Характеристика белковых факторов, связывающихся с регуляторными участками эндогенных ретровирусов человека семейства К тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи

ТРУБЕЦКОЙ ДМИТРИЙ ОЛЕГОВИЧ

ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВЫХ ФАКТОРОВ, СВЯЗЫВАЮЩИХСЯ С РЕГУЛЯТОРНЫМИ УЧАСТКАМИ ЭНДОГЕННЫХ РЕТРОВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА

СЕМЕЙСТВА К

02.00.10-Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук Л.Г. Николаев

Официальные оппоненты:

доктор химических наук кандидат химических наук

В.Л. Туницкая М.Б. Костина

Ведущая организация:

Институт биологии развития РАН

Защита состоится «¡/'Т >> ^ 2005 г. в_10_часов на заседании

Специализированного совета Д00201901 при Институте биоорганической химии Ихмени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г.Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан

¿5 »Нар

2005 г.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Эндогенные ретровирусы человека и их фрагменты, представленные несколькими семействами и составляющие до 8 % всей ДНК человеческого генома, обладают потенциальной способностью регулировать экспрессию близко расположенных генов. Благодаря их способности к перемещению по геному и к амплификации они могут быть важными инструментами эволюции и видообразования. Некоторые из них обладают способностью образовывать вирусные частицы, что свидетельствует об их участии в патогенных процессах, включая опухолевую трансформацию. Одиночные LTR некоторых семейств эндогенных ретровирусов человека, образующиеся, по всей видимости, по механизму гомологичной рекомбинации, присутствуют в геноме в количествах в десятки раз больших, чем соответствующие провирусы, что многократно умножает их регуляторный потенциал. Показано, что одиночные LTR человеческих эндогенных ретровирусов (HERV) могут служить промоторами и терминаторами транскрипции клеточных генов как in vitro, так и in vivo, а также обладать другими функциями. Таким образом, изучение эндогенных ретровирусов человека позволило получить ряд важных новых данных о механизмах регуляции и эволюции на уровне полного генома человека. Типичный LTR ретровируса включает в себя комплекс регуляторных элементов, необходимых для эффективной транскрипции провирусной ДНК: промоторы и энхансеры, необходимые для инициации транскрипции, и сигналы терминации и полиаденилирования РНК. Наличие промоторной и энхансерной активностей LTR экзогенных и эндогенных ретровирусов предполагает связывание ими специфических регуляторных белков.

Семейство К эндогенных ретровирусов человека (HERV-K) считается наиболее биологически активным и, возможно, способно формировать вирионы в клетках плаценты и тератокарциномы. Нуклеотидные последовательности LTR этого семейства были проверены на наличие участков связывания белковых факторов клетки-хозяина с использованием торможения в геле и ультрафиолетовой сшивки. Было показано, что последовательности LTR двух подсемейств HERV-K содержат специфические сайты связывания по крайней мере для трёх белковых факторов - ERF1, ERF2 и ERF3 (Akopov et al., 1998). По своим характеристикам эти белки не похожи на уже известные факторы транскрипции. Участок их связывания расположен в 5'-области Ш-элемента LTR.

Цель работы состояла в идентификации и функциональной характеристике регуляторных участков LTR эндогенных ретровирусов человека семейства К, связывающихся с белковыми факторами, а также в выделении и характеристике белков, связывающихся с этими участками.

Объём работы.

Диссертационная работа изложена на ¿3 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, состоящего из 151 наименования.

Научная новизна и практическая ценность.

В настоящей работе показано, что центральная и 3'-концевая области LTR HERV-К, в частности область негативного регуляторного элемента, способны специфически связываться с клеточными белковыми факторами. Было также обнаружено, что в клетках, где LTR HERV-K обладает энхансерной активностью, с центральной областью LTR связывается дополнительный клеточный фактор. Была проанализирована тканеспецифичность белковых факторов, связывающихся с определённым участком длинного концевого повтора человеческого эндогенного ретровируса семейства К. Был разработан метод аффинной элюции специфических ДНК-связывающих белков с гепарин-агарозной колонки, и с его помощью выделены белки, связывающиеся с 5'-концом области U3 LTR HERV-K. Один из белков был идентифицирован и охарактеризован методами масс-спектрометрии и иммунохимии.

Апробация полученных результатов.

Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: 7th International Symposium on Hyphenated Techniques in Chromatography and Hyphenated Chromatographic Analyzers (HTC 7), 2002; FEBS advanced course No 02-11, 2002; VI чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова, 2002; 2nd International Workshop "Retrotransposons and genome evolution", 2003; Cold Spring Harbor Laboratory meeting on retroviruses, 2004; 3rd European Conference & Practical course "Advanced methods for industrial production, purification, and characterization of gene vectors", 2004; Конгрессы HUPO 2003 и HUPO 2004.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Клеточные белки, специфически связывающиеся с LTR HERV-K

Для изучения связывания белковых факторов нами был выбран LTR HERV-K из геномного локуса L47334 (далее LTR L47334), расположенного в области ql3.2 на хромосоме 19 человека и принадлежащего к "молодому" подсемейству HERV-K, появившемуся в геноме после расхождения линий человека и шимпанзе. Структура этого LTR, в числе других, была детально проанализирована в нашей лаборатории (Lebedev, 2000), a LTR использовался для исследования его промоторной и энхансерной активностей (Domansky, 2000; Доманский, 2002).

Локализация и специфичность связывания факторов ERF1, ERF2 и ERF3 с 5'-участком области U3 LTR HERV-K

Ранее в нашей лаборатории было показано, что LTR HERV-K способен специфически связывать три белковых фактора. Белки были обозначены как ERF1, ERF2 и ERF3 (Endogenous Retrovirus Factors, эндогенные ретровирусные факторы) в соответствии с уменьшающимися молекулярными массами. Эти белки образуют комплекс, связьшающийся с участком ДНК длиной около 30 п.о., расположенным вблизи 5'-конца области U3 LTR HERV-K (Akopov et al, 1998). Для дальнейшей характеристики этих факторов нами был локализован участок их связывания с большей точностью. Для этого был синтезирован набор двунитевых олигонуклеотидов, перекрывающих различные участки этой последовательности, и проверена их способность связывать комплекс ERF методом сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) с белками ядерных экстрактов из различных клеточных линий человека и мыши (рис. 1). Из рисунка видно, что двунитевой олигонуклеотид длиной 21 п.о. (отожженные олигонуклеотиды С1 и С2, см. таблицу 1, далее олигонуклеотид С1/С2) также способен связываться специфически с клеточными белками, однако вместо одного ДНК-белкового комплекса наблюдаются два.

Для определения белкового состава комплексов с коротким (21 п.о.) олигонуклеотидом С1/С2 был проведён двумерный электрофоретический анализ с промежуточным сшиванием фрагмента ДНК с белками при помощи ультрафиолетового излучения (см. Материалы и методы). Как видно из рис. 2Б, один из комплексов с олигонуклеотидом С1/С2 длиной 21 п.о. содержит белковые факторы ERF1, ERF2 и ERF3, а другой (с большей электрофоретической подвижностью) - только факторы ERF1 и ERF2.

А Б

Рис. 1. Сдвиг электрофоретической подвижности (ЕЛКА) с использованием ядерных экстрактов из клеток Лигка^ КгеЬз-II и НеЬа. В качестве зонда использовали двунитевые олигонуклеотиды длиною 30 п.о. (А) и 21 п.о. (Б), содержащие участок связывания ЕШ\ В соседних дорожках нанесены комплексы, образованные при добавлении 5 и 10 мкг белка соответствующего ядерного экстракта. 1 - зона сдвига комплекса олигонуклеотцц-белок; 2 - свободный меченый олигонуклеотид.

Относительные количества этих двух комплексов зависят от типа клеток (рис 1Б), количества ядерного экстракта и других неустановленных факторов Тем не менее общий белковый состав комплекса с олигонуклеотидом С1/С2 длиной 21 по не отличается от такового с более длинным олигонуклеотидом

В то же время состав комплексов области Ш HERV-K существенно зависит от состояния клеток Хорошо известно, что тепловой шок (Moggs, 2003) и митогены, такие как фитогемагглютинин и форболовые эфиры (Guгskaya, 1996), оказывают существенное влияние на профиль экспрессии генов в клетке Митогены, в частности, индуцируют продукцию эндогенных ретровирусов (Таске, 2003) Мы проследили влияние теплового шока и индукции клеток Juгkat митогенами на состав белкового комплекса, связывающегося с 5'-частью области Ш HERV-K (рис. 2 В,Г) Как видно из рисунка, при воздействии теплового шока и митогенов ДНК-белковый комплекс теряет фактор ERF3, тогда как факторы ERF1 и ERF2 остаются связанными с ДНК. Следует отметить, что комплекс может также включать другие белки, участвующие в связывании через белок-белковые взаимодействия и не сшивающиеся с ДНК

—• СЧ

U. A. л,

ас se а

ы Л Л

Рис. 2. Результаты эксперимента по EMSA с использованием олигонуклеотида С1/С2 длиной 21 п.о. и ядерного экстракта из клеток линии Jurkat (А), и состав белковых комплексов (Б, В, Г), полученный по результатам двумерного EMSA с ульрафнолетовой сшивкой. Подробности в тексте.

LTRL47334 Ш R U5

400 п.о

Prl 590г ,„,

^_393 п.о.

Pr4 725R

415 п.о. <-►

577for Рг2

136 п.о. <-►

Рг7 Рг2

Рис. 3. Структура LTR L47334 и расположение ПЦР-фрагментов, использованных для EMSA.

Полученные результаты демонстрируют, что, по крайней мере, некоторые LTR HERV-K сохранили потенциал для специфических взаимодействий с клеточными белками, что является необходимым условием их вовлечения в функциональную регуляцию генома.

Тканеспецифичное связывание белков другимиучастками LTR

Для дальнейшего изучения связывания ядерных белков, при помощи ПЦР-амплификации были получены три перекрывающихся фрагмента LTR L47334 длиной 400, 393 и 415 п.о. с использованием пар праймеров, положение которых приведено на рис. 3, а последовательности - в таблице 1. Эти фрагменты были радиоактивно мечены в ходе ПЦР-амшшфикации и связывающиеся с ними белки выявлены при помощи EMSA с ядерными экстрактами из клеточной линии Jurkat. В эксперимент брали по 500 нг белка ядерного экстракта. Полосы, соответствующие ДНК-белковым комплексам, были обнаружены для всех трёх фрагментов LTR. Можно сделать вывод о том, что все три фрагмента LTR способны связывать белки, отличающиеся по электрофоретической подвижности, однако наиболее эффективно комплекс образуется между 5'-концевым фрагментом LTR и факторами ERF.

Белки, образующие комплексы с фрагментами LTR, были обнаружены в ядерных экстрактах многих клеточных линий. Нами были проверены линии человеческих клеток эмбриональных карцином Тега-1 и NT2/D1, клеток Jurkat, эмбриональной почки 293, нейробластомы NGP, клеток HeLa, а также асцитной опухоли мышей Krebs-П. Присутствие белков ERF в клетках мышей, геном которых не содержит HERV-K, заставляет предположить, что эти белки связываются с регуляторными последовательностями не только HERV, но и клеточных генов.

Тот факт, что белковые комплексы специфически взаимодействуют с LTR, подтверждают эксперименты по конкуренции. Суть метода конкурентного связывания заключается в том, что в реакционную смесь, наряду с радиоактивно меченым специфическим фрагментом ДНК, вносится избыток того же самого фрагмента без метки. В результате этого, из-за конкурентного взаимодействия белка с избытком специфического немеченого фрагмента, сигнал на радиоавтографе уменьшается по отношению к контролю (белок, связавшийся с меченым фрагментом). По мере увеличения концентрации немеченого специфического к белку олигонуклеотида, наблюдается исчезновение сигнала в области комплекса олигонуклеотида с белками ERF, что свидетельствует о специфичности связывания белков ERF с U3 областью LTR.

Идентификация белков потенциально ответственныхза энхансерную активность LTRHERV-K

Ранее в нашей лаборатории было показано, что энхансерная активность HERV-K существенно различается в различных линиях клеток. В частности, были проанализированы близкие по происхождению клеточные линии человека Тега-1 и ЭТ2^1, полученные из одного и того же типа ткани (тестикулярная эмбриональная карцинома), но от разных индивидуумов. Было продемонстрировано, что в линии клеток Teгa-1 L47334 обладает высокой энхансерной активностью (примерно в 10 раз

активирует ранний промотор вируса SV40), тогда как в клеточной линии №Г2/Э1 энхансерная активность практически отсутствует (Domansky, 2002). Одно из

возможных объяснений этого факта может состоять в том, что наборы клеточных регуляторных белков, связывающихся с различны для этих типов клеток. Чтобы

проверить эту возможность, мы провели эксперименты по EMSA с использованием ядерных экстрактов из линий клеток Тега-1, и Juгkat (рис. 4).

Как видно из рис. 4А, не наблюдается различий в связывании факторов ERF между ядерными экстрактами из клеток Tera-1, NT2/D1 и Jurkat. По всей видимости, комплекс с белками ERF не влияет на тканеспецифичность энхансерной активности LTR. В то же время, белковые комплексы, сформированные ядерными экстрактами линии клеток Тега-1 с центральной областью LTR, заметно отличаются от комплексов с ядерными экстрактами линии NT2/D1 или Jurkat (рис. 4Б). Появляется дополнительный ДНК-белковый комплекс с большей электрофоретической подвижностью. Можно предположить, что белок или белки, образующие комплекс с высокой электрофоретической подвижностью, могут быть ответственны за повышенную энхансерную активность LTR в клеточной линии Тега-1.

Таким образом, различие в энхансерной активности между Тега-1 и NT2/D1 может объясняться различным набором клеточных белков, связывающихся с центральной областью LTR.

Связывание белков снегативнымрегуляторным элементом (NRE)

Ранее в нашей лаборатории при помощи анализа активности репортёрного гена при временной (транзиентной) трансфекции было показано, что LTR HERV-K обладают промоторной активностью в клетках эмбриональной карциномы человека и могут направлять транскрипцию в обоих направлениях относительно репортёрного гена. Кроме того, по результатам делеционного анализа было показано, что 3'-концевой участок области U5 LTR HERV-K обладает свойствами негативного регуляторного элемента (negative regulatory element, NRE) (Domansky, 2000). Так, делеция фрагмента области U5 приводила к повышению промоторной активности LTR независимо от ориентации последнего. Подобные негативные регуляторные элементы были описаны для пенистого вируса (foamy virus) человека (Yang, 1997), и вируса Т-клеточного лейкоза 1 (HTLV-1) (Seiki, 1990, Okumura, 1996).

Чтобы охарактеризовать NRE более детально, нами была проверена способность содержащего NRE фрагмента специфически связывать клеточные белки. Для этого эксперимента содержащий NRE фрагмент LTR L47334 длиной 136 п.о. был амплифицирован при помощи ПЦР с использованием праймеров Рг2 и Рг7 (см. таблицу 1), радиоактивно мечен и использован для EMSA с ядерными экстрактами из нескольких клеточных линий. Белки, способные связываться с NRE-содержащим фрагментом, были обнаружены во всех проверенных клеточных линиях. Специфичность связывания была подтверждена конкуренцией с немеченым фрагментом, содержащим NRE.

По результатам полученных экспериментов можно сделать вывод, что область L47334, содержащая негативный регуляторный элемент, способна связывать клеточные белки, которые, возможно, отвечают за свойства NRE.

Таблица 1. Структуры олигопуклеотидов (праймеров).

Олигонуклеотид Описание Структура (5'-3')

590г Внутренний праймер ЬТК 1.47334 GCCATATTTCAGACTATCACATGG

Prl Фланхирующий праймер 1/ГН 1.47334 CAGTCTTATCTCCTTTACTGACC

Рг2 Фланкирующий праймер ЬТК 1.47334 CCTCGTGTTTGTGCTTG

Рг4 Внутренний праймер Х.ТК. 1.47334 ATTGTCCAAGGTTTCTCCC

577£ог Внутренний праймер ЬТЯ 1.47334 GCCTTAGGGCTGGAGGTG

725R Внутренний праймер ЬТИ 147334 CAGCAGACAAACACGTGAAC

Рг7 Внутренний праймер ХЛ& 1,47334 GGGTCCCCTTATTTCTTTCTC

С1 Зонд для ЕМЭА AGTAGGAGACTCCATTTTGTT

С2 Зонд для ЕМЭА CTAACAAAATGGAGTCTCCTA

Выделение белков ERF1,2 и 3, специфически связывающихся с 5'-концом области Щ LTR HERV-K, и их идентификация

Получениеядерныхжстрактов

Белки, специфически связывающиеся с регуляторными элементами LTR человеческих эндогенных ретровирусов семейства HERV-K, были впервые идентифицированы в нашей лаборатории в ядерных экстрактах клеток человека линий Jurkat и СНО и обозначены как ERF1, 2 и 3 (Endogenous Retrovirus Factors) (Akopov et al, 1998). Для дальнейшей функциональной характеристики этих белков необходима идентификация их генов. Наиболее прямой и распространённый до последнего времени метод идентификации генов белковых факторов заключается в очистке белка, определении его N-концевой последовательности, синтезе на основании этой последовательности вырожденных праймеров, комплементарных 5'-концевой области мРНК искомого белка, и клонировании этих мРНК путём ПЦР-амплификации с этим

праймером и олиго-сГГ-праймером на матрице кДНК, синтезированной на суммарной мРНК из содержащих искомые белки клеток. Определение первичной структуры геномов человека и других организмов привело к появлению геномных баз данных, которые уже содержат нуклеотидные последовательности большинства генов. Это позволяет во многих случаях обходиться без секвенирования белков и клонирования кДНК, пользуясь, например, методами масс-спектрометрии (см. ниже). Тем не менее, в любом случае, для нахождения соответствующего белку гена необходимо получение белка в чистом виде в определенном количестве. Основная трудность при этом состоит в весьма малом содержании регуляторных белков - обычно не более десятков или сотен молекул на клетку.

Ядерный экстракт из клеток Jurkat содержит относительно много белков ERF, тем не менее, для их очистки в необходимых количествах (5-30 мкг) требуются десятки миллилитров ядерного экстракта, что соответствует десяткам литров суспензионной культуры клеток. Получение и обработка такого количества клеток весьма трудоёмки и дорогостоящи. Поэтому на первом этапе в качестве источника исследуемых белков нами была выбрана плацента человека, как наиболее доступный тип человеческой ткани. Оказалось, что искомые белки в плаценте содержатся, однако их количество слишком мало для эффективного выделения (данные не приведены).

Так как группа факторов ERF была ранее обнаружена нами в клетках китайского хомячка, а системы регуляции транскрипции у человека и грызунов весьма похожи, мы предположили, что искомые белки могут содержаться и в опухолевых клетках грызунов. Поэтому было предложено в качестве источника ядерных белков использовать клетки асцитной карциномы мышей, которые можно получать в значительных количествах. В результате заражения мышей линии BALB/c была получена асцитная жидкость, содержащая клетки эпителиальной асцитной карциномы мышей Krebs-П, из которых был выделен ядерный экстракт. В ядерном экстракте из асцитной опухоли мышей содержится интересующий нас специфический белковый комплекс в количествах, сравнимых с содержанием его в клетках Jurkat. Таким образом, нами был подобран удобный источник ядерных белков, с высокой аффинностью связывающихся с идентифицированным ранее участком 5'-конца области U3 LTR HERV-K.

Выделение факторовЕВ^методомДНК-аффиннойхроматографии

Для выделения и очистки ДНК-связывающих белков из ядерных экстрактов клеток асцитной карциномы мышей Krebs-П первоначально нами был использован метод ДНК-аффинной хроматографии (Kadonaga, 1986). Известно, что белки, способные связываться

с ДНК, хорошо взаимодействуют с гепарином, так как структура его повторяющегося олигосахаридного звена напоминает углеводно-фосфатный скелет нуклеиновых кислот. На первом этапе белки, связавшиеся с гепарин-агарозой, элюировали с колонки буфером с высокой концентрацией соли (0,5 М КС1). Полученные элюаты наносили на аффинную колонку с пришитыми к носителю двунитевыми олигонуклеотидами. Аффинный носитель был получен в результате предварительного лигирования олигонуклеотидов, содержащих сайт связывания ERF белка (олигонуклеотиды С1 и С2, см. таблицу 1), с последующей их пришивкой к сефарозе (Arndt--Jovin, 1975). На колонке с таким сорбентом задерживаются белки, образовавшие комплексы разной степени сродства с пришитыми олигонуклеотидами. На следующем этапе были подобраны условия солевой элюции с сорбента белков, образующих с олигонуклеотидами наименее прочные комплексы (0,1 М КС1). Специфические белки, образующие с олигонуклеотидом прочные комплексы, элюировали с сорбента буфером с концентрацией соли 0,4-0,5 М КС1. При использовании этого метода на стадии элюции слабо связывающихся белков наблюдаются, как правило, большие потери (до 80%) специфических белков (таблица 2), что значительно снижает их окончательный выход. Таким образом, рассматриваемый метод ДНК-аффинной хроматографии достаточно трудоёмок, так как требует приготовления специального аффинного носителя для каждого выделяемого белка или комплекса белков. Кроме того, большие потери специфических белков в процессе их выделения приводят к значительному увеличению объемов исходного материала (в данном случае -ядерного

Таблица 2. Сравнение эффективности очистки ДНК-связывающих белков с помощью методов ДНК-аффинной хроматографии и аффинной элюции олигонуклеотидом.

Фракция Белок (мкг) Белок (%) Связывающая активность (%) Очистка (кратность)

Исходный ядерный экстракт 3200 100 100 1

Белки, элюированные с гепарин-агарозы 270 8,5 92 11

Белки с ДНК-аффинной колонки 0,16 0,005 10 2000

Белки, элюированные с гепарин-агарозы двухцепочечным олигонуклеотидом 1.8 0,06 80 1400

экстракта) и к масштабированию расходов сопутствующих материалов на всех этапах получения белков в количествах, необходимых для их надежной идентификации.

Хотя с помощью метода ДНК-аффинной хроматографии нам удалось выделить белковые факторы ERF1,2 и 3 в практически гомогенном виде (рис. 6Б), выход белка был невелик (таблица 2) и недостаточен для секвенирования или идентификации белков методом масс-спектрометрии.

Выделение факторов ERFметодом аффинной элюции олигонуклеотидом С1/С2

Дря. упрощения процедуры выделения и повышения выхода факторов ERF мы разработали альтернативный метод получения связывающихся с ДНК-белков с использованием иммобилизованного на агарозе гепарина. Гепарин широко используется при выделении ДНК-связывающих белков из разных источников (Genersch, 1995; Cheng, 1997; Gadgil, 1999). Этот отрицательно заряженный полимер можно рассматривать как аналог фосфатного остова ДНК, в связи с этим большинство белков, специфически связывающихся с ДНК, имеют сродство к гепарину. Тем не менее, сродство этих белков к ДНК, содержащей последовательность их специфических участков связывания, значительно выше, чем к гепарину, что дает возможность быстро и эффективно их очищать при помощи элюции низкосолевым буфером, содержащим такую ДНК (рис. 5).

На первом этапе белки ядерного экстракта из клеток асцитной карциномы мышей Krebs-II были сорбированы на гепарин-агарозном носителе, аналогично тому, как описано выше для первого этапа ДНК-аффинной хроматографии. Далее колонку промывали буфером, содержавшим КС1 в такой концентрации, при которой специфические белки с колонки не элюируются (в нашем случае 0,2 М КС1). Белковые факторы ERF далее элюировали тем же буфером, содержащим меченый 32Р двунитевой олигонуклеотид с последовательностью, соответствующей участку связывания ERF (C1/C2). Элюированные с колонки фракции анализировали методом EMSA.

Олигонуклеотид вытесняет белки из комплексов с гепарином, в результате чего на выходе с колонки обнаруживаются высоко аффинные комплексы белков с олигонуклеотидом, совпадающие по электрофоретической подвижности с комплексами, получаемыми в присутствии исходного ядерного экстракта, Таким образом, предложенный нами метод очистки ДНК-связывающих белков позволяет получать эти белки в виде комплексов с олигонуклеотидом.

Для оптимизации процесса очистки факторов ERF были проделаны следующие эксперименты:

1. Определена ёмкость гепарин-агарозной колонки. Для этого колонку с гепарин-агарозой (0,5 мл) последовательно нагружали увеличивающимися количествами ядерного экстракта. Насыщение гепарин-агарозы факторами ERF происходило при нанесении на колонку 6,4 мг белка ядерного экстракта. Во всех последующих экспериментах на такую колонку наносили не более 4 мг исходного белка.

2. Проверена полнота элюции факторов ERF с колонки двунитевым специфическим олигонуклеотидом С1/С2. Для этого, после элюции факторов при помощи олигонуклеотида, колонку дополнительно промывали 0,5 М КС1. Количество факторов, элюируемых с колонки высокосолевым буфером после элюции олигонуклеотидом, незначительно.

использованием не содержащего радиоактивной метки олигонуклеотида С1/С2. Элюат собирали, концентрировали осаждением трихлоруксусной кислотой и анализировали при помощи белкового денатурирующего электрофореза в присутствии SDS. В состав элюата входят три мажорных белка с молекулярными массами от 60 до 70 кДа, не отличающихся от полученных методом аффинной хроматографии (рис. 6). Постадийные результаты очистки факторов ERF методом аффинной элюции в сравнении с методом ДНК-аффинной хроматографии приведены в таблице 2. Из результатов, представленных в таблице, видно, что при использовании предлагаемого метода аффинной элюции удаётся получить из ядерного экстракта в одну стадию высокоочищенные специфические ДНК-связывающие белки при кратности их очистки в 1400 раз и с выходом примерно на порядок большим, чем при ДНК-аффинной хроматографии.

Основными достоинствами метода аффинной элюции по сравнению с ДНК-аффинной хроматографией являются:

1. Метод аффинной элюции намного проще и быстрее, искомый белок может быть выделен за одну стадию в течение одного дня.

2. Потери целевого белка в несколько раз меньше, чем при ДНК-аффинной хроматографии.

3. Нет необходимости в приготовлении специального аффинного носителя для каждого выделяемого белка. Более того, в принципе возможно (хотя экспериментально такая возможность не проверялась) получать несколько различных белков с различной специфичностью связывания из одной порции ядерного экстракта, проводя элюцию с одной и той же колонки различными олигонуклеотидами.

Идентификация ERF(l-3) методом масс-спеюпрометрии

Исследование белков ERF1, 2 и 3, полученных в результате аффинной элюции с гепарин-агарозы двунитевым олигонуклеотидом С1/С2 и затем разделенных с помощью электрофореза в ПААГ (рис. 6), проводили с помощью метода масс-спектрометрии MALDI-TOF-MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of- Flight Mass Spectrometry) (Shevchenko, 1996). Предварительно полосу каждого из ERF(l-3) вырезали из полиакриламидного геля, расщепляли трипсином и проводили масс-спектрометрический анализ полученных пептидов. Молекулярные массы выявленных пептидов сопоставляли с молекулярными массами пептидов, входящих в базу данных MASCOT с последующей идентификацией наиболее вероятных белков, включающих выявленные пептиды. В результате такого анализа ERF1 более всего соответствовал конститутивному белку теплового шока Hsc70 (Heat shock 70kDa protein 8, isoform 1, Homo sapiens). Исследование ERF(l-3) с помощью MALDI-TOF-MS-анализа

mskgpavgidlgttyscvgvfahgkveiiandagnrttpsyvaftdterligdaaknavamnpt

ntyfdakrMgrrfddawa8dinkhwpfmwndagrpkyaveykgetksfypeevssinvltkink

eiaeaylgktvtnawtvpayfndsaraatkdagtiaglnvlriineptaaaiaygldkkvgae

rnvlifdlgggtfdvsiltiedgifevkstagdthlggedfdnrmvnhf iaefkrkhkkdisen

kravrrlrtacerakrtlssstaasieidslyegidfytsitrarfeelnadlfrgtldpveka

lrdakldksaihdivlvggstripkiaklladf fngkelnksinpdeavaygaavaaailsgdk

senvadlllldvtplslgietaggvmtvllkrnttiptkatatfttysdnapgvliavyegera

mtkdnnllgkfeltgippaprgvpaievtfdidangilnvsavdkstgkenkititndkgrlsk

ediermvaeaekykaedekardkvs sknslesyafnmkatvedeklagkindedkakildkcne

linwldknataekeefehaakelekvcnpiltklyasaggmpggmpggfpgggappsggassgp

tieevd

Рис. 7. Аминокислотная последовательность белка Hsc70 (ААН16660, Heat shock 70 kDa protein 8, isoform 1, Homo sapiens). Идентифицированные триптические пептиды подчёркнуты.

проводили 6 раз, причем для получения аффинного элюата использовали ядерный экстракт, выделенный в разное время. В результате удалось установить значительную часть аминокислотной последовательности ERF1, совпадающей со структурой белка теплового шока Hsc70 на 66% (рис. 7).

MASCOT-анализ пептидов, полученных в результате триптического гидролиза ERF-2 и ERF-3, не выявил известных белков, включая гипотетические. Это позволяет предполагать, что ERF2 и ERF3 могут быть новыми белками и, соответственно, кодироваться неизвестными пока генами.

EMSA ERFe присутствии антител к Hsc70

Поскольку в настоящее время ничего не известно о непосредственном взаимодействии белков теплового шока, и в частности Hsc70, с нуклеиновыми кислотами, возможно, эту функцию в составе комплекса ERF(l-3):flHK выполняет ERF2 или ERF3.

Для независимого подтверждения того, что Hsc70 принимает участие в формировании комплекса ERF с LTR HERV-K, мы использовали метод дополнительного сдвига электрофоретической подвижности комплекса в присутствии антител к этому белку. Е.В. Свирщевской (группа клеточных взаимодействий отдела иммунологии ИБХ РАН) были получены поликлональные антитела (IgG фракция) к рекомбинантному Hsc70 (любезно предоставлен доктором М. Ladjimi, Universite Pierre & Marie Cune, France). EMSA анализ проводили по стандартной методике (см. Материалы и методы) с той лишь разницей, что к реакционной смеси добавляли антитела. Суть метода заключается в том, что при специфическом взаимодействии антител с белками, связывающимися с меченым фрагментом, комплекс белка с ДНК и антителом будет обладать меньшей электрофоретической подвижностью, нежели просто комплекс ДНК с белком. Разница в электрофоретической подвижности свидетельствует о том, что добавленные антитела специфически связываются с белком, входящим в комплекс с ДНК. На рис. 8 можно видеть, что в присутствии антител образуется комплекс ДНК-белок-антитело, который имеет меньшую электрофоретическую подвижность, чем комплекс ДНК-белок. Полученные данные подтверждают результаты идентификации ERF1 методом MALDI-TOF-MS.

Вестерн-блотанализERFc антителами к Hsc70

Мы также исследовали возможность взаимодействия белков фракции ERF с моноклональными антителами к Hsc70, любезно предоставленными доктором Б.А.

Маргулисом (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Анализ проводили по стандартной методике (см. Материалы и методы), предполагающей электрофоретическое разделение белков фракции ERF в ПААГ (Рис. 9А) с последующим их переносом на PVDF-мембрану и инкубацией с моноклональными антителами к Hsc70 (рис. 9Б). На дорожке 3, соответствующей смеси белков ERF1,2 и 3, полученных из ядерного экстракта Rrebs-П методом аффинной элюции, наблюдается полоса, совпадающая по электрофоретической подвижности с Hsc70 (дорожка 2).

kDa 1 2 3 4 5 6

тП «-й «-ri 31^ •»*

12 3 4 5

¡Г"Г"7*~ r -

j i** et tfeg

2ЪФ W»

t 4 «д-

Рис. 9. Вестерн-блот анализ ERF с антителами к IIsc70. А -электрофореграмма белков фракции ERF в ПААГ; Б - PVDF-рсплика с ПААГ (А), обработанная моноклональными антителами к Hsc70. Вторичные антитела конъюгированы с пероксидазой, в качестве субстрата использовали 4-хлор-1-нафтол. Дор. 1,6 - набор стандартных маркерных белков с известными молекулярными массами; дор. 2 - смесь Hsc70 (70 кДа), бычьего сывороточного альбумина (67 кДа) и глютаматдегидрогеназы (60 кДа); дор. 3 - белки ERF, полученные методом аффинной элюции; 4,5 - ядерный экстракт из клеток Krebs-II (20 и 40 мкг).

Эти данные также подтверждают результаты идентификации Е1Ш методом МАЬШ-ТОР-МЗ. Таким образом, в составе комплекса белков Е1Щ1-3) с 5'-концом области 113 1ЛИ НЕЯУ-К обнаруживается белок, который по триптической пептидной карте и антигенным детерминантам идентифицируется как конститутивный белок теплового шока 1Ьс70.

выводы

Состав комплекса 5'-области HERV-K с клеточными белками изменяется при воздействии на клетку теплового шока и митогенных факторов.

Центральная и 3'-концевая области HERV-K, в частности область негативного регуляторного элемента, способны специфически связываться с клеточными белковыми факторами.

В клетках Тега-1, где HERV-K обладает высокой энхансерной активностью, с центральной областью связывается дополнительный клеточный фактор.

Разработан новый метод выделения ДНК-связывающих белков, и с его помощью очищены до гомогенности три белка, образующие специфический комплекс с 5'-областью LTRHERV-K.

При помощи метода масс-спектрометрии MS-MALDI-TOF один из белков, образующих комплекс с 5'-областью HERV-K, был идентифицирован как сходный с конститутивно экспрессирующимся белком теплового шока Hsc70.

Присутствие Hsc70 в составе комплекса с 5'-концом области U3 HERV-K

было подтверждено иммунохимическими методами с использованием поликлональных и моноклональных антител.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ

D 0. Trubetskov. L.G. Nikolaev, S.B. Akopov, L.L. Zavalova. HSC70 protein is a specifically binding protein to potential LTR HERV-K regulatory element. Mol. Cell. Proteomics, 2004, vol. 3, No. 10, p. S91.

V.M. Ruda, S.B. Akopov, P.O. Trubetskov. NX. Manuylov, A.S. Vetchinova, L.L. Zavalova, L.G. Nikolaev, E.D. Sverdlov. Tissue specificity of enhancer and promoter activities ofa HERV-K(HML-2) LTR. Virus Res., 2004, vol. 104, No 1, p. 11-16.

D O. Trubetskov, L.G. Nikolaev, S.B. Akopov, L.L. Zavalova. Proteomic analysis of proteins specifically binding to potential LTR HERV-K regulatory element. Mol. Cell. Proteomics, 2003, vol. 2, No. 9, p. 992.

P.O. Trubetskov, L.L. Zavalova, S.B. Akopov, L.G. Nikolaev. Purification ofproteins specifically binding human endogenous retrovirus К long terminal repeat by affinity elution chromatography. J Chromatogr A., 2002, vol. 976, No. 1-2, p. 95-101.

P.O. Trubetskov. L.G. Nikolaev, S.B. Akopov, L.L. Zavalova. Proteomic analysis of proteins specifically binding to potential LTR HERV-K regulatory element. 3 rd European Conference & Practical course "Advanced methods for industrial production, purification, and characterization ofgene vectors", 14th-26th June 2004, Evry, France, p. 121.

V.M. Ruda, S.B. Akopov, P O. Trubetskov. N.L. Manuylov, A.S. Vetchinova, L.L. Zavalova, L.G. Nikolaev, E.P. Sverdlov. Negative regulatory element (NRE) ofUS-region of human endogenous retrovirus К LTR does not display cell type specificity. Cold Spring Harbor Laboratory 2004 meeting on retro viruses, CSH, New York, USA, p. 236.

S. Akopov, A. Pomansky, V. Ruda, N. Manuylov, A. Vetchinova, P. Trubetskov. E. Kopantzev, L. Zavalova, L Nikolaev, E. Sverdlov. Functional activity ofhuman endogenous retrovirus К long terminal repeats. 2nd International Workshop "Retrotransposons and genome evolution" 20-22.04,2003 (тезисы докладов, с. 13, Сочи, Россия).

СБ. Акопов, А.Н. Доманский, В.М. Руда, Д О. Трубецкой. Е.П. Копанцев, Л. Л. Завалова, Л.Г. Николаев, Е.Д. Свердлов. Длинные концевые повторы эндогенных ретровирусов человека семейства К - анализ функциональной активности. VI чтения, посвященные памяти академика Ю.А Овчинникова, 25.11-2.12,2002 (тезисыдокладов, с.45, Москва-Пущино), Россия.

P.O. Trubetskov. Isolation ofproteins binding to specific PNA sequences by affinity desorption chromatography. Students Abstracts ofFEBS advanced course No 02-11,2002, p.12.

P.O. Trubetskov. L.G. Nikolaev, L.L. Zavalova. Isolation ofproteins binding to specific PNA sequences by affinity desorption chromatography - PAGE. Book of abstracts ofHTC 7, Febr.6-8,2002,p. 161.

Заказ № 344. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

op

Ь г *

/ {

Список используемых сокращений

Ключевые слова

1. Обзор литературы

1.1.Введение

1.2.Ретроэлементы

1.3.Структура эндогенных ретровирусов.

1.4.Типы эндогенных ретровирусов

1.5.Семейства эндогенных ретровирусов 12 1 .б.Эндогенные ретровирусы семейства HERV-H 12 1.7.Эндогенные ретровирусы семейства HERV-K(CUU)

1.8.Продукты трансляции эндогенных ретровирусных последовательностей и их роль в функционировании организма человека

1.9.Роль эндогенных ретровирусов и их LTR в регуляции транскрипции клеточных генов

1.10. Белковые факторы-регуляторы транскрипции, способные связываться с LTR

1.11. Свиные эндогенные ретровирусы, PERVs

1.12. Белки теплового шока (HSP, БТШ)

Эндогенные ретровирусы человека и их фрагменты, представленные несколькими семействами и составляющие до 8 % всей ДНК человеческого генома, обладают потенциальной способностью регулировать экспрессию близко расположенных генов. Благодаря их способности к перемещению по геному и к амплификации они могут быть важными инструментами эволюции и видообразования. Некоторые из них могут также обладать и способностью образовывать вирусные частицы, что свидетельствует об их участии в патогенных процессах, включая опухолевую трансформацию. Одиночные LTR некоторых семейств эндогенных ретровирусов человека, образующиеся, по всей видимости, по механизму гомологичной рекомбинации, присутствуют в геноме в количествах в десятки раз больших, чем соответствующие провирусы, что многократно умножает их регуляторный потенциал. Показано, что одиночные LTR HERV могут служить промоторами и терминаторами транскрипции клеточных генов как in vitro, так и in vivo, а также обладать другими функциями. Таким образом, изучение эндогенных ретровирусов человека позволило получить ряд важных новых данных о механизмах регуляции и эволюции на уровне полного генома человека.

1.2. Ретроэлементы

В геноме позвоночных существует большое количество различных семейств и типов ретроэлементов, способных играть важную роль в эволюции (1). Их активное перемещение по геному является одним из основных источников изменчивости генома. Без участия ретроэлементов и кодируемых ими ферментов темпы эволюции животного мира могли бы значительно замедлиться. По доминирующей на сегодня точке зрения все ретроэлементы тесно взаимосвязаны между собой. Роль ретровирусов и других кодирующих обратную транскриптазу (RT) последовательностей является ключевой в эволюции других ретроэлементов, таких как псевдогены, короткие диспергированные повторы, Alu-повторы и т.д. Согласно этому, другие ретроэлементы либо являются продуктами обратной транскрипции, т.е. ДНК-копиями (кДНК) клеточных РНК-транскриптов, либо бывшими ретровирусами, давно внедрившимися в геном позвоночных (2-4) и потерявшими в ходе рекомбинаций и замен часть своих генов (7).

Эндогенные ретровирусы человека (HERVs - human endogenous retroviruses) представляют собой один из классов ретроэлементов, появившиеся в результате давнего заражения ретровирусами клеток зародышевого пути. Эндогенные ретровирусы и их элементы представлены в геноме высших приматов десятками тысяч копий, при этом число представителей различных классов НЕЮ/ сильно различается (Табл. 1), составляя в сумме приблизительно 8% всего наследственного материала (15). Кроме полноразмерных элементов, для ряда классов НЕЮ/ обнаружено большое число одиночных длинных концевых повторов (ЬТЯ), являющихся скоре всего продуктами рекомбинации целого ретровируса, содержащего два длинных концевых повтора в своём составе. Их число может значительно превышать количество полноразмерных НЕЮ/ (Табл.1). Естественно, что столь значительный объём вирусной генетической информации в геноме может оказывать существенное влияние на функционирование организма.

Таблица 1. Характеристики ретроэлементов

Геномная структура Название элемента Пример Число копий на гаплоидный геном Доля генома

Ретроэлемент без ЮГ с клеточным промотором Ретроген (псевдоген) Фосфоглицерат-киназа человека 1-10

Ретроэлемент без ЮГ с внутренним промотором SINE (Short interspersed element) Alu SENE-R 1090000 400000 10,6 % 2,6 %

Ретроэлемент с ЮГ и внутренним промотором Ретропозон LINE (Long interspersed element) 850000 21%

Ретроэлемент с ЮГ и ига Ретротранспозон Ту 1 100-1000 1%

Ретроэлемент с ЮГ, ЬТ11 и Епу Эндогенный ретровирус HERV-H, HERV-R, ERV-9, HERV-K 8000-112000 8% ига Одиночный длинный концевой повтор (LTR) LTR HERV-K 10-1000 5%

По широко распространённой на сегодня точке зрения ретровирусы инфицировали геном неоднократно. В пользу этого говорит наличие их в геноме как беспозвоночных, так и высокоразвитых позвоночных животных (4). Ретровирусы внедрились в геном приматов примерно 10-60 млн. лет назад (15) путём инфицирования экзогенными ретровирусами и с того времени существуют как стабильно интегрированные вертикально наследуемые провирусы.

В ходе эволюции хозяина их геном видоизменялся, в нём происходили нарушения открытых рамок считывания. Процессы транскрипции и трансляции их белков сопрягались с процессами, происходящими в геноме хозяина (см. ниже). Рекомбинация со встроившимися ранее ретроэлементами повлекла изменения кодируемых ретровирусами белков, а продуцируемые ими ферменты вызвали появление большого количества ДНК-копий (кДНК) РНК-транскриптов многих клеточных генов.

4. ВЫВОДЫ

1. Состав комплекса 5'-области ЬТ11НЕЮ/-К с клеточными белками изменяется при воздействии на клетку теплового шока и митогенных факторов.

2. Центральная и 3'-концевая области ЬТЯ НЕЯУ-К, в частности, область негативного регуляторного элемента, способны специфически связываться с клеточными белковыми факторами.

3. В клетках Тега-1, где ЬТЯ НЕЯУ-К обладает энхансерной активностью, с центральной областью ЬТЯ связывается дополнительный клеточный фактор.

4. Разработан новый метод выделения ДНК-связывающих белков, и с его помощью очищены практически до гомогенности три белка, образующих специфический комплекс с 5'-областью 1ЛИ НЕЛУ-К.

5. При помощи метода масс-спектрометрии (МАЬВЬТОР-МБ) один из белков, образующих комплекс с 5'-областью ЬТЯ НЕЛУ-К, был идентифицирован как сходный с белком теплового шока конститутивно экспрессирующийся белок Нзс70.

6. Присутствие Нзс70 в составе комплекса с 5'-концом области Ш ЬТЛ НЕЯУ-К было подтверждено иммунохимическими методами с использованием поликлональных и моноклональных антител.

Заключение

Из обзора литературы становится понятным, что связывающиеся с 1ЛИ эндогенных ретровирусов белковые факторы способны играть важную роль в регуляции активности и эволюции генома человека. В то же время, существует лишь несколько работ, посвященных их характеристике, и ни в одном случае связывающийся с ЬТЯ белок не был выделен и полностью охарактеризован. Выделение таких белков и их функциональная характеристика, таким образом, представляет собой актуальную задачу.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

Акриламид, хлорид калия, хлорид магния - производства фирмы "Merck" (ФРГ). Глицерин, Ы-2-гидроксиэтилпиперазин->Г-2-этилсульфоновая кислота (HEPES), гепарин-агароза, фенилметилсульфонил фторид (ФМСФ) - фирмы "Sigma" (США). Бромфеноловый синий, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), дитиотреитол (DTT), 2-меркаптоэтанол, спермин, спермидин - фирмы "Serva" (ФРГ)' Дезоксирибонуклеотид-5'-трифосфаты - фирмы "Pharmacia" (Швеция). Леупептин (Leupeptin hemisulfate) - acetyl-leu-leu-arg-ala - фирмы ICN (США).

2.2. Буферные растворы

Буфер ТЕ -10 мМ Трис-НС1, 0,5 мМ ЭДТА (рН 8,0).

Буфер ТВЕ - 50 мМ Трис, 50 мМ Н3В03,0,5 мМ ЭДТА (рН 8,3).

Буфер для ПИР реакции (10х) - 500 мМ КС1,100 мМ Трис-HCl (рН 9,0), 1% Triton Х-100. Буфер А (для получения ядерного экстракта) - 10 мМ HEPES-KOH (рН 7,9), 25 мМ КС1, 0,15 мМ спермин, 0,5 мМ спермидин, 1 мМ ЭДТА, 10% глицерин. Перед использованием добавляли ДТТ до 0,5 мМ, ФМСФ до 0,5 мМ, леупептин до 5 мкМ. Буфер В (для получения ядерного экстракта) - 20 мМ HEPES-KOH (рН 7,9), 100 мМ КС1, 0,2 мМ ЭДТА, 20% глицерин. Перед использованием добавляли ДТТ до 0,5 мМ, ФМСФ до 0,5 мМ, леупептин до 5 мкМ.

Буфер С (для аффинной колонки) -12 мМ HEPES-KOH (рН 7,9), 60 мМ КС1, 0,12 мМ ЭДТА, 12% глицерин. Перед использованием добавляли ДТТ до 0,3 мМ, ФМСФ до 0,3 мМ, леупептин до 3 мкМ.

Анодный буфер I - 300 мМ Трис-HCl, рН 10,4,10% метанол. Анодный буфер II - 25 мМ Трис-HCl, рН 10,4,10% метанол.

Катодный буфер — 25 мМ Трис-HCl, рН 9,4, 10% метанол, 40чмМ е-аминокапроновая кислота.

Буфер PBS - 0,137 М NaCl, 2,68 мМ КС1, 8,06 мМ Na2HP04,1,47 мМ КН2Р04 (рН 7,4). Буфер ТМ 10х- 100 мМ Трис-HCl (рН 9,0), 100 мМ MgCl2.

Буфер для Фрагмента Клёнова 10х - 500 мМ Tris-HCl рН 7,5,100 мМ MgCl2,10 мМ ДТТ, 0,5 мг/мл БСА.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов для мечения (-А) - 0,33 мМ dGTP, 0,33 мМ dCTP, 0,33 мМ dTTP.

Буфер для нанесения на неденатурирующий ПААГ — 0,1х TBE, 50% глицерин, бромфеноловый синий, ксиленцианол.

Буфер для нанесения на ДДС-ПААГ (5х) - 20% ДЦС, 100 мМ Tris-HCl pH 6,8,20% глицерин, 10 мМ ЭДТА, 3% 2-меркаптоэтанол, бромфеноловый синий. Буферные растворы готовили из максимально чистых реагентов и фильтровали через 0,45 мкм нитроцелюллозный фильтр.

Методы

2.3. Клеточные культуры

Клетки линий Jurkat и СНО (Chinese Hamster Ovary) были выращены в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (0,1 мг/мл). Клетки линий 293 (CRL-1573; первичная человеческая эмбриональная почка, трансформированная ДНК человеческого аденовируса типа 5), СНО-К1 (CCL-61; яичник китайского хомячка), HeLa (CCL-2; аденокарцинома шейки матки), HL-60 (CRL-1964; острый промиелоцитный лейкоз), Jurkat (TIB-152; острый Т-клеточный лейкоз), NT2/D1 (CRL-1973; полипотентная человеческая тестикулярная эмбриональная карцинома), PANC-1 (CRL-1469; панкреатическая аденокарцинома), и Тега-1 (НТВ-105; человеческая тестикулярная злокачественная эмбриональная карцинома) выращивали в условиях, рекомендованных АТСС (http://www.lgcpromochem.com/atccA)-Клетки линии NGP-127 (нейробластома), любезно предоставленные Paul S. Meitzer, выращивали, как описано ранее (Elkahloum et al., 1996). Клетки линии GS (человеческая почечная клеточная карцинома) (104) были получены из коллекции Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия) и выращивали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки всех линий выращивали при 37°С и 5% СО2.

2.4. Получение клеток асцитной карциномы мышей Krebs-II

Для работы использовали линии мышей BALB/C. В каждую мышь вводили внутрибрюшинно 200 мкл асцитной жидкости из эпителиальной асцитной карциномы мышей Krebs-II. Через 1-1,5 недели, по мере созревания опухолей, из них выделяли асцитную жидкость, содержащую опухолевые клетки.

2.5. Получение ядерных экстрактов

Клетки асцитной жидкости собирали центрифугированием в течение 5 мин при 800xg, промывали несколько раз холодным фосфатно-солевым раствором (PBS) и взвешивали осадок. 1 г осадка клеток суспендировали в 10 мл буфера А (см. выше), инкубировали 10 минут в ледяной бане и разрушали в гомогенизаторе Даунса. Степень гомогенизации (уровень разрушения клеток) проверяли под световым микроскопом с применением окрашивания Trypan Blue после каждых 10 проходов пестика гомогенизатора. Гомогенизацию проводили до разрушения более чем 80% клеток. Ядра собирали в течение 5 мин при 3000 об/мин и 4°С. Полученные ядра суспендировали в 1 мл буфера А и определяли объём полученной суспензии по весу, считая ее плотность равной 1 г/мл. Далее к суспензии ядер по каплям добавляли 3 М KCl до концентрации 0,3 М, инкубировали 30 мин при 4°С или на льду при медленном перемешивании и центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин и 4°С. Супернатант диализовали в течение 2 часов против 100-кратного избытка буфера В. После диализа смесь центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин и 4°С. Концентрацию белка в экстракте определяли по методу Брэдфорд, ядерный экстракт расфасовывали и хранили при -70°С. Ядерные экстракты из других типов клеток были приготовлены тем же методом.

2.6. Радиоактивное мечение ДНК 2.6.1. Мечение в ходе ПЦР

Фрагменты LTR для мечения были амплифицированы с использованием в качестве матрицы космиды F23280 (номер по GenBank L47334), любезно предоставленной А. Olsen, Ливерморская национальная лаборатория, США. ПЦР проводили в реакционной смеси (30 мкл), содержащей: 1х буфер для ПЦР, 2,5 мМ MgCh, 0,125 мМ dNTPs, по 0,4 мкМ праймеров (таблица 3), 1-1,5 ед. Taq-полимеразы (Biotaq) и космиду F23280 в количестве 2-4 нг.

Сверху на реакционную смесь наслаивали 25 мкл минерального масла и проводили ПЦР в режиме: денатурация, 94°С-20 с; отжиг праймеров, 60°С-30 с; достройка, 72°С-90 с в течение 10-15 циклов амплификации.

После определенного числа циклов из реакционной смеси отбирали аликвоты по 10 мкл для анализа методом электрофореза в агарозном геле, для чего аликвоту препарата ДНК смешивали с 2 мкл буфера для нанесения на электрофорез. Гель-электрофорез проводили в 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий и приготовленном на

1. Baltimore D., Retroviruses and retrotransposons: the role of reverse transcription in shaping the eukaryotic genome., Cell. 1985 Mar;40(3):481-482. Review

2. Wilkinson DA, Mager DL and Leong, J.A.C. Endogenous human retroviruses. The Retroviridae, 1994,3:465-535, in J.A. Levy (ed.), Plenum Press, New York.

3. Larsson E, Kato N, Cohen M., Human endogenous proviruses. Curr Top Microbiol Immunol. 1989; 148:115-132. Review.

4. Leib-Mosch C, Brack-Werner R, Werner T, Bachmann M, Faff O, Erfle V, Hehlmann R., Endogenous retroviral elements in human DNA., Cancer Res. 1990 Sep 1;50(17 Suppl):5636S-5642S. Review.

5. Cohen M, Larsson E., Human endogenous retroviruses., Bioessays. 1988 Dec;9(6):191-196. Review.

6. Kim A, Terzian C, Santamaria P, Pelisson A, Purd'homme N, Bucheton A., Retroviruses in invertebrates: the gypsy retrotransposon is apparently an infectious retrovirus of Drosophila melanogaster., Proc Natl Acad Sei USA. 1994 Feb 15;91(4):1285-1289.

7. Lower R, Lower J, Kurth R., The viruses in all of us: characteristics and biological significance of human endogenous retrovirus sequences., Proc Natl Acad Sei USA. 1996 May 28;93(11):5177-5184. Review.

8. Patience C, Wilkinson DA, Weiss RA., Our retroviral heritage., Trends Genet. 1997 Mar;13(3):l 16-120. Review.

9. Kroger B, Horak I., Isolation of novel human retrovirus-related sequences by hybridization to synthetic oligonucleotides complementary to the tRNA(Pro) primer-binding site., J Virol. 1987 Jul;61(7):2071-2075.

10. Harada F, Tsukada N, Kato N., Isolation of three kinds of human endogenous retro virus-like sequences using tRNA(Pro) as a probe., Nucleic Acids Res. 1987 Nov 25;15(22):9153-9162.

11. Maeda N., Nucleotide sequence of the haptoglobin and haptoglobin-related gene pair. The haptoglobin-related gene contains a retrovirus-like element., J Biol Chem. 1985 Jun 10;260(11):6698-6709.

12. May FE, Westley BR., Structure of a human retroviral sequence related to mouse mammary tumor virus., J Virol. 1986 Nov;60(2):743-749.

13. Ono M, Yasunaga T, Miyata T, Ushikubo H., Nucleotide sequence of human endogenous retrovirus genome related to the mouse mammary tumor virus genome., J Virol. 1986 Nov;60(2):589-598.

14. Cordonnier A, Casella JF, Heidmann T., Isolation of novel human endogenous retrovirus-like elements with foamy virus-related pol sequence., J Virol. 1995 Sep;69(9):5890-5897.

15. Leib-Mosch C, Haltmeier M, Werner T, Geigl EM, Brack-Werner R, Francke U, Erfle V, Hehlmann R., Genomic distribution and transcription of solitary HERV-K LTRs., Genomics. 1993 Nov; 18(2):261-269.

16. Rabson AB, Hamagishi Y, Steele PE, Tykocinski M, Martin MA., Characterization of human endogenous retroviral envelope RNA transcripts., J Virol. 1985 Oct;56(l): 176-182.

17. Tomita N, Horii A, Doi S, Yokouchi H, Ogawa M, Mori T, Matsubara K., Transcription of human endogenous retroviral long terminal repeat (LTR) sequence in a lung cancer cell line., Biochem Biophys Res Commun. 1990 Jan 15;166(1):1-10.

18. Cohen M, Powers M, O'Connell C, Kato N., The nucleotide sequence of the env gene from the human provirus ERV3 and isolation and characterization of an ERV3-specific cDNA., Virology. 1985 Dec;147(2):449-458.

19. Kato N, Shimotohno K, VanLeeuwen D, Cohen M., Human proviral mRNAs down regulated in choriocarcinoma encode a zinc finger protein related to Kruppel., Mol Cell Biol. 1990 Aug; 10(8) :4401 -4405.

20. Venables PJ, Brookes SM, Griffiths D, Weiss RA, Boyd MT., Abundance of an endogenous retroviral envelope protein in placental trophoblasts suggests a biological function., Virology. 1995 Aug 20;211(2):589-592.

21. Wilkinson DA, Freeman JD, Goodchild NL, Kelleher CA, Mager DL., Autonomous expression of RTVL-H endogenous retroviruslike elements in human cells., J Virol. 1990 May;64(5):2157-2167.

22. Mager DL., Polyadenylation function and sequence variability of the long terminal repeats of the human endogenous retrovirus-like family RTVL-H., Virology. 1989 Dec;173(2):591-599.

23. Goodchild NL, Wilkinson DA, Mager DL., A human endogenous long terminal repeat provides a polyadenylation signal to a novel, alternatively spliced transcript in normal placenta., Gene. 1992 Nov 16;121(2):287-294.

24. Shih A, Misra R, Rush MG., Detection of multiple, novel reverse transcriptase coding sequences in human nucleic acids: relation to primate retroviruses., J Virol. 1989 Jan;63(l):64-75.

25. Bohannon RC, Donehower LA, Ford RJ., Isolation of a type D retrovirus from B-cell lymphomas of a patient with AIDS., J Virol. 1991 Nov;65(l l):5663-5672.

26. Callahan R, Chiu IM, Wong JF, Tronick SR, Roe BA, Aaronson SA, Schlom J., A new class of endogenous human retroviral genomes., Science. 1985 Jun 7;228(4704):1208-1211.

27. Deen KC, Sweet RW., Murine mammary tumor virus pol-related sequences in human DNA: characterization and sequence comparison with the complete murine mammary tumor virus pol gene., J Virol. 1986 Feb;57(2):422-432.

28. Li MD, Lemke TD, Bronson DL, Faras AJ., Synthesis and analysis of a 640-bp pol region of novel human endogenous retroviral sequences and their evolutionary relationships., Virology. 1996 Mar 1;217(1):1-10.

29. Li MD, Bronson DL, Lemke TD, Faras AJ., Restricted expression of new HERV-K members in human teratocarcinoma cells., Virology. 1995 Apr 20;208(2):733-741.

30. Medstrand P, Lindeskog M, Blomberg J., Expression of human endogenous retroviral sequences in peripheral blood mononuclear cells of healthy individuals., J Gen Virol. 1992 Sep;73 (Pt 9):2463-2466.

31. Brodsky I, Foley B, Gillespie D., Expression of human endogenous retrovirus (HERV-K) in chronic myeloid leukemia., Leuk Lymphoma. 1993; 11 Suppl 1:119-123. Review.

32. Boiler K, Konig H, Sauter M, Mueller-Lantzsch N, Lower R, Lower J, Kurth R., Evidence that HERV-K is the endogenous retrovirus sequence that codes for the human teratocarcinoma-derived retrovirus HTDV., Virology. 1993 Sep;196(l):349-353.

33. Caroll MC, Campbell RD, Bentley DR, Porter R., 1984, Nature, v.307, 237-241.

34. Dirksen ER, Levy JA., Virus-like particles in placentas from normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus., J Natl Cancer Inst. 1977 Oct;59(4):l 187-1192.

35. Bronson DL, Saxinger WC, Ritzi DM, Fraley EE., Production of virions with retrovirus morphology by human embryonal carcinoma cells in vitro., J Gen Virol. 1984 Jun;65 (Pt 6): 1043-1051.

36. Larsson E, Nilsson BO, Sundstrom P, Widehn S., Morphological and microbiological signs of endogenous C-virus in human oocytes., Int J Cancer. 1981 Nov 15;28(5):551-557.

37. Query CC, Keene JD., A human autoimmune protein associated with U1 RNA contains a region of homology that is cross-reactive with retroviral p30gag antigen., Cell. 1987 Oct 23;51(2):211-220.

38. Mellors RC, Mellors JW., Type C RNA virus-specific antibody in human systemic lupus erythematosus demonstrated by enzymoimmunoassay., Proc Natl Acad Sci'U S A. 1978 May;75(5):2463-2467.

39. Rucheton M, Graafland H, Fanton H, Ursule L, Ferrier P, Larsen CJ., Presence of circulating antibodies against gag-gene MuLV proteins in patients with autoimmune connective tissue disorders., Virology. 1985 Jul 30;144(2):468-480.

40. Shih CC, Stoye JP, Coffin JM., Highly preferred targets for retrovirus integration., Cell. 1988 May 20;53(4):531-537.

41. Vijaya S, Steffen DL, Robinson HL., Acceptor sites for retroviral integrations map near DNase I-hypersensitive sites in chromatin., J Virol. 1986 Nov;60(2):683-692.

42. Makalowski W, Mitchell GA, Labuda D., Alu sequences in the coding regions of mRNA: a source of protein variability., Trends Genet. 1994 Jun;10(6):188-193.

43. Banki K, Halladay D, Perl A., Cloning and expression of the human gene for transaldolase. A novel highly repetitive element constitutes an integral part of the coding sequence., J Biol Chem. 1994 Jan 28;269(4):2847-2851.

44. Ting CN, Rosenberg MP, Snow CM, Samuelson LC, Meisler MH., Endogenous retroviral sequences are required for tissue-specific expression of a human salivary amylase gene., Genes Dev. 1992 Aug;6(8): 1457-1465.

45. Madhusudhan KT, Naik SS, Patel MS., Characterization of the promoter regulatory region of the human pyruvate dehydrogenase beta gene., Biochemistry. 1995 Jan 31;34(4):1288-1294.

46. Frech K, Brack-Werner R, Werner T., Common modular structure of lentivirus LTRs., Virology. 1996 Oct l;224(l):256-267.

47. Frech K, Danescu-Mayer J, Werner T., A novel method to develop highly specific models for regulatory units detects a new LTR in GenBank which contains a functional promoter., J Mol Biol. 1997 Aug l;270(5):674-687.

48. Knossl M, Lower R, Lower J., Expression of the human endogenous retrovirus HTDV/HERV-K is enhanced by cellular transcription factor YY1., J Virol. 1999 Feb;73(2):1254-1261.

49. Dignam JD, Lebovitz RM, Roeder RG. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei., Nucleic Acids Res. 1983 Mar11;11(5):1475-1489.

50. Fried M, Crothers DM., Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by Polyacrylamide gel electrophoresis., Nucleic Acids Res. 1981 Dec ll;9(23):6505-6525.

51. Nikolaev LG, Glotov BO, Belyavsky AV, Grachev SA, Levin AV., Identification of sequence-specific DNA-binding factors by label transfer: application to the adenovirus-2 major late promoter., Nucleic Acids Res. 1988 Jan 25;16(2):519-535.

52. Akopov SB, Nikolaev LG, Khil PP, Lebedev YB, Sverdlov ED., Long terminal repeats of human endogenous retrovirus K family (HERV-K) specifically bind host cell nuclear proteins., FEBS Lett. 1998 Jan 16;421(3):229-233.

53. Nelson DT, Goodchild NL, Mager DL., Gain of Spl sites and loss of repressor sequences associated with a young, transcriptionally active subset of HERV-H endogenous long terminal repeats., Virology. 1996 Jun 1 ;220(1>:213-218.

54. Smit AF, Toth G, Riggs AD, Jurka J., Ancestral, mammalian-wide subfamilies of LINE-1 repetitive sequences., J Mol Biol. 1995 Feb 24;246(3):401-417.

55. Leib-Mosch C, Seifarth W., Evolution and biological significance of human retroelements., Virus Genes. 1995;11(2-3):133-145. Review.

56. Eisfeld K, Candau R, Truss M, Beato M., Binding of NF1 to the MMTV promoter in nucleosomes: influence of rotational phasing, translational positioning and histone HI., Nucleic Acids Res. 1997 Sep 15;25(18):3733-3742.

57. Truss M, Bartsch J, Hache RS, Beato M., Chromatin structure modulates transcription factor binding to the mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter., J Steroid Biochem Mol Biol. 1993 Dec;47(l-6):1-10.

58. Fragoso G, John S, Roberts MS, Hager GL., Nucleosome positioning on the MMTV LTR results from the frequency-biased occupancy of multiple frames., Genes Dev. 1995 Aug 1;9(15): 1933-1947.

59. Daelemans D, Vandamme AM, De Clercq E., Human immunodeficiency virus gene regulation as a target for antiviral chemotherapy., Antivir Chem Chemother. 1999 Jan;10(l):l-14. Review.

60. Kapitonov VV, Jurka J., The long terminal repeat of an endogenous retrovirus induces alternative splicing and encodes an additional carboxy-terminal sequence in the human leptin receptor., J Mol Evol. 1999 Feb;48(2):248-251.

61. Kjellman C, Sjogren HO, Widegren B., HERV-F, a new group of human endogenous retrovirus sequences., J Gen Virol. 1999 Sep;80 (Pt 9):2383-2392.

62. Mager DL, Freeman JD. HERV-H endogenous retroviruses: presence in the New World branch but amplification in the Old World primate lineage., Virology. 1995 Nov10;213(2):395-404.

63. Barbulescu M, Turner G, Seaman MI, Deinard AS, Kidd KK, Lenz J., Many human endogenous retrovirus K (HERV-K) proviruses are unique to humans., Curr Biol. 1999 Aug 26;9(16):861-868.

64. Medstrand P, Mager DL, Human-specific integrations of the HERV-K endogenous retrovirus family., J Virol. 1998 Dec;72(12):9782-9787.

65. Lebedev YB, Belonovitch OS, Zybrova NV, Khil PP, Kurdyukov SG, Vinogradova TV, Hunsmann G, Sverdlov ED., Differences in HERV-K LTR insertions in orthologous loci of humans and great apes., Gene. 2000 Apr 18;247(l-2):265-277.

66. Lower R, Tonjes RR, Korbmacher C, Kurth R, Lower J., Identification of a Rev-related protein by analysis of spliced transcripts of the human endogenous retroviruses

67. HTDV/HERV-K., J Virol. 1995 Jan;69(l): 141-149.

68. Yang J, Bogerd HP, Peng S, Wiegand H, Truant R, Cullen BR., An ancient family of human endogenous retroviruses encodes a functional homolog of the HIV-1 Rev protein., Proc Natl Acad Sei USA. 1999 Nov 9;96(23):13404-13408.

69. Boese A, Sauter M, Mueller-Lantzsch N., A rev-like NES mediates cytoplasmic localization of HERV-K cORF. FEBS Lett. 2000 Feb 18;468(l):65-67.

70. Magin C, Lower R, Lower J., cORF and RcRE, the Rev/Rex and RRE/RxRE homologues of the human endogenous retrovirus family HTDV/HERV-K., J Virol. 1999 Nov;73(l 1):9496-9507.

71. Domansky AN, Kopantzev EP, Snezhkov EV, Lebedev YB, Leib-Mosch C, Sverdlov ED., Solitary HERV-K LTRs possess bi-directional promoter activity and contain a negative regulatory element in the U5 region., FEBS Lett. 2000 Apr 28;472(2-3):191-195.

72. Kowalski PE, Freeman JD, Mager DL., Intergenic splicing between a HERV-H endogenous retrovirus and two adjacent human genes., Genomics. 1999 May l;57(3):371-379.

73. Knossl M, Lower R, Lower J., Expression of the human endogenous retrovirus HTD V/HERV-K is enhanced by cellular transcription factor YY1., J Virol. 1999 Feb;73(2):1254-1261.

74. Laemmli UK, Favre M., J Mol Biol. 1973 Nov 15;80(4): 601-613.

75. Akopov SB, Nikolaev LG, Khil PP, Lebedev YB, Sverdlov ED., Long terminal repeats of human endogenous retrovirus K family (HERV-K) specifically bind host cell nuclear proteins., FEBS Lett. 1998 Jan 16;421(3):229-233.

76. Nikolaev LG, Glotov BO, Belyavsky AV, Grachev SA, Levin AV., Identification of sequence-specific DNA-binding factors by label transfer: application to the adenovirus-2 major late promoter., Nucleic Acids Res. 1988 Jan 25;16(2):519-535.

77. Dirksen ER, Levy JA., Virus-like particles in placentas from normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus., J Natl Cancer Inst. 1977 Oct;59(4):l 187-1192.

78. Kadonaga JT, Tjian R., Affinity purification of sequence-specific DNA binding proteins., Proc Natl Acad Sei USA. 1986 Aug;83(16):5889-5893.

79. Sverdlov ED., Perpetually mobile footprints of ancient infections in human genome., FEBS Lett. 1998 May 22;428(l-2):l-6. Review.

80. Moggs JG, Orphanides G., Genomic analysis of stress response genes. Toxicol Lett. 2003 Apr 11;140-141:149-153. Review.

81. Tacke SJ, Specke V, Denner J., Differences in release and determination of subtype of porcine endogenous retroviruses produced by stimulated normal pig blood cells., Intervirology. 2003;46(l):17-24.

82. Доманский АН, Акопов СБ, Лебедев ЮБ, Николаев ЛГ, Свердлов ЕД., Энхансерная активность одиночного длинного концевого повтора человеческого эндогенного ретровируса семейства К.,, Биоорг. Хим. 2002;28, номер 4,341-345.

83. Yang Р, Zemba М, Aboud М, Flügel RM, Lochelt М., Deletion analysis of both the long terminal repeat and the internal promoters of the human foamy virus., Virus Genes. 1997;15(l):17-23.

84. Seiki M, Hikikoshi A, Yoshida M., The U5 sequence is a cis-acting repressive element for genomic RNA expression of human T cell leukemia virus type I., Virology. 1990 May;176(l):81-86.

85. Arndt- Jovin DJ, Jovin TM, Bahr W, Frischauf AM, Marquardt M., Covalent attachment of DNA to agarose. Improved synthesis and use in affinity chromatography., Eur J Biochem. 1975 Jun;54(2):411-418.

86. Cheng MC, Wu SP, Chen LF, Chen SC., Identification and purification of a spinach chloroplast DNA-binding protein that interacts specifically with the plastid psaA-psaB-rpsl4 promoter region., Planta. 1997;203(3):373-380.

87. Gadgil H, Jarrett HW., Heparin elution of transcription factors from DNA-Sepharose columns., J Chromatogr A. 1999 Jul 2;848(1-2):131-138.

88. Maniatis T, Frisch EF, Sambrook J, Cold Spring Harbor: Molecular Cloning, 3-rd edition. 1990.

89. Vydra J, Vytasek R, Sainerova H, Mandys V, Sovova V, Hejnar J, Sloncova E, Pouckova P, Bubenik J, Novaak J, et al., A new cell line, GS, derived from a human renal cell carcinoma., Folia Biol (Praha). 1988; 34(5):308-315.

90. Bloom H, Beier H, Gross H., Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in Polyacrylamide gels., Electrophoresis. 1987, 8,93-99.

91. Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, Mann M., Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained Polyacrylamide gels., Anal Chem. 1996 Mar l;68(5):850-858.

92. Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cottrell JS., Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data., Electrophoresis. 1999 Dec;20(18):3551-3567.

93. Le Tissier P, Stoye JP, Takeuchi Y, Patience C, Weiss RA., Two sets of human-tropic pig retrovirus., Nature. 1997 Oct 16;389(6652):681-682.

94. Patience C, Takeuchi Y, Weiss RA., Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs., Nat Med. 1997 Mar;3(3):282-286.

95. Takeuchi Y, Patience C, Magre S, Weiss RA, Baneijee PT, Le Tissier P, Stoye JP., Host range and interference studies of three classes of pig endogenous retrovirus., J Virol. 1998 Dec;72(12):9986-9991.

96. Lee JH, Webb GC, Allen RD, Moran C., Characterizing and mapping porcine endogenous retroviruses in Westran pigs., J Virol. 2002 Jun;76(l l):5548-5556.

97. Gorbovitskaia M, Liu Z, Bourgeaux N, Li N, Lian Z, Chardon P, Rogel-Gaillard C., Characterization of two porcine endogenous retrovirus integration loci and variability in pigs., Immunogenetics. 2003 Jul;55(4):262-270. Epub 2003 Jun 24.

98. Wilson CA, Laeeq S, Ritzhaupt A, Colon-Moran W, Yoshimura FK., Sequence analysis of porcine endogenous retrovirus long terminal repeats and identification of transcriptional regulatory regions., J Virol. 2003 Jan;77(l): 142-149.

99. Avidan O, Loya S, Tonjes RR, Sevilya Z, Hizi A., Expression and characterization of a recombinant novel reverse transcriptase of a porcine endogenous retrovirus., Virology. 2003 Mar 15;307(2):341-357.

100. Morimoto RL, Cells in stress: transcriptional activation of heat shock genes., Science. 1993 Mar 5;259(5100):1409-1410. Review.

101. Sorger PK, Nelson HC., Trimerization of a yeast transcriptional activator via a coiled-coil motif., Cell. 1989 Dec 1;59(5):807-813.

102. Harrison CJ, Bohm AA, Nelson HC., Crystal structure of the DNA binding domain of the heat shock transcription factor., Science. 1994 Jan 14;263(5144):224-227.

103. Niyaz Y, Frenz I, Petersen G, Gehring U., Transcriptional stimulation by the DNA binding protein Hap46/BAG-1M involves hsp70/hsc70 molecular chaperones., Nucleic Acids Res. 2003 Apr 15;31(8):2209-2216.

104. Harrison CJ, Bohm AA, Nelson HC., Crystal structure of the DNA binding domain of the heat shock transcription factor., Science. 1994 Jan 14;263(5144):224-227.

105. Niyaz Y, Frenz I, Petersen G, Gehring U., Transcriptional stimulation by the DNA binding protein Hap46/BAG-1M involves hsp70/hsc70 molecular chaperones., Nucleic Acids Res. 2003 Apr 15;31(8):2209-2216.

106. Groth CG, Korsgren O, Tibell A, Tollemar J, Moller E, Bolinder J, Ostman J, Reinholt FP, Hellerstrom C, Andersson A., Transplantation of porcine fetal pancreas to diabetic patients., Lancet. 1994 Nov 19;344(8934): 1402-1404.

107. Fishman JA., Xenosis and xenotransplantation: addressing the infectious risks posed by an emerging technology., Kidney Int Suppl. 1997 Mar;58:S41-45. Review.

108. Holmes GP, Chapman LE, Stewart JA, Straus SE, Hilliard JK, Davenport DS., Guidelines for the prevention and treatment of B-virus infections in exposed persons. The B virus Working Group.

109. Clin Infect Dis. 1995 Feb;20(2):421-439.

110. Gao F, Bailes E, Robertson DL, Chen Y, Rodenburg CM, Michael SF, Cummins LB, Arthur LO, Peeters M, Shaw GM, Sharp PM, Hahn BH., Origin of HIV-1 in the chimpanzee Pan troglodytes troglodytes., Nature. 1999 Feb 4;397(6718):436-441.

111. Chapman, LE.,. Folk TM, Salomon DR., Patterson AP., Eggerman TE., Noguchi P. D., Xenotransplantation and xenogeneic infections., N. Engl. J. Med. 1995, 333:1498-1501.

112. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Biologies Evaluation and Research (CBER), april 1999,http ://www. fda. gov/cber/gdlns/xenoprim.pdf

113. Fishman, JA., Miniature swine as organ donors for man: strategies for prevention of xenotransplant-associated infectiuons. Xenotransplantation, 1994,1: 47-57.

114. Niemann H., Current status and perspectives for the generation of transgenic pigs for xenotransplantation., Ann Transplant. 2001;6(3):6-9. Review.

115. Lieber MM., Scherr CJ., Benveniste RE., Todaro GJ.,. Biologic and immunologic properties of porcine type C viruses. Virology 1975, 66:616-619

116. Akiyoshi DE, Denaro M, Zhu H, Greenstein JL, Baneijee P, Fishman JA., Identification of a full-length cDNA for an endogenous retrovirus of miniature swine., J Virol. 1998 May;72(5):4503-4507.

117. Czauderna F, Fischer N, Boller K, Kurth R, Tonjes RR., Establishment and characterization of molecular clones of porcine endogenous retroviruses replicating on human cells., J Virol. 2000 May;74(9):4028-4038.

118. Patience C, Takeuchi Y, Weiss RA., Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs., Nat Med. 1997 Mar;3(3):282-286.

119. Wilson CA, Wong S, Muller J, Davidson CE, Rose TM, Burd P., Type C retrovirus released from porcine primary peripheral blood mononuclear cells infects human cells., J Virol. 1998 Apr;72(4):3082-3087.

120. Le Tissier P, Stoye JP, Takeuchi Y, Patience C, Weiss RA., Two sets of human-tropic pig retrovirus., Nature. 1997 Oct 16;389(6652):681-682.

121. Takeuchi Y, Patience C, Magre S, Weiss RA, Banerjee PT, Le Tissier P, Stoye JP., Host range and interference studies of three classes of pig endogenous retrovirus., J Virol. 1998 Dec;72(12):9986-9991.

122. Adler AJ, Scheller A, Robins DM., The stringency and magnitude of androgen-specific gene activation are combinatorial functions of receptor and nonreceptor binding site sequences., Mol Cell Biol. 1993 Oct;13(10):6326-6335.

123. Truss M, Bartsch J, Mows C, Chavez S, Beato M., Chromatin structure of the MMTV promoter and its changes during hormonal induction., Cell Mol Neurobiol. 1996 Apr;16(2):85-101. Review.

124. Boronat S, Richard-Foy H, Pina B., Specific deactivation of the mouse mammary tumor virus long terminal repeat promoter upon continuous hormone treatment., J Biol Chem. 1997 Aug 29;272(35):21803-21810.

125. Miksicek R, Heber A, Schmid W, Danesch U, Posseckert G, Beato M, Schutz G., Glucocorticoid responsiveness of the transcriptional enhancer of Moloney murine sarcoma virus., Cell. 1986 Jul 18;46(2):283-290.

126. Mitra D, Sikder SK, Laurence J., Role of glucocorticoid receptor binding sites in the human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat in steroid-mediated suppression of HIV gene expression., Virology. 1995 Dec 20;214(2):512-521.

127. Payvar F, DeFranco D, Firestone GL, Edgar B, Wrange O, Okret S, Gustafsson JA, Yamamoto KR., Sequence-specific binding of glucocorticoid receptor to MTV DNA at sites within and upstream of the transcribed region., Cell. 1983 Dec;35(2 Pt l):381-392.

128. Ramakrishnan C., Robins DM., Steroid hormone responsiveness of a family of closely related mouse proviral elements., Mamm. Genome, 1997, 8, 811-817

129. Tonjes RR, Czauderna F, Kurth R., Genome-wide screening, cloning, chromosomal assignment, and expression of full-length human endogenous retrovirus type K., J Virol. 1999 Nov;73(ll):9187-9195.

130. Venables PJ, Brookes SM, Griffiths D, Weiss RA, Boyd MT., Abundance of an endogenous retroviral envelope protein in placental trophoblasts suggests a biological function., Virology. 1995 Aug 20;211(2):589-592.

131. Meng XJ, Purcell RH, Halbur PG, Lehman JR, Webb DM, Tsareva TS, Haynes JS, Thacker BJ, Emerson SU., A novel virus in swine is closely related to the human hepatitis E virus., Proc Natl Acad Sei USA. 1997 Sep 2;94(18):9860-9865.