эти значения показывают среднее количество молекул р50, связанных с р-глобиновой мРНК при пороговом значении соотношения мРНК и р50 в исходной смеси (р50/мРНК~30), при котором сборка 48Э предынициаторного комплекса максимальна.

5. Р50- "менеджер" мРНК-белковых взаимодействий в мРНП млекопитающих.

В проделанных экспериментах нам удалось подтвердить, что р50 играет не только негативную, но и позитивную роль в трансляции, и что такой позитивный эффект проявляется на стадии инициации трансляции. Стимуляция достигает

¡11

своего максимума, когда менее чем 10 молекул р50 связано с одной молекулой размера кроличьей р-глобиновой мРНК (589 нукпеотидов без поли(А)-хвоста). Стимуляция уже наблюдается при много меньших соотношениях р50/мРНК (см. рис.1), и, таким образом, можно утверждать, что при таких соотношениях среднее расстояние между связанными молекулами р50 составляет более 100 нуклеотидов.

Нукпеотидные основания не принимают участия в связывании р50 с мРНК. Р50 связывается с сахаро-фосфатным остовом и не имеет предпочтения к определённым нуклеотидным мотивам мРНК. Тем не менее, он имеет большое предпочтение к последовательностям с неспаренными или, возможно, слабоспаренными нуклеотидными основаниями. Можно спекулировать, что такие свойства делают мишенью р50 в первую очередь наиболее неструктурированные участки молекулы мРНК, которые, возможно, также являются предпочтительными местами для аберрантного связывания факторов инициации трансляции или других мРНК-связывающих белков. Так как неспецифические РНК-белковые взаимодействия протекают по сахаро-фосфатному остову РНК, р50 эффективно вытесняет другие белки из несоответствующих сайтов связывания, не оказывая конкурентного влияния (при невысоких его концентрациях) за функциональные участки взаимодействия, в которые, как правило, вовлечены нукпеотидные основания. Отсюда можно легко вообразить, почему всего нескольких молекул р50 достаточно для стимулирования инициации трансляции, процесса, который заключён в довольно ограниченном участке нукпеотидной последовательности мРНК (5-НТО).

Предложенная нами модель ("конкурирующая модель") (рис.6) описывает р50 как основного организатора РНК-белковых взаимодействий в мРНП.

"" гис.0 модель стимулирующего и ингиоирующего впиннщ рои на

образование 48в комплекса. Модель показывает как р50 может вытеснять е1Р4Р и другие основные факторы с несоответствующих мест на мРНК, оставляя, таким образом, их свободными для инициации трансляции на 5'-мэнце мРНК, а также, какр50 в результате конкуренции на 5-конце разных мРНК ингибирует инициацию трансляции 4Е означает е!Р4Е; 4А- е!Р4А.

без р50

Интригующее предположение заключается в том, что некоторые или все типы клеток млекопитающих могут регулировать общий уровень белкового синтеза . простым изменением внутриклеточной концентрации р50. Из эксперимента, представленного на рисунке 4, возможно предположение, что такой путь может дифференциально влиять на экспрессию мРНК с неструктурированными и высоко > организованными 5'-нетранслируемыми областями.

II. РТВ- активный участник инициации трансляции на IRES-элементе РНК вируса энцефаломиокардита, В настоящее время известны три основных пути связывания мРНК с 40S

субчастицей рибосом у эукариот: классический кэп-зависимый путь, шунтирующий

механизм и 1RES- зависимый способ инициации трансляции. При IRES-зависимом

способе, 40S субчастица связывается не с 5'-концом мРНК, а со специфическим

внутренним участком ее 5-НТО, иначе IRESom. Классическим примером 1RES-.

элементов являются специфические участки связывания рибосом РНК

пикорнавирусов, к которым относится и мышиный вирус энцефаломиокардита

(ВЭМК, группа кардиовирусов). Известно, что IRES-элементы пикорнавирусов

используют те же канонические факторы инициации трансляции, что и кэп-

зависимые мРНК, но, в отличие от последних, главным компонентом, узнающим

IRES-элемент, является не кэп-связывающая субъединица (elF4E) фактора

инициации elF4F, а его большая субъединица (eiF4G), обладающая РНК-

связывающими свойствами.

Помимо канонических инициирующих факторов трансляции, инициация на 1RES- элементах пикорнавирусов требует также специальных вспомогательных мРНК-связывающих белков. Белок РТВ требуется для образования 48S комплекса с IRES-элементом РНК вируса Тейлера (Pilipenko, 2000). IRES-элементы вирусов полиомиелита и риновирусов требуют в дополнение к РТВ еще белков unr и РСВР (poly(C)-binding protein) (Belsham, 2000), а IRES-элемент вируса ящура - РТВ и т.наз. ITAF 45 (Pilipenko, 2000). Функциональная роль этих белков и, в частности, РТВ не известна. По поводу требования РТВ для образования 48S комплекса на IRES-элементе РНК ВЭМК в литературе имеются противоречивые сведения. В данной работе мы представляем убедительные доказательства того, что РТВ обладает очень сильным эффектом при сборке 48S комплекса на IRES-элементе РНК ВЭМК дикого типа. Мы также получили некоторые важные данные о функциональной роли этого загадочного белка в образовании 48S комплекса на > РНК ВЭМК и, возможно, других пикорнавирусных РНК, имеющих сходный с РНК ВЭМК тип строения IRES-алемента.

1. РТВ значительно усиливает сборку 48S инициаторного комплекса на РНК ВЭМК из очищенных компонентов in vitro.

Для выявления роли РТВ в инициации трансляции был поставлен ряд экспериментов по его влиянию на сборку 48S предынициаторного комплекса. В качестве матрицы использовали транскрипт, синтезированный в Т7-полимеразной системе. Транскрипт покрывал последовательность 315-846 IRES-элемента РНК ВЭМК, сцепленную с начальным участком кодирующей части мРНК люциферазы светлячка. При сборке комплекса использовали очищенные и охарактеризованные нативные (elF2, e!F3, elF4F, elF4A и elF4B) и рекомбинантные (elF1, elF1A) факторы инициации трансляции, асцитные и выделенные из клеток HeLa 40S рибосомные субчастицы, и, соответственно, РТВ. Вместо суммарной тРНК в систему добавляли искусственно синтезированную (Т7 полимеразной транскрипцией) инициаторную . метиониновую тРНК, заряженную метионином. В предыдущей работе по р50 мы использовали суммарную тРНК, так как на тот момент не было известно, что возможна замена последней на искусственно синтезированную тРНК с сохранением её функциональной активности в сборке 48S комплекса (Pestova, 2001).

Сборку проводили при насыщающих количествах канонических факторов над матрицей и варьировали количество РТВ в интервале 2-20 молекул белка на молекулу мРНК. В результате мы подтвердили, что из канонических инициирующих факторов IRES РНК ВЭМК строго требует только elF2, elF3, elF4F (последний может быть заменен на elF4G + elF4A) и избытка свободного elF4A. Добавление рекомбинантного белка РТВ в возрастающих количествах к системе реконструкции 48S комплекса приводило к прогрессивному возрастанию выхода 48S комплекса. Максимальная стимуляция, оцененная с помощью фосфоримиджера, составляла от 5 до 6 раз (рис.7). Стимулирующий эффект наблюдался уже при 2-х кратном молярном избытке РТВ над матрицей.

Проделанные эксперименты позволяют нам полагать, что в споре о необходимости РТВ для инициации трансляции на РНК ВЭМК можно наконец-то поставить точку: РТВ необходим для инициации трансляции на всех изученных к настоящему моменту IRES-элементах РНК для групп кардио-, афто-, рино- и полиовирусов, хотя его отсутствие сказывается на образовании 48S комплекса с РНК ВЭМК не столь фатальным образом, как в случае других пикорнавирусов.

2. РТВ проявляет свойства РНК-шаперона.

Согласно литературным данным (Pestova, 1996), фактор инициации elF4F, вернее его субъединица elF4G, с высокой константой связывания взаимодействует с районом основания J-K домена IRESa ВЭМК (рис.8). Образование такого

бинарного комплекса стабилизирует вС-богатый стебель у основания домена .1-К, что в свою очередь приводит к резкому усилению остановки обратной транскрипции в положении С786 в комплексах 1ЯЕ5-е1Р4Р(4в) (см. рис.8).

1»34в С ТА«

Рис.7 Влияние РТВ на образование 488 инициирующего комплекса с ШЕв-элементом РНК ВЭМК.Дорожка 'К" (контроль) показывает тоупринт инкубационной смеси, где не бы л добавлен фактор е1Р2 и инициаторная тРНК. Молярное соотношение РТВ/РНК в дорожках З-б равно 2, 6 и 20, соответственно. В дорожке 2 РТВ отсутствует. Справа от дорожек с тоупринтом показан сиквенстого же участка нуклеотидной последовательности, полученный стой же затравкой для соответствующей кДНК.

Нами был успешно повторен такой эксперимент, при этом для большей ясности картины мы поставили ряд дополнительных контролей, в частности, помимо бинарного комплекса е1Р4Р+РНК ВЭМК тоупринтом анализировали комплексы е1Р4Р+е1Р4А+РНК ВЭМК и е1Р4Р+е1Р4А+РТВ+РНК ВЭМК (с различной концентрацией РТВ) (рис.9). Оказалось, что добавление в дополнение к е1Я4Р избытка е1Р4А приводит к появлению ранее никем не замеченной дополнительной полосы в положении 11780.

Ещё одним интересным наблюдением в нашем эксперименте оказалось то, что добавление РТВ к комплексу е1Р4Р+е1Р4А+РНК ВЭМК приводит к резкому ослаблению полосы в положении 1)780, но не оказывает отрицательного влияния на интенсивность полосы в положении С786. Причём эффект "прямо пропорционален количеству добавленного РТВ, и в случае 20-кратного молярного избытка РТВ над матрицей полоса и780 полностью исчезает. Эти данные позволили сделать предположение, что РТВ каким-то образом влияет на взаимодействие е1Р4Р с доменом ,1-К 1РЕЗ-элемента РНК ВЭМК.

Рис.8 Схематическое избрахоение ИЗЕв-элемента РНК ВЭМК. Домены вторичной структуры элемента обозначены латинскими буквами. Участил, зачищаемые фактором е1Р4Р или РТВ от химической или ферментативной модификации, отмечены чёрными крестиками и квадратиками, соответственно. Стрелками указаны места остановки ревертазы при обратной транскрипции комплексов 1РЕ8-элемента с е1Р4Р (положение 786) и с е1Р4Р+е1Р4А(780 и 786). Положение инициирующего кодона показано чёрным прямоугольником. А>С550- положение мутации, исследованной в работе (см. результаты и обсуждение).

Подтверждение этому предположению было получено в опытах по УФ-сшиванию комплексов инициирующих факторов с РНК ВЭМК. Для этого РНК метили в системе Т7-транскрипции [32Р] ЦТР, инкубировали со смесью факторов и РТВ в буфере для реконструкции 48в комплексов и облучали УФ-светом с длиной волны 257 нм. Для снятия фона от неспецифических РНК-белковых взаимодействий в смесь также добавляли 10-кратный весовой избыток однотяжевой РНК, которая представляла собой кодирующую часть РНК ВЭМК. Таким образом, из игры -выводилась кодирующая часть РНК ВЭМК, а наблюдавшиеся сшивки отражали взаимодействия, происходящие лишь на ПЧЕЭе.

Рисунок ТО наглядно демонстрирует взаимное влияние факторов и РТВ при взаимодействии с 1ВЕ5-элементом РНК ВЭМК. Фактор инициации е!Р4Р усиливает

CTA012345

Рис.9 Влияние PTB на остановку обратной транскрипции на комплексе IRES-элемента с факторами elF4F и elF4F+elF4A. В скобках указаны количества РТВ, добавленные в инкубационную смесь, в расчёте на 1пмоль РНК. Положения U780 и С786 соответствуют специфическим для комплексов местам остановки обратной транскрипции. Сиквенс соответствующего участка РНК ВЭМК приведён слева.

р110> рбб-

PTB-Î

PTB-i

Рис.10 УФ-сшивание различных комбинаций е1РЗ, е!Р4Р+е1Р4А и РТВ с [=Р]-меченным ¡ИЕв-элементом РНК ВЭМК. Обознанешя р116, р110 и рбб слева от геля (а) соответствуют субъединицам фактора е!РЗ.

( i

пришивку elF3 (рис.Юа), о чём свидетельствует увеличение интенсивности полос, соответствующих положению субъединиц рбб, рЮО и р116 фактора elF3. И это естественно. Поскольку elF4G взаимодействует с J-K доменом, а центральный участок фактора- с elF3, тем самым повышается константа связывания фактора elF3 с IRESom. В свою очередь elF3 стимулирует пришивку РТВ (рис.106), а elF4F + elF4A ее снижают (рис.Юв). Пришивание elF4A никак не меняется при различных комбинациях остальных белков. Отсутствие на представленных гелях полосы для пришитого elF4G не удивительно. Во-первых, это очень большой белок (подвижность в геле как 220 кДа) и его сшитый комплекс плохо входит в гель. Во-вторых, в участке связывания elF4G почти нет неспаренных остатков U, которые в наших экспериментах несли [32Р] метку. 1 Однако самым замечательным наблюдением, сделанным в этом

эксперименте, является появление интенсивной полосы пришивки фактора elF4E (он обычно представлен дублетом, вероятно вследствие частичного фосфорилирования или существования его изоформ), обусловленной присоединением РТВ к IRES-элементу (рис.Юг). Само по себе взаимодействие eiF4E с РНК ВЭМК вряд ли имеет какое-нибудь функциональное значение, поскольку достоверно известно (см. выше), что кэп-связывающая субъединица elF4E не нужна для взаимодействия elF4F (вернее его большой субъединицы elF4G) с IRES-элементом РНК ВЭМК.

По нашему мнению, резкое усиление его пришивки говорит о том, что под действием РТВ район elF4G, прилежащий к участку связывания elF4E, входит в контакт с каким-то участком IRES-элемента РНК ВЭМК (рис.11). В результате такой „ конформационной перестройки IRES-элемента и/или фактора elF4G, последний,

вероятно, переходит из менее в более компетентное состояние для развития дальнейшего процесса инициации трансляции на РНК ВЭМК. Например, можно

предположить, что при этом корректируются контакты с РНК других инициирующих факторов, взаимодействующих с фактором elF4G и принимающих участие в узнавании инициирующего кодона.

Однако в экспериментах по химическому зондированию нам не удалось обнаружить изменений во вторичной структуре IRESa РНК ВЭМК при его взаимодействии с РТВ (хотя пРТВ- гомолог РТВ из нейронов- способен расплетать довольно протяженный участок IRESa мРНК Apaf-1 (Mitchell, 2003)).

В любом случае полученные результаты впервые дают наглядное экспериментальное обоснование существующего мнения, что РТВ модифицирует РНК-белковые взаимодействия, то есть обладает свойствами РНК-шаперона. ! 19

834

AUG-

J J

Рис.11 Схема иллюстрирует влияние РТВ на характер взаимодействия фактора elF4F с IRES-апементом РНК ВЭМК. Домены IRESa обозначены латинскими буквами. Для домена I показано только его основание. РТВ, как полагают; функционируете форме димера, взаимодействуя одновременно с доменами Н, J/K и L (Kolupasva, 1996).

3. Функция РТВ в IRES-опосредованной инициации трансляции на РНК ряда пикорнавирусов специфична, но не распространяется на все пикорнавирусы.

Своими экспериментами мы обобщили необходимость РТВ для трансляции всех известных пикорнавирусов. Но это не означает, что и новые семейства пикорнавирусов будут требовать РТВ для трансляции. А также не означает, что РТВ необходим вообще для любых IRESob. Чтобы это проверить, нами был поставлен опыт по сборке 48S инициаторного комплекса из очищенных компонентов в присутствии и отсутствии РТВ по уже описанной выше методике, однако в качестве контрольной пикорнавирусной матрицы мы использовали РНК PTV-1 (от англ. porcine teschovirus-1 Talfan) - представителя недавно открытого нового класса тешовирусов семейства пикорнавирусов.

Здесь уместно несколько слов сказать о самом вирусе. Совместно с группой Белшама (Великобритания), которая предоставила нам РНК данного вируса и локализовала минимальный участок 5'-НТО, сохраняющий свойства IRESa РНК PTV-1, мы определили минимальный набор факторов инициации трансляции, достаточный для реконструкции 48S предынициаторного комплекса на PHKPTV-1. Вспомним, что IRES-элементы пикорнавирусов содержат порядка 450 нуклеотидов и для трансляции используют большинство клеточных канонических факторов инициации. Группа Белшама показала, что 280 нуклеотидов 5'-нетранслируемой области РНК PTV-1 достаточно для эффективной внутренней инициации трансляции как in vitro, так и in vivo. Используя метод тоупринта, нами было

показано, что для сборки 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов на IRESe РНК PTV-1 достаточно только 40S рибосомной субъединицы, фактора elF2 и инициаторной метиониновой тРНК, заряженной метионином.

Далее, методом центрифугирования в сахарозном градиенте мы показали возможность образования бинарного комплекса 40S*IRES PTV-1, а обнаружив дополнительные полосы в области IRESa в эксперименте футпринтинга бинарного комплекса elF3*IRES PTV-1, доказали возможность прямого взаимодействия фактора elF3 с IRESom PTV-1 (данные не показаны). Таким образом, можно утверждать, что IRES PTV-1 обладает свойствами, полностью отличными от других "

пикорнавирусных IRES-элементов, но сильно напоминающими свойства IRESa HCV (вируса гипатита С) (от англ. hepatitis С virus).

Сравнение нукпеотидных последовательностей IRESob PTV-1 и HCV (с помощью компьютерных программ) выявило существование островков высокой гомологии, соответствующих областям, необходимым для взаимодействий IRESa HCV с 40S рибосомной субъединицей и фактором elF3. К тому же были найдены схожие элементы вторичной структуры, в частности, псевдоузел, расположенный непосредственно перед инициаторным AUG-кодоном, который абсолютно необходим для эффективного функционирования IRES-элемента HCV.

Тг(ким образом, можно смело утверждать, что существует высокая степень функционального и структурного сходства между IRES-элементами из пикорнавируса PTV-1 и HCV, флавивируса. Факт существования такого сходства между вирусами из двух разных вирусных семейств кажется нам довольно значимым. Мы предполагаем, что либо имел место генетический обмен данного элемента между вирусными семействами, либо существует очень ограниченное число путей, с помощью которых исключительно цитоплазматические РНК могут напрямую взаимодействовать с рибосомой по кэп-независимому механизму.

'' Вернёмся к эксперименту по сборке 48S инициаторного комплекса из

очищенных компонентов на РНК PTV-1. Для сборки комплекса на этой матрице необходимо и достаточно, как было установлено нами ранее, трёх компонентов: 40S рибосомной субъединицы, фактора elF2 и инициаторной метиониновой тРНК, ' заряженной метионином. Добавление в такую систему РТВ в 20-кратном молярном избытке над матрицей лишь слабо усиливало интенсивность сигнала тоупринта (можно высказать предположение, что РТВ работает на РНК PTV-1 неспецифически) (рис.12). Тогда как добавление РТВ в избытке аналогичной кратности над' матрицей в систему сборки 48S инициаторного комплекса из

очищенных компонентов на РНК ВЭМК приводило к эффекту 6-кратного усиления интенсивности сигнала тоупринта.

шш

Рис.12 Влияние РТВ на образование 48Э инициирующего комплекса с (РЕв-элементом РНК РТУ-1 из минимального набора компонентов. I

Дорожка "К" (контроль) показывает тоупринт инкубационной смеси, где не был добавлен фактор е!Р2 и инициаторная тРНК. РТВ добавлен в 20-краггном молярном избытке над матрицей.

Полученных экспериментальных данных достаточно, чтобы утверждать о необходимости РТВ для инициации трансляции на РНК кардио-, энтеро-, рино- и афтовирусов и о ненадобности РТВ для инициации трансляции на РНК РТ\/-1, являющегося представителем другого класса семейства пикорнавирусов. Следовательно, можно смело утверждать, что функция РТВ в инициации 1

трансляции не распространяется на все семейства пикорнавирусов.

ВЫВОДЫ

1. На основании результатов химического зондирования показано, что р50 связывается с мРНК по сахаро-фосфатному остову, предпочитая участки с полностью неспаренными нуклеотидными основаниями.

2. При низких концентрациях р50 активирует, а при высоких- ингибирует сборку 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов in vitro.

3. Максимальная стимуляция сборки 48S предынициаторного комплекса , соответствует связыванию 6-8 молекул р50 на молекулу ß-глобиновой мРНК.

4. р50 стимулирует сборку 48S комплекса на стадии связывания 40S субчастицы с I 5'-концом матрицы и, по-видимому, не оказывает влияние на процесс

сканирования.

5. При низких концентрациях р50 эффективно конкурирует с факторами инициации трансляции elF2 и elF4F за неспецифические места связывания, проявляя существенно меньшую конкуренцию за функциональные для них участки взаимодействия.

6. РТВ значительно активирует сборку 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов на РНК ВЭМК и практически не оказывает влияния на аналогичную сборку с другим представителем пикорнавирусов, PTV-1.

7. Методом тоупринта и УФ-сшивок показано влияние РТВ на характер взаимодействия IRES-элемента РНК ВЭМК с одним из основных факторов инициации трансляции elF4G.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. A.V. Pisarev, M.A. Skabkin, A.A. Thomas, L.P. Ovchinnikov, I.N. Shatsky (2000) The major core protein of messenger ribonucieoprotein particles (p50) increases-specificity of mRNA-protein interactions. Translation control. Cold Spring Harbor, New York. Abstract book, p.262.

2. A.V Pisarev, M.A. Skabkin, A.A. Thomas, W.C. Merrick, L.P. Ovchinnikov, I.N. Shatsky (2002) Positive and negative effects of the major mammalian messenger ribonucieoprotein p50 on binding of 40S ribosomal subunits to the initiation codon of beta-globin mRNA. J Biol Chem, 277, 15445-15451.

3. S.E. Dmitriev, A.V. Pisarev, M.P. Rubtsova, Y.E. Dunaevsky, I.N. Shatsky (2003) Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett, 533, 99 -104. j.

A^Ui

I I

ООП Фыф-та МГУ Зак 101-80-03

\s>£é? #18 6 6 9

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Писарев, Андрей Владимирович

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы

Глава 1. Инициация трансляции у эукариот.

1.1 Механизмы инициации трансляции

1.1.1 Сканирующая модель.

1.1.2 Внутренняя инициация трансляции.

1.2 Канонические факторы инициации трансляции у эукариот.

1.2.1 Факторы, участвующие в образовании 4 8S предынициаторного комплекса eIF2. eIF3. elFl. elFIA. eIF4F. eIF4A. eIF4B. eIF4H.

1.2.2 Факторы, участвующие в образовании 80S комплекса eIF5. eIF5B.

1.3 Неканонические транс-действующие факторы в инициации трансляции. р50.22* гяРНП Е1/Е2 и К.

La аутоантиген.

1.4 Общая модель инициации трансляции у эукариот.

Глава 2. Метод тоупринта в изучении сборки инициаторного комплекса из индивидуальных компонентов.

Результаты и обсуждение

Р50 в инициации трансляции.

1. р50 влияет на связывание 40S рибосомной субчастицы с инициаторным кодоном в сборке 4 8S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов in vitro.

2. р50 способен стимулировать образование аберрантного

4 8S комплекса на 5'-конце мРНК.51"

3. Способность р50 стимулировать образование 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов при низких отношениях р50/мРНК не является универсальным свойством мРНК-связывающих белков.

4. р50 связывается с сахаро-фосфатным остовом мРНК, проявляя предпочтение к последовательностям, содержащим полностью неспаренные нуклеотидные основания.

5. Связывание всего нескольких молекул р50 на молекулу |3-глобиновой мРНК достаточно для стимуляции образования

4 8S предынициаторного комплекса.

6. р50- "менеджер" мРНК-белковых взаимодействий в мРНП млекопитающих.

РТВ- активный участник инициации трансляции на IRES-элементе РНК вируса энцефаломиокардита.

1. РТВ значительно усиливает сборку 48S инициаторного комплекса на РНК ВЭМК из очищенных компонентов in vitro.

2. РТВ проявляет свойства РНК-шаперона.7Q

Материалы и методы

1. Реактивы и материалы.

2 . Плазмидные конструкции.

Ш^Ч 3. Генноинженерные манипуляции.

4. Получение РНК-транскриптов.

5. Трансляция в лизате ретикулоцитов кролика.

6. Реконструкция инициаторных комплексов из очищенных компонентов.

6.1. Выделение рибосомных субчастиц и факторов инициации.

6.2. Аминоацилирование инициаторной тРНК.866.3. Собственно сборка инициаторных комплексов.

6.4. Тоупринт.

7. Центрифугирование комплексов в сахарозном градиенте.

8. Зондирование вторичной структуры мРНК.

Wf^ 9. Иммуноблоттинг-анализ.

10. Ультрафиолетовые сшивки.

11. Количественная обработка результатов.

Выводы.

Введение диссертация по химии, на тему "Функциональная роль неканонических белковых факторов р50 и РТВ в инициации трансляции у млекопитающих"

В последнее время наблюдается значительный подъём интереса к вопросам регуляции трансляции у млекопитающих. Следует подчеркнуть, что основная регуляция трансляции происходит на стадии инициации. Исследование механизмов инициации трансляции очень актуально на сегодняшний день, так как они точно установлены лишь для простых матриц с короткими и слабоструктурированными 5-НТО и ряда вирусов с ^Ев-зависимой инициацией трансляции.

Помимо канонических факторов инициации трансляции, для активности ряда матриц в трансляции необходимы дополнительные белковые факторы, которые регулируют клеточную активность в развитии клетки, делении и апоптозе. Такие неканонические факторы инициации трансляции специфичны в трансляции на определённой стадии клеточного цикла, специфичны для клеток тех или иных тканей, а также отвечают на характерный стресс. Есть лишь общие соображения, касающиеся функциональной роли таких белков в клетке при трансляции, механизм же их действия доподлинно не известен. Многообразие и загадочность поведения в трансляции ставят по важности исследования неканонических факторов инициации трансляции в один ряд с каноническими.

По направленности действия в инициации трансляции есть специфические и общие неканонические белковые факторы. Например, РАВР и р50 связываются с большинством или даже со всеми видами мРНК и в целом контролируют белковый синтез. Р50 является наиболее широко представленным белком и неактивных, и активных полисомальных глобиновых мРНП, хотя последние содержат его в два раза меньше в расчёте на молекулу РНК. Переходы мРНК из неактивного в активное состояние и обратно сопровождаются изменением содержания р50 в составе мРНП.

РТВ, Ьа-аутоантиген, ипг, поли(С)-связывающие белки РСВР1 и РСВР2, ИпКМРК и другие, в отличие от р50, являются специфическими неканоническими белковыми факторами, и их функциональная роль в инициации трансляции проявляется лишь для ряда определённых матриц. РТВ, в частности, требуется для образования 48Э комплекса с 1КЕ8-элементами РНК ряда пикорнавирусов й с клеточной мРНК АраМ, продукт которой вовлечён в регуляцию клеточного апоптоза.

Обзор литературы.

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

Выводы

3. Максимальная стимуляция сборки 48S предынициаторного комплекса соответствует связыванию 6-8 молекул р50 на молекулу р-глобиновой мРНК.

4. р50 стимулирует сборку 48S комплекса на стадии связывания 40S субчастицы с 5'-концом матрицы и, по-видимому, не оказывает влияние на процесс сканирования.

6. РТВ значительно активирует сборку 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов in vitro на РНК ВЭМК и практически не оказывает влияния на аналогичную сборку с другим представителем пикорнавирусов, PW-1.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Писарев, Андрей Владимирович, Москва

1. Voorma H.O, Thomas A AM, Van Heugten H.A.A. (1994) Initiation of protein synthesis in eukaryotes. Mol. Biol. Reports, 19,139-145.

2. Sherman F, McKnight G, Stewart J.W. (1980) AUG is the only initiation codon in eukaryotes. >V Biochim. Biophys. Acta 609, 343-346

3. Alter H.J. (1995) To C or not to C: These are the questions. Blood, 85,1681-1695.

4. Lim L, Canellakis E.S. (1970) Adenine-rich polymer associated with rabbit reticulocyte messenger RNA. Nature. 227, 710-712.

5. Kozak M. (1983) Comparison of initiation of protein synthesis in procaryotes, eucaryotes, and organelles. Microbiol. Rev. 47, 1-45.

6. Morris D.R, Geballe A.P. (2000) Upstream open reading frames as regulators of mRNA translation. Mol. Cell Biol. 20, 8635-8642.

7. Hinnebusch A.G. (1993) Gene-specific translational control of the yeast GCN4 gene by -¡^ phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2. Mol. Microbiol. 10, 215-223.

8. Kozak M. (1984) Compilation and analysis of sequences upstream from the translational start site in eukaryotic mRNAs. Nucleic Acids Res. 12, 857-872.

9. Pesole G, Gissi C, Grillo G, Licciulli F, Liuni S, Saccone C. (2000) Analysis of oligonucleotide AUG start codon context in eukariotic mRNAs. Gene 261, 85-91

10. Pesole G, Bernardi G, Saccone C. (1999) Isochore specificity of AUG initiator context of human genes. FEBS Lett. 464, 60-62.

11. Cavener D.R, Ray S.C. (1991) Eukaryotic start and stop translation sites. Nucleic Acids Res. 19, 3185-3192.

12. Hamilton R, Watanabe C.K, de Boer H.A. (1987) Compilation and comparison of the sequence context around the AUG start codons in Saccharomyces cerevisiae mRNAs. Nucleic Acids Res. 15, 3581-3593.

13. Grunert S, Jackson R.J. (1994) The immediate downstream codon strongly influences the efficiency of utilization of eukaryotic translation initiation codons. EMBO J. 13, 3618-3630.

14. Cigan A.M, Pabich E.K, Donahue T.F. (1988) Mutational analysis of the HIS4 translational initiator region in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 8, 2964-2975.

15. McBratney S, Sarnow P. (1996) Evidence for involvement of trans-acting factors in selection of the AUG start codon during eukaryotic translational initiation. Mol. Cell Biol. 16, 3523-3534.

16. Kozak M. (1989) Context effects and inefficient initiation at non-AUG codons in eucaryotic cell-free translation systems. Mol. Cell Biol. 9, 5073-5080.

17. Dreyfuss G, Kim V.N, Kataoka N. (2002) Messenger-RNA-binding proteins and the messages they carry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3,195-205.

18. Kozak M. (1978) How do eucaryotic ribosomes select initiation regions in messenger RNA? Cell. 15, 1109-1123.

19. Kozak M. (1977) Nucleotide sequences of 5'-terminal ribosome-protected initiation regions from two reovirus messages. Nature. 269, 391-394.

20. Kozak M. (1980) Influence of mRNA secondary structure on binding and migration of 40S ribosomal subunits. Cell 19, 79-90.

21. Kozak M. (1980) Binding of wheat germ ribosomes to fragmented viral mRNA. J. Virol. 35, 748-756.

22. Kozak M. (1983) Translation of insulin-related polypeptides from messenger RNAs with tandemly reiterated copies of the ribosome binding site. Cell. 34, 971-978.

23. Kozak M. (1977). Inability of circular mRNA to attach to eucariotic ribosomes. Nature. 280, 82-85.

24. Gunnery S, Maivali U, Mathews M.B. (1997) Translation of an uncapped mRNA involves scanning. J. Biol. Chem. 272, 21642-21646.

25. Kozak M. (1989) The scanning model for translation: an update. J. Cell Biol. 108, 229-241.

26. Kozak M. (1987) Effects of intercistronic length on the efficiency of reinitiation by eucaryotic ribosomes. Mol. Cell Biol. 7, 3438-3445.

27. Kozak M. (1991) A short leader sequence impairs the fidelity of initiation by eukaryotic ribosomes. Gene Expr. 1,111-115.

28. Kozak M. (1991) Effects of long 5' leader sequences on initiation by eukaryotic ribosomes in vitro. Gene Expr. 1,117-125.

29. Tsukiyama-Kohara K, lizuka N, Kohara M, Nomoto A. (1992) Internal ribosome entry site within hepatitis C virus RNA. J. Virol. 66, 1476-1483.

30. Jackson R.J, Kaminski A. (1995) Internal initiation of translation in eukaryotes: the picornavirus paradigm and beyond. RNA 1, 985-1000

31. Macejak D.G, Sarnow P. (1990) Translational regulation of the immunoglobulin heavy-chain binding protein mRNA. Enzyme. 44, 310-319.

32. Frisby D, Eaton M, Fellner P. (1976) Absence of 5' terminal capping in encephalomyo-carditis virus RNA. Nucleic Acids Res. 3, 2771-2787.

33. Gallie D.R, Ling J, Niepel M, Morley S.J, Pain V.M. (2000) The role of 5'-leader length, secondary structure and PABP concentration on cap and poly(A) tail function during translation in Xenopus oocytes. Nucleic Acids Res. 28, 2943-2953.

34. Futterer J, Kiss-Laszlo Z, Hohn T. (1993) Nonlinear ribosome migration on cauliflower mosaic virus 35S RNA. Cell 73, 789-802.

35. Peri S, Pandey A. A (2001) Reassessment of the translation initiation codon in vertebrates. Trends Genet. 17, 685-687.

36. Davuluri R.V, Suzuki Y, Sugano S, Zhang M.Q. (2000) CART classification of human 5' UTR sequences. Genome Res. 10,1807-1816.

37. Wilson J.E, Pestova T.V, Hellen C.U, Sarnow P. (2000) Initiation of protein synthesis from the A site of the ribosome. Cell. 102, 511-520.

38. Trachsel H. (1995). Binding of initiator methionyl-tRNA to ribosomes. In Translational Control of Gene Exression (ed. N. Sonenberg, J. W. B. Hershey and M. B. Matthews), Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 113-138.

39. Trachsel H, Staehelin T. (1978) Binding and release of eukaryotic initiation factor elF-2 and GTP during protein synthesis initiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 204-208.

40. Chaudhuri J, Chowdhury D, Maitra U. (1999) Distinct functions of eukaryotic translation initiation factors eIF1A and elF3 in the formation of the 40 S ribosomal preinitiation complex. J. Biol. Chem. 274, 17975-17980.

41. Peterson D.T, Merrick W.C, Safer B. (1979) Binding and release of radiolabeled eukaryotic initiation factors 2 and 3 during 80 S initiation complex formation. J. Biol. Chem. 254, 25092516.

42. Kiledjian M, Wang X, Liebhaber S.A. (1995) Identification of two KH domain proteins in the alpha-globin mRNP stability complex. EMBO J. 14, 4357-4364.

43. Raychaudhuri P, Chaudhuri A, Maitra U. (1985) Formation and release of eukaryotic initiation factor 2 X GDP complex during eukaryotic ribosomal polypeptide chain initiation complex formation. J. Biol. Chem. 260, 2140-2145.

44. Rapoport S.M. et al. (1990) In Blood Cell Biochemistry (ed. Harris J.R.) Plenum press. 151194.

45. Ostareck D.H, Ostareck-Lederer A, Wilm M, Thiele B.J, Mann M, Hentze M.W. (1997) mRNA silencing in erythroid differentiation: hnRNP K and hnRNP E1 regulate 15-lypoxygenase translation from the 3* end. Cell 89, 597-606.

46. Erickson F.L, Hannig E.M. (1996) Ligand interactions with eukaryotic translation initiation factor 2: role of the gamma-subunit. EMBO J. 15, 6311-6320.

47. Thompson G.M, Pacheco E, Melo E.O, Castilho B.A. (2000) Conserved sequences in the beta subunit of archaeal and eukaryal translation initiation factor 2 (elF2), absent from elF5, mediate interaction with elF2gamma. Biochem. J. 347, 703-9.

48. Flynn A, Oldfield S, Proud C.G. (1993) The role of the beta-subunit of initiation factor elF-2 in initiation complex formation. Biochlm Biophys Acta 1174, 117-121.

49. Das S, Maiti T, Das K, Maitra U. (1997) Specific interaction of eukaryotic translation initiation factor 5 (elF5) with the beta-subunit of elF2. J. Biol. Chem. 272, 31712-31718.

50. Flynn A, Shatsky I.N, Proud C.G, Kaminski A. (1994) The RNA-binding properties of protein synthesis initiation factor elF-2. Biochlm. Biophys. Acta. 1219, 293-301.

51. Ostareck-Lederer A, Ostareck D.H, Standart N, Thiele B.J. (1994) Translation of 15-lipoxygenase mRNA is inhibited by a protein that binds to a repeated sequence in the 3' untranslated region. EMBO J. 13,1476-1481.

52. Weiss I.M, Liebhaber S.A. (1994) Erythroid cell-specific determinants of alpha-globin mRNA stability. Mot. Cell. Biol. 14, 8123-8132.

53. Huang H.K, Yoon H, Hannig E.M, Donahue T.F. (1997) GTP hydrolysis controls stringent selection of the AUG start codon during translation initiation in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 11, 2396-2413.

54. Wang X, Kiledjian M, Weiss I.M, Liebhaber S.A. (1995) Detection and characterization of a 3' untranslated region ribonucleoprotein complex associated with human alpha-globin mRNA stability. Moll. Cell. Biol. 15,1769-1777.

55. Kaufman R.J. (2000) Double-stranded RNA-activated protein kinase PKR. In Translational Control of Gene Exression (ed. N. Sonenberg, J. W. B. Hershey and M. B. Matthews), Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 503-528.

56. Anderson P, Kedersha N. (2002) Visibly stressed: the role of elF2, TIA-1, and stress granules in protein translation. Cell Stress Chaperones. 7, 213-221.

57. Redpath N.T, Proud C.G. (1990) Activity of protein phosphatases against initiation factor-2 and elongation factor-2. Biochem J. 272, 175-180.

58. Holcik M, Liebhaber S.A. (1997) Four highly stable eukaryotic mRNAs assemble 3' untranslated region RNA-protein complexes sharing cis and trans components. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 2410-2414.

59. Gamarnik A.V, Andino R. (1997) Two functional complexes formed by KH domain containing proteins with the 5' noncoding region of poliovirus RNA. RNA 3, 882-892.

60. Mouat M.F, Manchester K. (1998) An alpha subunit-deficient form of eukaryotic protein synthesis initiation factor elF-2 from rabbit reticulocyte lysate and its activity in ternary complex formation. Mol. Cell. Blochem. 183, 69-78.

61. Hashimoto N.N, Camevalli L.S, Castilho B.A. (2002) Translation initiation at non-AUG codons mediated by weakened association of eukaryotic initiation factor (elF) 2 subunits. Biochem. J. 367, 359-368.

62. Ostareck D.H, Ostareck-Lederer A, Shatsky I.N, Hentze M.W. (2001) Lipoxygenase mRNA silencing in erythroid differentiation: The 3'UTR regulatory complex controls 60S ribosomal subunit joining. Cell 104,281-290.

63. Donahue T.F, Cigan A.M, Pabich E.K, Valavicius B.C. (1988) Mutations at a Zn(ll) finger motif in the yeast elF-2 beta gene alter ribosomal start-site selection during the scanning process. Cell 54, 621-632.

64. FalveyA.K, StaehelinT. (1970) Structure and function of mammalian ribosomes. II. Exchange of ribosomal subunits at various stages of in vitro polypeptide synthesis. J. Mol. Biol. 53, 21-34

65. Trachsel H, Erni B, Schreier M.H, Staehelin T. (1977) Initiation of mammalian protein synthesis. II. The assembly of the initiation complex with purified initiation factors. J. Mol. Biol. 116,755-767.

66. Valasek L, Mathew A.A, Shin B.S, Nielsen K.H, Szamecz B, Hinnebusch A.G. (2003) The yeast elF3 subunits TIF32/a, NIP1/c, and elF5 make critical connections with the 40S ribosome in vivo. Genes Dev. 17,786-799.

67. Fraser C, Mayeur G, Lee J, Hershey J.W (2002) Reconstitute of human eukaryotic initiation factor 3 (elF3); assignment of functions for two subunits, elF3d and elF3j. Abstracts of papers presented at the 2002 meeting on translational control, CSHL, 92

68. Valasek L, Nielsen K.H, Hinnebusch A.G. (2002) Direct elF2-elF3 contact in the multifactor complex is important for translation initiation in vivo. EMBOJ. 21, 5886-5898.

69. Kyrpides N.C, Woese C.R. (1998) Universally conserved translation initiation factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 224-228.

70. Lomakin I, Kolupaeva V, PestovaT.V (2002) Interaction of eukaryotic translation initiation factor elF1 with the 40S ribosomal subunit. Abstracts of papers presented at the 2002 meeting on translational control, CSHL, 267

71. Czyzyk-Krzeska M.F, Bendixen A.C. (1999) Identification of the poly(C) binding protein in the complex associated with the 3' untranslated region of erythropoietin messenger RNA. Blood. 93, 2111-2120.

72. Yoon H.J, Donahue T.F. (1992) The suil suppressor locus in Saccharomyces cerevisiae encodes a translation factor that functions during tRNA(iMet) recognition of the start codon. Mol. Cell. Biol. 12, 248-260.

73. Pestova T.V, Borukhov S.I, Hellen C.U. (1998) Eukaryotic ribosomes require initiation factors 1 and 1A to locate initiation codons. Nature. 394, 854-859.

74. Pestova T.V, Kolupaeva V.G. (2002) The roles of individual eukaryotic translation initiation factors in ribosomal scanning and initiation codon selection. Genes Dev. 16, 2906-2922.

75. Murray K.E, Roberts A.W, Barton D.J. (2001) Poly(rC) binding proteins mediate poliovirus mRNA stability. RNA 7,1126-1141.

76. Goumans H, Thomas A, Verhoeven A, Voorma H.O, Benne R. (1980) The role of elF-4C in protein synthesis initiation complex formation. Biochim. Biophys. Acta. 608, 39-46.

77. Wei C.L, MacMillan S.E, Hershey J.W. (1995) Protein synthesis initiation factor elF-1A is a moderately abundant RNA-binding protein. J. Biol. Chem. 270, 5764-5771.

78. Battiste J.L, Pestova T.V, Hellen C.U, Wagner G. (2000) The elF1 A solution structure reveals a large RNA-binding surface important for scanning function. Mol. Cell. 5, 109-119.

79. Olsen D.S, Savner E.M, MathewA, Zhang F, Krishnamoorthy T, Phan L, Hinnebusch A.G. (2003) Domains of elF1A that mediate binding to elF2, elF3 and elF5B and promote ternary complex recruitment in vivo. EMBO J. 22, 193-204.

80. Moazed D, Samaha R.R, Gualerzi C, Noller H.F. (1995) Specific protection of 16 S rRNA by translational initiation factors. J. Mol. Biol. 248, 207-210.

81. Brock S, Szkaradkiewicz K, Sprinzl M. (1998) Initiation factors of protein biosynthesis in bacteria and their structural relationship to elongation and termination factors. Mol. Microbiol. 29, 409-417.

82. Roll-Mecak A, Shin B.S, Dever T.E, Burley S.K. (2001) Engaging the ribosome: universal IFs of translation. Trends Biochem. Sci. 26, 705-709.

83. Blyn L.B, Towner J.S, Semler B.L, Ehrenfeld E. (1997) Requirement of poIy(rC) binding protein 2 for translation of poliovirus RNA. J Virol. 71, 6243-6246.

84. Grifo J .A, Tahara S.M, Morgan M.A, Shatkin A.J, Merrick W.C. (1983) New initiation factor activity required for globin mRNA translation. J. Biol. Chem. 258, 5804-5810.

85. Sonenberg N, Rupprecht K.M, Hecht S.M, Shatkin A.J. (1979) Eukaryotic mRNA cap binding protein: purification by affinity chromatography on sepharose-coupled m7GDP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76,4345-4349.

86. Hunt S.L, Hsuan J.J, Totty N, Jackson R.J. (1999) unr, a cellular cytoplasmic RNA-binding protein with live cold-shock domains, is required for internal initiation of translation of human rhinovirus RNA. Genes Dev. 13,437-448.

87. Graff J, Cha J, Blyn L.B, Ehrenfeld E. (1998) Interaction of poly(rC) binding protein 2 with the 5' noncoding region of hepatitis A virus RNA and its effects on translation. J Virol. 72, 96689675.

88. Graumann P.L, Marahiel M.A. (1998) A superfamily of proteins that contain the cold-shock domain. Trends Biochem Sci. 23, 286-290.

89. Hunt S.L, Jackson R.J. (1999) Polypyrimidine-tract binding protein (PTB) is necessary, but not sufficient, for efficient internal initiation of translation of human rhinovirus-2 RNA. RNA 5, 344-359.

90. Jacquemin-Sablon H, Triqueneaux G, Deschamps S, le Maire M, Doniger J, Dautry F. (1994) Nucleic acid binding and intracellular localization of unr, a protein with five cold shock domains. Nucleic Acids Res. 22, 2643-2650.

91. Keiper B.D, Gan W, Rhoads R.E. (1999) Protein synthesis initiation factor 4G. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 31,37-41.

92. Meerovitch K, Svitkin Y.V, Lee H.S, Lejbkowicz F, Kenan D.J, Chan E.K, Agpl V.I, Keene J.D, Sonenbrg N. (1993) La autoantigen enhances and corrects aberrant translation of poliovirus RNA in reticulocyte lysate. J Virol. 67, 3798-3807.

93. Svitkin Y.V, Meerovitch K, Lee H.S, Dholakia J.N, Kenan D.J, Agol V.I, Sonenberg N. (1994) Internal translation initiation on poliovirus RNA: further characterization of La function in poliovirus translation in vitro. J Virol. 68,1544-1550.

94. Browning K.S, Fletcher L, Lax S.R, Ravel J.M. (1989) Evidence that the 59-kDa protein synthesis initiation factor from wheat germ is functionally similar to the 80-kDa initiation factor 4B from mammalian cells. J. Biol. Chem. 264, 8491-8494.

95. Gallie D.R, Browning K.S. (2001) elF4G functionally differs from elFiso4G in promoting internal initiation, cap-independent translation, and translation of structured mRNAs. J. Biol. Chem. 276, 36951-36960.

96. Pyronnet S. (2000) Phosphorylation of the cap-binding protein eIF4E by the MAPK-activated protein kinase Mnk1. Biochem. Pharmacol. 60,1237-1243.

97. Scheper G.C, Proud C.G. (2002) Does phosphorylation of the cap-binding protein elF4E play a role in translation initiation? Eur. J. Biochem. 269, 5350-5359.

98. Lawrence J.C, Abraham R.T. (1997) PHAS/4E-BPs as regulators of mRNA translation and cell proliferation. Trends Biochem. Sci. 22, 345-349.

99. Gingras A.C, Raught B, Sonenberg N. (1999) elF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu. Rev. Biochem. 68, 913-963.

100. Shiroki K, Isoyama T, Kuge S, Ishii T, Ohmi S, Hata S, Suzuki K, Takasaki Y, Nomoto A. (1999) Intracellular redistribution of truncated La protein produced by poliovirus 3Cpro-mediated cleavage. J Virol. 73,2193-2200.

101. Craig A.W, Svitkin Y.V, Lee H.S, Belsham G.J, Sonenberg N. (1997) The La autoantigen contains a dimerization domain that is essential for enhancing translation. Moi Cell Biol. 17,163169.

102. Ray P.S, Das S. (2002) La autoantigen is required for the internal ribosome entry sitemediated translation of Coxsackievirus B3 RNA. Nucleic Acids Res. 30, 4500-4508.

103. Kim Y.K, BackS.H, Rho J, Lee S.H, Jang S.K. (2001) La autoantigen enhances translation of BiP mRNA. Nucleic Acids Res. 29, 5009-5016.

104. Imataka H, Sonenberg N. (1997) Human eukaryotic translation initiation factor 4G (elF4G) possesses two separate and independent binding sites for elF4A. Mol. Cell. Biol. 17, 69406947.

105. Korneeva N.L, Lamphear B.J, Hennigan F.L, Merrick W.C, Rhoads R.E. (2001) Characterization of the two elF4A-binding sites on human elF4G-1. J. Biol. Chem. 276, 28722879.

106. Balasta M.L, Carbeny S.E, Friedland D.E, Perez RA, Goss D.J. (1993) Characterization of the ATP-dependent binding of wheat germ protein synthesis initiation factors elF-(iso)4F and elF-4Ato mRNA. J. Biol. Chem. 268,18599-18603.

107. Korneeva N.L, Lamphear B.J, Hennigan F.L, Rhoads R.E. (2000) Mutually cooperative binding of eukaryotic translation initiation factor (elF) 3 and elF4A to human elF4G-1. J. Biol. Chem. 275,41369-41376.

108. Kuhn U, PielerT. (1996) Xenopus poly(A) binding protein: functional domains in RNA binding and protein-protein interaction. J. Mol. Biol. 256, 20-30.

109. Tarun S.Z, Sachs A.B. (1996) Association of the yeast poly(A) tail binding protein with translation Initiation factor elF-4G. EMBO J. 15, 7168-7177.

110. Cuesta R, Laroia G, Schneider R.J. (2000) Chaperone hsp27 inhibits translation during heat shock by binding elF4G and facilitating dissociation of cap-initiation complexes. Genes Dev. 14, 1460-1470.

111. Laroia G, Cuesta R, Brewer G, Schneider R.J. (1999) Control of mRNA decay by heat shock-ubiquitin-proteasome pathway. Science. 284, 499-502.

112. Holcik M, Korneluk R.G. (2000) Functional characterization of the X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) internal ribosome entry site element: role of La autoantigen in XIAP translation. Mol. Cell. Biol. 20, 4648-4657.

113. Tarun S.Z, Sachs A.B. (1997) Binding of eukaryotic translation initiation factor 4E (elF4E) to elF4G represses translation of uncapped mRNA. Mol. Cell. Biol. 17, 6876-6886.

114. Pudi R, Abhiman S, Srinivasan N, Das S. (2003) Hepatitis С virus internal ribosome entry site-mediated translation is stimulated by specific interaction of independent regions of human La autoantigen. J. Biol. Chem. 278, 12231-12240.

115. Huttenhofer A, Noller H.F. (1994) Footprinting mRNA-ribosome complexes with chemical probes. EMBO J. 13,3892-3901.

116. Under P, Lasko P.F, Ashburner M, Leroy P, Nielsen P.J, Nishi K, Schnier J, Slonimski P.P. (1989) Birth of the D-E-A-D box. Nature 337, 121-122.

117. Gorbalenya A.E, Koonin E.V, Donchenko A.P, Blinov V.M. (1989) Two related superfamilies of putative helicases involved in replication, recombination, repair and expression of DNA and RNA genomes. Nucleic Acids Res. 17, 4713-4730.

118. Pestova T.V, Hellen C.U. (2001) Preparation and activity of synthetic unmodified mammalian tRNAi(Met) in initiation of translation in vitro. RNA 7,1496-1505.

119. Шатский И.Н. (2001) Исследование молекулярных механизмов инициации трансляции у млекопитающих с помощью реконструкции инициирующих комплексов in vitro. Mol Biol (Mosk). 35, 628-637.

120. Hellen C.U, Pestova T.V, Litterst M, Wimmer E. (1994) The cellular polypeptide p57 (pyrimidine tract-binding protein) binds to multiple sites in the poliovirus 5' nontranslated region. J Virol. 68, 941-950.

121. Merrick W.C. (1979) Purification of protein synthesis initiation factors from rabbit reticulocytes. Methods Enzymol. 60, 101-108.

122. Le H, Browning K.S, Gallie D.R. (1998) The phosphorylation state of the wheat translation initiation factors elF4B, elF4A, and elF2 is differentially regulated during seed development and germination. J. Biol. Chem. 273, 20084-20089.

123. Abramson R.D, Dever T.E, Lawson T.G, Ray B.K, Thach R.E, Merrick W.C. (1987) The ATP-dependent interaction of eukaryotic initiation factors with mRNA. J. Biol. Chem. 262, 38263832.

124. Seal S.N, Schmidt A, Marcus A. (1983) Eukaryotic initiation factor 4A is the component that interacts with ATP in protein chain initiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6562-6565.

125. Grifo J .A, Abramson R.D, Satler C.A, Merrick W.C. (1984) RNA-stimulated ATPase activity of eukaryotic initiation factors. J. Biol. Chem. 259, 8648-8654.

126. Lorsch J.R, Herschlag D. (1998) The DEAD box protein elF4A. 1. A minimal kinetic and thermodynamic framework reveals coupled binding of RNA and nucleotide. Biochemistry. 37, 2180-2193.

127. Peck M.L, Herschlag D. (1999) Effects of oligonucleotide length and atomic composition on stimulation of the ATPase activity of translation initiation factor elF4A. RNA 5, 1210-1221.

128. Ray B.K, Lawson T.G, Kramer J.C, Cladaras M.H, Grifo J.A, Abramson R.D, Merrick W.C, Thach R.E. (1985) ATP-dependent unwinding of messenger RNA structure by eukaryotic initiation factors. J. Biol. Chem. 260, 7651-7658.

129. Bi X, Ren J, Goss D.J. (2000) Wheat germ translation initiation factor elF4B affects elF4A and elFiso4F helicase activity by increasing the ATP binding affinity of elF4A. Biochemistry. 39, 5758-5765.

130. Richter-Cook N.J, Dever T.E, Hensold J.O, Merrick W.C. (1998) Purification and characterization of a new eukaryotic protein translation factor. Eukaryotic initiation factor 4H. J. Biol. Chem. 273, 7579-7587.

131. Rogers G.W, Richter N.J, Lima W.F, Merrick W.C. (2001) Modulation of the helicase activity of elF4A by elF4B, elF4H, and elF4F. J. Biol. Chem. 276, 30914-30922.

132. Altmann M, Blum S, Pelletier J, Sonenberg N, Wilson T.M, Trachsel H. (1990) Translation initiation factor-dependent extracts from Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 1050,155-159.

133. Tahara S.M, Morgan M.A, Shatkin A.J. (1983) Binding of inosine-substituted mRNA to reticulocyte ribosomes and eukaryotic initiation factors 4A and 4B requires ATP. J. Biol. Chem. 258, 11350-11353.

134. Sambrook J, Russell D. (2001) Molecular cloning: a laboratory manual. 3d Ed. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press.

135. Milburn S.C, Hershey J.W, Davies M.V, Kelleher K, Kaufman R.J. (1990) Cloning and expression of eukaryotic initiation factor 4B cDNA: sequence determination identifies a common RNA recognition motif. EMBO J. 9, 2783-2790.

136. Metz A.M, Wong K.C, Malmstrom SA, Browning K.S. (1999) Eukaryotic initiation factor 4B from wheat and Arabidopsis thaliana is a member of a multigene family. Biochem. Biophys. Res. Commun. 266, 314-321.

137. Methot N, Pickett G, Keene J.D, Sonenberg N. (1996) In vitro RNA selection identifies RNA ligands that specifically bind to eukaryotic translation initiation factor 4B: the role of the RNA remotif. RNA 2,38-50.

138. Coppolecchia R, Buser P, Stotz A, Linder P. (1993) A new yeast translation initiation factor suppresses a mutation in the elF-4A RNA helicase. EMBO J. 12, 4005-4011.

139. Robertson M.E, Seamons R.A, Belsham G.J. (1999) A selection system for functional internal ribosome entry site (IRES) elements: analysis of the requirement for a conserved GNRA tetraloop in the encephalomyocarditis virus IRES. RNA 5, 1167-1179.

140. Ray B.K, Lawson T.G, Abramson R.D, Merrick W.C, Thach R.E. (1986) Recycling of messenger RNA cap-binding proteins mediated by eukaryotic initiation factor 4B. J. Biol. Chem. 261, 11466-11470.

141. Mitchell S.A, Spriggs K.A, Coldwell M.J, Jackson R.J, Willis A.E. (2003) The Apaf-1 internal ribosome entry segment attains the correct structural conformation for function via interactions with PTB and unr. Mol. Cell 11, 757-771.

142. Gallie D.R, Le H, Caldwell C, Tanguay R.L, Hoang N.X, Browning K.S. (1997) The phosphorylation state of translation initiation factors is regulated developmental^ and following heat shock in wheat. J. Biol. Chem. 272, 1046-1053.

143. Sha M, Balasta M.L, Goss D.J. (1994) An interaction of wheat germ initiation factor 4B with oligoribonucleotides. J. Biol. Chem. 269, 14872-14877.

144. Bonneau A.M, Sonenberg N. (1987) Involvement of the 24-kDa cap-binding protein in regulation of protein synthesis in mitosis. J. Biol. Chem. 262, 11134-11139.

145. Duncan R, Hershey J.W. (1985) Regulation of initiation factors during translational repression caused by serum depletion. Covalent modification. J. Biol. Chem. 260, 5493-5497.

146. Wolthuis R.M, Cremers A.F, Kasperaitis M.A, van der Mast C, Voorma H.O, Boonstra J. (1993) Epidermal growth factor stimulates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 4B, independently of protein kinase C. Biochim. Biophys. Acta 1177,160-166.

147. Gallie D.R, Le H, Caldwell C, Tanguay R.L, Hoang N.X, Browning K.S. (1997) The phosphorylation state of translation initiation factors is regulated developmentally and following heat shock in wheat. J. Biol. Chem. 272, 1046-1053.

148. Morley S.J, Traugh J.A. (1990) Differential stimulation of phosphorylation of initiation factors elF-4F, elF-4B, elF-3, and ribosomal protein S6 by insulin and phorbol esters. J. Biol. Chem. 265,10611-10616.

149. Duncan R.F, Hershey J.W. (1989) Protein synthesis and protein phosphorylation during heat stress, recovery, and adaptation. J. Cell. Biol. 109,1467-1481.

150. Bushell M, Wood W, Clemens M.J, Morley S.J. (2000) Changes in integrity and association of eukaryotic protein synthesis initiation factors during apoptosis. Eur. J. Biochem. 267,10831091.

151. Richter N.J, Rogers G.W, Hensold J.O, Merrick W.C. (1999) Further biochemical and kinetic characterization of human eukaryotic initiation factor 4H. J. Biol. Chem. 274, 3541535424.

152. Herschlag D. (1995) RNA chaperons and the RNA folding problem. J. Biol. Chem. 270, 20871-20874.

153. Raychaudhuri P, Chaudhuri A, Maitra U. (1985) Eukaryotic initiation factor 5 from calf liver is a single polypeptide chain protein of Mr = 62,000. J. Biol. Chem. 260, 2132-2139.

154. Paulin F.E, Campbell L.E, O'Brien K, Loughlin J, Proud C.G. (2001) Eukaryotic translation initiation factor 5 (elF5) acts as a classical GTPase-activator protein. Curr. Biol. 11, 55-59.

155. Chakrabarti A, Maitra U. (1991) Function of eukaryotic initiation factor 5 in the formation of an 80 S ribosomal polypeptide chain initiation complex. J. Biol. Chem. 266, 14039-14045.

156. Chakravarti D, Maitra U. (1993) Eukaryotic translation initiation factor 5 from Saccharomyces cerevisiae. Cloning, characterization, and expression of the gene encoding the 45,346-Da protein. J. Biol. Chem. 268, 10524-10533.

157. Belsham G.J, Jackson R.J. (2000) Translation initiation on picornavirus RNA. In Translational control of gene expression (Eds. N. Sonenberg et al.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 869-900.

158. Evdokimova V, Ruzanov P, Imataka H, Raught B, Svitkin Y, Ovchinnikov L.P, Sonenberg N. (2001) The major mRNA-associated protein YB-1 is a potent 5'-cap dependent mRNA stabilizer. EMBOJ. 20, 5491-5502.

159. Chaudhuri J, Das K, Maitra U. (1994) Purification and characterization of bacterially expressed mammalian translation initiation factor 5 (elF-5): demonstration that eIF-5 forms a specific complex with elF-2. Biochemistry 33, 4794-4799.

160. Asano K, Clayton J, Shalev A, Hinnebusch A.G. (2000) A multifactor complex of eukaryotic initiation factors, elF1, elF2, elF3, elF5, and initiator tRNA(Met) is an important translation initiation intermediate in vivo. Genes Dev. 14, 2534-2546.

161. Pestova T.V, Lomakin I.B, Lee J.H, Choi S.K, DeverT.E, Hellen C.U. (2000) The joining of ribosomal subunits in eukaryotes requires elF5B. Nature 403, 332-335.

162. Benne R, Hershey J.W. (1978) The mechanism of action of protein synthesis initiation factors from rabbit reticulocytes. J. Biol. Chem. 253, 3078-3087.

163. Ghosh R, Maitra U. (2002) Translation initiation factors elF5 and elF5B act at distinct steps in the initiation process. Abstracts of papers presented at the 2002 meeting on translational control, CSHL, 102

164. Lee J.H, Choi S.K, Roll-Mecak A, Burley S.K, DeverT.E. (1999) Universal conservation in translation initiation revealed by human and archaeal homologs of bacterial translation initiation factor IF2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4342-4347.

165. Choi S.K, Lee J.H, Zoll W.L, Merrick W.C, DeverT.E. (1998) Promotion of met-tRNAiMet binding to ribosomes by ylF2, a bacterial IF2 homolog in yeast. Science 280, 1757-1760.

166. Lee J.H, Pestova T.V, Shin B.S, Cao C, Choi S.K, Dever T.E. (2002) Initiation factor elF5B catalyzes second GTP-dependent step in eukaryotic translation initiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 16689-16694

167. Shin B.S, Maag D, Roll-Mecak A, Arefin M.S, Burley S.K, Lorsch J.R, DeverT.E. (2002) Uncoupling of initiation factor elF5B/IF2 GTPase and translational activities by mutations that lower ribosome affinity. Cell 111, 1015-1025.

168. Marintchev A, Kolupaeva V.G, Pestova T.V, Wagner G. (2003) Mapping the binding interface between human eukaryotic initiation factors 1A and 5B: a new interaction between old partners. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 1535-1540.

169. Boileau G, Butler P, Hershey J.W, Traut R.R. (1983) Direct cross-links between initiation factors 1, 2, and 3 and ribosomal proteins promoted by 2-iminothiolane. Biochemistry 22, 31623170.

170. DeverT.E. (2002) Gene-specific regulation by general translation factors. Cell 108, 545556.

171. Seal S.N, Schmidt A, Marcus A. (1989) Ribosome binding to inosine-substituted mRNAs in the absence of ATP and mRNA factors. J. Biol. Chem. 264, 7363-7368.

172. Haghighat A, Sonenberg N. (1997) elF4G dramatically enhances the binding of elF4E to the mRNA 5'-cap structure. J. Biol. Chem. 272, 21677-21680.

173. Belsham G.J, Sonenberg N. (2000) Picornavirus RNA translation: roles for cellular proteins. Trends Microbiol. 8,330-335.

174. Wagner E.J, Garcia-Blanco (2001) Polypyrimidine tract binding protein antagonizes exon definition. Mol. Cell. Biol. 21,3281-3288.

175. Tzareva N.V, Makhno V.I, Boni I.V. (1994) Ribosome-messenger recognition in the absence of the Shine-Dalgarno interactions. FEBS Lett. 337,189-194.

176. Dreyfus G, Matunis M.J, Pinol-Roma S, Burd S.G. (1993) hnRNP proteins and the biogenesis of mRNA. Annu Rev Biochem. 62, 289-321.

177. Pilipenko E.V, Viktorova E.G, Guest S.T, Ago! V.I, Roos R.P. (2001) Cell-specific proteins regulate viral RNA translation and virus-induced disease. EMBO J. 20, 6899-6908.

178. Borovjagin A, Pestova T, Shatsky I. (1994) Pyrimidine tract binding protein strongly stimulates in vitro encephalomyocarditis virus RNA translation at the level of preinitiation complex formation. FEBS Lett. 351, 299-302.

179. Skabkin M.A, Evdokimova V, Thomas A.A, Ovchinnikov LP. (2001) The major messenger ribonucleoprotein particle protein p50 (YB-1) promotes nucleic acid strand annealing. J. Biol. Chem. 276,44841-44847.

180. Sachs A.B, Sarnow P, Hentze M.W. (1997) Starting at the beginning, middle, and end: translation initiation in eukaryotes. Cell 89, 831-838.

181. Unbehaun A, Pestova T.V (2002) Hydrolysis of elF2-bound GTP and release of initiation factors from 43S complexes during ribosomal subunit joining. Abstracts of papers presented at the 2002 meeting on translational control, CSHL, 341

182. Jackson R.J, Standart N. (1990) Do the poly(A) tail and З'-untranslated region control mRNA translation? Cell 62,15-24.

183. Vincent A, Goldberg S, Scherrer K. (1981) Comparisons of proteins associated with duck-globin mRNA and its polyadenylated segment in polyribosomal and repressed free messenger ribonucleoprotein complexes. Eur. J. Biochem. 114,179-193.

184. Schreier M.H, Erni B, Staehelin T. (1977) Initiation of mammalian protein synthesis. I. Purification and characterization of seven initiation factors. J. Mol. Biol. 116, 727-753.

185. Hartz D, McPheeters D.S, Traut R, Gold L. (1988) Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425.

186. Anthony D.D, Merrick W.C. (1992) Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J. Biol. Chem. 267, 1554-1562.

187. Pestova T.V, Hellen C.U, Shatsky I.N. (1996) Canonical eukaryotic initiation factors determine initiation of translation by internal ribosomal entry. Mol. Cell. Biol. 16, 6859-6869.

188. Pestova T.V, Hellen C.U. (2003) Translation elongation after assembly of ribosomes on the Cricket paralysis virus internal ribosomal entry site without initiation factors or initiator tRNA. Genes Dev. 17, 181-186.

189. Blobel G. (1973) A protein of molecular weight 78000 bound to the polyadenylate region of eucaryotic messenger RNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 924-928.

190. Algire M.A, Maag D, Savio P, Acker M.G, Tarun S.Z, Sachs A.B, Asano K, Nielsen K.H, Olsen D.S, Phan L, Hinnebusch A.G, Lorsch J.R. (2002) Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA 8, 382-397.

191. Lorsch J.R, Herschlag D. (1999) Kinetic dissection of fundamental processes of eukaryotic translation initiation in vitro. EMBO J. 18, 6705-6717.

192. Le H, Browning K.S, Gallie D.R. (2000) The phosphorylation state of poly(A)-binding protein specifies its binding to poly(A) RNA and its interaction with eukaryotic initiation factor (elF) 4F, elFiso4F, and elF4B. J. Biol. Chem. 275, 17452-17462.

193. Pilipenko E.V, Pestova T.V, Kolupaeva V.G, Khitrina E.V, Poperechnaya A.N, Agol V.I, Hellen C.U. (2000) A cell cycle-dependent protein serves as a template-specific translation initiation factor. Genes Dev. 14, 2028-2045.

194. Preobrazhensky A.A, Spirin A.S. (1978) Informosomes and protein components: the present state of knowledge. Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 21,1-38.

195. Minich W.B, Ovchinnikov LP. (1992) Role of cytoplasmic mRNP proteins in translation. Biochimie 74,477-483.

196. Minich W.B, Maidebura I.P, Ovchinnikov L.P. (1993) Purification and characterization of the major 50-kDa repressor protein from cytoplasmic mRNP of rabbit reticulocytes. Eur. J. Biochem. 212, 633-638.

197. Овчинников Л.П, личное сообщение.

198. Didier D.K, Schiffenbauer J, Woulfe S.L, Zaceis M, Schwartz B.D. (1988) Characterization of the cDNA encoding a protein binding to the major histocompatibilitycomlex class IIY box. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 283-287.

199. Wistow G. (1990) Col shock and DNA binding. Nature 344, 823-824.

200. Jones P.G, VanBogelen R.A, NeidHardt F.C. (1987) Induction of proteins in response to low temperature in Escherichia coli. J. Bacteriol. 169, 2092-2095.

201. Davydova E.K, Evdokimova E.M, Ovchinnikov L.P, Hershey J.W. (1997) Overexpression in COS cells of p50, the major core protein associated with mRNA, results in translation inhibition. Nucleic cids Res. 25, 2911-2916.

202. Svitkin Y.V, Ovchinnikov L.P, Dreyfuss G, Sonenberg N. (1996) General RNA binding proteins render translation cap dependent. EMBO J. 15, 7147-7155.

203. Varcarcel J, Gebauer F. (1997) Post-transcriptional regulation: The dawn of PTB. Curr. Biol. 7, 705-708.

204. Ghetti A, Pinol-Roma S, Michael W.M, Morandi C, Dreyfuss G. (1992) hnRNPI, the polypyrimidine tract binding protein: Distinct nuclear localization and association with hnRNPs. Nucleic Acids Res. 14, 3671-3678.

205. Kaminski A., Huny S.L, Patton J.G, Jackson R.J. (1995) Direcy evidance that polypyrimidine tract binding protein (PTB) is essential for internal initiation of encephalomyocarditis vitus RNA translation. RNA 1, 924-938.

206. Kaminski A, Jackson R.J. (1998) The polypyrimidine tract binding protein (PTB) requirement for internal initiation of translation of cardiovirus RNAs is conditional rather than absolute. RNA 4, 626-638.

207. Perez I, McAfee J.G, Patton J.G. (1997) Multiple RRMs contribute to RNA binding specificity and affinity for polypyrimidine tract binding protein. Biochemistry 36,11881-11890.

208. Kolupaeva V.G, Hellen C.U.T, Shatsky I.N. (1996) Structural analysis of the interaction of the pyrimidine tract binding protein with the internal ribosome entry segment of encephalomyocarditis virus and foot-and-mouth disease virus. RNA 2,1199-1212.

209. Mitchell S.A, Brown E.C, Coldwell M.J, Jackson R.J, Willis A.E. (2001) Protein factor requirements of the Apaf-1 Internal ribosome entry segment: roles of polypyrimidine tract binding protein and upstream of N-ras. Moll. Cell. Biol. 21, 3364-3374.

210. Rozen F, Edery I, Meerovitch K, DeverT.E, Merrick W.C, Sonenberg N. (1990) Bidirectional RNA helicase activity of eucaryotic translation initiation factors 4A and 4F. Mol. Cell. Biol. 10, 1134-1144.

211. Methot N, Pause A, Hershey J.W, Sonenberg N. (1994) The translation initiation factor elF-4B contains an RNA-binding region that is distinct and independent from its ribonucleoprotein consensus sequence. Mol. Cell. Biol. 14, 2307-2316.

212. Methot N, Song M.S, Sonenberg N. (1996) A region rich in aspartic acid, arginine, tyrosine, and glycine (DRYG) mediates eukaryotic initiation factor 4B (elF4B) self-association and interaction with elF3. Mol. Cell. Biol. 16, 5328-5334.