Характеристика начальных этапов функционирования системы репарации ДНК-"мисматчей" Escherichia coli с использованием модифицированных ДНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

005535986

На правах рукописи

ПЕРЕВОЗЧИКОВА Светлана Анатольевна

Характеристика начальных этапов функционирования системы репарации ДНК-«мисматчей» Escherichia coli с использованием модифицированных ДНК

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

31 ОКТ 2813

Москва-2013

005535986

Работа выполнена в отделе химии нуклеиновых кислот Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» и в Институте биохимии Университета имени Ю. Либиха (г. Гиссен, Германия) в группе профессора П. Фридхоффа.

Научный руководитель:

главный научный сотрудник Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», доктор химических наук, профессор Кубарева Елена Александровна

Официальные оппоненты:

заведующий лабораторией структурно-функциональной организации хромосом Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биологии гена Российской академии наук, член-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Разин Сергей Владимирович

профессор химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», доктор химических наук Сергиев Пётр Владимирович

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук

Защита состоится 26 ноября 2013 года в 17 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ, НИИ ФХБ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова Автореферат разослан 25 октября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поддержание стабильности генома из поколения в поколение и в течение жизни индивидуального организма является одним из важнейших процессов в клетке. Существуют различные механизмы восстановления (репарации) повреждений ДНК. Данная работа посвящена изучению особенностей функционирования системы репарации неканонических пар нуклеотидов («мисматчей») в ДНК - MMR (от англ. Mismatch Repair). Одной из её главных функций является исправление ошибок, появляющихся в ходе репликации ДНК. Система MMR участвует в ответе клеток на повреждения, возникающие под действием мутагенных факторов. К функциям белков MMR также относится координация узнавания и репарации повреждений ДНК с клеточным циклом, предотвращение рекомбинации между сходными последовательностями ДНК, регуляция конденсации хромосом в митозе и сегрегации ДНК, участие в гипермутировании генов иммуноглобулинов (Schofleld et al., 2003; Jun et al, 2006). Нарушение функционирования MMR на одном из её этапов приводит к накоплению мутаций, результатом чего является возникновение онкологических заболеваний. Таким образом, необходимо всестороннее изучение системы репарации «мисматчей»

Система репарации «мисматчей» была обнаружена во всех царствах живых организмов и характеризуется высокой консервативностью первичной структуры её ключевых белков - MutS и MutL, от бактерий до высших эукариот. Предполагается, что основы механизма репарации «мисматчей» сходны для всех организмов. Поэтому детальная характеристика белковых ансамблей и их комплексов с ДНК, образующихся в процессе MMR, в том числе в бактериальных клетках, является актуальной задачей.

Функционирование системы MMR обусловлено координированным действием более 10 белков. В клетках Е. coli сенсорный белок системы MMR MutS узнаёт и связывает неканоническую пару нуклеотидов, образуя «начальный» узнающий комплекс, который претерпевает конформационные перестройки, сопровождающиеся формированием «окончательного» узнающего комплекса. Последний в присутствии координирующего белка MutL активирует эндонуклеазу MutH, гидролизующую дочернюю (временно неметилированную по участкам 5'-GATC-3') цепь ДНК. К одноцепочечному разрыву присоединяется ДНК-хеликаза UvrD и расплетает ДНК. Далее неметилированную цепь ДНК гидролизует набор экзонуклеаз. Метилированную (материнскую) цепь ДНК защищают белки SSB (от англ. SingleStrand Binding). ДНК-полимераза III и ДНК-лигаза восстанавливают целостность ДНК. Функционирование белков MutS, MutL и MutH можно считать начальными этапами MMR, действие остальных ферментов - эксцизионными этапами.

В настоящее время определены основные структурные и функциональные характеристики белка MutS. Тем не менее, взгляды на начальные этапы MMR с участием этого молекулярного сенсора все еще противоречивы. Практически не исследовано основное уникальное событие процесса MMR - связывание MutS с ДНК при выявлении единичного «мисматча» среди многих тысяч канонических пар нуклеотидов. Спорные моменты касаются структуры конформационно подвиж™"'1'

в ДНК.

промежуточных комплексов MutS с ДНК и механизма активации этапов эксцизионной репарации. На сегодняшний день ключевые экспериментальные данные по этим вопросам отсутствуют из-за ограниченных возможностей использовавшихся ранее подходов. Перспективной стратегией для характеристики динамически подвижных ДНК-белковых комплексов представляется сочетание физико-химических и молекулярно-биологических методов с ковалентной фиксацией MutS на ДНК. Расширение методологической базы в этом направлении является необходимым этапом изучения процесса MMR.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась характеристика начальных этапов функционирования системы репарации «мисматчей» Е. coli с использованием модифицированных ДНК. В работе решались следующие задачи:

1) Изучение возможности репарации системой MMR остатка тимидингликоля в ДНК. Разработка комплексного биохимического подхода для характеристики начальных этапов функционирования системы репарации «мисматчей».

2) Выявление с помощью ковалентной фиксации MutS на ДНК:

• конформационных перестроек ДНК, происходящих при формировании «окончательного» узнающего комплекса MutS с ДНК;

• механизма «мисматч»-зависимой активации эндонуклеазы MutH.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено детальное биохимическое исследование влияния остатка тимидингликоля (Tg) — продукта окисления тимидина — в ДНК на функционирование системы MMR. Показано, что появление Tg в составе кольцевых ДНК не активирует белки системы репарации «мисматчей». Это обусловлено отсутствием эффективного связывания сенсорного белка MutS с фрагментами ДНК, содержащими пары G/Tg и A/Tg, и невозможностью формирования изгиба ДНК, характерного для «начального» узнающего комплекса. По-видимому, MutS не способен к специфическому взаимодействию с Tg вследствие его неплоской структуры. Таким образом, нарушение межплоскостных взаимодействий в двойной спирали ДНК, приводящее к её дестабилизации, не является решающим фактором для узнавания повреждений белком MutS.

Разработаны методы ковалентной фиксации MutS на ДНК, позволяющие проводить структурно-функциональные исследования системы MMR. С количественными выходами получены конъюгаты мутантных форм MutS, содержащие единственный остаток Cys на мономер в положении 497 или 469, с фрагментами ДНК, несущими 2'-пиридилдисульфидную группировку или дисульфидную группировку на 3'-конце олигонуклеотида. Разработаны методы очистки ковалентно связанных комплексов MutS с ДНК, обеспечивающие сохранение активности белка в составе конъюгатов.

Предложен подход, позволяющий проследить конформационные перестройки в ДНК на различных этапах её взаимодействия с MutS. Сконструирована ДНК-система, содержащая дисульфидную группировку (для фиксации динамичных комплексов MutS) и флуоресцентную пару (в качестве репортёрной конструкции). Впервые показано, что при образовании «окончательного» узнающего комплекса с MutS

происходит изменение конформации дуплекса, характеризующееся отсутствием характерного изгиба двойной спирали. С помощью метода ковалентной фиксации MutS в области «мисматча» установлено, что дальнейшее перемещение MutS по ДНК не является обязательным условием для активации MutH. Разработанная стратегия может быть использована для реконструкции основных этапов функционирования систем репарации в клетке на молекулярном уровне.

В целом, полученные в настоящей работе результаты расширяют представления об особенностях механизма действия белков системы MMR на начальных этапах и впоследствии могут быть использованы для объяснения причин возникновения неполипозного рака толстой кишки (синдрома Линча).

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в российских и международных периодических изданиях. Результаты были представлены на международных научных конференциях молодых ученых «Ломоносов» (Москва, Россия, 2008, 2009, 2010, 2011), на конференции «Minisymposium of the International Research Training Group Gießen/Marburg-Moscow» (Москва, Россия, 2009), на конференции «Enzymes and enzyme complexes acting on nucleic acids» (Вильнюс, Литва, 2010), на конференции «3-rd Giessen Graduate Centre for the Life Sciences, Conference on Life Sciences» (Гиссен, Германия, 2010), на 38-ом конгрессе FEBS «Mechanisms in Biology» (Санкт-Петербург, Россия, 2013).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (обобщены современные представления о структурно-функциональной организации системы репарации «мисматчей» в ДНК), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 65 рисунками, 4 схемами, 14 таблицами. Библиографический указатель включает 264 цитированные работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Объекты и основные направления исследования

Ключевой фигурой в процессе репарации «мисматчей» в ДНК в клетках Е. coli является белок MutS. Этот белок представляет собой гомодимер (молекулярная масса мономера - 97 кДа), формирующий ДНК-связывающий участок, обхватывающий ДНК в виде «зажима». Белок имеет в каждой субъединице АТФазный домен. Для обнаружения «мисматчей» в ДНК MutS сканирует и затем образует с «мисматчем» специфические контакты в так называемом «начальном» узнающем комплексе (IRC). В этом комплексе ДНК изогнута на 60° в области «мисматча», и он является достаточно стабильным. Структура IRC была охарактеризована методом РСА. Затем из 1RC высвобождается АДФ, и с MutS связывается АТФ, что переводит белок в активированную форму. В результате MutS формирует с ДНК «окончательный» узнающий комплекс (URC), а затем - «скользящий зажим». Конформационная мобильность URC и «скользящего зажима» усложняет задачу их характеристики.

Первая часть данного исследования направлена на создание комплексного биохимического подхода для характеристики воздействия того или иного повреждения ДНК на систему MMR в целом и белок MutS в частности. ДНК,

содержащие тимидингликоль, выбраны как модельные соединения. Прежде всего необходимо было выяснить, возможна ли репарация остатка системой ММЯ. Ответить на этот вопрос позволяет исследование гидролиза Tg-coдepжaщeй ДНК ферментом МиШ в присутствии белков \4utS и МщЬ. Анализ механизма узнавания повреждения в ДНК белком Ми18 включает в себя оценку влияния на стабильность ДНК-фрагмента, определение сродства МЩ8 к таким ДНК-дуплексам, изучение структуры модифицированных ДНК (наличие изгиба) в комплексе с Ми18, характеристику локализации МЩ8 на ДНК относительно Tg, выявление эффективности гидролиза белком \lutS АТФ и скорости обмена АДФ в АТФазных доменах МЩ8 в присутствии Т§-содержащих ДНК (рис. 1).

адф атф

ДНК

«Скользящий зажим»

Рис. 1. Основные этапы взаимодействия М^Б с ДНК, содержащей остаток Tg (ДНК*).

Вторая часть работы посвящена изучению структурных особенностей короткоживущих ДНК-белковых комплексов (ДНК-МЩ8, ДИК-МЩв-МиШ) и механизма активации репарации «мисматчей». Различные способы нуклеиново-белковых и белок-белковых «сшивок» открывают широкие возможности для получения недоступной другими способами структурной информации {Khodyreva, Ьтпк, 2005; УегсИпе еГ а!., 2003; Ходырева и др., 2011). Для получения белково-нуклеинового конъюгата удобен подход сайт-направленной фиксации белка МЩв, содержащего единственный остаток цистеина, на ДНК, имеющей в области контакта с цистеином тиол-специфичную реакционноспособную группировку. Реализация данного подхода предполагала проведение работы в нескольких направлениях. Предварительно нужно было создать мутантные формы Ми18, содержащие единственный остаток цистеина на мономер белка в его ДНК-связывающей области, и охарактеризовать их. Также необходимо было сконструировать оптимальные ДНК-системы с реакционноспособными группировками, взаимодействующими с остатками Сув. Перед использованием конъюгата Мщ8 с ДНК для структурно-функциональных исследований требовалось разработать методы его очистки и охарактеризовать активность Ми18 в его составе. Предполагалось, что применение этого подхода позволит селективно и с высоким выходом целевого продукта получать функционально активный ДНК-белковый конъюгат для изучения структурных особенностей «окончательного» узнающего комплекса МЩ8 с ДНК и для выяснения деталей механизма «мисматч»-зависимой активации МиШ.

2. Характеристика влияния остатка тимидингликоля в составе ДНК на функционирование системы MMR

Тимидингликоль (5,6-дигидро-5,6-дигидрокситимидин) является одним из наиболее распространенных окислительных повреждений пиримидиновых нуклеотидов (Dolinnaya et al., 2013). Так как Tg содержит два хиральных центра (при С5- и Сб-атомах), он существует в виде четырех стереоизомеров: цис-{5R, 6S), транс-(5R, 6R), цис-(5S, 6R), транс-(5S, 6S). В природе встречаются преимущественно цис-формы Tg (Brown et al., 2010). Особенности репарации Tg в бактериальных и эукариотических клетках с участием систем эксцизионной репарации оснований и нуклеотидов, а также последствия, которые вызывают остатки Tg в ДНК, подробно описаны (Dolinnaya et al., 2013; Huang et al., 2009). Особенности взаимодействия MutS с ДНК, содержащими Tg, а также возможность репарации этого повреждения системой MMR ранее не рассматривались.

В работе использовалась серия 17-, 30- и 45-звенных олигодезокси-рибонуклеотидов, как содержащих, так и не содержащих остаток (5R, 68)-изомера Tg . На основе полученных ДНК-фрагментов были сконструированы линейные ДНК-дуплексы, а также модифицированные плазмидные ДНК.

2.1. MutS- и MutL-зависимый гидролиз белком MutH кольцевых ДНК с остатком

тимидингликоля

Наиболее достоверный ответ на вопрос о возможности репарации системой MMR того или иного повреждения в экспериментах in vitro может быть получен путем оценки эндонуклеазной активности MutH в присутствии белков MutS и MutL. Оптимальными для исследования процесса инициации репарации являются протяженные фрагменты ДНК, т.к. расстояние между «мисматчем» и местом гидролиза ДНК может достигать более 1000 п. н. В качестве систем, наиболее приближенных к природным, удобно использовать ковалентно замкнутые ДНК. Методика создания таких ДНК включала следующие этапы: 1) гидролиз плазмиды pUC-MMR (3315 п. н.) сайт-специфической никазой Nt.BpulOI; 2) тепловая денатурация-ренатурация ДНК в присутствии 100-кратного избытка целевых фосфорилированных 17-звенных и 21-звенных синтетических дезокси-рибоолигонуклеотидов; 3) восстановление целостности образовавшихся гибридных молекул ДНК с помощью рекомбинантной ДНК-лигазы фага Т4; 4) удаление избытков олигонуклеотидов и открытой формы плазмиды смесью экзонуклеаз Exol, ExoIII, RecJ; 5) удаление ферментов с помощью протеиназы К; 6) осаждение ДНК (рис. 2). В результате были сконструированы две ковалентно замкнутые ДНК, содержащие пары A/Tg и G/Tg, а также положительный контроль - ДНК с «мисматчем» G/T и отрицательный контроль - плазмида с канонической G/C-парой. В состав каждой из плазмид входил участок узнавания MutH: 5'-GATC-3 73 '-CTm6AG-5'. Эти ДНК использовали для исследования инициации процесса MMR in vitro.

Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие остаток Тз или остаток 2'-дезокси-2'-аминоуридина, а также немодифицированные ДНК-фрагменты, синтезированы ст. науч. сотр. НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, к.х.н. Е.А. Романовой. Олигодезоксирибонуклеотиды с З'-концевой дисульфидной группировкой - коммерческие препараты (Еип^еШес, Германия).

Т4ДНК-лигаза Ехо1, ЕхоШ, Реи

Рис. 2. Схема конструирования ковалентно замкнутой ДНК и гидролиза этой ДНК в присутствии белков Ми18, МЩЬ и МЩН. Участок узнавания МиЩ выделен синим, фрагмент с исследуемой нуклеотидной парой - красным, где эта пара обозначена как ▲ , кзц -ковалентно замкнутый цикл, оц - открытый цикл плазмидной ДНК, -разрыв в цепи ДНК.

Эндонуклеаза МиШ способна гидролизовать каноническую ДНК, содержащую участок 5'-ОАТС-3'/3'-СТш6АО-5'. Были подобраны условия «мисматч»-зависимого расщепления ДНК этим ферментом в присутствии белков МЩБ и МЩЬ . Об эффективности гидролиза той или иной ковалентно замкнутой ДНК (кзц) эндонукпеазой МиШ судили по появлению ДНК с разрывом в одной из цепей (рис. 2). Оценивали увеличение в ходе реакции интенсивности зоны, соответствующей открытой форме плазмиды (оц). Практически полный переход ДНК-субстрата с О/Т-«мисматчем» в открытый цикл наблюдался уже за 5 мин (рис. 3, а). Степень расщепления канонической ДНК была значительно ниже (примерно 30% за 5 мин).

Время, мин 0

(а)

5 10

м тыс. п.н. f

10 Ё <D

6 i

• ■ *

3 1

—— 2.5 5 О

?

— 1,5 <5

100

75

л

50

о 25

0

II

(б)

G/T

G/C

JL

СЯд

JL

АЛд

Рис. 3. Гидролиз ковалентно замкнутых ДНК (кзц) MutH в присутствии MutS и MutL. (а) Анализ гидролиза плазмидной ДНК, содержащей С/Т-«мисматч», в 1%-ном агарозном геле, содержащем бромид этидия. Дорожка, содержащая исходную ДНК, обозначена как 0 мин. М - ДНК-маркеры, (б) Диаграммы, представляющие относительную степень гидролиза G/T-(100%), G/Tg-, A/Tg-содержащих и канонической ДНК через 5 мин после начала инкубации.

Эффективность гидролиза плазмид, содержащих пары G/Tg, и A/Tg, сопоставима в пределах погрешности эксперимента с эффективностью гидролиза канонической ДНК. Таким образом, остаток Tg в составе ДНК, скорее всего, не репарируется системой MMR.

2.2. Особенности взаимодействия белка MutS с ДНК-фрагментами, содержащими остаток тимидингликоля

Отсутствие или чрезвычайно низкая эффективность репарации Tg-содержащей ДНК может быть обусловлена блокированием одного из этапов её специфического взаимодействия с белком MutS - первым участником процесса MMR (рис. 1). Для характеристики этих этапов были использованы дуплексы 1-Х (табл. 1 и схема. 1).

Методом УФ-спектроскопии изучали термическую устойчивость ДНК-

* Буфер А: 20 мМ HEPES (pH 7,9), 5 мМ MgCl2, 125 мМ KCl. Реакционная смесь: MutS (0,4 мкМ), MutL (0,4 мкМ), MutH (0,1 мкМ), 20 нг/мкл ДНК, 1 мМ АТФ. Здесь и далее концентрации белков приводятся в расчёте на мономер.

дуплексов 1-1V. Для этого в буфере, содержащем 10 мМ НЕРЕ8 (рН 7,5) и 125 мМ КС1, определяли зависимость оптического поглощения образцов при длине волны 260 нм от температуры (табл. 1). Температура плавления (Тпл) ДНК-дуплекса II с О/Т-парой на 5 °С, а Tg-coдepжaщиx дуплексов III и IV на 16 и 12 °С, ниже, чем Тпл канонического дуплекса I. Эти данные свидетельствуют о дестабилизации структуры ДНК-дуплексов не только в районе «мисматча» в/Т, но и в районе модифицированных пар вЛ^ и АЛ^, что может служить сигналом для связывания сенсорного белка Ми1в с повреждённым участком в ДНК.

Таблица 1. Термическая устойчивость ДНК-дуплексов и их влияние на функционирование белка МшБ.

№ ДНК-дуплекс (5'^3'/3'^5') т °с 1 пл, (±1) КЛ MutS, нМ Начальные скорости (v0) гидролиза АТФ Скорость обмена АДФ, k„t¡

Vo, нМ отн. Vo, % koff, с 1 отн. ко//, %

I CAAGCCTATGCCCTCAGCACCCAGGGTGCC GTTCGGATACGGGAGTCGTGGGTCCCACGG 79 32,7 ± 3,3 0,77 ± 0,07 2,1 0,047 ± 0,001 3,9

11 CAAGCCTATGCCCTCAGCACCCAGGGTGCC GTTCGGATACGGGAGTCGTGGGTTCCACGG 74 7,2 ± 1,5 0,75 ± 0,07 2,0 0,280 ± 0,013 23

III CAAGCCTATGCCCTCAGCACCCAG-GGTGCC GTTCGGATACGGGAGTCGTGGGTTgCCACGG 63 44,8 ± 2,3 0,67 ± 0,04 1,8 0,037 ± 0,015 3,0

IV CAAGCCTATGCCCTCAGCACCCA-GGGTGCC GTTCGGATACGGGAGTCGTGGGTgCCCACGG 67 25,0 ± 3,0 0,69 ± 0,01 1,9 0,025 ± 0,001 2,1

MutS без ДНК - - 0,37 ± 0,02 1 0,012 ± 0,001 1

Константы диссоциации (K¿) комплексов MutS с ДНК-дуплексами I-IV определяли методом Скэтчарда. Наиболее высокое сродство MutS проявлял к дуплексу II, содержащему G/T-пару (K¿ = 7 нМ). Значения Kd для комплексов MutS с каноническим дуплексом I и Tg-содержащими дуплексами III и IV близки и примерно в 3-6 раз выше (в диапазоне 25-45 нМ) по сравнению с K¿ для комплекса MutS-дуплекс II (табл. 1). Полученные результаты свидетельствуют о пониженном сродстве MutS к ДНК с остатком Tg. Возможно, потеря системы сопряжённых связей в Tg делает невозможным образование контакта между ним и консервативным остатком Phe36 MutS.

Белок MutS имеет в каждой субъединице АТФазный домен, представляя собой АТФазу класса ABC. Две основные активности MutS - ДНК-связывающая и АТФазная - взаимозависимы (Lebbink et al., 2006). Оценено влияние дуплексов I-IV на скорость превращения у-32Р-АТФ в АДФ и у-32Рг, катализируемого MutS (табл. 1). Присутствие любого из дуплексов I-IV в реакционной смеси примерно в 2 раза ускоряло гидролиз АТФ в АТФазном домене MutS по сравнению с экспериментом в отсутствие ДНК (табл. 1), что согласуется с данными литературы {Goodrich et al., 2007). Вместе с тем, зависимости между сродством белка MutS к ДНК-лиганду и скоростью гидролиза АТФ в его присутствии обнаружено не было.

Известно, что этапом, лимитирующим скорость АТФазного цикла MutS в отсутствие ДНК, является высвобождение АДФ. В присутствии ДНК, содержащей «мисматч», диссоциация комплекса АДФ с MutS происходит намного быстрее

{Lebbink et al., 2010). Было выяснено, каким образом наличие Tg в ДНК влияет на этот процесс. Для измерения констант скорости диссоциации (&ofr) комплекса АДФ-MutS использовали его флуоресцентный аналог - 2'/3'-0-(М-метилантранилоил)аденозин-5'-дифосфат (МАНТ-АДФ). Вытеснение МАНТ-АДФ из комплекса с MutS 2000-кратным избытком АДФ происходит по схеме:

MutSeMAHT-АДФ + АДФ -» М1Л8«АДФ + МАНТ-АДФ

Интенсивность флуоресценции МАНТ-АДФ, связанного с MutS, примерно в 2 раза выше, чем не связанного с белком. После добавления избытка АДФ к раствору комплекса MutS с ДНК, сформированного в присутствии МАНТ-АДФ, наблюдали постепенное уменьшение интенсивности флуоресценции. Экспериментальные данные аппроксимировали с помощью одноэкспоненциальной функции, благодаря чему удалось вычислить koff для процесса диссоциации комплекса МАНТ-АДФ с белком MutS (табл. 1).

В отсутствие ДНК белок MutS способен связывать МАНТ-АДФ и обменивать его на молекулу АДФ, однако скорость этого процесса невелика (0,012 с-1). Присутствие ДНК-лиганда в реакционной смеси увеличивает скорость высвобождения МАНТ-АДФ: примерно в 4 раза в случае канонического дуплекса I и в 23 раза в присутствии дуплекса II, содержащего G/T-napy, что согласуется с данными Lebbink et al. (2010). Tg-содержащие дуплексы III и IV влияли на скорость высвобождения МАНТ-АДФ из комплекса с MutS даже в меньшей степени, чем канонический дуплекс I. Таким образом, значительной стимуляция обмена АДФ в АТФазных доменах MutS, характерной для «мисматч»-содержащей ДНК II, в присутствии этих дуплексов не происходит.

2.3. Характеристика комплекса MutS с тимидингликольсодержащими флуоресцентно-меченными ДНК

Формирование специфического комплекса MutS с G/T-содержащим дуплексом сопровождается изгибом ДНК на 60° (Lamers et al., 2000). Удобным методом контроля за изменением конформации ДНК является регистрация флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) для дуплекса, содержащего два флуорофора по обе стороны от неканонической пары нуклеотидов, до и после связывания с белком. Предложенная нами ДНК-система (схема 1 ) представляет собой 45-звенный дуплекс, содержащий флуорофоры А1еха-488 (донор) и А1еха-594 (акцептор) на расстоянии 25 п. н. друг от друга, а также вариабельную центральную пару нуклеотидов.

_j X/Y - G/T в дуплексе V,

45"меР I - G/C в дуплексе VI;

5' -GTCATCCTCGTCTCAGGCACCCTXGGTGCTGAGGGCATAGGCTTG -3' - G/Tg в дуплексе VII;

3' -.CAGTAGGAGCAGAGTCCGTGGGAYCCACGACTCCCGTATCCGAAC -5' _ д/с R дуплексе уШ

1. ___-А/Т в дуплексе IX; '

- A/Tg в дуплексе X.

Схема 1.

Для создания таких ДНК на олигонуклеотиде-матрице (45-звенный олигонуклеотид с А1еха-594) гибридизовали модифицированные (содержащие флуорофор А1еха-488 или остаток Tg) и немодифицированные олигонуклеотиды. ДНК-дуплексы формировали в присутствии 5 мМ MgCl2, что обеспечивало их

стабильность. Наличие разрывов в одной из цепей ДНК не влияло на характер связывания Ми18 с дуплексами. При возникновении изгиба ДНК флуорофоры РЯЕТ-пары сближаются, перенос энергии от донора к акцептору происходит более эффективно, и интенсивность флуоресценции акцептора увеличивается. Действительно, при связывании МЩ8 с дуплексом V, содержащим пару О/Т, наблюдалось значительное изменение спектра флуоресценции в условиях возбуждения донора флуоресценции: уменьшалась интенсивность пика донора и увеличивалась интенсивность пика акцептора, что свидетельствовало об увеличении переноса энергии (рис. 4). Для остальных флуоресцентно-меченных ДНК такого эффекта не наблюдалось.

— ДНК

ДНК+MutS

Рис. 4. Изменение эффективности переноса энергии при комплексообразовании МШв с флуоресцентно-меченным дуплексом V.

550 650 750 А, нм

Для количественной интерпретации изменений, наблюдавшихся в спектрах флуоресценции при связывании MutS с дуплексами, использовали значение &(Fmax/Red), где за Fmax принимали максимум интенсивности испускания А1еха-594 при возбуждении А1еха-488, а за Red - максимум испускания А1еха-594 в условиях его возбуждения; А указывает на изменение величины Fmax/Red в ходе связывания MutS с ДНК. Значение A{Fmax/Red) нивелирует эффект разведения реакционной смеси в ходе эксперимента и позволяет оценить изменение эффективности переноса энергии между донором и акцептором во FRET-nape. Значения A(Fmax/Red), полученные для комплексов MutS с ДНК-дуплексами с парой G/Tg (VII) и с парой A/Tg (X), значительно ниже, чем комплекса MutS с дуплексом V с парой G/T. Они находятся в диапазоне значений, полученных для комплексов MutS с каноническими дуплексами VI и IX (табл. 2), т.е. при связывании белка MutS с ДНК, содержащими пары G/Tg и A/Tg, изгиба дуплекса, характерного для ДНК с парой G/T, не наблюдается.

Таблица 2. A(Fmax/Red) дуплексов V-X при связывании с белком MutS.

№ (X/Y) Фрагмент ДНК-дуплекса (5'—>373'—>5') Д (Fmax/Red)

V (G/T) ...GGCACCCTGGGTGCTGA... ...CCGTGGGATCCACGACT... 0,13±0,001

VI (G/C) ...GGCACCCTGGGTGCTGA... ...CCGTGGGACCCACGACT... 0,01 ±0,001

VII (G/Tg) ...GGCACCCTG-GGTGCTGA... ...CCGTGGGATgCCACGACT... 0,01 ±0,001

VIII (А/С) ...GGCACCCTAGGTGCTGA... ...CCGTGGGACCCACGACT... 0,02±0,002

IX (А/Т) ...GGCACCCTAGGTGCTGA... ...CCGTGGGATCCACGACT... 0,01 ±0,001

X (A/Tg) ...GGCACCCTA-GGTGCTGA... ...CC GTGGGATgCCACGACT... 0,01±0,008

О предпочтительном расположении белка относительно флуорофоров в комплексе с той или иной ДНК можно судить по изменению анизотропии (Дг) по сравнению с раствором ДНК (Сга?отао е? а!., 2012). Измеряли равновесную анизотропию флуорофоров (Дг(А1еха-488) и Дг(А1еха-594)) для растворов комплексов МшЗ с флуоресцентно-меченными ДНК У-Х. На диаграммах (рис. 5 а, б) приведены усреднённые значения Дг(А1еха-488) и Дг(А1еха-594), рассчитанные при максимальном связывании МЩБ с ДНК для флуоресцентно-меченных дуплексов. В случае Tg-coдepжaщиx дуплексов VII и X обнаружено повышенное влияние МШЗ на флуорофор А1еха-594. По-видимому, ориентация белка на Tg-coдepжaщиx ДНК сходна с его ориентацией на дуплексе с О/Т-парой, т. е. связывание МЩЗ происходит со стороны остатка Tg. Однако, как показано выше, сродство МЩв к ДНК с окисленным тимином сравнимо со сродством белка к дуплексу канонического строения, и изгиб ДНК, характерный для «начального» узнающего комплекса с МщЭ, не формируется. Следовательно, сенсорный белок МЩ8 системы ММЯ не «считает» пары вЛ^ и АЛ^ «мисматчами».

в/Т С1С Э/Тд А/С А/Т А/Тд

а/т ас

0,12

Ш

"Г 0,08

га

Л 0,06

5. 0,04 < 0,02 0,00

(В)

(б)

1

.1

I

вя ас в/Тд А/С А/Т А/Тд

а/С

С/Т

Рис. 5. Амплитуда сигнала анизотропии (Дг): (а) Дг(А1еха-594), (б) Дг(А1еха-488). (в) Модели расположения МйЗ на ДНК относительно флуорофоров А1еха-594 (красный кружок) и А1еха-488 (зеленый кружок). Субъединица А, специфически взаимодействующая с «мисматчем», обозначена тёмно-зелёным, субъединица Б, образующая только неспецифические контакты с ДНК, - светло-зелёным.

3. Способы ковалентной фиксации Ми18 на ДНК

Для ковалентной фиксации белка МЩЗ на ДНК были использованы дуплексы, содержащие 2'-йодацетамидную, 2'-пиридилдисульфидную и концевую дисульфидную (присоединённую с помощью линкера к З'-концевой фосфатной группе) группировки, специфически реагирующие с остатком СуБ белка (схема 2).

2'-Модифицированные ДНК были предложены ранее в лаборатории химии нуклеиновых кислот кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ для изучения свойств фактора транскрипции №-кВ (Борисова и др., 2003; Ме1е1еу е/ а1, 2006). Фрагменты ДНК с З'-концевой дисульфидной группой впервые применяются в данной работе для исследования ДНК-связывающих белков.

3' 5'

U га

V

н2с о Vra

О1

о hn. л S-S О-Р-О II v TS

Обозначения: MutS АДФ

Ü

"G н/о

р>

3'

3' 5'

A " S-(CH2),OH

V

V 5' 3'

V

3' s-

SH

Ura „H

Vt

Vs

Ura

? HNvvs"s

) = P О П .6 °

-1 5'

s>

G

L А

н2с 0 fy p

о

o=p-o о

о

Схема 2.

Для выбора положения реакционноспособной группы в ДНК-фрагменте и для направленного введения единственного остатка Cys в MutS с целью последующего кросслинкинга с ДНК была проанализирована кристаллическая структура MutS в комплексе с дуплексом, содержащим 0/Т-«мисматч» (PDB-код 1ЕЗМ, Lamers et al., 2000). Основным критерием при выборе аминокислоты белка MutS, подходящей для замены на остаток Cys, был минимальный риск нарушения функциональной активности MutS. Поэтому аминокислотные остатки (а. о.), имеющие непосредственный контакт с «мисматчем» и взаимодействующие с двумя соседними с ним нуклеотидными остатками, не рассматривались. Наиболее перспективными представлялись следующие а. о. из ДНК-связывающей области MutS: N468, А469 и N497*. Были получены мутантные формы SCMutS(N468C/A801-853), SCMutS(A469C/A801-853) и SCMutS(N497C/A801-853). Эти белки содержали единственный остаток Cys на мономер (SC - от англ. single Cys, далее сокращение опущено). Кроме того в них отсутствуют ответственные за тетрамеризацию MutS 53 а. о. с С-конца (обозначение А800-853 также в дальнейшем опущено). Белки выделяли на Ni-NTA-агарозе с последующей эксклюзионной ВЭЖХ на сорбенте Superdex200. В результате были получены гомогенные препараты белков WTMutS (дикий тип), CFMutS (без остатков Cys), SCMutS(N468C), SCMutS(A469C) и SCMutS(N497C) и охарактеризована их способность активировать эндонуклеазную активность белка MutH в присутствии MutL на кольцевой ДНК, содержащей G/T-napy и последовательность 5'-GATC-3V3'-CTm<)AG-5' (рис. 6).

Генетические конструкции для экспрессии мутантных форм М^Э были любезно предоставлены д-ром К. Биртрюмпфелем (Институт диабета и болезней пищеварения и почек, США).

.100 -80 — 60 40 — : 20 — 0

Й:

М^Э: СР N4680 А469С N4970

Рис. 6. Эффективность гидролиза эндонуклеазой МиШ ковапентно замкнутых ДНК (кзц), содержащих неканоническую пару в/Т и мономе-тилированную последовательность 5'-ОАТС-37 3'-СТтбАО-5', в присутствии МШЬ и различных мутантных форм Мйв через 1 мин после начала инкубации. За 100% принята эффективность гидролиза ДНК в присутствии \VTMutS.

Мутантные формы МШ:8(А469С) и МШ:8(Ж97С) сохраняют свою активность и могут использоваться для дальнейших структурно-функциональных исследований.

3.1. Взаимодействие ДНК-дуплексов, содержащих 2'-йодацетамидную или 2'-пиридилдисульфидную группировку, с белком Ми(8

Сконструированы 17-звенные ДНК-дуплексы, содержащие остаток 2'-дезокси-2'-йодацетамидоуридина (Ш) или 2'-дезокси-2'-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]-уридина (««и). Единичный модифицированный остаток уридина, содержащий в 2'-положении йодацетамидную или дисульфидную группировку, вводили на расстоянии четырёх нуклеотидных остатков от «мисматча» в одну из цепей ДНК-дуплекса (показано стрелками на схеме 3), что должно обеспечить максимальное сближение реакционноспособной группировки с Суэ469 или Сув497 мутантных форм МиЛв:

5 ' -АССТСССА<эССАССАСТ-3 1 31 -ТССАССХ;ттсотсстса-З '

I I

Схема 3.

Исходными соединениями для введения в ДНК 2'-йодацетамидной группы являлись синтетические олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие в заданном положении единичный остаток 2'-амино-2'-дезоксиуридина. Эти олигонуклеотиды ацилировапи йодуксусным ангидридом, выделяли из реакционной смеси и гибридизовали на соответствующей матрице. Были подобраны условия комплексообразования МЩ^ с дуплексами, в которых наблюдалось практически количественное связывание ДНК (буфер А, содержащий 1 мМ АДФ, концентрация белка - 5 мкМ, ДНК - 1 мкМ). Ковалентная связь между остатком Сув белков Ми18(Ы497С) или МЩ8(А469С) и 2'-йодацетамидной группировкой ДНК формировалась с низкой эффективностью, что видно при электрофоретическом анализе образцов в полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем додецилсульфат натрия (ДСН).

На рис. 7 в качестве примера приводятся результаты кросслинкинга МЩ8(А469С) с дуплексом XI/ (5'-АОСАОССАСОСАССАОТ-373'-ТСОгиСООТТСОТСОТСА-5'). Выход конъюгата МШЗхДНК по отношению к исходной ДНК не превышал 10%. В качестве положительного контроля выступала сайт-специфическая никаза ВврОб! (ЖВврЭб!). Выход продукта реакции №.Взр061 с ДНК-дуплексом XII/ (5'-СОТОСТСТССАС/иСТТСТСААООТАС-373'-ОСАССАОАССТСАСААОАОТТССАТС-5'), содержащим в участке узнавания фермента (выделен) остаток 2'-йодацетамидоуридина, достигал 50%, что свидетельствовало о высокой реакционной способности группировки. Возможно, расстояние от 2'-йодацетамидной группировки в

сконструированных дуплексах до тиольной группы М1И5 не является оптимальным для эффективного взаимодействия.

Рис. 7. Радиоавтографы разделения продуктов ковалентного связывания дуплексов, содержащих остаток /II: (а) XI/ с Мш8(А469С) в 6%-ном ДСН-ПААГ; (б) XII/ с №.Взр061 в 8%-ном ДСН-ПААГ. МШвхДНК и Nt.BspD6IxДHK - ДНК-белковые конъюгаты.

Для получения реакционноспособных ДНК-дуплексов с 2'-пиридилдисульфидной группировкой олигонуклеотиды, содержащие 2'-дезокси-2'-аминоуридиновые звенья, подвергали постсинтетической модификации раствором 14-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионата, а затем гибридизовали с соответствующими олигонуклеотидами-матрицами. В качестве примера на рис. 8. приведены результаты кросслинкинга МШ:8(А469С) с ДНК-дуплексом Х1$« (5'-АОСАОССАСОСЛССА(;'1'-ЗУЗ'-'1'СС|.ул'иСОО'1ТСО'ГОО'1СА-5'). Модифицированное звено в комплексе МЩв с этой ДНК находится на расстоянии менее 10 А от а. о. 469 субъединицы А гомодимера МЩБ и на расстоянии более 20 А от а. о. 497 гомодимера Ми18. Связывание мутантной формы МЩ8(А469С) с 5'-)2Р-меченным ДНК-дуплексом Х1м проводили в буфере А, содержащем 1 мМ АДФ, в течение 30 мин при 37 °С. Для достижения максимальной степени связывания МЩ8 использовали 5-кратный избыток ДНК по отношению к белку (ДНК - 5 мкМ, МЩв - 1 мкМ). При анализе образцов в ДСН-ПААГ наблюдалась дополнительная зона, соответствующая конъюгату МЩв с ДНК (МЩБхДНК).

Рис. 8. Анализ методом электрофореза в 8%-ном ДСН-ПААГ продуктов реакции Ми18(А469С) с ДНК-дуплексом (а)

Фотография геля, окрашенного раствором кумасси 0250; (б) радиоавтограф геля. М -маркеры молекулярной массы белков (кДа). 1 - исходный Ми18(А469С), 2 - исходный 32Р-меченный ДНК-фрагмент 3-4 -

продукты ковалентного связывания Мш8 с ДНК в буфере без ДТТ и с ДТТ (10 мМ).

Из двух остатков СуБ гомодимеров мутантных форм МЩ8 только один способен образовывать ковалентную связь с реакционноспособной ДНК (см. схему 2). Выход конъюгата МЩ8(А469С) с дуплексом Х1м составлял более 90%, так как более 45% белка находилось в составе зоны, соответствующей конъюгату (рис. 8, дорожки 3). Кроме зоны, соответствующей конъюгату МЩ8(А469С) с ДНК-дуплексом, наблюдалась зона с очень низкой подвижностью в 8%-ном ДСН-ПААГ (более 200 кДа), соответствующая димеру МЩЗ. При добавлении 10 мМ ДТТ в реакционную смесь наблюдается разрушение конъюгата Мщ8 с ДНК и димера белка (рис. 8,

(а)

(б)

4МИ 100- -МШБхДНК 80 60 - ш

-ДНК

КН.ВгрОб!

М.ВэрОбВДНК

ДНК

дорожки 4), что подтверждает наличие в них дисульфидной связи. При взаимодействии мутантной формы МЩ8(Ж97С) с дуплексом Х1и эффективность образования конъюгата достигала только 60%, возможно, из-за большей удалённости Сув белка от дисульфидной группировки в составе ДНК. Белок СРМШЗ, как и ожидалось, не вступал в реакцию ни с одним из реакционноспособных ДНК-дуплексов. Эффективность образования конъюгатов МШ:8(А469С) или МЩ8(Ж97С) со всеми дуплексами с й/Т-парой и остатком ««и (см. схему 3) составляла от 60 до 95%. Формирование ковалентно связанного комплекса между мутантными формами МЩв и ДНК-дуплексом канонического строения также проходило с выходом до 60% (в расчёте на белок), возможно, из-за высокой неспецифической ДНК-связывающей активности МЩв. Таким образом, использование дуплексов, содержащих 2'-дезокси-2'-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]уридиновое звено, обеспечивает эффективное ковалентное связывание ДНК с белком МЩ8.

3.2. Взаимодействие ДНК-дуплексов с З'-концевой дисульфидной группировкой с мутантными формами Ми(8

Сконструированы 29-звенные дуплексы, содержащие З'-концевую дисульфидную группировку на гибком линкере:

5/ _ А(ЗСТОССАО(ЗСАССАСТСТСА(эССТССТАТ -3' Х1НЛ'$ пСвАС£ЗСТщССТ(ЗСТСАСАСТС(ЗСА<3<ЗАТА -5'

5'- А<ЗСТСССАА<ЗСАССАСТвТСА(5ССТССТАТ -3' xiv.«' ССАСОСТТССТССГСАСАСТСССАССАТА -5'

НО(СН2)з-Э-3\/ч^Р

В дуплексе С/Т-«мисматч» находился на расстоянии 7 нуклеотидных

остатков от модифицированного 3'-конца дуплекса, что должно обеспечивать максимальное сближение реакционноспособной группировки с а. о. 497 из субъединицы А и а. о. 469 из субъединицы Б МЩБ (расстояние до З'-конца олигонуклеотида ~ 7,6 и 9,4 А соответственно).

Реакция тиол-дисульфидного обмена мутантных форм МЩ8 с этими дуплексами протекала количественно за 30 мин. В случае дуплекса ХШ««, содержащего О/Т-«мисматч», скорость образования конъюгата была примерно в 2 раза выше, чем в случае канонического дуплекса Х1Ум. Белки СИМиЙ и \VTMutS не вступали в реакцию с 2'-дисульфидсодержащими ДНК, что указывает на её специфичность. Для дополнительной проверки специфичности кросслинкинга исследовали способность МЩ8(А469С) и МЩ8(Ы497С) к образованию конъюгата с ДНК при их предварительной инкубации с: АДФ, АТФ и негидролизуемым аналогом АТФ -аденозин-5'-(Р,у-имидо)трифосфатом (АМФ-РЫР). Связанный с АМФ-РИР Ми18 находится в «закрытой» конформации, при этом белок не способен взаимодействовать с ДНК. Как и следовало ожидать, в этом случае образование конъюгата Ми$ с ДНК не наблюдалось (рис. 9, дорожки 5). При гидролизе АТФ и при связывании АДФ МЩв находится в «открытой» конформации, способной контактировать с ДНК. В этих случаях наблюдалось эффективное образование ДНК-белкового конъюгата (рис. 9, дорожки 3, 4).

(Я)

(6)

MutS(A469C)

MutS(N497C)

кДа 200 150 120 100 85

АД® АТФ

АМФ-PNP

ДТТ

MutSxMut

Рис. 9. Влияние АДФ, АТФ и АМФ-PNP на эффективность кросслинкинга мутантных форм (а) MutS(A469C) и (б) MutS(N497C) с ДНК-дуплексом XIIIss. Дорожка К - исходный препарат мутантной формы MutS без MutsxflHK ДНК. Анализ в 6%-ном ДСН-ПААГ.

Гель окрашивали раствором кумасси

Mu,S G250.

123456 123456

Для функциональных исследований системы MMR были предложены три

протяжённые ДНК-системы, содержащие дисульфидную группировку. При создании этих ДНК-систем, так же как и в разделе 2.3, использовался метод гибридизации модифицированных и немодифицированных олигонуклеотидов на олигонуклеотиде-матрице («верхней» цепи, содержащей в составе G/T-лмисматча» остаток G). «Нижняя» цепь составлена из двух или трёх олигонуклеотидов, один из которых вариабелен для той или иной системы дуплексов. Такая структура ДНК-фрагмента позволяет внедрить в его состав реакционноспособную группу, находящуюся на 3'-концевом фосфате вариабельного олигонуклеотида. В состав протяжённых ДНК-дуплексов входили последовательности 29-звенных дуплексов XIIIss и XIVss (выделены серым), для которых была показана высокая эффективность кросслинкинга с мутантными формами MutS:

XVss

XVIss

5 1 -ACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGTCTCA----AGCTGCCAfiGCACCAGTGTCAGCGTCCTAT-3 '

3 ' -TGTTACGCGAGTAGCAGTAGGAGCAGAGTT CGACGGTfflCGTGGTCACAGTCGCAGGATA-5 '

HOiCHjJj-S-Ss/S/

45-мер

5'-GTCATCCTCGTCTCAGGCACCCTGGGTGCTGAGGGCATAGGCTTG -3' 3' -.CAGTAGGAGCAGAGT rGTGGGATCCACGACT.CCCGTATCCGAAC

HO(CHi)>Äis —

15-мер

iGAGT .CG

вч^СЛ

IfrMep

ACj -5'

XVIISS 5 ' -TCCTTTCGGGCTTTGTTAGCATGAGGGATCCTCGAGCATATGGCTC----AGCTGCCAjcjGCACCAGTGTCAGCGTCCTAT-3 '

3 ' -AGGAAAGCCCGAAACAATCGTACTCCCTAGGAGCTCGTATACCGAGT CGACGGTfflCGTGGTCACAGTCGCAGGATA-5 '

HO(CHi>l-S-S\/\/p

XVII |SS 5 _TCCTTTCGGGCTTTGTTAGCATGAGGGAT^TCGAGCATATGGCTC----AGCTGCC03GCACCAGTGTCAGCGTCCTAT-3 '

3 1 -AGGAAAGCCCGAAACAATCGTACTCCCTAGGAGCTCGTATACCGAGT CGACGG?J CCGTGGTCACAGTCGCAGGATA- 5 '

HO(CHi))-S.Sv^P

Для функциональных исследований конъюгатов (продукты реакции MutS(A469C) или MutS(N497C) с дуплексами XIIIss-XVIIIss) требовалась их очистка от ДНК и белка, не вступивших в реакцию. Основным требованием при выделении конъюгата было сохранение гомодимерной структуры и активности белка MutS, а также дуплексной структуры фрагмента ДНК. Поэтому для очистки конъюгатов Мщ8хДНК была использована эксклюзионная ВЭЖХ на сорбенте Superdex200 и аффинная хроматография низкого давления на колонке HiTrap Heparin HP (гепарин-агароза).

4. Анализ функциональной активности белка MutS в составе конъюгатов с ДНК 4.1. Эффективность обмена АДФ в MutS, зафиксированном на ДНК

Важной характеристикой эффективного функционирования MutS является взаимная регуляция между его ДНК-связывающей и нуклеотидсвязывающей

активностями. В ходе работы была определена скорость высвобождения флуоресцентно-меченного аналога АДФ - МАНТ-АДФ из АТФазных доменов димера Мщ8(А469С) в составе конъюгата с дуплексом Для этого конъюгат получали в

присутствии МАНТ-АДФ, а затем выделяли методом эксклюзионной ВЭЖХ. В качестве образца сравнения использовали «несшитый» комплекс МЩ8(А469С) с дуплексом XIII. Для повышения степени комплексообразования Ми18(А469С) с ДНК в этом эксперименте концентрации ДНК и белка составляли 0,25 мкМ и 0,5 мкМ, соответственно. Измерения проводили также для МЩв, не связанного с ДНК. Наблюдали вытеснение МАНТ-АДФ из комплекса с Ми18 немеченым АДФ (рис. 10).

Рис. 10. Высвобождение МАНТ-АДФ из мутантной формы Ми18(А469С) при добавлении АДФ (1 мМ): в отсутствие ДНК (голубая линия), в присутствии ДНК-дуплекса XIII (пурпурная линия) и из М|Л8(А469С) в составе конъюгата с дуплексом ХШм (серая линия). Приведены нормированные интенсивности флуоресценции препаратов, где за 1 принята интенсивность флуоресценции до добавления АДФ.

Время, с

Константа скорости высвобождения МАНТ-АДФ (£off) из АТФазных доменов MutS(A469C) в отсутствие ДНК составляла около 0,007 с"1. В присутствии нереакционноспособного «мисматч»-содержащего дуплекса XIII kofi МАНТ-АДФ увеличивалась примерно в семь раз (-0,05 с"1). Эти результаты коррелируют с данными (Kunkel et al., 2005). Высвобождение МАНТ-АДФ из MutS(A469C) в составе конъюгата с дуплексом XIIIss также характеризовалось высоким значением к0я (0,079 с"1). Таким образом, фиксация MutS через остаток Cys на ДНК, содержащей дисульфидную группировку на З'-конце, не нарушает взаимную координацию АТФазной и ДНК-связывающей функций MutS.

4.2. Формирование «тройного» комплекса ДНК/MutS/MutL

«Тройной» комплекс ДНК/MutS/MutL является ключевым интермедиатом в процессе репарации «мисматчей» (Winkler et al., 2011). Его образование служит доказательством активности зафиксированного на ДНК белка MutS. Получали конъюгат мутантной формы MutS(D246C/A469C), содержащей два остатка цистеина: в положении 246 (в области этого а. о. MutL контактирует с MutS) и в положении 469 (для фиксации MutS на ДНК) с дуплексом XVss. Конъюгат выделяли из реакционной смеси методом эксклюзионной ВЭЖХ и затем инкубировали с MutL(N131C) в присутствии тиолспецифичного бифункционального кросслинкера 1,11-бис(малеимидо)триэтиленгликоля (BM[PEG]3) (рис. 11 а).

В присутствии АТФ (рис. 11 б, дорожка 1) наблюдалось образование зоны, соответствующей конъюгату «тройного» комплекса между реакционноспособным дуплексом XVss и белками MutS(D246C/A469C) и MutL(N131C). Таким образом, ковалентная фиксация MutS через а.о. 469, не нарушает способности белка к связыванию с MutL, что также подтверждает активность MutS в составе конъюгата.

(а)

Мш8(0246С/А469С)хДНК

HS SH

о L L

131С)

(б)

MutL. АТФ. АДФ.

МшБхДНКхМшЬ ^-MutSxMutL MutLxMutL _ MutSxflHK _

- MutS

MutL

L L

1 2 3 Кумасси G250

1 2 3 Бромид этидия

«^МтвхДНКхМиЛ

Рис. 11. Образование «тройного» комплекса между дуплексом ХУ$5, концевую дисульфидную группу, и белками Ми18(0246С/А469С) и

содержащим 3'-Ми1ЦЖ31С) в

присутствии ВМ[РЕО]з. (а) Схема реакции, (б) Электрофоретический анализ реакционных смесей в 6%-ном ПААГ-ДСН.

5. Структурно-функциональные исследования MMR с использованием конъюгатов MutS с ДНК 5.1. Конформационные перестройки ДНК при образовании «окончательного»

узнающего комплекса

В представленной работе предложен подход, позволяющий наблюдать структурные перестройки в ДНК при формировании URC. Он основан на ковалентной фиксации MutS(A469C) на дисульфидсодержащем дуплексе XVIss. Дуплекс XVIss также имеет флуоресцентную пару (А1еха-488 и А1еха-594), позволяющую контролировать изменения в его структуре (см. раздел 2.3). Эксперименты выполнялись в присутствии ЭДТА (10 мМ). ЭДТА связывает ионы Mg'+ и делает невозможным гидролиз АТФ в АТФазных доменах MutS. Благодаря этому гомодимеры MutS, связанные с АТФ, не способны возвращаться в конформацию «сканирующего зажима», а в случае диссоциации ДНК-белкового комплекса не могут связываться с ДНК повторно. Конъюгат MutS(A469C) с дуплексом XVIss выделяли методом эксклюзионной ВЭЖХ. Измеряли анизотропию флуорофоров и эффективность переноса энергии до и после добавления раствора АТФ (1 мМ). В качестве образца сравнения использовали «несшитый» комплекс MutS(A469C) с дуплексом V. В ходе эксперимента ковалентный комплекс MutS(A469C) с дуплексом XVIss сохранялся, что подтверждается практически полным отсутствием изменения анизотропии в растворе (рис. 12 а и б, нижние панели). Для раствора конъюгата MutS(A469C) с дуплексом XVIss и контрольного раствора несвязанного ковалентно комплекса MutS(A469C) с дуплексом V в присутствии АДФ наблюдался эффективный перенос энергии между флуорофорами, характерный для IRC, в котором ДНК изогнута на 60° (рис. 12 в).

После добавления АТФ наблюдалось значительное уменьшение эффективности переноса энергии (рис. 12 а и б, верхние панели). Аналогичные результаты были

получены для конъюгата MutS(A469C) с дуплексом, содержащим 2'-пиридилдисульфидную группировку. Таким образом, впервые показано, что при формировании URC ДНК из изогнутой конформации, характерной для IRC, переходит в исходную, линейную форму.

Рис. 12. Анализ конформационных перестроек ДНК при образовании URC методами, основанными на измерениях интенсивности и анизотропии флуоресценции. На верхних панелях представлены спектры флуоресценции при возбуждении А1еха-488. Нижние панели — диаграммы, демонстрирующие изменение анизотропии флуорофора А1еха-594 в ходе эксперимента. (а) Комплекс MutS(A469C) с дуплексом V, (б) коиъюгат MutS(A469C) с дуплексом XVIss. (в) Схема конформационной перестройки «мисматч»-содержащей ДНК в составе конъюгата с MutS при добавлении АТФ.

5.2. «Мисматч»-зависимая активация MutH в присутствии MutL и MutS(A469C),

зафиксированного на ДНК

Конъюгат MutS(A469C) с 32Р-меченными ДНК-дуплексами XVIIss и XVIIIss выделяли аффинной хроматографией на колонке HiTrap Heparin HP. Исследовали MutL- и «мисматч»-зависимый гидролиз ДНК в составе полученных конъюгатов белком MutH. В реакционной смеси варьировали концентрацию KCl (рис. 13).

Рис. 13. Оценка способности MutS(A469C) в составе конъюгата с ДНК-дуплексами XVIIss и XVIIIss активировать гидролиз ДНК белком MutH в присутствии MutL при различных концентрациях KCl. Анализ продуктов гидролиза в 10%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину и 10% формамида.

Белок MutS(A469C) в составе конъюгата с дуплексом XVIIss совместно с белком MutL активировали гидролитическую функцию фермента MutH. При концентрации KCl 90 мМ степень гидролиза ДНК-субстрата составляла около 50% (рис. 13). В случае конъюгата MutS(A469C) с канонической ДНК XVIIIss в этих же условиях гидролиз субстрата наблюдался лишь в незначительной степени (5-7%). Этот результат свидетельствует о том, что фиксация MutS в области «мисматча» не препятствует активации системы MMR. Таким образом, проведённые нами исследования наглядно демонстрируют перспективность З'-дисульфидсодержащих группировок для функциональных исследований системы MMR.

xvito ХУШИ ДНК-дуплекс

KCl, 50 90 126 50 90 125 мМ

i| Исходная IJflHK

Продукт J гидролиза

выводы

1. Предложен комплексный биохимический подход для характеристики начальных этапов функционирования системы репарации неканонических пар нуклеотидов ДНК (MMR). Этот подход позволяет оценить влияние модифицированных гетероциклических оснований (в том числе и в ДНК-«мисматче») на активацию репарации, локализацию белка MutS на модифицированной ДНК, сродство MutS к ДНК-лигандам, формирование изгиба двойной спирали ДНК в комплексе с MutS и эффективность обмена АДФ в АТФазном домене этого белка.

2. Впервые показано, что остаток тимидингликоля (Tg), введённый в кольцевые ДНК в составе пар G/Tg и A/Tg, препятствует активации системы MMR вследствие снижения сродства MutS к тимидингликольсодержащей ДНК по сравнению с дуплексом, содержащим пару G/T. Остаток тимидингликоля не способствует формированию изгиба ДНК при взаимодействии с MutS и стимулированию обмена АДФ белком MutS. Показано, что собственно дестабилизация двойной спирали не является необходимым и достаточным фактором в узнавании белком MutS дефекта в ДНК.

3. Предложены ДНК-лиганды, содержащие дисульфидную группу в углеводофосфатном остове, для ковапентной фиксации короткоживущих комплексов MutS на ДНК. Подобраны и оптимизированы условия формирования и последующего выделения конъюгатов мутантных форм MutS, содержащих единичный остаток Cys, с реакционноспособными ДНК.

4. Показано, что белок MutS, ковалентно связанный с G/T-содержащим дуплексом, находится в «начальном» узнающем комплексе, характеризующемся изгибом ДНК. Обнаружено АТФ-зависимое формирование «окончательного» узнающего комплекса MutS с ДНК, сопровождающееся конформационным переходом дуплекса в форму, не имеющую характерного изгиба двойной спирали.

5. Впервые продемонстрировано, что фиксация MutS в области «мисматча» не препятствует активации системы MMR.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Heinze R.J., Sekerina (Perevoztchikova) S.. Winkler I., Bierffimpfel C., Oretskaya T.S., Kubareva E., Friedhoff P. Covalently trapping MutS on DNA to study DNA mismatch recognition and signaling. // Molecular Biosystems, 2012, v. 8, N. 7, p. 1861-1864.

2. Секерина (Перевозчикова) C.A.. Гришин A.B., Рязанова А.Ю., Артюх Р.И., Рогулин Е.А., Юнусова А.К., Орецкая Т.С., Железная Л.А., Кубарева Е.А. Олигомеризация сайт-специфической никазы BspD6I при повышенных концентрациях белка. // Биоорганическая химия, 2012, v. 38, N. 4, р. 431-438.

3. Перевозчикова С.А.. Романова Е.А., Орецкая Т.С., Фридхофф П., Кубарева Е.А. Современные представления о структурно-функциональной организации системы репарации неканонических пар нуклеотидов в ДНК. // Acta Naturae, 2013, т. 5, N. 3, с. 27-44.

4. Секерина (Перевозчикова) С.А.. Хайнце Р. Аффинная модификация белка MutS ДНК-дуплексами, содержащими 2'-йодацетамидную групприровку. // Материалы международной научной конференции молодых ученых «Ломоносов-2009». Физико-химическая биология. Москва, Россия, с. 12.

5. Sekerina (Perevoztchikova) S.. Heinze R. Cross-linking of single-cysteine MutS variants to modified DNA. // Abstract book of minisymposium of the International Research Training Group GieBen/Marburg-Moscow-2009. Moscow, Russia, p. 2.

6. Секерина (Перевозчикова) C.A.. Рогулин Е.А. Аффинная модификация никазы BspD6I фрагментами ДНК, содержащими 2-йодацетамидную группу. // Материалы международной научной конференции молодых ученых «Ломоносов-2010». Физико-химическая биология. Москва, Россия, с. 1.

7. Sekerina (Perevoztchikova) S.A.. Zheleznaya L.A., Yunusova A.K., Abrosimova L.A., Ryazanova A.Yu., Oretskaya T.S., Kubareva E.A. Heterodimeric restriction endonuclease BspD6I: investigation of protein-DNA interactions using synthetic DNA duplexes. // Abstract book of workshop "Enzymes and enzyme complexes acting on nucleic acids" 2010. Vilnius, Lithuania, p. 52.

8. Sekerina (Perevoztchikova) S.. Heinze R., Winkler I., Kubareva E., Oretskaya Т., Friedhoff P. Trapping MutS on DNA using chemical crosslinking. // Abstract book of 3-rd Giessen Graduate Centre for the Life Sciences, Conference on Life Sciences. 2010. Giessen, Germany, p. 127.

9. Секерина (Перевозчикова) C.A.. Хайнце P. Химическая фиксация белка MutS на ДНК для структурно-функциональных исследований начальных этапов процесса репарации «мисматчей. // Материалы международной научной конференции молодых ученых «Ломоносов-2011». Биоинженерия и биоинформатика. Москва, Россия, с. 1.

10. Kubareva Е.А., Perevoztchikova S.A.. Trikin R.M., Heinze R.J., Romanova E.A., Oretskaya T.S., Friedhoff P. Influence of thymidine glycol on DNA mismatch repair. // Abstract book of FEBS Congress «Mechanisms in Biology» 2013. St. Petersburg, Russia, p. 217.

Заказ № 90-Р/10/2013 Подписано в печать 22.10.13 Тираж 120 экз. Усл. п.л. 1,0

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-таП: info@cfr.ru

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

ФАКУЛЬТЕТ БИОИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ

На правах рукописи

u4Zui3637Z0

ПЕРЕВОЗЧИКОВА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА

Характеристика начальных этапов функционирования системы репарации ДНК-«мисматчей» Escherichia coli с использованием модифицированных ДНК

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Кубарева Е.А.

МОСКВА-2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................................5

ДНК-ДУПЛЕКСЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ..........................................................8

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................................11

ГЛАВА I. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ СИСТЕМЫ РЕПАРАЦИИ «МИСМАТЧЕЙ» В ДНК (Обзор литературы)........................................................................14

1.1. Роль системы MMR в биологических процессах............................................................15

1.2. Общее представление о механизме и последовательности событий в процессе репарации «мисматчей» в ДНК.............................................................................................16

1.3. MutS как ключевой белок репарации «мисматчей» в ДНК...........................................20

1.3.1. Структура белка MutS из Е. coli и функции его отдельных доменов......................21

1.3.2. Этапы действия MutS в процессе MMR.....................................................................27

1.3.3. Роль АТФазного цикла MutS.......................................................................................28

1.4. Белок MutL - молекулярный координатор процессов репарации

«мисматчей» в ДНК................................................................................................................31

1.5. MutH - белок, направляющий действие репарации «мисматчей» в ДНК....................33

1.6. Взаимодействие MutS, MutL, MutH и ДНК.....................................................................35

1.7. Модели координации между участком узнавания и участком гидролиза

ДНК в системе MMR..............................................................................................................37

ГЛАВА II. ХАРАКТЕРИСТИКА НАЧАЛЬНЫХ ЭТАПОВ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ СИСТЕМЫ РЕПАРАЦИИ ДНК-«МИСМАТЧЕЙ» Escherichia coli С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

МОДИФИЦИРОВАННЫХ ДНК (<Обсуждение результатов)...............................................41

II. 1. Характеристика влияния остатка тимидингликоля в составе ДНК на функционирование системы MMR...........................................................................................43

II. 1.1. MutS- и MutL-зависимый гидролиз белком MutH кольцевых ДНК

с остатком тимидингликоля..................................................................................................45

II. 1.2. Термическая устойчивость 30-звенных ДНК-дуплексов, содержащих остаток тимидингликоля........................................................................................................51

II. 1.3. Взаимодействие MutS с содержащими тимидингликоль флуоресцентно-

меченными ДНК.....................................................................................................................52

II. 1.3.1. Анализ формирования изгиба тимидингликольсодержащих ДНК

при связывании с MutS..........................................................................................................60

II. 1.3.2. Характеристика локализации MutS на тимидингликольсодержащих

ДНК..........................................................................................................................................62

II. 1.4. Связывание MutS с тимидингликольсодержащими ДНК-дуплексами....................65

II. 1.5. Влияние тимидингликольсодержащих ДНК-лигандов на кинетику

гидролиза АТФ.......................................................................................................................69

II. 1.6. Влияние тимидингликольсодержащих ДНК-лигандов на обмен АДФ

в АТФазных доменах MutS...................................................................................................71

II.2. Ковалентная фиксация MutS для функциональных исследований

процесса репарации «мисматчей» в ДНК.................................................................................75

11.2.1. Дизайн и получение мутантных форм белка MutS, содержащих единичный остаток цистеина.....................................................................................................................77

11.2.2. Характеристика мутантных форм белка MutS с единичным

остатком цистеина.....................................................................................81

И.2.3. Взаимодействие ДНК-дуплексов, содержащих 2'-йодацетамидную группировку, с ДНК-связывающими белками....................................................................84

11.2.3.1. Взаимодействие с сайт-специфической никазой BspD61.....................................84

11.2.3.2. Взаимодействие с мутантными формами MutS....................................................88

11.2.4. Ковалентное связывание MutS с фрагментами ДНК, содержащими дисульфидную группировку..................................................................................................91

11.2.4.1. Взаимодействие мутантных форм MutS с ДНК-дуплексами с 2'-пиридилдисульфидной группировкой.............................................................................92

И.2.4.1.1. Синтез олигонуклеотидов, содержащих

2'-дезокси-2'-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]уридиновое звено............................92

IL2.4.1.2. Ковалентное связывание мутантных форм MutS с

2'-пиридилдисульфидными производными ДНК-дуплексов..........................................93

11.2.4.2. Взаимодействие ДНК-дуплексов с З'-концевой дисульфидной группировкой с мутантными формами MutS......................................................................97

11.2.5. Конструирование модифицированных ДНК для исследований особенностей функционирования системы MMR.....................................................................................102

11.2.6. Разработка методов выделения конъюгатов MutS с ДНК.......................................106

11.2.6.1. Выделение конъюгатов MutS с ДНК методом эксклюзионной ВЭЖХ................107

11.2.6.2. Выделение конъюгатов MutS с ДНК методом аффинной

хроматографии.............................................................................................................................................110

11.2.1. Анализ функциональной активности белка MutS в составе конъюгатов с ДНК.....................................................................................................................................114

11.2.7.1. Эффективность обмена АДФ в MutS, зафиксированном на ДНК.....................114

11.2.7.2. Формирование «тройного» комплекса ДНК/MutS/MutL...................................116

II.2.8. Структурно-функциональные исследования MMR с использованием конъюгатов MutS с ДНК......................................................................................................118

11.2.8.1. Конформационные перестройки ДНК при образовании «окончательного» узнающего комплекса..........................................................................................................118

11.2.8.2. Выяснение возможности активации MutH в присутствии MutS, зафиксированного на ДНК в области «мисматча»...........................................................121

11.2.8.2.1. «Мисматч»-зависимый гидролиз линейных ДНК-дуплексов

в присутствии белков MutS, MutL и MutH......................................................................122

11.2.8.2.2. «Мисматч»-зависимая активация MutH в присутствии MutL

и MutS(A469C), зафиксированного на ДНК...................................................................123

ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...................................................................125

III. 1. Реактивы и материалы..................................................................................................125

111.2. Приборы и методы........................................................................................................129

III.2.1. Электрофоретические методы.............................................................131

111.2.1.1. Горизонтальный электрофорез в 1%-ном агарозном геле.....................131

111.2.1.2. Вертикальный электрофорез в 15-20%-ных ПААГ.............................131

111.2.1.3. Вертикальный электрофорез в 4%-ных и 8%-ных ПААГ.....................132

111.2.1.4. Вертикальный электрофорез в 20-30%-ных ПААГ с 7 М мочевиной......132

111.2.1.5. Электрофорез по Лэммли............................................................132

111.3. Общие методики............................................................................................................132

III.3.1. Трансформация компетентных клеток Е. coli.......................................................132

II 1.3.1.1. Метод «теплового шока».............................................................132

III.3.1.2. Метод электропорации...............................................................133

III.3.2. Экспрессия рекомбинантных белков MutS, MutL и MutH в

клетках Е. coli.......................................................................................................................133

111.3.3. Выделение и очистка рекомбинантных белков MutS, MutL и MutH....................134

111.3.4. Выделение плазмидных ДНК....................................................................................135

111.3.5. Конструирование модифицированных кольцевых ДНК-субстратов....................136

111.3.6. Конструирование флуоресцентно- и Р-меченных ДНК-дуплексов....................136

111.3.7. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов с йодацетамидной

группировкой в 2'-положении углеводного фрагмента....................................................137

111.3.8. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов с единичным 2'-дисульфидсодержащим уридиновым звеном................................................................139

111.3.9. Определение термической устойчивости ДНК-дуплексов....................................139

111.3.10. Активация начальных этапов репарации «мисматчей» в ДНК...........................140

111.3.11. Связывание сайт-специфической никазы BspD6I с ДНК-лигандами.................140

111.3.12. Гидролиз Р-меченной ДНК сайт-специфической никазой BspD61...................141

111.3.13. Связывание белка MutS с ДНК-лигандами............................................................141

111.3.14. Ковалентное связывание белка MutS с реакционноспособными ДНК-лигандами....................................................................................................................141

111.3.14.1 Взаимодействие ДНК-дуплексов, содержащих остаток

2'-дезокси- 2'-йодацетамидоуридина, с мутантными формами MutS..........................142

111.3.14.2 Взаимодействие ДНК-дуплексов, содержащих дисульфидную группировку, с мутантными формами MutS...................................................................142

111.3.15. Выделение ДНК-белковых конъюгатов методом хроматографии......................143

III.3.15.1. Эксклюзионная ВЭЖХ...................................................................143

III.3.15.1. Аффинная хроматография..............................................................143

111.3.16. Флуоресцентные методы.........................................................................................144

111.3.17. Кинетика гидролиза АТФ белком MutS.................................................................145

111.3.18. Кинетика обмена АДФ в АТФазных доменах белка MutS..................................145

111.3.19. Образование «тройного» комплекса линейной ДНК с белками

MutS и MutL..........................................................................................................................146

111.3.20. Активация гидролиза ферментом MutH линейных

ДНК белками MutS и MutL..................................................................................................147

ВЫВОДЫ......................................................................................................................................148

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................149

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BER

BM[PEG]3

CF

DE3

Е. coli FRET

^260

HEPES

HMGB1

HNPCC

HTH IDL IRC Kd

koff

LB

m5C

m6A

m6G

MLH

MMR

Mr

MSH

MSI

NER

NTA

OG

PCNA

PDB

PMS

эксцизионная репарация оснований, от англ. base excision repair

1,11 -бис(малеимидо)триэтиленгликоль

форма белка, не имеющая остатков Cys, от англ. cysteine free

геномная конструкция экспрессионных штаммов бактерий, в которой ген Т7

РНК-полимеразы находится под регуляцией /ас-промотора

Escherichia coli

флуоресцентный резонансный перенос энергии, от англ. fluorescence resonance energy transfer гипохромный эффект

Н-2-гидроксиэтилпиперазин->Г-2-этансульфоновая кислота негистидиновый белок высокой мобильности, от англ. high-mobility group boxl синдром Линча или неполипозный рак толстой кишки, от англ. hereditary nonpolyposis colon cancer

спираль-поворот-спираль, от англ. helix-turn-helix инсерционные и делеционные петли ДНК

«начальный» узнающий комплекс, от англ. initial recognition complex константа диссоциации константа скорости диссоциации

питательная среда для выращивания бактерий Е. coli, от англ. lysogeny broth

С5-метил-2'-дезоксицитидин

Ы6-метил-2 '-дезоксиаденозин

06-метил-2 '-дезоксигуанозин

гомолог MutL, от англ. MutL homolog

репарация неканонических пар нуклеотидов («мисматчей»), от англ. mismatch repair

молекулярная масса

гомолог MutS, от англ. MutS homolog

явление нестабильности микросателлитов ДНК, от англ. microsatellite instability

эксцизионная репарация нуклеотидов, от англ. nucleotide excision repair

нитрилотриуксусная кислота

краситель оранжевый G

ядерный антиген пролиферирующих клеток

база данных трёхмерных структур белков, от англ. protein data bank гомологи MutL, от англ. post meiotic segregation

Р-петля элемент структуры АТФазного домена MutS, от англ. phosphate-binding

PMSF фенилметансульфонилфторид

г анизотропия

SC мутантная форма белка, имеющая единственный остаток цистеина в составе

молекулы, от англ. single Cys

SSB белки, связывающие одноцепочечные ДНК, от англ. single-strand binding protein)

Т. aquaticus Thermus aquaticus

ТСЕР трис(2-карбоксиэтил)фосфин

TEMED Н,Н,№,Н'-тетраметилэтилендиамин

Tg 5,6-дигидро-5,6-дигидрокситимидин, тимидингликоль

ír время удерживания

Тпл температура плавления

URC «окончательный» узнающий комплекс, от англ. ultimate recognition complex

VSPR «очень короткий путь репарации», от англ. very short patch repair

WT форма белка «дикого типа», от англ. wild type

AT температурный интервал плавления ДНК-дуплекса

а. о. аминокислотный остаток

АДФ аденозин-5'-дифосфат

АМФ-PNP аденозин-5'-(Р,у-имидо)трифосфат

АП-сайт апуриновый/апиримидиновый сайт

АТФ аденозин-5'-трифосфат

БСА бычий сывороточный альбумин

БФС бромфеноловый синий

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ДМСО диметилсульфоксид

ДМФА Ы,Ы-диметилформамид

ДСН додецилсульфат натрия

ДТТ 1,4-дитиотреит, трео-2,3-дигидрокси-1,4-димеркаптобутан

ИПТГ изопропил-(3-0-тиогалактопиранозид

кзц ковалентно замкнутый цикл плазмидной ДНК

КЦ ксиленцианол

МАНТ-АДФ 273 '-0-(Ы-метилантранилоил)аденозин-5 '-дифосфат

н.о. нуклеотидный остаток

оц открытый цикл плазмидной ДНК

п. н. пара нуклеотидов

ПААГ полиакриламидный гель

РСА ренттеноструктурный анализ

СПДТП Ы-сукцинимидил-З -(2-пиридилдитио)пропионат

Трис трмс-(гидроксиметил)аминометан

у. е. условные единицы

ЭДТА этилендиаминтетраацетат, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

ЯМР ядерный магнитный резонанс

Для обозначения аминокислотных остатков, гетероциклических оснований, нуклеозидов, нуклеотидов, олиго- и полинуклеотидов использовали символы, рекомендованные Комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPАС) и Международного союза биохимиков (IUB).

Префикс «d» (дезокси) при обозначении нуклеозидов, нуклеотидов, олигодезоксирибонуклеотидов и ДНК-дуплексов опущен.

ДНК-ДУПЛЕКСЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ

Название ДНК-дуплекс (5'-»ЗУЗ'->5')

I СААСССТАТССССТСАССАСССАвССТССС СТТСССАТАССССАСТССТСССТСССАССС

II СААСССТАТССССТСАССАСССАСССТССС СТТСССАТАССССАСТССТСССТТССАССС

III СААСССТАТССССТСАССАСССАв-ССТССС СТТСССАТАССССАСТССТСССТТдССАССС

IV СААСССТАТССССТСАССАСССА-СССТССС СТТСССАТАССССАСТССТСССТдСССАССС

V СТСАТССТССГ"СТСА | СССАСССТСССТССТСАССССАТАСССТТС САСТАССАССАСАСТ-СССТСССАСССАССАСТССССТАТСССААС

VI СТСАТССТСС'Г'СТСА | СССАСССТСССТСТТСАССССАТАСССТТС САСТАССАССАСАСТ-СССТСССАСССАССАСТССССТАТСССААС

VII СТСАТССТСС+СТСА|СССАСССТССТСТССТСАССССАТАСССТТС САСТАССАССАСАСТ-СССТСССАСС-САССАСТССССТАТСССААС

VIII СТСАТССТСС^СТСА | СССАССТТСССТССТСАССССАТАСССТТС САСТАССАССАСАСТ-СССТСССАСССАССАСТССССТАТСССААС

IX СТСАТССТССгСТСА-СССАСССТСССТССТСА-ССССАТАСССТТС САСТАССАССАСАСТ|СССТСССАТССАССАСТ|ССССТАТСССААС

X СТСАТССТСС"гСТСА-СССАСССТСССТССТСА-ССССАТАСССТТС САСТАССАССАСАСТ|СССТСССАСССАССАСТ|ССССТАТСССААС

XI СТСАТССТССтСТСА-СССАСССТв-ССТССТСА-ССССАТАСССТТС САСТАССАССАСАСТ|СССТСССАТдССАССАСТ|ССССТАТСССААС

XII СТСАТССТСС+СТСА-СССАСССТАССТССТСА-ССССАТАСССТТС САСТАССАССАСАСТ|СССТСССАСССАССАСТ|ССССТАТСССААС

XIII СТСАТССТССтСТСА-СССАСССТАССТССТСА-ССССАТАСССТТС САСТАССАССАСАСТ|СССТСССАТССАССАСТ|ССССТАТСССААС

XIV СТСАТССТССтСТСА-СССАСССТА-ССТССТСА-ССССАТАСССТТС САСТАССАССАСАСТ|СССТСССАТдССАССАСТ|ССССТАТСССААС

XV/ CGTGGTCTCGAGiUCTTCTCAAGGTAC GCACCAGAGCTC-AGAAGAGTTCCATG

XVI/ GCACCAGAGCiUGAGAAGAGTTCCATG CGTGGTCTCG-AGTCTTCTCAAGGTAC

XVII/ CGTGGTCTCGAGTCTTCiUCAAGGTAC GCACCAGAGCTCAGAAG-AGTTCCATG

XVIII/ CGTGGTCTCGAGTCTTCTCA-AGGTAC GCACCAGAGCTCAGAAGAGTiUCCATG

XIX/ CGTGGTCTCGAGTCTTCTC-AAGGTAC GCАС СAGAGCTCAGAAGAG ¿UT С CATG

XX CGTGGTCTCGAGTCTTCTCAAGGTAC GCACCAGAGCTCAGAAGAGTTCCATG

XXI/ AGCiUGCCAGGCACCAGT TCG-ACGGTTCGTGGTCA

XXII/ AGC-AGCCAGGCACCAGT TCGiUCGGTTCGTGGTCA

XXIII/ AGCAGCCAGGCAC-AAGT TCGACGGTTCGTGiUTCA

XXIV/ TCAGGCACCTTGGGiUGC AGTCCGTGGGACCC-ACG

XXV/ GGC-ACCCTGGGTGCTGA CCGiUGGGATCCACGACT

XXVI/ GGC-ACCCTGGGTGCTGA CCGiUGGGACCCACGACT

XX Ivy AGCssUGCCAGGCACCAGT TCG—ACGGTTCGTGGTCA

XXIIss AGC--AGCCAGGCACCAGT TCGssUCGGTTCGTGGTCA

XXIII.v.v AGCAGCCAGGCAC—AAGT TCGACGGTTCGTGssUTCA

XXIVss TCAGGCACCTTGGGssUGC AGTCCGTGGGACCC—ACG

XXV.sv GGC—ACCCTGGGTGCTGA CCGssUGGGATCCACGACT

XXVI« ССС—АСССТСССТССТСА СССввиСССАСССАССАСТ

XXVII АССТСССАСССАССАСТСГСАСССГССТАТ ССАСССТТССТССТСАСАСТСССАССАТА

XXVII« АССТСССАвССАССАСТСТСАСССТССТАТ Х1рССАСССТТССТССТСАСАСТСССАССАТА

XXVIII АССТСССААССАССАСТСТСАСССТССТАТ ССАСССТТССТССТСАСАСТСССАССАТА

XXVIII« АССТСССААССАССАСТСТСАСССТССТАТ Х1рССАСССТТССТССТСАСАСТСССАССАТА

XXIX« АССТСССАбССАССАСТСТСАСССТССТАТ Х2рССАСССТТССТССТСАСАСТСССАССАТА

XXX« АССТСССААССАССАСТСТСАСССТССТАТ Х2рССАСССТТССТССТСАСАСТСССАССАТА

XXXI« АСААТССССТСАТССТСАТССТССТСТСАА----ССТСССАСССАССАСТСТСАСССТССТАТ ТСТТАССССАСТАССАСТАССАССАСАСТТ|Х1рССАСССТТССТССТСАСАСТСССАССАТА

XXXII« СТСАТССТССтСТСА-ССС—АСССТвССТССТСА-ССССАТАСССТТС САСТАССАССАСАСТ|СССяяиСССАТССАССАСТ|ССССТАТСССААС

XXXIII« СТСАТССТССТ-СТСА---СССАСССТвССТССТСА-ССССАТАСССТТС САСТАССАССАСАСТ|Х1рССТСССАТССАССАСТ|ССССТАТСССААС

XXXIV ТССТТТСССССТТТСТТАССАТСАСС(ЗАТССТССАССАТАТСССТСА-ССТСССАСССАССАСТСТСАСССТССТАТ АССАААСССССАААСААТССТАСТСССТАССАССТССТАТАСССАСТ|ССАСССТТССТССТСАСАСТСССАССАТА

XXXIV« ТССТТТСССССТТТСТТАССАТСАСССЗАТССТССАССАТАТСССТСА----ССТСССАвССАССАСТСТСАСССТССТАТ АССАААСССССАААСААТССТАСТСССТАССАССТССТАТАСССАСТ |Х1рССАСССТТССТССТСАСАСТСССАССАТА

XXXV ТССТТТСССССТТТСТТАССАТСАСССЗАТССТССАССАТАТСССТСА-ССТСССАСССАССАСТСТСАСССТССТАТ АССАААСССССАААСААТССТАСТСССТАССАССТССТАТАСССАСТ|ССАСССТСССТССТСАСАСТСССАССАТА

XXXV« ТССТТТСССССТТТСТТАССАТСАСССАТССТССАССАТАТСССТСА----ССТСССАСССАССАСТСТСАСССТССТАТ АССАААСССССАААСААТССТАСТСССТАвСАССТССТАТАСССАСТ|Х1рССАСССТСССТССТСАСАСТСССАССАТА

Тё - остаток т